cellula donatrice somatica

5. PRODUZIONE di EMBRIONI IN VITRO (IVEP: IVM, IVF, IVC)
FECONDAZIONE IN VITRO
Fertilizzazione: unione del DNA del nucleo nella testa dello spermatozoo
con il DNA nel nucleo dell’oocita
MATURAZIONE
L’uovo subisce cambiamenti complessi prima di essere
pronto per la fecondazione (meiosi  aploide). Cominciano
durante la vita fetale ma si completano soltanto dopo la
ovulazione e la penetrazione dello spermatozoo.
MATURAZIONE IN VITRO
Oociti da mattatoio (superamento limite numerico;
origine e stadio di sviluppo sconosciuti)
OPU (oociti uniformi e sincronizzati)
Competitiva alla SO: > numero embrioni /mese, (2
v/sett senza stimolazione ormonale)
Alternativa alla SO: Animali gravidi, aciclici, vecchi,
problemi vie genitali e tube, prepuberi.
CAPACITAZIONE
•Gradiente di densità (Percoll)
•Swim-up
•Medium con alta forza ionica
•Ca++ ionofori
•Caffeina, teofillina
•(….)
Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI)
Successi variabili
Specie-specifico (meglio per umani e cavalli)
In alcuni specie meglio SUZI (sub-zonal insemination)
Sempre meno efficiente di IVF
Selezione spermatozoi non naturale
COLTIVAZIONE IN VITRO DI EMBRIONI
BCS
Coculture (per es cellule ovidotto)
SOF
•Fabbisogni ignoti e variabili nel tempo
•Meno sviluppati
•Aborti tardivi
•Meno resistenti al congelamento
•LOS!
•Perdite fetali dal 5% (embrioni prodotti in vivo)
al 20%
6. SEZIONE EMBRIONI (fissione gemellare o EMBRYO SPLITTING)
Si possono ottenere individui
identici suddividendo un unico
embrione come succede
naturalmente nel caso dei gemelli
monozigoti
Nei mammiferi max 2-4 individui
Non sono cloni:
a) non sono il risultato di
riproduzione asessuata;
b) condividono tutto il loro
materiale genetico, mentre i
cloni prodotti artificialmente
condividono solo il DNA
nucleare mentre il DNA
mitocondriale è diverso.
Semplice, minimo addestramento, ma laborioso, strumentazione costosa.
Non commerciale, solo sperimentale.
Tasso di gravidanza < 10-15% rispetto a interi. Totale +50% (e non 100%)
Necessita tempo nel momento meno opportuno per ET
1 o max 2 persone: raccolta isolamento, ET, congelamento ecc.
Concentrazione e rapidità
Non funziona molto bene per congelamento (< tasso di gravidanza)
Non sempre auspicato aumento della prole (es. allevamenti da latte)
Aumentano riceventi non gravide
Combinato con sessaggio
Molto meno costoso IVM da mattatoio
7. TRAPIANTO DI GENI
•Prima della fertilizzazione (gameti)
•Prime fasi di sviluppo embrionale
Bioreattori capaci di produrre grandi quantità
di proteine nei liquidi biologici
Donatori per xenotrapianti
Modelli animali di malattie
MICROINIEZIONE: iniezione diretta di DNA nel pronucleo di un
uovo appena fecondato (nessun controllo sul posto, risultati assai
variabili, relativamente inefficiente
CELLULE GERMINALI PRIMORDIALI
Coltivate in vitro si moltiplicano ma si
differenziano e diventano TOTIPOTENTI
BLASTOMERI FETALI
TRAPIANTO NUCLEARE
8. CLONAZIONE
Per clonazione, in biologia, si intende la
riproduzione asessuata, naturale o
artificiale, di un intero organismo vivente o
anche di una singola cellula.
Dal greco κλών (klōn = “ramo", "ramoscello“)
Clonazione in natura
La clonazione intesa come riproduzione asessuata è molto comune
nelle piante.
