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ITTIOPATOLOGIA, 2006, 3: 193-194
INDICE
Editoriale
Editorial
G. Bovo ……………………………………………………………………..
ITTIOPATOLOGIA
Pubblicazione quadrimestrale
Rivista ufficiale della
Società Italiana di Patologia Ittica
PREMIO TESI “SIPI 2006”
Approccio
sistematico
a
Gyrodactylus
salaris
(Platyhelminthes, Monogenea) e sua prima descrizione
in Italia
Systematic
approach
to
Gyrodactylus
salaris
(Platyhelminthes, Monogenea): first report in Italy
G. Paladini, A. Gustinelli, M.L. Fioravanti, A.P. Shinn ….………………..
Direttore responsabile:
Dott. Giuseppe Ceschia
Responsabile scientifico:
Dott. Marino Prearo
c/o Laboratorio di Ittiopatologia e
Acquacoltura, Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte, Liguria e
Valle d’Aosta
Via Bologna, 148
10154 Torino
Tel.: 011-2686251
Fax: 011-2474458
E-mail: [email protected]
Comitato scientifico:
Prof.ssa Maria Letizia Fioravanti
Prof. Francesco Quaglio
Prof. Pietro Giorgio Tiscar
Segreteria S.I.P.I.:
Prof. Pietro Giorgio Tiscar
Università degli Studi di Teramo,
Dpt.
di
Scienze
Biomediche
Comparate, Piazza Aldo Moro, 45
64100 Teramo
Tel. & Fax: 0861-412868
E-mail: [email protected]
Autorizzazione:
Tribunale di Udine n° 10 del 27
marzo 1990
Codice ISSN:
ISSN 1824-0100
Foto di copertina:
Gyrodactylus salaris: particolare.
Foto di Giuseppe Paladini
pag. 197
Principali patologie dei Syngnathidae in cattività
The main disease of Syngnathidae in captivity
C. Bombardini, D. Florio, L. Fichtel, M.L. Fioravanti ……………………..
pag. 205
Indagine sull’infezione da Betanodavirus in specie ittiche
selvatiche
Investigation on Betanodavirus infection in wild fish species
M. Grodski, E. Galletti, S. Ciulli …………………………………………...
pag. 213
Episodio d’infezione da Pseudomonas fluorescens in
storione siberiano (Acipenser baeri) d’allevamento
Pseudomonas fluorescens infection in farmed Siberian
sturgeon (Acipenser baeri)
R. Brunetti, F. Gasparri, S. Marturano, M. Prearo ……………….………...
pag. 221
Studio epidemiologico della Perkinsosi nella vongola
filippina (Ruditapes philippinarum) allevata nella
Laguna di Marano (Nord Adriatico)
Epidemiology of Perkinsosis of manila clam (Ruditapes
philippinarum) farmed in the Marano Lagoon (North
Adriatic Sea)
G. Ceschia, L. Sgro, G. Capelli, A. Zentilin, R. Ramirez Tafur, M. Sello …
pag. 227
Parasitological monitoring of commercial native
bivalves from St. Gilla lagoon (Sardinia, South Western
Mediterranean)
Monitoraggio parassitologico di bivalvi autoctoni di
interesse commerciale della laguna di S.ta Gilla (Sardegna,
Mediterraneo Sud-Occidentale)
J. Culurgioni, V. D’Amico, R. De Murtas, G. Canestri Trotti, V. Figus …..
Tipografia:
Sistem Copy S.a.s.
Via Emilia, 47 – 40064 Ozzano
Emilia (BO)
pag. 195
pag. 243
Metazoan parasite fauna of conger eel Conger conger L.
from Sardinian waters (Italy)
Parassitofauna in grongo, Conger conger L., delle acque
della Sardegna
J. Culurgioni, V. D’Amico, E. Coluccia, A. Mulas, V. Figus ……………...
193
pag. 253
Referees:
Abete Maria Cesarina
Alborali Loris
Beraldo Paola
Bossù Teresa
Bovo Giuseppe
Bozzetta Elena
Caffara Monica
Canestri Trotti Giorgio
Ceschia Giuseppe
Ciulli Sara
Colorni Angelo
D’Amelio Stefano
Di Cave David
Dörr Ambrosius Josef Martin
Elia Antonia Concetta
Figueras Antonio
Fioravanti Maria Letizia
Galeotti Marco
Galuppi Roberta
Ghittino Claudio
Gustinelli Andrea
Malvisi Josè
Manfrin Amedeo
Marcer Federica
Marino Giovanna
Mattiucci Simonetta
Orecchia Paola
Quaglio Francesco
Regoli Francesco
Romalde Jesus Lopez
Rubini Silva
Salati Fulvio
Scapigliati Giuseppe
Tampieri Maria Paola
Tiscar Pietro Giorgio
Volpatti Donatella
Zaghini Anna
Zanoni Renato Giulio
Gastro-protective effect of capsaicin in Anguilla anguilla
(Linnaeus, 1758): evidence from an experimental study
on gastric bags
Effetto gastro-protettivo della capsaicina in Anguilla
anguilla (Linneo, 1758): studio sperimentale su sacchetti
gastrici
M.G. Denaro, G. Caruso, L. Genovese …………………………………….
pag. 263
Norme per gli autori
Instructions to authors
pag. 273
194
Editoriale
Editorial
Giuseppe Bovo
Vice Presidente della Società Italiana di Patologia Ittica
______________________________
Cari Soci,
l’occasione offertami dalla preparazione di questo editoriale, mi consente di raggiungerVi
tutti, in un’unica occasione, standomene comodamente seduto alla mia scrivania. Il primo
pensiero che mi sopravviene, dopo l’apertura del documento, va dritto al Convegno di
Abano.
Lo so, ci sono state alcune carenze organizzative e, soprattutto, il tempo meteorologico non
è stato dei migliori; a qualcuno, arrivato da angoli più soleggiati del Paese, non ho potuto
tacere la verità per cui ho confermato che quello di quei giorni era il tipico tempo
“Padano”…… non ho ottenuto risposta, probabilmente si sono sentiti più fortunati e non
hanno voluto dirlo, forse solo per pudore.
Per chi non si è fermato però posso assicurare che il fine settimana ci ha regalato due
giornate solari che hanno consentito, ai pochi che invece avevano azzardato il
prolungamento della loro permanenza, di godere appieno della piscina termale dell’Hotel
Mioni-Pezzato. Voci di corridoio riportano anche che, per rifarsi del cattivo tempo, alcuni
Soci si sono arresi alla “spalmatura” di cioccolato, proposta dal Wellness Center Tea Rose
dell’Hotel.
Se l’organizzazione locale ha mostrato qualche pecca (spero la vogliate considerare solo
veniale), l’organizzazione scientifica si è rivelata complessivamente forte, come sempre, del
contributo dei molti amici che si sono prodigati al meglio delle loro forze, come il gruppo di
Bologna, Teramo e tutti gli altri che ringrazio calorosamente.
La parte scientifica ritengo sia stata all’altezza delle precedenti edizioni. Avevamo lavorato
a lungo per organizzare la tavola rotonda ed avere, con noi, alcuni dei ricercatori più
rappresentativi ed alla fine eravamo soddisfatti: tutti gli esperti contattati ci avevano
confermato la loro presenza.
A mio avviso quest’ampia adesione rappresenta già un primo importante risultato che
personalmente interpreto come elemento di stima nei nostri confronti, di apprezzamento del
nostro lavoro, della nostra Associazione, della nostra rivista.
Purtroppo le mille piccole cose che si susseguono, durante lo svolgimento di un Convegno,
non mi hanno permesso di assistere a tutte le sezioni ma, quando ho potuto, l’ho fatto molto
volentieri e con l’attenzione dovuta: ho apprezzato la qualità di vari lavori, spesso presentati
da giovani ricercatori che mi auguro abbiano la possibilità di continuare il lavoro iniziato. La
SIPI è una associazione giovane, fatta da giovani (con qualche rara eccezione … ) e nei
giovani crede tanto da aver istituito un premio annuale per la migliore tesi sperimentale nel
campo dell’ittiopatologia, giunto, quest’anno, alla terza edizione. All’unanimità il Consiglio
ha selezionato il lavoro di Giuseppe Paladini e, nel corso della premiazione, la soddisfazione
195
di “Doctor Girodattilo” si è fatta palesemente manifesta quando, dalla borsa di Paul
(Midtlyng), è spuntata casualmente una cravatta infestata da giganti, quanto artistici
Girodattili Norvegesi D.O.C.. Il tutto è avvenuto “da Nicola” il ristorante individuato da
alcuni fedelissimi, ad un tiro di doppietta dalla sede del Convegno. In fondo anche la cena
sociale non era male; indubbiamente si poteva trovare qualcosa di più tipico, ma sarebbe
stato necessario avventurarsi nei colli veneti, con qualche difficoltà per il trasporto. Tutte
queste cose, la parte scientifica e la parte più gioviale sono state agevolate dal contributo
economico di vari sponsor, alcuni dei quali ci seguono, fedelmente, da anni e che voglio
ringraziare citandoli singolarmente:
- Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie;
- Associazione Piscicoltori Italiani;
- Skretting Italia – Hendrix S.p.A.;
- Schering-Plough Animal Health;
- Biomar Italia
- Valle Ca’ Zuliani
- Veronesi
L’ultimo pensiero va al prossimo Convegno che, con ogni probabilità, vista la coincidenza
della Conferenza Internazionale EAFP, a cui certamente riservate la precedenza, in termini
di presentazione di lavori, verrà organizzato in forma ridotta, soprattutto per consentire il
rinnovo delle cariche sociali e non interrompere una tradizione che dura da 13 anni.
Vorrei concludere questo mio breve intervento augurandomi ed augurandovi di poterci
ritrovare ancora a lungo per discutere di fatti scientifici e diluire il tutto con la nostra
amicizia.
Il Vice Presidente SIPI
Giuseppe Bovo
196
PREMIO TESI “S.I.P.I. 2006”
Approccio sistematico a Gyrodactylus salaris
(Platyhelminthes, Monogenea)
e sua prima descrizione in Italia
Systematic approach to Gyrodactylus salaris
(Platyhelminthes, Monogenea): first report in Italy
Giuseppe Paladini1, Andrea Gustinelli2,
Maria Letizia Fioravanti2 , Andrew Paul Shinn3
1
Corso di Laurea in Acquacoltura ed Ittiopatologia, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Bologna, Sede
di Cesenatico; 2 Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Patologia Animale, Università di Bologna,
Ozzano Emilia (BO); 3 Institute of Aquaculture, University of Stirling, FK9 4LA, Scotland, UK
______________________________
SUMMARY - The monogenean Gyrodactylus salaris Malmberg, 1957 is one of the most important parasites of
farmed fish in Europe mainly for the heavy damages and losses caused in Atlantic salmon (Salmo salar), and for
this reason in the past it was listed as a List III pathogen under the Fish Health Directive 91/67/EEC. Although
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) represents a suitable carrier host for G. salaris, the presence of this species
has been never officially reported in Italy. More in general, information about the identity of Gyrodactylus
species diffused in Italian rainbow trout farms are very scarce. Therefore during 2004 and 2005 a survey was
carried out in 8 rainbow trout farms in order to search for and identify Gyrodactylus species. Morphological and
molecular features of Gyrodactylus specimens collected allowed to identify 4 different species, G. salaris,
G. teuchis, G. derjavini and G. truttae and to point out for the first time the presence of G. salaris and G. teuchis
on the national territory.
Key words: Gyrodactylus salaris, Gyrodactylus spp., Rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, Identification, Italy.
______________________________
INTRODUZIONE
I parassiti monogenei Gyrodactylidae appartenenti al genere Gyrodactylus von Nordmann,
1832, vengono frequentemente indicati quali responsabili di problemi sanitari e perdite
produttive in acquacoltura. In particolare G. salaris ha dimostrato un’elevata patogenicità per
il salmone atlantico (Salmo salar), soprattutto allo stadio di parr (I anno di età) e smolt (dal
II al V anno di età), tanto da venire inserito nell’Elenco III dell’Allegato A della Direttiva
91/67/CEE. Sebbene la nuova normativa europea di polizia sanitaria in acquacoltura
(Direttiva 2006/88/CE) non prenda più in considerazione questo parassita, la sua importanza
sanitaria per il salmone atlantico viene confermata dalle numerose ricerche e pubblicazioni
scientifiche in corso. Va inoltre evidenziato come questo monogeneo possa parassitare in
forma latente numerose altre specie di salmonidi che rappresentano quindi ospiti di trasporto
di estrema rilevanza nella diffusione del parassita (Malmberg, 1993; Shinn et al., 1998;
Dalgaard et al., 2003; Buchmann et al., 2004; Dalgaard et al., 2004). In particolare la trota
iridea (Oncorhynchus mykiss) è stata descritta frequentemente come ospite asintomatico o
sub-clinico di G. salaris e per tal motivo viene considerata un serbatoio ideale del parassita.
197
In Italia, sebbene la troticoltura rappresenti il maggiore comparto produttivo
dell’acquacoltura dulciacquicola, mancano dati scientifici sulla presenza di G. salaris nelle
trote iridee d’allevamento, così come peraltro risultano essere estremamente carenti in
generale le informazioni sulle specie di monogenei Gyrodactylidae che possono essere
reperite in questo ospite. Si è quindi condotta un’indagine al fine di individuare le specie di
Gyrodactylus presenti in troticolture nazionali, conducendo esami parassitologici su trote
iridee provenienti da allevamenti intensivi ubicati in diverse regioni italiane ed applicando i
criteri identificativi suggeriti dal Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals (OIE,
2003), inerenti morfometria delle strutture chitinose dell’opisthaptor ed analisi molecolare.