Negli animali la riproduzione asessuata include gemmazione (meduse,
coralli, vermi piatti), frammentazione (vermi) e partenogenesi (alcuni
pesci, insetti, rane, lucertole).
La maggior parte degli animali capaci di riprodursi asessualmente ricorrono
alle partenogenesi solo in alcune circostanze. La partenogenesi è più rapida
della riproduzione sessuata e permette un veloce sfruttamento delle risorse
disponibili.
Nelle api le uova fertilizzate diventano individui femmine, mentre le aploidi
non fertilizzate (partenogenetiche) diventano maschi.
LA RIPRODUZIONE ASESSUATA NON SI VERIFICA NATURALMENTE NEI MAMMIFERI
STORIA DELLA CLONAZIONE
Anni ’50 primi esperimenti di TN con uova di anfibi
Anni 60 e 70 successi negli anfibi, anche con cellule donatrici
differenziate (cellule intestinali dei girini) ma il ciclo completo
non si chiudeva:
cellule donatrici da
girini risultavano in
rane completamente
sviluppate, cellule
donatrici di rane
completamente
sviluppate fornivano
girini, ma nessuna
rana adulta fu clonata
da cellule di rana
adulta
Nei mammiferi:
1986 Clonazione di pecora mediante
trapianto nucleare di blastomeri
fetali (cellule embrionali
indifferenziate), cioè embrioni allo
stadio molto precoce prima
dell’impianto.
1989 bovini e suini
La novità di Dolly è stata quella di usare una cellula donatrice
somatica (mammaria) di un animale ADULTO per
TRAPIANTO NUCLEARE (SCNT)
Il genoma di una cellula somatica
di mammifero adulto può essere
riprogrammato all’interno di un
citoplasma di un oocita enucleato e
può poi supportare tutto lo sviluppo
embrionale fino alla nascita
dell’individuo.
Dimostrazione che il genoma di
una cellula somatica differenziata è
completo, nel senso che contiene
tutte le coppie di geni
dell’individuo, come nello zigote
originale, cioè il genoma completo
può venire conservato durante la
differenziazione.
Dopo Dolly: Bovino (1998), topo (1998), capra (1999), suino (2000),
poi ratti cani gatti cavalli cervi….
SCNT: Passo fondamentale per lo sviluppo di OGM
Fin dagli anni ’80 si producevano OGM mediante microiniezione di
pezzi di genoma in uno dei due pronuclei dello zigote: efficienza 1%
animali d’allevamento, 6% topi. La maggior parte degli embrioni non
si sviluppano. Tra i nati, meno dell’1% mostrano la modificazione
genetica desiderata, e non è sicuro che la trasmettano. Possibilità di
mosaicismo. Si aggiungono dei geni, che possono interferire con quelli
già presenti.
Le cellule donatrici per TN possono essere raccolte da un animale
transgenico con le desiderate modificazioni genetiche, oppure le
cellule donatrici in coltura possono essere modificate geneticamente
prima del TN. Permette ricombinazioni genetiche molto precise e
specifiche (geni modificati, eliminati o aggiunti) (a differenza della
microiniezione di DNA). La cellula donatrice può essere controllata
prima evitando quindi di sprecare tempo e denaro in gestazioni di
animali non modificati (le madri surrogate sono impiantate solo con
embrioni GM)
ANIMALI TRANSGENICI - MG + NT applicazioni:
“BIOREATTORI”
Produzione di proteine umane o farmaci
es: fattori della coagulazione – emofilia
insulina – diabete, interferone – infezioni virali,
antitrombina, antiptripsina (TRACY ’91),
anticorpi verso cellule tumorali (GRACE ’98)
Problemi di sicurezza per eventualità di zoonosi
efficienza troppo bassa.
MG + NT applicazioni
“XENOTRAPIANTI”
produzione di organi e tessuti animali adatti ad essere trapiantati
negli umani (cuore, polmoni, reni, fegato, tessuto nervoso per m. di
Parkinson e Alzheimer, isole di Langherans per diabete).
Primati no, molti più problemi etici e maggior rischio trasmissione
infezioni. Preferiti i maiali (simili agli umani per anatomia fisiologia e
taglia degli organi, rapida crescita, breve ciclo riproduttivo e
prolificità, mantenimento relativamente facile ed economico).
Applicazione controversa dal punto di vista sociale ed etico grande
dibattito e sensibilità nell’opinione pubblica.
Ma a parte questo, ci sono ostacoli dal punto di vista tecnologico e
scientifico:
a) Pericolo di zoonosi (per es. retrovirus)
b) Rigetto immunologico (maiali con epitopo antigenico silenziato)
c) Compatibilità: anche se evitiamo il rigetto, poi l’organo del suino può
funzionare adeguatamente e rispondere in maniera appropriata ai
segnali chimici e ormonali umani?
MG + NT applicazioni
MODELLI ANIMALI PER MALATTIE UMANE
moltissime malattie umane riprodotte nei topi.
Problemi come sempre per trasferire le conoscenze da
una specie a l’altra
Ciclo vitale dei topi molto corto, meglio animali
d’allevamento, in particolare suini (Parkinson,
Alzheimer, alcuni tipi di diabete, aterosclerosi, cancro
mammella, psoriasi).
Pecore per fibrosi cistica.
Osteogenesi imperfetta, talassemia, oncologia (geni
attivatori e soppressori)
MG + NT applicazioni
ZOOTECNIA: MIGLIORAMENTO DEGLI ANIMALI DA REDDITO
Clonare un individuo particolarmente produttivo oppure inserire geni
desiderati prima del NT (produzione latte, velocità di accrescimento,
magrezza della carne, prole tutta dello stesso genere ecc).
Ancor più che per le applicazioni biomediche in questo caso le
procedure devono essere economicamente vantaggiose e dunque i
problemi tecnici rendono ancora più remota questa possibilità, essendo
troppo costosa la procedura rispetto ai vantaggi commerciali. In
qualche caso usati tori clonati per fecondazione naturale in grandi
mandrie (Nord Australia).
Nei prodotti alimentari derivati da animali clonati non sembrano
esserci pericoli per la salute umana, ma le conoscenze sono ancora
molto scarse e dovrebbe prevalere il principio della prudenza.
Dibattito in USA per la legislazione.
Gli individui che manifestano correttamente il gene desiderato (per
es. maiali con GH bovino) soffrono di moltissimi problemi di salute
(ulcere gastriche, artriti, malattie renali, cardiomegalia, dermatiti).
Lana pecore con antitarme, aumento caseine latte, eliminazione βlattoglubulina, riduzione % lattosio, grasso latte ….
MG + NT applicazioni
RESISTENZA ALLE MALATTIE (per es. mucca pazza, mastiti)
ENVIROPIGTM: a pig that has the capability to digest plant
phytate, leading to less phosphate in the manure from the animal
and thus less environmental pollution. Often mentioned in the
literature as an example of an environmentally friendly use of
biotechnology (GM and cloning)
MG + NT applicazioni
•Recupero di specie e razze in via di estinzione o addirittura ESTINTE
MG + NT applicazioni
RICERCA DI BASE
capire le leggi fondamentali della biologia,
come per es. l’espressione dei geni durante lo
sviluppo e la differenziazione
MG + NT applicazioni
Clonazione terapeutica (medicina rigenerativa)
Cura malattie tramite cellule staminali e riproduzione dei
tessuti:
●
Parkinson
●
Alzheimer
●
Sclerosi multipla
●
Infarto del miocardio
●
Diabete
●
Leucemia
Prima i limiti erano tecnici: “ciò che è possibile
fare”
Ormai dopo Dolly i limiti sono etici: “ciò che è
accettabile fare”
La fama di Dolly è dovuta soprattutto ad
ansietà pubblica e preoccupazioni morali,
visto che gli scienziati hanno dimostrato di
poter gestire e manipolare la vita fino a
questo punto.