MATERIALI E METODI
Da ottobre 2004 a giugno 2005 sono stati condotti campionamenti in otto troticolture
intensive ubicate nelle regioni Veneto (tre allevamenti), Umbria (due allevamenti), Toscana,
Trentino Alto-Adige e Abruzzo (Tabella 1). Per ogni allevamento sono stati esaminati 20
soggetti di trota iridea di lunghezza compresa tra 10 e 40 cm. Da ogni esemplare è stato
raccolto, previa eutanasia per spinalizzazione, il muco cutaneo mediante raschiamento di
superficie corporea e pinne. Il materiale prelevato è stato fissato in alcool etilico 70° e
sottoposto ad osservazione allo stereomicroscopio per la ricerca di monogenei girodattilidi. I
parassiti isolati sono stati identificati nel corso di un periodo di studio all’estero condotto
presso il laboratorio di Parassitologia dell’Institute of Aquaculture dell’Università di Stirling
(Scotland, UK). Dopo accurata pulizia in acqua distillata, 51 esemplari sono stati sottoposti a
leggera digestione in soluzione proteolitica (Shinn et al., 1993) in modo da mantenere intatti
gli organi chitinosi ed eliminare i tessuti molli, quindi montati su vetrino in fissativo di
Malmberg (Malmberg, 1957). L’impiego di tecniche enzimatiche consente di ottenere un
preparato estremamente sottile ed appiattito rendendo più facilmente osservabili gli apparati
chitinosi utili all’identificazione del parassita (Malmberg, 1970; Shinn et al., 1993). Si è
quindi proceduto all’osservazione microscopica dei preparati utilizzando un microscopio
Olympus BH2 a contrasto di fase e una camera digitale JVC KY-F30B 3CCD con il
programma Zeiss KS300 iC/Windows Release ver. 3.0 (1997) (Carl Zeiss Vision GmbH,
Munchen, Germany / Imaging Associates Ltd., Thame, Oxfordshire, UK). Ai fini
identificativi sono state applicate le seguenti metodologie.
- Point-to-point Analysis
Per ogni esemplare sono stati presi in considerazione 25 parametri morfometrici, di cui 11
per l’hamulus, 6 per la barra ventrale e 8 per gli uncini marginali, raccogliendo in totale
1.275 misure, applicando il protocollo indicato da Shinn et al. (2004) con il software PointR
ver. 1.0 (© Shinn, Bron, Kay & Sommerville, 2003, Universities of Stirling & Glasgow,
UK).
- Statistical Classification
I dati rilevati con il software Point-R sono stati inseriti in un programma di analisi statistica
contenente un database delle principali specie di girodattili dei salmonidi. Tale software
(S-PLUS 2000, Professional Release 3 © 1988-2000 Mathsoft, Inc.) è in grado di effettuare
una comparazione tra le misure degli esemplari in studio e quelle delle specie di
Gyrodactylus inserite nel database, indicandone le probabilità di appartenenza ad una
determinata specie (Kay et al., 1999; Shinn et al., 2000).
198
- OGRE (Optical Gyro Recognition)
La terza analisi é stata effettuata utilizzando il programma OGRE (Optical Gyro
Recognition) ver. 1.0 (© Shinn, Bron, Kay & Sommerville, 2003, Universities of Stirling &
Glasgow, UK) che attraverso vari passaggi di pulizia, ricostruzione e tagli dell’immagine
permette di ottenere l’esatto profilo delle strutture anatomiche utili all’identificazione. Le
immagini così ottenute sono state poi confrontate e sovrapposte a quelle di specie già
classificate utilizzando i software MultiHook Comparisons ver. 1.0 e HookAlign I-IV ver.
1.0 databases (© Shinn, Bron, Kay & Sommerville, 2003, Universities of Stirling &
Glasgow, UK).
- PCA (Principal Component Analysis)
Il PCA consiste in un’analisi discriminante che mostra graficamente e tridimensionalmente
le similitudini fra le diverse specie di Gyrodactylus spp. grazie all’immissione, all’interno
del software Statistical Release 6.0 (© StatSoft, Inc., 1984-2001, Tulsa, OK, USA), di tutte
le misure “point to point” precedentemente rilevate. Per poter ottenere questo grafico è
necessario definire preliminarmente due variabili corrispondenti alle due misure
morfometriche che influiscono maggiormente sulla discriminazione di specie (Shinn et al.,
1996; 2001).
- PCR (Polymerase Chain Reaction)
Per riuscire ad effettuare anche l’analisi molecolare delle specie di girodattili rinvenute,
ritenuta imprescindibile dall’analisi morfometrica nel Manual of Diagnostic Tests for
Aquatic Animals dell’OIE, si è proceduto alla dissezione della parte anteriore di 14 dei 51
parassiti in esame, prima della digestione proteolitica. Tale porzione veniva posta in alcool
etilico 95° ed inviata al dott. Haakon Hansen presso i laboratori del Zoological Museum
dell’University of Oslo (Norvegia), dove si procedeva all’analisi molecolare mediante PCRRFLP dell’intera regione ITS dell’rRNA.
RISULTATI E DISCUSSIONE
La presenza di monogenei appartenenti al genere Gyrodactylus è stata rilevata nelle trote
iridee prelevate presso 5 (62,5%) degli 8 allevamenti sottoposti a campionamento. In
tabella 1 vengono indicate le specie di girodattili identificate nel corso della ricerca, con
indicazione della regione in cui erano ubicati gli allevamenti positivi.
VENETO
G. salaris (n=6)
UMBRIA
TOSCANA
G. salaris (n=2)
G. teuchis (n=8)
G. salaris (n=1)
G. teuchis (n=5)
G. derjavini (n=4)
G. salaris (n=10)
TRENTINO
ALTO-ADIGE
G. salaris (n=4)
G. truttae (n=1)
Tabella 1 - Specie di Gyrodactylus identificate nel corso della ricerca
Table 1 – Gyrodactylus species identified during the survey
199
ABRUZZO
-----
Come si può osservare in tabella, è stato possibile identificare grazie alle analisi
morfometriche 4 diverse specie di girodattili: G. salaris, G. derjavini, G. teuchis e G. truttae
(Figure 1 A-D).
Figura 1 - Hamuli e uncini marginali di Gyrodactylus salaris (A), G. derjavini (B),
G. teuchis (C), G. truttae (D).
Figure 1 - Hamuli and marginal hooks of Gyrodactylus salaris (A), G. derjavini (B),
G. teuchis (C), G. truttae (D).
La presenza di G. salaris é stata riscontrata in tutti gli allevamenti risultati positivi. In
particolare, in due allevamenti tutti gli esemplari sottoposti a identificazione morfologica
sono stati riferiti esclusivamente a G. salaris, mentre nei restanti tre allevamenti G. salaris è
stato riscontrato in associazione ad altre specie. Appare poi interessante come in Umbria, in
entrambi gli allevamenti presi in considerazione, il numero di esemplari identificati come G.
teuchis sia risultato predominante. Inoltre la specie G. derjavini è stata individuata soltanto
nelle trote iridee campionate in questa regione. Per quanto concerne il Veneto, nell’unico
allevamento risultato positivo sono stati reperiti girodattili appartenenti esclusivamente alla
specie G. salaris, così come nei campioni provenienti dalla regione Toscana. Nel Trentino
Alto-Adige, oltre ad un unico esemplare di G. truttae, specie già descritta in altre troticolture
europee, sono stati evidenziati alcuni esemplari di G. salaris.
Lo studio delle sequenze dei 14 esemplari sottoposti ad analisi molecolare ha confermato
la presenza in Italia di G. teuchis, G. derjavini e G. salaris, mentre l’identificazione di
200
G. truttae è stata condotta solo morfologicamente in quanto nel corso delle ricerche è stato
isolato un unico esemplare di questa specie.
Ricerche effettuate in passato in Danimarca (Lindenstrøm et al., 2003) avevano rilevato
nelle trote d’allevamento le stesse quattro specie da noi identificate nelle troticolture italiane.
Questi risultati sembrano indicare la trota iridea quale ospite idoneo per questi girodattili
che, anche a diverse latitudini, mostrerebbero una notevole ospite-specificità.
In riferimento alle diverse procedure di identificazione morfologica applicate in questa
ricerca, va evidenziato come l’applicazione di una singola procedura sia spesso insufficiente
ad ottenere un’identificazione di specie, rendendo necessario integrare tutte le analisi di
identificazione morfometrica. A titolo di conferma la conduzione parallela di analisi
molecolari appare di notevole importanza (Lindenstrøm et al., 2003).
Il rilevamento, negli esemplari di G. salaris raccolti nelle troticolture nazionali, di lievi
differenze morfologiche rispetto a parassiti della stessa specie isolati da salmonidi presenti
nei fiumi norvegesi, conferma la possibilità che le caratteristiche morfologiche di girodattili
appartenenti alla stessa specie possano essere influenzate da fattori abiotici quali in
particolare la temperatura (Harris, 1998).
CONCLUSIONI
Questa ricerca ha permesso di individuare, per la prima volta in Italia, la presenza di
G. salaris nelle trote iridee d’allevamento, ampliando la distribuzione geografica di questo
parassita (Ergens, 1983; Rintamaki, 1989; Keranen et al., 1992; Mo, 1994; Shinn et al.,
1995; Johnston et al., 1996; Nielsen & Buchmann, 2001; Cunningham et al., 2003; Bakke et
al., 2004).
Risulta inoltre di estremo interesse il reperto di G. teuchis, descritto originariamente in
Francia (Cunningham et al., 2001) e solo sporadicamente in Danimarca e Scozia, le cui
caratteristiche biologiche e patologiche non risultano ancora definite e la cui presenza in
Italia non era stata ancora segnalata.
Per quanto riguarda G. derjavini e G. truttae, frequentemente riportati in troticolture di altri
paesi europei, risultano anch’essi diffusi negli allevamenti di trote nazionali sebbene siano
stati evidenziati con frequenza minore rispetto alle precedenti due specie.
Appare particolarmente importante aver acquisito, nel corso delle ricerche condotte per la
realizzazione di questa tesi, le conoscenze tecnico-scientifiche necessarie a condurre
l’identificazione di specie dei girodattili dei salmonidi, con particolare riferimento a
G. salaris, di estremo interesse non solo da un punto di vista strettamente parassitologico, ma
anche e soprattutto in funzione dell’importanza sanitaria che questo parassita riveste nella
salmonicoltura comunitaria.
RINGRAZIAMENTI
Parte delle ricerche sono state condotte grazie ad una borsa di studio all’estero del Corso di
Laurea in Acquacoltura ed Ittiopatologia di Cesenatico finanziata dalla Banca di Credito
Cooperativo di Sala di Cesenatico (FC).
201
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parasitising British salmonids. Int. J. Parasitol., 28: 805-814.
Tesi 1a classificata al Premio “SIPI 2006”
203
ITTIOPATOLOGIA, 2006, 3: 204
204
Principali patologie dei Syngnathidae in cattività
The main disease of Syngnathidae in captivity
Corinne Bombardini 1, Daniela Florio 2, Lara Fichtel 3,
Maria Letizia Fioravanti 2
1
Corso di Laurea in Acquacoltura ed Ittiopatologia, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Bologna, Sede
di Cesenatico; 2 Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Patologia Animale, Università di Bologna,
Ozzano Emilia (BO); 3 Medico Veterinario del Parco Oltremare di Riccione (RN)
______________________________
SUMMARY - The family Syngnathidae includes several species of seahorse, pipefish and seadragon of great
interest to the public aquarium industry. Although the scientific knowledge about their biology and husbandry in
captivity has been improved in recent years, information on their diseases is still poor. From May 2005 to March
2006 a mixed population of 90 syngnathids housed at an Italian public aquarium were subjected to diagnostic
procedure in order to identify the cause of sporadic and/or chronic morbidity and mortality. All the fish were
subjected to parasitological, bacteriological and mycological examinations. The results showed a range of
opportunistic organisms, highlighting the importance of good management procedures to prevent common
diseases of syngnathids. The actual pathogenic role of some parasites, bacteria and mycotic organisms has yet to
be investigated. Furthermore, some non infectious diseases, such as Gas Bubble Disease (GBD) and thyroidal
disorders were also observed.
Key words: Syngnathids, Diseases, Public aquarium.
______________________________
INTRODUZIONE
Alla famiglia Syngnathidae appartengono specie appartenenti al gruppo dei cavallucci
marini, dei pesci ago e dei dragoni marini (Kuiter, 2003). Questi teleostei sono di estremo
interesse commerciale in quanto circa 20 milioni di esemplari vengono pescati ogni anno per
il loro utilizzo nella medicina tradizionale cinese e nella fabbricazione di souvenir. L’ingente
pressione antropica a cui sono stati sottoposti i singnatidi ha reso necessaria la loro tutela
attraverso la regolamentazione del loro commercio. Attualmente tutte le specie di cavallucci
sono inserite nell’appendice II del regolamento CITES e numerose specie sono indicate
anche nella ‘Red List’ dell’International Union for Conservation of Nature and Natural
Resources (IUCN) stilata nel 2003 (www.redlist.org).
I singnatidi sono inoltre animali molto apprezzati negli acquari pubblici, dove esistono
però ancora molteplici problematiche inerenti la loro corretta stabulazione. Le insufficienti
conoscenze tecnico-scientifiche sui parametri ambientali e nutrizionali necessari al
mantenimento del loro benessere, determinano conseguentemente condizioni stressanti tali
da influenzare lo stato di salute di questi animali, peraltro particolarmente sensibili ad ogni
205
alterazione dell’omeostasi. Inoltre, a causa della carenza di informazioni organiche sulle
patologie che possono colpire questi teleostei in cattività, si hanno frequenti difficoltà
nell’individuare le opportune strategie di profilassi e controllo da adottare.
Nell’arco di un anno di studio si sono quindi condotte osservazioni sullo stato sanitario dei
singnatidi stabulati presso le vasche espositive e presso il settore quarantena di un parco
acquatico nazionale, provvedendo a condurre esami diagnostici approfonditi volti ad
individuare gli agenti patogeni di maggiore rilievo.
MATERIALI E METODI
Da maggio 2005 a marzo 2006 sono stati sottoposti ad esami parassitologici, batteriologici,
micologici ed istologici complessivamente 90 Syngnathidae, in particolare 67 cavallucci
marini (34 Hippocampus erectus - He, 24 H. abdominalis - Ha, 7 H. zosterae - Hz, 2 H.
barbouri - Hb), 21 pesci ago (10 Syngnathus typhle - St, 7 S. scovelli - Sc, 4 Syngnathoides
biaculeatus - Sb) e 2 dragoni marini (1 Phycodurus eques - Pe - e 1 Phyllopterix taeniolatus
- Pt).
L’esame parassitologico a fresco è stato condotto su cute, branchie ed organi interni. Per
l’identificazione di protozoi ciliati è stata condotta impregnazione argentica (Klein’s
method) su raschiati cutanei e branchiali. L’identificazione di metazoi è stata condotta previo
isolamento e chiarificazione dei parassiti in glicerina o lattofenolo di Amman.
L’esame colturale per batteri è stato effettuato mediante semina da rene, cervello e/o cute e
branchie su Tryptic Soy Agar (TSA) + 2% NaCl, Brain Heart Infusion Agar (BHIA) + 2%
NaCl, Blood Agar (BA), Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose Agar (TCBS), Flexibacter
maritimus Medium (FMM) ed incubazione per 24-48 ore a 25°C ±1.
L’esame colturale per micobatteri è stato condotto omogenando pool di fegato e rene ed
inoculandoli su Middlebrook 7H10 e Löwenstein–Jensen (LJM), incubando per 2 mesi a
25°C ±1 e 30°C ±1. Sono state inoltre allestite impronte da cute, branchie ed organi interni
colorate mediante metodica di Ziehl-Neelsen classica e modificata per Nocardia (Kinyoun).
Gli isolati batterici sono stati identificati mediante test fenotipici e sistemi API del
commercio (BioMérieux, France) (API 20E, 20NE, ZYM, 20CAUX, 50CH).
Per quanto concerne l’esame micologico, porzioni di cute e branchie sono state seminate su
Glucose Yeast Extract +Acido Oxolinico +Penicillina Agar (GY+OX+P) ed incubate per 10
giorni a 18 e 25°C ±1.
L’esame istologico è stato condotto su porzioni d’organo fissate in formalina tamponata al
10% ed incluse in paraffina e le sezioni, dello spessore di 6 µm, sono state colorate con
Ematossilina-Eosina (EE), Giemsa (G) e Ziehl-Neelsen (ZN).
RISULTATI
Le osservazioni sanitarie condotte nei singnatidi stabulati presso le vasche espositive e nel
settore di quarantena di un parco acquatico nazionale nel corso dell’anno di studio hanno
permesso di individuare molteplici patologie ad eziologia parassitaria, batterica, micotica e
non infettiva, queste ultime rappresentate dalla Gas Bubble Disease e dall’iperplasia tiroidea.
Nella tabella 1 vengono schematizzati i principali reperti parassitari, batterici e micotici
individuati nel corso del periodo d’osservazione.
206
REPERTI PARASSITARI,
BATTERICI E MICOTICI
He
Ha
Hz
Hb
St
Sc
Sb
Pe
Pt
Peritrichi sessili
10
-
-
-
-
4
1
-
-
Scuticociliatida
-
-
-
-
-
-
1
1
1
Microspora-Glugea sp.
2
-
-
-
-
-
-
-
-
Gyrodactylus sp.
-
-
-
-
8
2
-
-
-
Vibrio spp.
7
9
4
2
-
5
-
-
-
Aeromonas spp.
6
-
-
-
-
4
-
-
-
T. maritimum
-
-
-
-
8
-
-
-
-
Mycobacterium spp.
9
-
-
-
9
1
1
-
-
T. paurometabola
-
-
-
2
-
-
-
-
-
Cladosporium spp.
1
-
4
1
-
-
-
-
-
Tabella 1: Principali reperti parassitari, batterici e micotici individuati nei Syngnathidae esaminati
nel corso dell’indagine.
Table 1: Main parasitological, bacterial and mycological findings from Syngnathidae examined
during the survey.
I reperti patologici ad eziologia parassitaria rinvenuti durante gli esami autoptici sono stati
numerosi, alcuni rappresentati da organismi chiaramente opportunisti e d’irruzione
secondaria rispetto a disordini metabolici o ad episodi primari infettivi (es. ciliati peritrichi
sessili), altri da parassiti di indubbio carattere patogeno con segni clinici o lesioni ad essi
riferibili, come nel caso di ciliati Scuticociliatida Uronema-like (Foto 1, 2 e 3) e di trematodi
Monogenea del genere Gyrodactylus (Foto 7). Nel primo caso, oltre ad un episodio du
scuticociliatosi cutaneo-branchiale, sono stati osservati due casi d’infezione sistemica in due
dragoni marini stabulati in un sistema in cui si erano verificate repentine escursioni della
temperatura a seguito di un malfunzionamento strutturale. L’intervento mirato a ripristinare
le condizioni ottimali dell’acquario, in associazione ad operazioni di disinfezione
dell’ambiente, ha dimostrato una buona efficacia nel risolvere la parassitosi negli altri
animali presenti nello stesso sistema. Per quanto riguarda la girodattilosi, registrata in S.
scovelli e S. typhle, il sovraffollamento in vasca si è dimostrato un importante fattore
predisponente. A dimostrazione di ciò, l’allargamento dei soggetti stabulati, unitamente al
loro trattamento con sostanze disinfettanti, ha permesso di controllare rapidamente la
parassitosi. Fra gli altri reperti parassitari riscontrati sporadicamente nel corso dell’indagine
vanno ricordati microsporidi riferibili al genere Glugea a livello cutaneo (Foto 5 e 6),
flagellati del genere Ichtyobodo sp. a livello branchiale, mixosporidi del genere Ceratomyxa
nella cistifellea, trematodi digenei e stadi larvali di Proteocephalidae a livello intestinale,
questi ultimi reperiti solo in soggetti di recente importazione.
Tra gli agenti patogeni di natura batterica, nel corso dell’indagine sono stati isolati Vibrio
spp., Aeromonas spp., Tenacibaculum maritimum, Tsukamurella paurometabola e
Mycobacterium spp. In particolare V. alginolyticus, spesso in associazione ad Aeromonas
spp. e T. maritimum sono stati frequentemente isolati in associazione a gravi lesioni cutanee
(Foto 4) e branchiali (foto 8 e 9). Mentre l’isolamento di V. alginolyticus è stato condotto da
tutte le specie del genere Hippocampus e da S. scovelli, T. maritimum è stato isolato solo da
soggetti di S. typhle. Durante il periodo d’osservazione sono state osservate frequentemente
infezioni sostenute da Mycobacteryum spp. nei lotti di singnatidi stabulati nelle vasche di
quarantena e soprattutto in soggetti di H. erectus, S. typhle, S. scovelli e S. biaculeatus. La
207
patologia osservata nei soggetti colpiti (Foto 10, 11, 12 e 13) era riconducibile al quadro
tipico delle micobatteriosi ittiche, sebbene si siano spesso osservate lesioni nodulari a carico
della cute oltre a quelle disseminate negli organi interni. Quando veniva riscontrata
un’infezione da Mycobacterium spp. si procedeva allo stamping out del lotto colpito ed
all’accurata disinfezione della vasca con prodotti a base di cloro. Infine gli esami micologici
hanno permesso di isolare da 5 soggetti, a livello cutaneo, Cladosporium spp., un ifomicete
ambientale che rappresenta probabilmente un semplice contaminante di lesioni preesistenti.
Fra le patologie non infettive la “gas bubble disease” (Foto 14 e 15) e l’iperplasia tiroidea
(Foto 16) sono risultate le problematiche sanitarie più importanti, a conferma dell’esigenza
di approfondire le conoscenze tecnico-scientifiche inerenti le esigenze dei singnatidi in
cattività. La “gas bubble disease” nei cavallucci marini si può presentare in forme diverse,
alcune comuni quali la sovradistensione del marsupio del maschio e gli enfisemi sottocutanei
nella regione caudale, altri meno frequenti come l’iperinsufflazione della vescica natatoria e
gli enfisemi sottocutanei nella regione della testa. La specie più colpita è risultata essere H.
erectus. Il trattamento di questa patologia può essere condotto con successo mediante
somministrazione di inibitori dell’anidrasi carbonica nel caso degli enfisemi sottocutanei e
mediante cateterismo manuale nel caso della sovradistensione del marsupio.
L’iperplasia tiroidea, nota anche come “gozzo”, macroscopicamente si manifesta con un
aumento del volume della camera branchiale per la presenza di formazioni sacciformi
bilaterali dovute all’iperplasia del tessuto tiroideo. Per controllare e prevenire questo
fenomeno si procede con l’integrazione di iodio per via alimentare e per bagno. La specie
maggiormente colpita da questa patologia si è dimostrata H. erectus.
Tavola 1 - Foto 1-2-3: Infezione sistemica da Scuticociliatida Uronema-like: cheratite (1); numerosi ciliati
Uronema-like in raschiato cutaneo, esame microscopico a fresco (80x) (2); ciliato Uronema-like nel lume di vaso
epatico, sezione istologica (EE, 40x) (3); Foto 4: Erosioni cutanee a livello del cranio in corso di infezione da
Vibrio alginolyticus; Foto 5-6: Lesioni cutanee da microsporidi (5), spore di microsporidi evidenziabili nelle
lesioni, esame microscopico a fresco (100x) (6); Foto 7: Esemplare di Gyrodactylus spp. da cute (40x); Foto 8-9:
quadro istologico di branchie con massiva presenza di batteri filamentosi riconducibili a Flavobacteriaceae; si
osserva marcato sfaldamento dell’epitelio sino a totale distruzione delle lamelle (8, EE; 9, Giemsa, 40x); Foto
10-11-12-13: Micobatteriosi - noduli giallastri (frecce) visibili macroscopicamente all’apertura della cavità
celomatica (10); lesioni emorragico-necrotiche a carico della zona buccale (11), nodulo cutaneo a livello della
regione caudale (12), sezione istologica di fegato con presenza di numerosi batteri acido-alcool resistenti (ZN,
40x) (13); Foto 14-15: Gas bubble disease - enfisema sottocutaneo (14), sezione istologica di branchie con
embolia gassosa (EE, 40x) (15); Foto 16: ingrossamento sacciforme bilaterale della tiroide in H. erectus affetto da
iperplasia tiroidea.
Table 1 - Photos 1-2-3: Systemic infection due to Scuticociliatida Uronema-like: keratitis (1); several ciliates
Uronema-like in skin scraping, microscopical exam (80×) (2); ciliate Uronema-like in the lumen of a liver vessel,
histological section (H&E, 40x) (3); Foto 4: Skin lesions on the head in Vibrio alginolyticus infection; Photos 56: skin lesions due to microsporidia (5), spores of microsporidia from lesions, fresh microscopical exam (100×)
(6); Photo 7: Gyrodactylus spp. from skin (40x); Photos 8-9: histological sections of gills with massive presence
of filamentous bacteria referable to Flavobacteriaceae; epithelium is heavily sloughed off up to complete
destruction of lamellae (8, H&E; 9, G, 40x); Photos 10-11-12-13: Micobacteriosis - yellowish nodules (arrows)
well visible at opening of the body cavity (10); hemorrhagic-necrotic lesions in the mouth region (11), skin
nodule in the caudal region (12), histological section of liver with presence of numerous acid fast bacteria (ZN,
40×) (13); Photos 14-15: Gas bubble disease – subcutaneous emphysema (14), histological section of gills with
gas bubbles (H&E, 40×) (15); Photo 16: bilateral sacciform enlargement of thyroid gland in H. erectus with
thyroid hyperplasia.
208
1
3
2
6
5
4
9
8
7
10
11
10
12
13
16
14
15
209
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Va innanzitutto evidenziato come la maggior parte delle patologie riscontrate nei
Syngnathidae esaminati nel corso di un anno di indagine sia apparsa sostenuta da patogeni
opportunisti che, nelle condizioni artificiali proprie dell’acquario (alimentazione forzata,
parametri dell’acqua spesso non ottimali, ecc.) trovano numerosi fattori predisponenti
l’insorgenza di stati di malattia.
A tal riguardo vanno ad esempio annoverati i ciliati dell’ordine Scuticociliatida che si sono
dimostrati capaci di causare gravi infezioni superficiali e sistemiche in presenza di
traumatismi cutanei e/o di fluttuazioni anche minime della temperatura dell’acqua (Cheung
et al., 1980). Parimenti, ciliati peritrichi sessili sono stati osservati anche ad alte intensità
d’infezione in soggetti che presentavano infezioni batteriche preesistenti o condizioni
d’iperplasia tiroidea. Anche per quanto concerne gli agenti batterici isolati nel corso di
questa ricerca va messo in evidenza come quelli più frequenti siano stati V. alginolyticus,
Vibrio spp., Aeromonas spp., ritenuti tipici patogeni opportunisti in condizioni di
stabulazione forzata e di stati di stress nell’ospite (Koldewey, 2005). Per quanto concerne i
micobatteri atipici va evidenziato come anche questi saprofiti siano stati isolati, seppur con
notevole frequenza, sempre da soggetti stabulati nel sistema di quarantena, ad indice della
necessità di operare sempre attenti controlli sugli animali di nuova introduzione al fine di
prevenirne l’ingresso nei settori espositivi. L’importanza di questi microrganismi in
ambiente d’acquario è infatti da non sottovalutare, in quanto lo stato di stress cronico in cui
vivono gli animali qui stabulati, unitamente alle condizioni forzate di ricircolo e di equilibrio
dei parametri dell’acqua, possono facilmente scatenare l’insorgenza delle micobatteriosi
quali gravi patologie croniche in grado di provocare notevoli perdite e mortalità (Snieszko,
1978). Inoltre l’impossibilità di condurre trattamenti risolutivi negli animali colpiti conduce
in genere alla necessità di effettuare l’eradicazione della malattia con stamping out di pesci
di grande valore quali tipicamente i Syngnathidae, vuoti sanitari e disinfezioni estremamente
dannose per i vegetali e gli invertebrati presenti nell’acquario. L’isolamento sporadico di T.
paurometabola dovrà essere meglio studiato in futuro per poterne definire l’esatto significato
sanitario (Florio et al., 2004).
Tra gli agenti parassitari che possono essere considerati patogeni primari vanno invece
annoverati i monogenei del genere Gyrodactylus, che hanno causato pesanti infestazioni in
alcuni soggetti di Syngnathidae. Sebbene l’insorgenza della girodattilosi venga in genere
correlata al sovraffollamento in vasca, nell’ambiente chiuso dell’acquario anche
l’introduzione di un solo soggetto parassitato può rappresentare il punto di partenza di gravi
infestazioni a causa del ricircolo dell’acqua e dello stretto contatto tra gli animali stabulati,
con facile passaggio del parassita da un ospite all’altro.
Fra le patologie non infettive l’iperplasia tiroidea e la “gas bubble disease” sono risultate le
problematiche sanitarie più importanti, a conferma della necessità di approfondire le
informazioni scientifiche inerenti le esigenze nutrizionali ed ambientali dei Syngnathidae in
modo da impostare un’idonea profilassi volta a prevenire l’insorgenza di queste malattie.
In linea generale le patologie osservate nei Syngnathidae stabulati a scopo ornamentale
sono state in gran parte poste in relazione a patogeni opportunisti e/o a stati carenziali
dell’ospite, indicando come prioritario il miglioramento delle conoscenze sulle tecniche di
gestione in cattività di questi delicati teleostei, in modo da rispettarne maggiormente il
benessere e garantirne quindi le condizioni di immunocompetenza.