Science 30 March 2001:
Vol. 291 no. 5513 p. 2552
Don't Clone Humans!
•Rudolf Jaenisch,
•Ian Wilmut*
•R. Jaenisch is at the Whitehead Institute for Biomedical Research and Department of Biology, MIT, Cambridge, MA 02142, USA.
•I. Wilmut is at the Roslin Institute, Roslin, Midlothian EH25 9PS, UK.
I successi nella clonazione animale suggeriscono ad alcuni che la tecnologia è abbastanza matura per giustificare la sua applicazione alla
specie umana. Uno specialista della fecondazione in vitro e un fisiologo della riproduzione hanno recentemente annunciato la loro
intenzione di clonare bambini entro un anno. Ci sono una infinità di ragioni sociali ed etiche per cui noi non saremo mai favorevoli a
copiare una persona, pur tuttavia la nostra preoccupazione immediata è che tale proposito non tiene minimamente conto dei problemi
riscontrati nella clonazione degli animali.
Sin dalla nascita della pecora Dolly clonazioni riuscite sono state riferite in topi, bovini, capre e suini, dunque è stata accumulata
abbastanza esperienza per rendersi conto dei rischi. La clonazione animale è insufficiente ed è verosimile che rimarrà tale per il futuro
che si può immaginare. La clonazione risulta in difetti della gestazione e neonatali. Nel migliore dei casi una percentuale bassissima degli
embrioni ottenuti con TN sopravvive fino alla nascita, e di questi circa la metà muore nel periodo perinatale. Non c’è nessuna ragione per
ritenere che i risultati dei tentativi di clonazione umana possano essere differenti. I pochi ruminanti clonati che sono sopravvissuti fino
alla nascita e sembrano normali sono spesso di taglia gigante, una condizione denominata “sindrome della prole grossa” (“large offspring
syndrome”). Molto più comuni sono difetti più gravi ed evidenti che si verificano durante lo sviluppo. Si ritiene che disfunzioni placentari
siano la causa delle frequenti morti embrionali durante la gestazione. I cloni neonati spesso mostrano insufficienza respiratoria e
problemi circolatori, che sono le cause più comuni di morti neonatali. Anche quelli che sopravvivono apparentemente sani possono
soffrire di disfunzioni immunitarie, o malformazioni dei reni o del cervello, che contribuiranno a causarne la morte poco più tardi.
Dunque se si va a tentare la clonazione umana, gli embrioni che non muoiono presto, potrebbero sopravvivere fino a diventare bambini
o adulti anormali, risultati problematici in ogni caso. […]
Hanno anche provato a rassicurare l’opinione pubblica: “classificheremo gli embrioni, faremo screening genetici, possiamo fare dei
controlli di qualità”. Dunque pensano di usare i metodi di diagnosi prenatale impiegati di routine per rilevare anomalie cromosomiche o
altri difetti genetici. Ma non esistono metodi scientifici disponibili ora o nel futuro immaginabile che possano esaminare lo stato
complessivo epigenetico del genoma (il problema dei cloni riguarda la riprogrammazione del nucleo trasferito).
Le reazioni pubbliche agli insuccessi della clonazione umana, potrebbero ostacolare le ricerche sulle cellule staminali embrionali per la
riparazione e rigenerazione di organi e tessuti. Si stanno conducendo ricerche al fine di programmare queste cellule a differenziarsi in
specifici tipi di tessuti che potrebbero essere usati per rigenerare cellule nervose (m. di Parkinson e di Alzheimer, per es.) o del muscolo
cardiaco. I potenziali benefici di questa clonazione di cellule ai fini terapeutici saranno enormi, e questa area di ricerca non può essere
associata agli attivisti della clonazione umana.
Noi riteniamo che nel momento in cui gli aspetti scientifici della clonazione nucleare non sono stati ancora chiariti, i tentativi di clonare
esseri umani siano pericolosi ed irresponsabili. […]