Appaiono infine di estrema importanza la corretta gestione del sistema di quarantena e la
costante attenzione sanitaria verso tutti i settori del parco acquatico al fine di prevenire
l’ingresso di patologie infettive e parassitarie ed evitarne il propagarsi alle diverse vasche di
stabulazione.
210
BIBLIOGRAFIA
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Dujardin (Ciliatea: Uronematidae) with a description of the histopathology of the infection in marine
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London, London, UK: 1-137.
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Snieszko S.F. (1978). Mycobacteriosis (Tubercolosis) of fishes. Fish and Wildl. Serv. Div. of Fishery
Res., Washington D.C.
211
212
Indagine sull’infezione da Betanodavirus
in specie ittiche selvatiche
Investigation on Betanodavirus infection in wild fish species
Marco Grodzki, Elena Galletti, Sara Ciulli
Corso di Laurea in Acquacoltura ed Ittiopatologia, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Bologna,
Sede di Cesenatico, viale Vespucci, 2 – 47042 Cesenatico (FC), Italy
______________________________
SUMMARY – Betanodavirus infection has a cosmopolitan distribution and causes a pathology defined Viral
Nervous Necrosis or Viral Encephalo-Retinopathy responsible of high mortality in several farmed marine fish
species with consequent high economical losses. Betanodaviruses are little ssRNA virus classified in Nodaviridae
family and divided in 4 species. The infection has been also signalled in wild fish, so it is important to inquire on
their possible role in the epidemiological cycle. The aim of this study was to investigate the presence of
Betanodavirus infections in wild fish of the Middle Adriatic Sea and to characterize genetically the isolated viral
strains. Brain samples from 293 fish belonging to 22 different species were collected at the fish market of
Cesenatico. Samples were pooled and analyzed for Betanodavirus infection with virus isolation on the cell line
SSN-1. Where specific cytophatic effect was visualised Betanodavirus infection was confirmed by RT-PCR
analysis. Genetic characterization of viruses isolated was conducted by sequencing and phylogenetic analysis.
Thirteen samples from 10 different species resulted positive. Sequencing and phylogenetic analysis confirmed
that the isolated viruses belong to the RGNNV genotype and evidenced a high grade of similarity with strains
previously isolated from farmed fish.
Key words: Betanodavirus, Marine fish, Middle Adriatic Sea, Phylogenetic analysis, RT-PCR, RGNNV .
______________________________
INTRODUZIONE
I Betanodavirus sono virus appartenenti alla famiglia Nodaviridae, capaci di infettare i
pesci responsabili di una patologia definita Encefalo-Retinopatia Virale (ERV) o Necrosi
Nervosa Virale. Questa malattia ha una distribuzione cosmopolita ed è responsabile di
elevata mortalità in larve e stadi giovanili di varie specie ittiche marine d’allevamento con
conseguenti elevate perdite economiche (Munday et al., 2002).
I Betanodavirus sono piccoli virus, a simmetria icosaedrica, privi di envelope e il loro
genoma è composto da 2 molecole di RNA a polarità positiva. La molecola RNA1 del peso
di 3,1 kbp è responsabile della sintesi della RNA-polimerasi RNA-dipendente, mentre la
molecola RNA2 del peso di 1,4 kbp sintetizza la proteina del capside virale. Sulla base
dell’analisi del genoma è stato possibile suddividere il genere Betanodavirus in 4 genotipi
recentemente riconosciuti dalla tassonomia ufficiale come 4 specie: SJNNV (Striped Jack
Nervous Necrosis Virus), BFNNV (Barfin Flounder Nervous Necrosis Virus), TPNNV
(Tiger Puffer Nervous Necrosis Virus) e RGNNV (Redspotted Grouper Nervous Necrosis
Virus) (Nishizawa et al., 1997; Fauquet et al., 2005).
Dal 1995 l'ERV è stata segnalata anche in Italia dove la specie maggiormente colpita è
213
costituita dal branzino (Dicentrarchus labrax). Al momento si presume che le specie
recettive, a livello mondiale, siano oltre 40. L’elenco comprende molte specie marine
provenienti da paesi con acque sia calde che fredde e anche alcune specie di acqua dolce.
L’infezione è stata segnalata anche nei soggetti selvatici ed il loro ruolo è intensamente
studiato sia con prove sperimentali, sia con studi di biologia molecolare al fine di
caratterizzare e comparare i ceppi isolati da soggetti selvatici e da soggetti d’allevamento
(Gagné et al., 2004; Gomez et al., 2004).
Il virus si trasmette sia attraverso il contatto diretto, sia mediante l’acqua, attrezzature e
mangime fresco. Un importantissimo ruolo nella diffusione del patogeno è rivestito dai
riproduttori; infatti, in alcune specie è possibile anche la trasmissione verticale.
La sintomatologia specifica è prevalentemente nervosa: nuoto circolare o a spirale,
improvvisi scatti alternati a letargia, posizione verticale. La malattia è caratterizzata da
lesioni istopatologiche quali vacuolizzazione dei neuroni, della materia grigia dell’encefalo e
della retina e la necrosi del Sistema Nervoso Centrale.
L’ERV può essere diagnosticata attraverso la dimostrazione delle caratteristiche lesioni
nell’encefalo e/o nella retina tramite la microscopia ottica, attraverso la rilevazione dei
virioni, antigeni virali o nucleotidi virali nel campione, oppure tramite l’evidenziazione di
anticorpi specifici nel siero o nei fluidi corporei.
Non essendo ancora disponibili metodi terapeutici o vaccinali per limitare la malattia,
bisogna ricorrere alla profilassi diretta tramite il controllo dell’ambiente e la diagnosi
precoce. A tal fine si rende indispensabile ampliare le conoscenze su alcuni aspetti
epidemiologici e diagnostici della malattia. In particolare è necessario indagare la presenza
dell’infezione nei soggetti selvatici ed il loro possibile ruolo nel ciclo epidemiologico.
MATERIALI E METODI
Per questa indagine, sono stati analizzati campioni di encefalo prelevati da pesci selvatici
appartenenti a 22 specie ittiche marine reperite presso il Mercato Ittico di Cesenatico (FC). Il
pescato proveniva dalla zona di pesca compresa tra Rimini e Ravenna. I campionamenti sono
stati effettuati settimanalmente dal 25 maggio al 6 dicembre 2005 con un’interruzione dal 6
luglio al 15 settembre a causa del fermo pesca. La quantità di pesci prelevati ad ogni singolo
campionamento è stata variabile, da un massimo di 33 pesci ad un minimo di 4 pesci con una
media di 16,27 pesci a campionamento; in totale sono stati raccolti 293 pesci. Le specie
campionate sono le seguenti (il numero di pesci prelevati di ogni specie viene indicato fra
parentesi): alice/acciuga (19), pagro (4), orata (4), sogliola (4), passera (2), aguglia (1),
ombrina (1), mormora (1), pesce prete (1), alaccia (3), ghiozzo (66), cefalo (18), triglia di
fango (39), boga (17), mazzola/gallinella (27), merlano/molo (21), suro (13), sarda/sardina
(14), sarago/sparo (8), suacia/zanchetta (12), sgombro (10) e nasello (8). I pesci sono stati
processati come pool di più esemplari omogenei per specie e giornata di prelievo.
I campioni di encefalo sono stati omogenati, decontaminati con soluzione antibiotata e
quindi processato per l’isolamento virale su SSN-1 (Figura 1) (Frerichs et al., 1996). Ogni
campione è stato processato sia tal quale, sia con una diluizione 1:10. La coltura cellulare è
stata quindi osservata giornalmente fino alla comparsa dell’effetto citopatico (ECP) oppure
per almeno 15 giorni in assenza di comparsa dello stesso. Sia in presenza sia in assenza di
ECP per ciascun campione sono state effettuate 2 subcolture con surnatante cellulare 7 giorni
post infezione. I lisati cellulari dei campioni che hanno manifestato l’effetto citopatico sono
stati quindi processati per l’estrazione dell’acido nucleico virale, retrotrascrizione e
amplificazione genica. L’estrazione dell’RNA è stata eseguita da 500 µl di surnatante della
coltura cellulare tramite TRI-REAGENT (Sigma®, Germania) seguendo le indicazioni della
214
ditta fornitrice e l’RNA è stato eluito in 40 µl di H2O addizionata con RNA secure (Ambion®,
USA). L’amplificazione genica è stata condotta tramite RT-PCR in due steps. La reazione di
retrotrascrizione è stata condotta con l’enzima Multiscribe Reverse Transcriptase (Perkin
Elmer®, U.S.A.) e con random hexamers. L’amplificazione genica è stata condotta con i
primers S6-S7 (Ciulli et al., 2005a; 2005b) per l’amplificazione dell’intera porzione
codificante della proteina del capside. L’amplificazione del cDNA è stata eseguita con
MasterTaq (Eppendorf®, Germania).
I prodotti della PCR sono stati purificati con High Pure PCR Product Purification Kit
(Roche, Germania) e sequenziati con sequenziatore automatico ABI 377 (Applied
Biosystem, CA). Le sequenze ottenute sono state allineate e comparate usando il programma
Clustal W (Thompson et al., 1994) del software Lasargene Biocomputing (DNASTAR Inc.
Madison, USA) con sequenze disponibili su GenBank. L'analisi filogenetica è stata condotta
con il programma MEGA versione 2.1 (Kumar et al., 2004). La distanza filogenetica è stata
calcolata usando il metodo Jukes-Cantor e l'albero filogenetico è stato costruito seguendo il
metodo Neighbour-joining. Al fine di valutare l'attendibilità dell'analisi filogenetica è stato
eseguito il test di boostrap 1000 ripetizioni.
Fig. 1
Fig. 2
Figura 1 – Monostrato cellulare della linea SSN-1.
Figura 2 – Monostrato cellulare con effetto citopatico da Betanodavirus.
Figure 1 –SSN-1 cell line monolayer.
Figure 2 – Cytopatic effect by Betanodavirus.in SSN-1 cell line monolayer.
215
RISULTATI
Tredici campioni hanno dato esito positivo in coltura cellulare. I campioni di suro e di
aguglia hanno manifestato effetto citopatico al 2° passaggio, 7 giorni post infezione, mentre
negli altri casi è stato possibile evidenziare l´effetto citopatico tipico al terzo passaggio
generalmente dopo 2-5 giorni di infezione (Figura 2). La RT-PCR ha confermato per tutti i
campioni isolati la presenza di Betanodavirus.
Nella tabella 1 sono riportate le specie, il numero di soggetti per campione e la data di
raccolta dei campioni positivi per Betanodavirus.
Dieci specie ittiche sono risultate colpite dall’infezione, 4 (cefalo, sardina, triglia, ghiozzo)
delle quali erano già state precedentemente segnalate sensibili all’infezione e trovate infette
in precedenti indagini svolte su soggetti di allevamento o selvatici (Guercio et al., 2005). Sei
specie (suro, mazzola/gallinella, aguglia, molo, nasello, boga), invece, non erano mai state
segnalate come sensibili, né sono riportate indagini in soggetti di tale specie.
Calcolando la percentuale di campioni positivi per specie, mazzola/gallinella è risultata la
specie più frequentemente colpita dall’infezione (30%), a seguire erano interessati il 28,6%
dei ghiozzi, il 25% delle sarde e naselli, il 18,2% dei cefali, il 14,3% dei suri, il 12,5% dei
merlani ed il 9,1% delle triglie. Il campione di aguglia risultato positivo era l’unico
disponibile per quella specie. In totale l’11,9% dei campioni è risultato positivo all’infezione
evidenziando una elevata diffusione dell’infezione in soggetti selvatici.
Otto ceppi dei 13 isolati sono stati sequenziati (Tabella 1) ed è stato ottenuto un
frammento di 362 bp comprendente la regione variabile dell’RNA2 del genoma virale.
Specie di provenienza
Nome comune
Nome scientifico
Cefalo
Mugil cephalus
Cefalo
Mugil cephalus
Suro
Trachurus spp.
Mazzola/Gallinella
Trigla lucerna
Sardina
Sardina pilchardus
Aguglia
Belone belone
Triglia
Mullus barbatus
Merlano/ Molo
Merlangius merlangus merlangus
Mazzola/Gallinella
Trigla lucerna
Nasello
Merluccius merluccius
Ghiozzo
Gobius sp.
Boga
Boops boops
Mazzola/Gallinella
Trigla lucerna
N°
soggetti
3
1
4
4
4
1
1
2
2
2
3
1
1
Data di
campionamento
8 giugno
29 giugno
15 settembre
21 settembre
21 settembre
2 ottobre
18 ottobre
25 ottobre
8 novembre
16 novembre
16 novembre
16 novembre
16 novembre
Sequenza
SI/NO
NO
SI
SI
NO
SI
SI
NO
NO
SI
SI
SI
SI
NO
Tabella 1 - Specie, numero di soggetti per campione e la data di raccolta dei campioni positivi per Betanodavirus.
Table 1 – The fish species, the number of subjects and sampling dates for Betanodavirus positive samples
are reported.
Le sequenze ottenute sono state comparate con i ceppi di referenza e sulla base
dell’identità nucleotidica e dell’analisi filogenetica attribuite al genotipo RGNNV (Figura 3).
216
DlEV-Sp20Sba
Triglia2 sicilia
cefalo 29/06
boga 16/11
nasello 16/11
Sarda sicilia
Dl-2
mazzola 08/09
DlEV-441-03
DlEV-77-00
Triglia1 sicilia
DlEV-411PD-96
ghiozzo 16/11
Dl-5
ghiozzo sicilia
DlEV-98-00
DlEV-351-01
Liza ramada
DlEV-It23Sba
DlEV-It19Sba
Dl-7
88 Dl-8
Dl-6
DlEV-Gr02Sba
DlEV-Pt08Sba
DLEV-Gr12Sba
Dl-3
99
99
Dl-4
DlEV-1348-03
DlEV-1416-03
sarda 21/09
aguglia 02/10
suro 15/09
DlEV-1213-03
BFNNV-D38635
99
HNNV-AF160473
SJNNV-D30814
99
TPNNV95-D38637
0.05
Figura 3 – Analisi filogenetica dei campioni positivi.
Figure 3 – Phylogenetic analysis of positive samples.
Sulla base dell’analisi filogentica i ceppi analizzati si dividono in 2 cluster con il 100% di
identità nucleotidica all’interno del gruppo e il 98,2% di identità fra i due gruppi
evidenziando la circolazione di due ceppi virali diversi. Comparando i ceppi analizzati con
sequenze di ceppi isolati in focolai di ERV da branzino Europeo nel Mediterraneo e di ceppi
isolati da specie selvatiche in una precedente indagine effettuata sul pescato del Canale di
Sicilia (Sicilia) si osserva ancora la divisione in due gruppi. In entrambi i gruppi sono
comunque presenti sia ceppi isolati da branzino, sia ceppi isolati da selvatici. L’identità
nucleotidica fra ceppi selvatici e domestici varia dal 92,5 al 100% mostrando la circolazione
degli stessi ceppi virali in allevamento e nelle popolazioni selvatiche. Non si osserva invece
correlazione tra i raggruppamenti e la specie ospite di provenienza; infatti un ceppo isolato
da sarda in un precedente studio è diverso (98,2% identità nucleotidica) da quello isolato in
questo studio. I ceppi, invece, di cefalo, mazzola/gallinella e nasello mostrano una elevata
similarità con i ceppi isolati da pesci selvatici pescati nel canale di Sicilia, avendo una
identità nucleotidica del 99,7-100%.
217
DISCUSSIONI E CONCLUSIONI
L'infezione da Betanodavirus è stata segnalata per la prima volta alla fine degli anni ’80. In
poco tempo questa infezione ha assunto una distribuzione cosmopolita interessando un
numero crescente di specie ittiche. La malattia che i Betanodavirus determinano viene
comunemente evidenziata negli allevamenti dove le condizioni di stress ed elevata densità di
popolazione incrementano la suscettibilità della specie ospite al virus. Recenti studi
comunque evidenziano che l’infezione è diffusa anche fra i selvatici, dove solo molto
raramente è stata osservata qualche forma clinica.
Con questa indagine si è voluto contribuire alla conoscenza della diffusione dell’infezione
da Betanodavirus nelle specie ittiche selvatiche che comunemente vivono nel Medio
Adriatico. L’indagine ha permesso di evidenziare l’infezione in 6 nuove specie fino ad oggi
mai segnalate come infette da Betanodavirus e in soggetti di 4 altre specie precedentemente
segnalate come infette, ma in altre aree geografiche.
Il virus è risultato diffuso sia in specie stanziali che in specie pelagiche (aguglia, sardina e
boga) che possono facilmente entrare in contatto con soggetti di allevamento.
Le positività ottenute, in relazione ai tempi di campionamento evidenziano una maggiore
circolazione del virus nel periodo settembre-ottobre, facendo pensare che essa sia il risultato
dell’amplificazione virale che avviene durante i focolai estivi negli allevamenti.
Il sequenziamento e l’analisi filogenetica hanno evidenziato che si tratta di Betanodavirus
genotipo RGNNV e che i ceppi circolanti nei selvatici hanno un alto grado d’identità con i
ceppi isolati da soggetti allevati, facendo ipotizzare un probabile ed allarmante ruolo di
portatori asintomatici dei soggetti selvatici di queste specie ittiche. Deve comunque essere
ancora chiarito se l’infezione in queste specie selvatiche sia una possibile sorgente
dell’infezione negli allevamenti o se si tratta solo della conseguenza della massiva
amplificazione virale che avviene durante i focolai stessi. Il coinvolgimento di specie
pelagiche capaci di spostarsi in un ampio territorio le rende comunque una possibile via di
trasmissione e diffusione del virus da un allevamento ad un altro e pertanto la conoscenza ed
il monitoraggio delle specie recettive è fondamentale al fine di controllare l’infezione.
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219
220
Episodio d’infezione da Pseudomonas fluorescens
in storione siberiano (Acipenser baeri) d’allevamento
Pseudomonas fluorescens infection in farmed
Siberian sturgeon (Acipenser baeri)
Rinaldo Brunetti 1, Filippo Gasparri 2,
Stefano Marturano 3, Marino Prearo 1*
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Via Bologna, 148 – 10154 Torino;
2
Skretting Italia, Hendrix S.p.A., Fraz. S. Zeno – 37060 Mozzecane (VR);
3
Studio Acqua Nostra, Via Bareggio 12/411 – 20090 Cusago (MI)
______________________________
RIASSUNTO - Nel corso dell’estate 2005 si è verificato un focolaio da Pseudomonas fluorescens in un
allevamento di storione siberiano (Acipenser baeri) situato nel Nord Italia, con una mortalità del 40% circa.
I soggetti colpiti erano esemplari giovani, della taglia di circa 10 grammi, allevati in vasche circolari interne di
circa 15 m3, dotate di ossigenazione automatica, con una temperatura dell’acqua attorno ai 22-24°C. All’esame
necroscopico i pesci presentavano lesioni cutanee in prossimità della regione perianale; all’apertura della cavità
corporea si evidenziava la distensione della vescica natatoria e la presenza di un’enterite emorragica,
particolarmente evidente nel tratto terminale dell’intestino. L’esame colturale, effettuato da rene e milza, ha dato
esito positivo, con crescita di colonie in purezza su terreni di primo isolamento. La successiva caratterizzazione
fenotipica e biochimica del germe ha consentito di identificarlo come P. fluorescens.
La terapia si è basata sull’utilizzo di mangime medicato con ossitetraciclina alla dose di 75 mg/kg di p.v. per 10
giorni con remissione completa della sintomatologia.
L’isolamento di P. fluorescens in A. baeri rappresenta una nuova segnalazione tra le patologie di origine batterica
che colpiscono questa specie ittica, non essendo nota altra comunicazione sul territorio nazionale.
SUMMARY – During the summer of 2005, an outbreak of Pseudomonas fluorescens, with a mortality rate of
about 40%, was isolated in farmed Siberian sturgeon (Acipenser baeri) in North Italy.
The affected subjects were young specimens, about 10 grams in size, bred in internal circular tanks of about
15 m3, equipped with automatic oxygenation, having a water temperature of about 22-24°C. Externally, fish
presented cutaneous lesions close to the perianal region. Necroscopic examination showed a distension of the
swim bladder and the presence of hemorrhagic enteritis, especially evident in the terminal tract of the intestine.
The cultural examination, carried out on kidney and spleen, was positive, with pure colonies, and successive
phenotypic and biochemical characterization allowed us to identify the germ as P. fluorescens.
The therapy was based on the use of food medicated with oxytetracycline at a dose of 75 mg/kg of weight for 10
days with complete remission of the symptoms.
The isolation of P. fluorescens in A. baeri represents a new pathology of bacterial origin affecting this species
since there have not been other reports in Italy.
Key words: Siberian sturgeon, Acipenser baeri, Bacterial disease, Pseudomonosis, Pseudomonas fluorescens.
______________________________
* Corresponding author: c/o Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta; Area
Diagnostica Generale e Sanità Animale, Laboratorio di Ittiopatologia e Acquacoltura, Via Bologna, 148 - 10154
Torino. Tel.: 011-2686251; Fax: 011-2474458; E-mail: [email protected]
221
INTRODUZIONE
La storionicoltura in Italia ha radici relativamente recenti; infatti, i primi impianti sono
sorti sul territorio lombardo alla fine degli anni settanta. Numerose sono le specie e gli ibridi
che vengono allevati, sia per le loro carni sia per le uova; tra questi troviamo lo storione
ladano (Huso huso), lo storione bianco (Acipenser transmontanus), lo storione russo
(Acipenser gueldenstaedti) e lo storione siberiano (Acipenser baeri).
Gli Acipenseridi appartengono all’ordine degli Acipenseriformi e sono caratterizzati dalla
presenza sulla cute, priva di squame, di cinque serie longitudinali di scudi ossei che
conferiscono una forma pentagonale alla sezione trasversale del corpo (Tortonese, 1970).
Lo storione siberiano (Acipenser baeri) (Brandt, 1869) oggetto di questo studio, viene
allevato in particolar modo per le carni che vengono consumate in tranci e che hanno un
tipico colore bianco-grigiastro. Questa specie fu importata dalla Russia prima in Francia nel
1975 e successivamente in Italia nel 1988. Lo storione siberiano raggiunge in due anni di
allevamento i 2-2,5 Kg a 15-18°C, con un indice di conversione medio compreso tra 1,8 e
2,5 nei primi 2-3 anni di allevamento, mentre negli anni successivi è decisamente superiore
(fra 2 e 4) (Hochleithner & Gessner, 1999).
Pseudomonas fluorescens appartiene alla famiglia delle Pseudomonadaceae e può essere
descritto come un bacillo Gram negativo, non sporigeno, ossidasi positivo, mobile per la
presenza di flagelli polari e con metabolismo aerobio. Una caratteristica di P. fluorescens è
la produzione di pigmenti che, illuminati con lunghezze d’onda di 254 nm (ultravioletto)
risultano fluorescenti (Palleroni, 1984). Tale specie viene normalmente descritta come un
saprofita non patogeno, che colonizza ambienti terrestri, acquatici e la superficie di molte
piante. E’ causa di alcune patologie nei vegetali, come ad esempio la necrosi del midollo in
piante di pomodoro (Demir, 1990; Saygili et al., 2004).
Nell’uomo è causa di infezioni a basso livello di virulenza, soprattutto in pazienti
ospedalizzati, (Simor et al.,1985), in pazienti anziani immunocompromessi (Pappas et al.,
2006) e provoca raramente setticemie più gravi in pazienti oncologici (Hsueh et al., 1998).
P. fluorescens è normalmente presente nelle acque libere (Allen et al., 1983) e viene
descritto in ittiopatologia sia come un patogeno secondario che invade tessuti già
danneggiati, sia come un patogeno primario a bassa virulenza (Roberts & Horne, 1978). È
stato segnalato come causa di malattia in diverse specie ittiche quali tinca (Tinca tinca)
(Ahne et al., 1982), carpa (Cyprinus carpio) e diversi altri ciprinidi (Farkas, 1984),
pescigatto (Ictalurus melas e I. punctatus) (Ghittino, 1985; Inglis et al., 1993), trota fario
(Salmo trutta fario) e trota marmorata (S. trutta marmoratus) (Prearo et al., 2002). È noto
anche come causa di ulcere cutanee in esemplari di trota iridea (Oncorhynchus mykiss) affetti
da Necrosi Pancreatica Infettiva in forma cronica (Roberts & Horne, 1978).
Scopo del presente lavoro è quello di descrivere un episodio di setticemia batterica causata
da P. fluorescens in giovanili di storione siberiano stabulati in vasche circolari, con
sintomatologia evidente ed elevata mortalità.
MATERIALI E METODI
Nel corso dell’estate 2005, sono giunti in laboratorio alcuni esemplari di storioni siberiani
provenienti da un allevamento dell’Italia settentrionale in cui si stava verificando un episodio
di elevata mortalità. I soggetti colpiti erano della taglia di circa 10 grammi e venivano
allevati in vasche circolari di circa 15 m3, dotate di ossigenazione automatica, con una
temperatura dell’acqua attorno ai 22-24°C. L’acqua di pozzo normalmente usata in questo
222
periodo, veniva mescolata in quantità uguali con acqua di superficie proveniente da un
canale sito in prossimità dell’allevamento.
I soggetti sono stati sottoposti ad esame parassitologico a fresco per la ricerca di parassiti.
All’esame necroscopico, eseguito su tutti i soggetti mediante dissezione, ha fatto poi seguito
l’esame colturale di primo isolamento, eseguito tramite prelievo da rene e milza e semine su
piastre di Columbia Agar addizionato con il 5% di sangue defibrinato di montone (AGS)
(Microbiol). Le colonie, sviluppatesi dopo 24-48 ore di incubazione a 22 ± 2°C, sono state
sottoposte ad analisi fenotipiche (trapianto su terreni selettivi quali il Pseudomonas Isolation
Agar PIA e test di motilità) e biochimiche mediante l’utilizzo di gallerie API 20NE
(bioMérieux).
Una volta individuato il germe, è stato allestito l’antibiogramma secondo la metodica di
Kirby-Bauer, utilizzando piastre di Muller-Hinton Agar e saggiando l’efficacia in vitro dei
più comuni antibiotici utilizzati per i batteri Gram negativi che colpiscono i pesci.
L’approccio terapeutico si è basato sulla somministrazione di un mangime medicato con
ossitetraciclina, alla concentrazione di 75 mg/kg di p.v. per 10 giorni.
RISULTATI
L’esame necroscopico ha permesso di evidenziare la presenza di lesioni cutanee in
prossimità della regione perianale e di rigonfiamento della parete addominale; all’apertura
della cavità corporea si è potuto notare una estrema distensione della vescica natatoria e in
diversi soggetti analizzati la presenza di un’imponente enterite emorragica, particolarmente
evidente nel tratto terminale dell’intestino.
L’esame parassitologico effettuato su cute e branchie è risultato negativo per tutti i soggetti
esaminati.
L’esame colturale di primo isolamento è risultato positivo, con crescita di colonie già dopo
circa 18 ore di incubazione a 22 ± 2°C su AGS.
Il germe isolato in purezza, era rappresentato da un bacillo Gram negativo, ossidasi
positivo, mobile, capace di crescere a 4°C, ma non a 41°C; la crescita su terreni selettivi
(PIA), metteva in evidenza colonie azzurro-verdastre che, se sottoposte a luce ultravioletta,
emettevano una caratteristica fluorescenza.
La caratterizzazione biochimica del ceppo isolato, eseguita in micrometodo (API 20NE),
ha fornito i risultati evidenziati in tabella 1.
La lettura dell’antibiogramma ha mostrato in vitro una sensibilità intermedia ad
Ossitetraciclina e Tetraciclina, mentre il germe è risultato resistente ad Acido Oxolinico,
Amoxicillina, Ampicillina, Enrofloxacina, Florfenicolo, Flumequine, Sulfametazolo
potenziato con Trimethoprim e Tiamfenicolo.
La terapia, effettuata mediante la distribuzione di mangime medicato per 10 giorni, ha
portato alla completa remissione dei sintomi a partire dal quarto-quinto giorno di
somministrazione.
La mortalità totale del presente episodio, dalla comparsa dei primi sintomi alla fine della
terapia, è stata calcolata intorno al 40% circa.
223
Reazione
Esito
NO3 - Riduzione dei nitrati
TRP - Produzione di indolo dal triptofano
GLU - Fermentazione del glucosio
ADH - Arginina deidrolasi
URE - Ureasi
ESC - Idrolisi dell’esculina
GEL - Idrolisi della gelatina
PNPG - β-galattosidasi
GLU - Assimilazione del glucosio
ARA - Assimilazione dell’arabinosio
MNE - Assimilazione del mannosio
MAN - Assimilazione del mannitolo
NAG - Assimilazione dell’n-acetil-glucosamina
MAL - Assimilazione del maltosio
GNT - Assimilazione del gluconato
CAP - Assimilazione del caprato
ADI - Assimilazione dell’adipato
MLT - Assimilazione del malato
CIT - Assimilazione del citrato
PAC - Assimilazione del fenil-acetato
OX - Ossidasi
Codice identificativo finale
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
0157557
Tabella 1 – Caratteristiche biochimiche, valutate mediante API 20NE,
del ceppo di Pseudomonas fluorescens isolato.
Table 1 – Biochemical characteristics (API 20NE) of Pseudomonas fluorescens strain.
La Pseudomonosi da Pseudomonas fluorescens colpisce pesci d’acqua calda e fredda, sia
dulciacquicoli che marini; la localizzazione è generalmente cutanea, soprattutto a carico di
coda e pinne ed è in grado di determinare lesioni necrotiche che possono arrivare fino alla
totale compromissione dell’organo (Ghittino, 1985).
Sono stati segnalati casi con elevate mortalità, anche del 90%, in avannotti di tinca, i quali
presentavano lesioni emorragiche a carico della cute e della base delle pinne; inoltre è stata
riscontrata la presenza di liquido ascitico in cavità peritoneale, di petecchie emorragiche a
livello branchiale, epatico, splenico e lungo il tratto intestinale, con un quadro tipico di
setticemia batterica (Ahne et al., 1982).
In Italia, un caso di setticemia batterica da P. fluorescens è stata diagnosticata durante
un’epizoozia in trotelle fario e marmorate allevate in un impianto montano da
ripopolamento, dove la mortalità ha raggiunto il 30% circa dei soggetti colpiti, con presenza
di lesioni emorragiche a carico di cute, pinne, branchie, grasso periviscerale e intestino
(Prearo et al., 2002).
Per quanto riguarda invece le patologie di origine batterica negli Acipenseridi, le
segnalazioni risultano essere relativamente scarse, soprattutto sul nostro territorio. Alle
224
segnalazioni di patologie causate da Yersinia ruckeri in storioni siberiani (A. baeri) in
Francia (Vuillaume et al., 1987) e da Plesiomonas shigelloides in storione comune
(A. sturio) in Germania in soggetti provenienti dalla Russia (Klein et al., 1993), si devono
aggiungere le segnalazioni italiane con isolamento di Flexibacter columnaris da storione
bianco (A. transmontanus) (Dottori et al., 1990) e di Aeromonas hydrophila da sterleto
(A. ruthenus) (Quaglio et al., 2000) e storione siberiano (Colussi et al., 2005). Inoltre è stata
dimostrata la suscettibilità di storione bianco ad Edwardsiella ictaluri tramite infezione
sperimentale (Baxa et al., 1990).
Nel caso in oggetto si è potuta constatare una forma setticemica, ad elevata mortalità, dove
i giovani storioni presentavano una sintomatologia aspecifica.
Per le caratteristiche di patogenicità del germe in questione la causa primaria di tale
episodio è da imputarsi probabilmente alla distensione della vescica natatoria, evenienza
relativamente frequente nelle forme giovanili di storione, sottoposti a stress di varia natura.
L’utilizzo di acqua superficiale proveniente da un canale di alimentazione esterno,
avvenuto alcuni giorni prima della comparsa delle manifestazioni cliniche, oltre a
rappresentare la possibile via di entrata del germe in allevamento, ha senza dubbio sottoposto
gli storioni ad un forte stress fisico, rendendoli probabilmente più vulnerabili a patologie
secondarie come la Pseudomonosi.
Tale segnalazione rappresenta il primo caso di Pseudomonosi da P. fluorescens in storioni
siberiani in Italia e costituisce un ulteriore tassello nella descrizione di quadri patologici di
origine batterica che colpiscono gli Acipenseridi.
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226
Studio epidemiologico della Perkinsosi nella vongola
filippina (Ruditapes philippinarum) allevata
nella Laguna di Marano (Nord Adriatico)
Epidemiology of Perkinsosis in manila clam
(Ruditapes philippinarum) farmed in
the Marano Lagoon (North Adriatic Sea)
Giuseppe Ceschia1*, Lucia Sgro1, Gioia Capelli2, Aurelio Zentilin3,
Rosario Ramirez Tafur1, Marco Sello1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Patologia Molluschi - Basaldella di
Campoformido (UD); 2 Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie - Legnaro (PD); 3 Acquacoltura
Lagunare Marinetta Scarl - Marano Lagunare (UD)
_______________________________
RIASSUNTO - Data la notevole presenza di Perkinsus sp. nelle vongole della Laguna di Marano (Nord Adriatico),
riscontrata attraverso l’analisi di diversi campioni in questi ultimi anni, questa ricerca si è proposta di studiare la
Perkinsosi durante un ciclo di allevamento e di valutare l’influenza dei parametri ambientali sullo sviluppo della
patologia. Allo scopo, sono stati effettuati campionamenti mensili in due zone di allevamento (ingrasso): Zona A,
Porto Lignano e Zona B, Isola di Marinetta. Su ogni campione, costituito da 50 soggetti, sono stati condotti esami
istologici ed esami colturali quantitativi in Ray Fluid Thioglicollate Medium. Perkinsus sp. è stato rinvenuto in
quasi tutti i soggetti esaminati: 76-100%. Nella zona A il numero di spore per soggetto varia tra 0 e 1.320.000;
quello di spore/g tra 0 e 1.702.127. Il valore medio spore/g si colloca tra 13.805 (marzo 2004) e 219.647 (ottobre
2003). Nella zona B il numero di spore per soggetto varia tra 0 e 3.000.000; quello di spore/g tra 0 e 3.273.137. Il
valore medio spore/g è compreso tra 43.794 (giugno 2003) e 783.390 (agosto 2004). Le vongole allevate nella zona
B mostrano una media di spore significativamente più elevata di quelle della zona A. La diversa salinità riscontrata
tra le due zone e la diversa composizione del substrato possono aver influenzato la variazione del grado di
infestazione di Perkinsus sp.
SUMMARY - Manila clam, farmed in the Marano Lagoon, is infested by the aetiological agent responsible for this
infection, Perkinsus sp., as revealed by survey performed in the last years on several clam samples. The purpose of
this research project was to observe the progression of the disease during farming cycle and to estimate the
influence of the environment on the disease status. Monthly, two areas in the lagoon were sampled: Area A,
Lignano harbour and Area B, Marinetta Island. Samples, each one of 50 subjects, were analysed by histology and
by incubation of tissues in Ray’s Fluid Thioglycollate Medium (RFTM). Perkinsus sp. was found in nearly all the
examined subjects: 76-100%. In area A, the number of hypnospores/individual ranged between 0 and 1320000,
while the number of hypnospores/g between 0 and 1702127. The mean value of hypnospores/g ranged between
13805 (March 2004) and 219647 (October 2003). In area B, the number of hypnospores/individual ranged between
0 and 3000000, while the number of hypnospores/g between 0 e 3273137. The mean value of hypnospores/g ranged
between 43794 (June 2003) and 783390 (August 2004). The mean value of hypnospores found in clams farmed in
the area B was significantly higher than that found in clams from the area A. The different salinity characterizing
the two areas and the different bottom composition may be the cause of the difference found in the Perkinsus sp.
infection level.
Key words: Manila clam, Ruditapes philippinarum, Perkinsus spp., Perkinsus olseni, Perkinsus mediterraneus,
Pathology.
_______________________________
* Corresponding author: c/o Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Patologia Molluschi,
Via della Roggia 102 - 33030 Basaldella di Campoformido (UD). Tel.: 0432-561196; Fax: 0432-561532; E-mail:
[email protected].
227
INTRODUZIONE
Il genere Perkinsus include diverse specie di parassiti protisti che infettano numerosi
molluschi marini. La sua presenza è segnalata in oltre 50 specie popolanti le acque sia
temperate sia tropicali dell’Oceano Pacifico e dell’Oceano Atlantico. Maggiori segnalazioni si
hanno nelle specie più commercializzate: Crassostrea virginica (USA), Haliotis spp.
(Australia) e Ruditapes spp. (Corea, Europa). In Europa è riscontrato soprattutto nelle vongole
(R. decussatus e R. philippinarum) negli Stati che maggiormente allevano queste specie o che
gestiscono, ai fini commerciali, zone naturali (Portogallo, Spagna, Francia, Italia).
Inizialmente, la specie rinvenuta in Europa era stata identificata come P. atlanticus
(Azevedo, 1989). Recentemente, da studi genetici di diversi isolati riferibili al genere
Perkinsus, si ritiene che P. atlanticus e P. olseni (segnalato in Haliotis spp. australiane) siano
la stessa specie (Murrell et al., 2002); pertanto per “diritto di prima segnalazione” gli
organismi riferibili al genere Perkinsus segnalati in Europa, salvo ritrovamento di nuove
specie, dovrebbero essere attribuiti alla specie P. olseni. D’altra parte nel 2004 organismi
riferibili al genere Perkinsus sono stati segnalati in ostrica piatta (Ostrea edulis) nelle Isole
Baleari spagnole (Casas et al., 2004) ed attribuiti a P. mediterraneus n. sp.
La malattia causata da questi organismi è conosciuta come Perkinsosi ed è molto studiata,
poiché le viene attribuita, talvolta, responsabilità diretta in casi di mortalità in Europa, ad
esempio nell’allevamento di R. decussatus e R. philippinarum in Portogallo (Ruano &
Cachola, 1986) e Spagna (Figueras et al., 1992).
Per l’Europa, la prima segnalazione di Perkinsus si è avuta nel 1978 in R. decussatus della
Laguna di Venezia (Da Ros & Canzonier, 1985; 1986). Poiché l’introduzione della vongola
filippina (R. philippinarum) in Italia (Laguna di Venezia) si è avuta nel 1983, appare evidente
l’esistenza di Perkinsus prima di tale introduzione, anche se la pratica di allevamento può
averne rinforzato la presenza. Da Ros & Canzonier (1985; 1986) segnalano Perkinsus in
O. edulis in banchi naturali della Laguna di Venezia. Secondo questi Autori, già durante
l’inverno 1978 il parassita era stato riscontrato in ostriche piatte, importate dalla Grecia ed
immesse nel Nord Adriatico. Nella Laguna di Marano (Nord Adriatico), in cui l’allevamento
di R. philippinarum ha avuto inizio nel 1986, è stata segnalata tale parassitosi nel 1991
(Ceschia et al., 1991). In tale area, la Cooperativa ALMAR Scarl possiede schiuditoio,
preingrasso ed ingrasso (100 ettari), nonché un’area naturale gestita (con reimmersione di
prodotto reperito commercialmente in Italia e/o estero) per la raccolta da parte della
Cooperativa Pescatori S. Vito.
Dato l’elevata presenza di Perkinsus nelle vongole della Laguna di Marano, evidenziata
dall’analisi di diversi campioni in questi ultimi anni, ci si è proposti di studiare la Perkinsosi
durante un ciclo di allevamento e di valutare l’influenza dei parametri temperatura e salinità ed
eventuali altri fattori ambientali sullo sviluppo della patologia.
MATERIALE E METODI
La Cooperativa ALMAR utilizza per l’ingrasso della vongola filippina due zone: una di 60
ettari nelle vicinanze del Porto di Lignano (zona A) e la seconda di 40 ettari in un’area limitata
verso il mare dal cordone litorale dell’isola di Marinetta (zona B).
228
Fiume Stella
Figura 1 - Laguna di Marano (UD). Zona A e zona B: aree di allevamento (ingrasso)
della vongola filippina (da Cooperativa ALMAR).
Figure 1 - Lagoon of Marano (UD – Italy). Zone A and zone B:
rearing areas of manila clam (Coop. ALMAR).
Le vongole, superata la taglia di 10 mm, vengono seminate direttamente sul fondale, con una
densità di 200 individui/m2, fino al raggiungimento della taglia commerciale (> 25 mm).
L’ingrasso viene fatto su di un substrato di matrice sabbioso-fangosa. Per ciascuna fase di
allevamento (preparazione terreno di semina, semina, protezione mediante stesura di reti in
materiale plastico, pulizia e raccolta) vengono utilizzati sistemi meccanizzati. Il seme prodotto
nello schiuditoio della ALMAR o acquisito sul mercato nazionale e/o estero, viene reimmerso
per l’ingrasso due volte l’anno: in primavera ed in estate.
La ricerca è stata condotta dal 4 dicembre 2002 al 25 marzo 2003 (fase di preingrasso) e dal
7 maggio 2003 al 19 ottobre 2004 (fase di ingrasso). La scelta delle zone di ricerca e del
periodo è stata suggerita dalla normale routine d’allevamento della Cooperativa. Durante la
primavera (7 maggio 2003), leggermente in ritardo dato il prolungarsi di temperature
particolarmente rigide, sono state effettuate semine nelle due zone. Il materiale di semina era
di origine locale (schiuditoio della Cooperativa).
Mensilmente venivano effettuati campionamenti nelle due aree di ingrasso:
- Zona A - Porto Lignano: substrato con componente sabbiosa del 20% (resto
fangoso), area fortemente influenzata dalla vivificazione marina attraverso la bocca
di Porto Lignano e dall’immissione di acqua dolce dai fiumi sfocianti a Nord della
Laguna di Marano;
- Zona B - Isola di Marinetta: substrato con componente sabbiosa del 10%, area meno
esposta ai flussi idrici, essendo protetta dal cordone litorale, e caratterizzata da bassi
fondali emergenti durante i periodi di bassa marea.
229
Contemporaneamente al prelievo dei campioni sono stati raccolti dati ed informazioni
riguardanti caratteristiche fisiche e meteorologiche: temperatura, salinità, condizioni meteo e
stato di marea.
Ogni campione era costituito da 50-55 soggetti. Appena raccolti venivano portati al
Laboratorio Patologia Molluschi dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie di
Basaldella di Campoformido (UD) per essere sottoposti ai seguenti accertamenti:
- misurazione di lunghezza e peso di ogni soggetto/campione;
- esami istologici normalmente condotti su 25-30 soggetti/campione
- esami colturali quantitativi in Ray Fluid Thioglicollate Medium (RFTM) sul mollusco
in toto, 25 soggetti/campione.
L’esame istologico è stato effettuato secondo le normali procedure istologiche (fissazione in
fissativo di Carson, processazione, inclusione in paraffina, taglio, colorazione EmatossilinaEosina, lettura al microscopio ottico). Questa analisi fornisce informazioni riguardanti la
reazione dei tessuti, la distribuzione dei trofozoiti di Perkinsus e la presenza di altre forme
parassitarie. Non fornisce però dati quantitativi e non è abbastanza sensibile per evidenziare
gli stati iniziali dell’infezione.
L’esame colturale quantitativo è stato condotto mediante coltura della polpa del mollusco in
RFTM. Con questa tecnica tutti i parassiti nei diversi stadi di maturazione aumentano di
volume e diventano più facilmente visibili ed identificabili e non si ha perdita di parassiti
eventualmente presenti nei tessuti. L’intero corpo del mollusco, dopo essere stato prelevato
dalla conchiglia, viene asciugato su carta assorbente per rimuovere il liquido intervalvare e
pesato. Successivamente il mollusco viene sminuzzato e posto ad incubare in 20 ml di
Tioglicolato per 4-5 giorni al buio a temperatura ambiente. Si procede in seguito alla
centrifugazione a 2500 rpm per 10 minuti e all’eliminazione del surnatante. Per la lisi, il
tessuto è sospeso in 20 ml di una soluzione 2M di NaOH ed incubato a bagnomaria a 60°C per
1-3 ore. Dopo centrifugazione a 2500 rpm per 10 minuti, rimosso il surnatante, si effettuano 5
lavaggi in 10 ml di acqua distillata, con successive centrifugazioni, a cui fa seguito
l’eliminazione del surnatante. Quindi 100 µl di sedimento diluito in 1 ml di acqua distillata,
sono posti su filtro Millipore con porosità 0,22 µm, prima di procedere alla colorazione (1 ml
di soluzione di Lugol al 20%) ed alla conta dei parassiti presenti mediante microscopio ottico.
Se il numero dei parassiti risulta elevato, si procede alla diluizione fino al raggiungimento di
una lettura ottimale. Al termine del conteggio si moltiplica il numero delle spore trovato per
10 (fattore di diluizione standard) e per l’eventuale altra diluizione apportata (n° spore totale) e
si divide per il peso della polpa dell’animale (g) in modo da esprimere il n° spore/g.
La differenza di positività per l’infezione da Perkinsus nei due anni di indagine è stata
valutata tramite il test esatto di Fisher. Il numero di spore/g è stato trasformato in logaritmo
naturale ([LN (x+1)] al fine di tendere alla normalità della distribuzione e poter utilizzare
strumenti statistici parametrici. Le eventuali correlazioni fra il numero di spore/g e le variabili
temperatura, salinità, lunghezza e peso del mitilo sono state valutate tramite il coefficiente di
correlazione r di Pearson. Il software utilizzato è stato SPSS per Windows, versione 12.01.
RISULTATI
Temperatura dell’acqua
Nella Zona A la temperatura è risultata compresa tra 3,0°C e 29,5°C; nella Zona B tra 4,0°C
e 30,5C°. L’ampia oscillazione è dovuta ad un ambiente poco profondo. Durante il 2003 si è
avuto un periodo caldo molto lungo e privo di precipitazioni (giugno-settembre) (Tabella 1).
230
Salinità
Nella Zona A i valori sono risultati compresi tra 14,8‰ e 33,3‰; nella zona B tra 21,3‰ e
35,0‰. Mediamente valori maggiori sono stati riscontrati nella Zona B. Come riportato
precedentemente questa zona è più protetta, con ricambio idrico più lento e meno condizionato
dai corsi d’acqua che sfociano in laguna (Tabella 1).
Data
Ora
ZONA A
Salinità
T °C
‰
ZONA B
Salinità
T °C
‰
07/05/03
06/06/03
04/07/03
07/08/03
02/09/03
15/10/03
07/11/03
09/12/03
07/01/04
04/02/04
16/03/04
21/04/04
18/05/04
23/06/04
20/07/04
23/08/04
19/09/04
19/10/04
9,30
7,35
9,45
14,45
15,30
16,00
15,00
14,00
16,00
16,00
11,00
9,00
7,00
8,00
17,00
8,45
17,30
15,20
20,5
24,0
26,0
29,5
24,0
16,5
12,0
11,0
3,0
7,0
12,0
15,0
19,5
21,0
27,5
23,0
20,5
16,0
21,0
25,0
25,0
30,5
24,0
17,0
12,0
11,5
4,0
7,5
12,0
15,0
18,5
22,0
30,0
24,0
23,0
16,0
18,0
24,6
26,5
33,3
25,9
27,5
21,3
16,0
15,4
24,4
14,8
19,3
19,1
15,6
24,4
24,2
19,5
26,1
28,9
29,6
32,8
35,0
32,5
32,9
29,1
22,5
24,2
24,4
21,3
27,2
25,5
29,1
29,5
32,5
30,8
28,8
Condizioni meteo
Marea
sereno
sereno
poco nuvoloso
quasi sereno
sereno
nuvoloso\bora
nuvoloso\bora
sereno
nuvoloso\calma
poco nuvoloso\nebbia
sereno
sereno
sereno
sereno
sereno
sereno/tramontana
sereno
molto nuvoloso
crescente
crescente
crescente
crescente
crescente
calante
calante
calante
calante
crescente
calante
crescente
crescente
crescente
calante
crescente
calante
calante
Tabella 1 - Caratteristiche fisiche e meteo delle zone di sperimentazione.
Table 1 - Physical and meteorological characteristics of experimental area.
Biometrie
Alla fine della sperimentazione le vongole della zona A sono risultate avere un peso medio
di 7,7 g e una lunghezza media di 32,2 mm, quelle della zona B, 8,4 g e 31,5 mm. Durante il
primo anno, i soggetti immessi in primavera hanno presentato una variazione sia in peso sia in
lunghezza tra le due zone (A-B); a fine ricerca i valori sono risultati molto simili (Tabelle 2 e
3; Grafici 1 e 2).
Stato sanitario
Esame colturale quantitativo
Perkinsus sp. è stato trovato in molti soggetti esaminati: 76-96%. Il numero di spore per
soggetto è variato tra 0 e 127.000; quello delle spore/g tra 0 e 1.336.842. Il valore medio delle
spore/g si è collocato tra 7.006 (febbraio 2003) e 123.755 (dicembre 2002).
231
Data
25.02.03
25.03.03
07.05.03
06.06.03
04.07.03
07.08.03
02.09.03
15.10.03
07.11.03
09.12.03
07.01.04
04.02.04
16.03.04
21.04.04
18.05.04
23.06.04
20.07.04
23.08.04
19.09.04
19.10.04
Min
0,063
0,050
0,069
0,363
0,329
0,192
0,548
0,544
0,526
0,676
0,418
0,305
0,332
0,657
1,363
3,073
3,493
5,400
7,014
4,527
Peso totale (g)
Max
Media
0,102
0,080
0,128
0,087
0,852
0,269
1,131
0,645
1,469
0,713
1,217
0,601
2,044
1,041
2,830
1,250
2,416
1,107
1,905
1,259
1,891
0,994
3,042
1,122
3,587
1,490
6,499
2,261
4,419
2,773
6,001
4,457
11,696
6,785
10,827
7,305
18,025
10,053
11,697
7,718
D.S.
0,010374
0,018039
0,186875
0,214749
0,299493
0,258199
0,362508
0,555259
0,535887
0,380838
0,407943
0,610232
0,828492
1,169679
0,860380
0,941333
2,172489
1,507214
2,840287
1,655501
Min
5,2
6,1
6,9
12,0
11,2
0,9
14,0
13,3
13,0
14,0
12,0
10,8
11,0
14,4
18,0
22,7
24,5
29,2
31,2
26,3
Lunghezza totale (mm)
Max
Media
D.S.
8,0
6,7
0,576715
9,1
7,3
0,687992
16,9
10,3
2,538536
17,5
14,5
1,719671
23,0
15,1
2,708277
17,5
13,0
4,027336
20,5
16,7
1,766796
23,2
17,2
2,538129
21,5
16,4
2,534745
21,0
17,5
1,865226
20,7
16,0
2,302157
25,0
16,6
3,225249
25,0
18,0
3,746296
29,5
21,0
3,230542
26,6
22,7
2,307907
30,0
26,6
2,065446
36,0
30,8
3,086136
35,4
31,7
1,821172
40,8
34,7
2,589080
35,6
32,2
2,090255
Tabella 2 - Caratteristiche peso medio e lunghezza media delle vongole nella Zona A.
Table 2 - Mean weight and length of manila clam (zone A).
Data
25.02.03
25.03.03
07.05.04
06.06.03
04.07.03
07.08.03
02.09.03
15.10.03
07.11.03
09.12.03
07.01.04
04.02.04
16.03.04
21.04.04
18.05.04
23.06.04
20.07.04
23.08.04
19.09.04
19.10.04
Min
0,063
0,050
0,082
0,248
0,419
0,954
1,527
1,621
1,726
2,107
1,787
2,606
1,869
3,322
3,914
4,471
4,871
4,650
6,927
5,227
Peso totale (g)
Max
Media
0,102
0,080
0,128
0,087
0,580
0,271
1,320
0,555
2,114
1,174
3,900
2,098
3,476
2,439
5,122
2,749
5,392
3,675
6,061
3,935
6,868
3,952
8,105
4,745
7,493
4,582
9,375
5,492
8,874
6,065
11,727
7,524
11,864
8,385
12,106
7,348
12,485
8,940
12,199
8,400
D.S.
0,010374
0,018039
0,136191
0,279085
0,425191
0,646654
0,617749
0,802605
1,018407
1,180776
1,330368
1,405334
1,453167
1,565486
1,553855
1,844045
1,806065
1,896967
1,380920
1,695898
Min
5,2
6,1
7,0
10,3
12,5
16,7
18,5
19,0
19,0
19,0
18,7
21,8
20,0
23,3
24,0
24,8
26,8
25,5
30,0
26,0
Lunghezza totale (mm)
Max
Media
D.S.
8,0
6,7
0,576715
9,1
7,3
0,687992
14,0
10,5
2,182712
18,4
13,3
2,306426
24,0
17,3
2,917904
27,0
20,9
2,222971
24,5
21,2
1,807365
28,5
22,7
2,178164
30,4
24,5
2,688754
30,0
24,8
2,854383
30,4
24,5
3,097757
31,0
26,8
2,612949
31,3
26,0
2,735282
34,0
27,7
2,823750
32,6
28,4
2,606613
37,0
30,8
2,910624
36,5
31,4
2,270154
35,1
30,5
2,319001
35,7
32,5
1,805519
36,9
31,5
2,415802
Tabella 3 - Caratteristiche peso medio e lunghezza media delle vongole nella Zona B.
Table 3 - Mean weight and length of manila clam (zone B).
232
Grafici 1-2 - Peso medio e lunghezza media delle vongole nelle zone A e B.
Graphics 1-2 -Mean weight and length of manila clam (zones A and B).
233
07.05.03
06.06.03
04.07.03
07.08.03
02.09.03
15.10.03
07.11.03
09.12.03
07.01.04
04.02.04
16.03.04
21.04.04
18.05.04
23.06.04
20.07.04
23.08.04
19.09.04
19.10.04
04.12.02
09.01.03
25.02.03
25.03.03
Data
0,628
0,812
1,522
1,113
1,256
2,187
2,150
2,188
1,800
0,043
0,072
0,151
0,249
0,483
0,419
0,857
0,942
0,688
0,494
0,120
0,405
0,221
0,017
0,328
0,433
0,027
0,072
0,235
0,057
0,105
0,190
0,003
0,512
0,028
0,006
0,629
0,013
0,002
0,085
0,110
0,012
0,102
0,136
Max
0,039
Min
234
1,219
1,340
1,329
1,174
0,837
0,589
0,588
0,365
0,208
0,201
0,206
0,238
0,234
0,209
0,097
0,100
0,118
0,049
0,014
0,007
0,061
0,065
Media
Peso polpa (g)
1000
300
50
200
40
70
70
40
0
0
50
100
70
90
0
0
0
0
0
0
0
0
Min
540
127000
161000
1320000
137000
174000
510000
148000
61000
50000
32000
121000
61000
115000
259000
104000
142000
51000
46000
37000
6700
Media
30560
113321
32470
27168
46256
22474
13959
5411
4338
16136
16889
17511
46854
22173
17816
4891
3902
2930
INGRASSO
284
40
6922
6158
34421,2
14806,2
10465,7
8179,8
29527,5
18980,3
27634,4
74125,6
27007,2
31281,5
11396,3
10528,2
8384,0
1336,7
105,2
25328,3
9136,9
D.S.
39667,4
272694,0
36187,6
41792,4
103713,6
PREINGRASSO
30000
Max
6000
36000
21000
11000
10000
10000
11000
1660
500
285
11000
8000
14000
17000
6000
160
30
80
10
20
170
820
Mediana
586
302
23
191
77
130
118
105
0
0
221
552
548
545
0
0
0
0
0
0
0
0
Min
Tabella 4- Peso polpa, n° spore totali e n° spore/g nelle vongole della Zona A
Table 4- Body weight, total spore and spores/g in manila clams reared (zone A)
0,245490
0,333607
0,306022
0,446734
0,216340
0,227088
0,288615
0,200797
0,122651
0,089238
0,061130
0,125442
0,112084
0,076755
0,056020
0,081917
0,051692
0,044160
0,004518
0,003234
0,025141
0,021099
D.S.
N° spore totali
147166
735376
83922
243356
478873
183850
110707
98591
244274
725490
281081
373376
1702127
622754
1302752
301369
308641
1275862
446666
90000
1336842
638297
Max
25099
78484
27271
28406
54441
35623
22534
13805
34247
79992
79235
71532
219647
114803
183959
38457
31934
64534
19102
7006
80947
123755
Media
N° spore/g
33891,5
169871,3
29254,5
50269,9
104958,3
45962,9
23617,3
23159,3
60195,1
161694,2
86107,0
91698,7
416322,6
150148,1
303453,7
76109,3
80799,6
253717,5
89083,1
17537,5
268204,5
196682,6
D.S.
8720
29190
10971
11088
11655
22106
19710
5725
1937
1914
64024
28753
62330
78703
65217
1875
350
3478
1176
3330
4117
976
Mediana
07.05.03
06.06.03
04.07.03
07.08.03
02.09.03
15.10.03
07.11.03
09.12.03
07.01.04
04.02.04
16.03.04
21.04.04
18.05.04
23.06.04
20.07.04
23.08.04
19.09.04
19.10.04
04.12.02
09.01.03
25.02.03
25.03.03
Data
1,164
0,893
1,437
1,270
1,750
1,832
1,668
2,176
1,538
1,631
1,555
1,672
0,311
0,349
0,474
0,437
0,682
0,499
0,692
0,697
0,483
0,730
0,630
0,571
0,183
0,896
0,605
0,160
0,315
0,295
0,226
0,229
0,039
0,028
0,006
0,024
0,013
0,002
0,107
0,110
0,012
0,014
0,136
Max
0,039
Min
235
1,053
0,990
0,949
1,107
1,279
0,981
1,108
1,029
0,868
0,761
0,561
0,692
0,520
0,395
0,363
0,133
0,088
0,054
0,014
0,007
0,061
0,065
Media
Peso polpa (g)
4000
1000
2000
350
600
1000
3000
3000
620
1000
1000
5000
510
680
40
0
0
20
0
0
0
0
Min
1660000
2350000
3000000
720000
700000
1131000
556000
800000
686000
1035000
828000
780000
730000
1450000
376000
97000
54000
54000
6700
540
Media
307680
519280
805560
198028
144464
204560
166680
301400
251776
323200
279600
211520
214040
251067
63709
13537
2642
4856
INGRASSO
284
40
6922
6158
9136,9
D.S.
475325,8
614694,9
703538,1
208970,8
147444,5
258655,5
155126,2
235092,4
275106,3
241057,0
260400,5
226702,5
233247,4
307310,9
102278,7
23150,4
10722,2
12828,0
1336,7
105,2
25328,3
PREINGRASSO
127000
30000
Max
261
993
3996
225000
115000
366
118000
2607
899
151000
790000
2722
117000
131000
633
1244
1730
346000
312000
2053
303000
158000
1847
10703
121
1497
5000
156000
64000
0
130000
0
40
0
10
1110
0
20
266
0
170
130
0
Min
820
Mediana
Tabella 5 - Peso polpa, n° spore totali e n° spore/g nelle vongole della Zona B.
Table 5 - Body weight, total spore and spores/g in manila clams reared (zone B).
0,246753
0,173150
0,254659
0,215361
0,389407
0,303388
0,314415
0,343685
0,236302
0,262071
0,183298
0,216374
0,146801
0,124441
0,109213
0,061583
0,054521
0,027675
0,004518
0,003234
0,025141
0,021099
D.S.
N° spore totali
1830209
2445369
2522756
482686
453661
767299
538035
713429
1223628
1470170
1566666
1287128
1533613
3273137
1089855
836206
964285
2133333
446666
90000
1336842
638297
Max
282540
510310
783390
169728
124575
206683
156209
266029
287842
434879
525368
319135
405858
647611
176168
114769
43794
127788
19102
7006
80947
123755
Media
N° spore/g
442299,6
658996,8
626157,4
167387,7
113637,1
213002,0
146986,3
216673,6
333757,6
368258,7
496537,3
369706,7
455538,7
692113,6
291173,9
206505,8
192275,7
434032,8
89083,1
17537,5
268204,5
196682,6
D.S.
147625
97077
794573
111111
105054
172661
122816
300752
193390
359550
529147
84544
307304
493670
15723
10620
1020
2727
1176
3330
4117
976
Mediana
Zona A - Perkinsus sp. è stato rinvenuto in quasi tutti i soggetti esaminati: 76-100%. Il
numero di spore per soggetto è variato tra 0 e 1.320.000; quello delle spore/g tra 0 e
1.702.127. Il valore medio spore/g è collocato tra 13.805 (marzo 2004) e 219.647 (ottobre
2003) (Tabella 4; Grafico 3).
Zona B - Perkinsus sp. è stato rinvenuto in quasi tutti i soggetti esaminati: 76-100%. Il
numero di spore per soggetto è variato tra 0 e 3.000.000; quello delle spore/g tra 0 e
3.273.137. Il valore medio di spore/g si è collocato tra 43.794 (giugno 2003) e 783.390 (agosto
2004) (Tabella 5; Grafico 3).
900000
800000
700000
n° spore/g
600000
500000
zona A n° spore/g
zona B n° spore/g
400000
300000
200000
100000
7.
05
.0
3
6.
06
.0
3
4.
07
.0
3
7.
08
.0
3
2.
09
.0
3
15
.1
0.
03
7.
11
.0
3
9.
12
.0
3
7.
01
.0
4
4.
02
.0
4
16
.0
3.
04
21
.0
4.
04
18
.0
5.
04
23
.0
6.
04
20
.0
7.
04
23
.0
8.
04
19
.0
9.
04
19
.1
0.
04
0
Grafico 3 - N° spore/g presenti nelle vongole delle zone A-B.
Graphic 3 - Spores/g in manila clam (zones A and B).
Esame istologico
L’esame istologico non è stato condotto su un numero omogeneo di soggetti per campione.
Complessivamente, sono risultati positivi nella Zona A il 39,1% dei soggetti esaminati, nella
Zona B il 57,82% (Tabella 6).
Come per l’esame colturale quantitativo, anche per l’esame istologico i soggetti allevati
nella Zona B risultavano maggiormente infestati da Perkinsus sp. rispetto a quelli della Zona
A (Tabella 7).
Analisi statistica
Le medie di spore/g rilevate in generale nei due anni di indagine non sono risultate
statisticamente significative.
Le vongole allevate su terreno fangoso hanno mostrato una media di spore
significativamente più elevata di quelle coltivate su terreno sabbioso.
In generale i mesi tardo primaverili-estivi (maggio, giugno e luglio) hanno mostrato una
media di spore/g significativamente inferiore rispetto ai mesi più freddi (da settembre a
gennaio).
236
Data
04.12.02
09.01.03
25.02.03
25.03.03
07.05.03
06.06.03
04.07.03
07.08.03
15.10.03
07.11.03
09.12.03
07.01.04
04.02.04
16.03.04
21.04.04
18.05.04
23.06.04
20.07.04
23.08.04
19.09.04
19.10.04
Zona A %
Zona B %
56,0
48,0
4,0
4,0
preingrasso primavera
36,0
36,0
40,0
36,0
0,0
75,0
28,5
50,0
50,0
62,5
42,8
58,3
33,3
60,0
40,0
37,5
28,0
24,0
24,0
52,0
56,0
72,0
68,0
52,0
73,3
92,0
88,0
56,0
64,0
84,0
90,6
80,0
64,0
Tabella 6 - Esame istologico: % soggetti positivi per Perkinsus sp.
Table 6 - Histological investigation: Perkinsus sp. positive samples (%).
Data
04.12.02
09.01.03
25.02.03
25.03.03
07.05.03
06.06.03
04.07.03
07.08.03
02.09.03
15.10.03
07.11.03
09.12.03
07.01.04
04.02.04
16.03.04
21.04.04
18.05.04
23.06.04
20.07.04
23.08.04
19.09.04
19.10.04
Zona A %
Zona B %
92,0
96,0
88,0
76,0
preingrasso primavera
84,0
76,0
96,0
96,0
100,0
100,0
100,0
100,0
95,8
96,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
76,0
96,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
Tabella 7 - Esame colturale quantitativo: % soggetti positivi per Perkinsus sp.
Table 7 - Cultural investigation: Perkinsus sp. positive samples (%).
237
Correlazioni
Nella tabella seguente (Tabella 8) vengono riportati i coefficienti di correlazione fra il
numero di spore e le variabili peso polpa, peso totale e lunghezza della vongola e fra il numero
di spore, temperatura e salinità dell’acqua al momento del prelievo. Benché alcune
correlazioni siano significative, i valori dei coefficienti sono bassi, indicando una mancanza di
relazione lineare fra il numero di spore conteggiate e le variabili esaminate.
variabili
Peso polpa
Peso totale (g)
Lunghezza (mm)
Temperatura
Salinità
Zona A
.059
.075
.093*
.035
.074
Zona B
.212**
.282**
.356**
-.209**
-.097*
* La correlazione è significativa al livello 0,05.
** La correlazione è significativa al livello 0,01.
Tabella 8 – Coefficienti di correlazione tra il numero di spore e le diverse variabili.
Table 8 – Correlation coefficients between spores numbers and parameters.
250000
35
30
°C
150000
20
15
100000
n° spore/g
200000
25
Temperatura
zona A n° spore/g
10
50000
5
19.10.04
19.09.04
23.08.04
20.07.04
23.06.04
18.05.04
21.04.04
16.03.04
4.02.04
7.01.04
9.12.03
7.11.03
2.09.03
15.10.03
7.08.03
4.07.03
6.06.03
0
7.05.03
0
250000
35
30
15
100000
Salinità
zona A n° spore/g
10
50000
5
19.10.04
19.09.04
23.08.04
20.07.04
23.06.04
18.05.04
21.04.04
16.03.04
4.02.04
7.01.04
9.12.03
7.11.03
15.10.03
2.09.03
7.08.03
4.07.03
0
6.06.03
0
7.05.03
salinità %
150000
20
n° spore/g
200000
25
Grafici 4-5 - Temperatura, salinità e numero di spore/g in vongole relative alla zona A.
Graphics 4-5 - Temperature, salinity and spores/g (zone A).
238
35
900000
30
800000
700000
600000
20
500000
400000
15
300000
10
40
900000
35
800000
700000
30
Salinità %
600000
25
500000
400000
20
15
300000
10
Salinità
zona B n° spore/g
19.10.04
19.09.04
23.08.04
20.07.04
23.06.04
18.05.04
21.04.04
16.03.04
4.02.04
7.01.04
9.12.03
7.11.03
15.10.03
2.09.03
0
7.08.03
0
4.07.03
200000
100000
6.06.03
5
7.05.03
Temperatura
zona B n° spore/g
19.10.04
19.09.04
23.08.04
20.07.04
23.06.04
18.05.04
21.04.04
4.02.04
16.03.04
7.01.04
9.12.03
7.11.03
2.09.03
15.10.03
7.08.03
0
4.07.03
0
6.06.03
200000
100000
7.05.03
5
n° spore/g
°C
25
n° spore/g
Grafici 6-7 - Temperatura, salinità e numero di spore/g in vongole relative alla zona B.
Graphics 6-7 - Temperature, salinity and spores/g (zone B).
La ricerca condotta fotografa quanto avvenuto nei due anni in esame in normali zone di
allevamento di vongola filippina della Laguna di Marano. Zona di allevamento, stagionalità di
introduzione, seme preingrassato, densità di popolazione, ecc., sono quelle abituali e
compatibili con l’habitat.
Le condizioni ambientali e trofiche, molto simili nelle due zone, permettono di raggiungere
la taglia minima commerciale (25 mm) in circa 12 mesi dall’introduzione del seme, in circa 18
mesi, una taglia maggiore, commercialmente più remunerativa (<30 mm).
La temperatura e la salin ità osservate rispecchiano, in parte, quelle rilevate annualmente
nella zona; la variazione più significativa si è avuta nei valori della temperatura osservati nei
mesi di giugno-luglio 2003, superiori alla norma.
La Perkinsosi nelle zone oggetto di ricerca è presente nell’arco di tutto l’anno. I soggetti
sono infetti già dalla fase di preingrasso.
Mediamente la sua presenza tende a ridursi durante il periodo invernale-primaverile, per poi
crescere a partire dall’estate e raggiungere un picco durante fine estate-inizio autunno. Durante
239
il primo anno di allevamento, i mesi con il grado maggiore di infezione sono stati settembre
(Zona B) e ottobre (Zona A); nel secondo anno i mesi di agosto (Zona B) e settembre (Zona
A).
I soggetti allevati nella Zona B presentavano un grado di infezione statisticamente
significativo più elevato rispetto a quelli della Zona A.
Normalmente il grado di infezione aumenta con l’età: il numero medio di spore/g nei
soggetti del secondo anno è maggiore rispetto ai soggetti del primo anno. Dalla ricerca questo
non si evince.
Molti fattori possono condizionare la presenza e l’intensità della Perkinsosi. Molte
considerazioni concernenti l’epidemiologia hanno focalizzato delle responsabilità, per quanto
riguarda fattori esterni, nella temperatura e nella salinità.
In Europa, il maggior numero di informazioni si ha dall’allevamento e dalle prove in vitro
effettuate da ricercatori portoghesi e spagnoli su R. decussatus e R. philippinarum.
Presenza ed intensità diminuiscono con il decrescere della temperatura e della salinità,
mentre aumentano con l’accrescimento di questi parametri, entro determinati limiti, legati alla
specie allevata e alle esigenze del parassita.
Negli allevamenti spagnoli di R. decussatus si hanno segnalazioni di mortalità durante tutto
l’anno, maggiormente dalla primavera all’autunno, con due picchi: primavera-fine estate ed
inizio autunno, quando la temperatura dell’acqua è compresa tra 15-28°C (La Peyne &
Nickens, 2002; Villalba et al., 2005). Valori simili per la temperatura sono riportati da più
Autori, che hanno basato i loro studi su dati raccolti durante fenomeni di mortalità o sullo
studio in vitro del ciclo biologico del parassita (in particolare fase di sporulazione). Una
ricerca condotta da Cigarria et al. (1997) per valori di temperatura compresi tra 15-25°C,
sottolinea che la mortalità coincide con il verificarsi delle temperature più elevate. Ordas &
Figueras (1998) riportano che a temperature comprese tra 5-37°C è presente Perkinsus, con
valori ottimali tra 16-26°C. Casas et al. (2002) riportano valori compresi tra 15-32°C, con
intervallo ottimale tra 19-28°C. Da prove in vitro effettuate in Francia da Auzoux-Bordenave
et al. (1995), risulta che i valori ottimali siano compresi tra 24-28°C.
La temperatura osservata durante la sperimentazione era caratterizzata da un’ampia
oscillazione, dovuta all’ambiente poco profondo. Nei mesi (agosto-ottobre) in cui Perkinsus
era maggiormente infettante (numero spore/g), il valore della temperatura si collocava tra 16 e
24°C. Questi valori bene si inseriscono tra quelli riportati in letteratura (15-28°C) come
ottimali per la presenza del parassita. I valori riscontrati durante l’arco di un anno (3-30,5°C)
sono compatibili con la sopravvivenza della specie allevata (3-32°C in banchi naturali)
(Gosling, 2003) e le esigenze del parassita.
A differenza di quanto riportato da alcuni Autori (mortalità nelle vongole con temperature
superiori a 25°C), nella ricerca condotta nella Laguna di Marano non sono stati evidenziati
episodi di mortalità.
Poiché non sono state rilevate variazioni significative di temperatura tra le due zone, non si
ritiene che la temperatura sia la causa del diverso grado di infestazione da Perkinsus
riscontrato.
Per quanto riguarda la salinità, i vari Autori riportano valori compresi tra 15-40 ‰ (Ordas &
Figueras, 1998) e 25-35‰ (Auzoux-Bordenave et al., 1995; Casas et al., 2002). Casas et al.
(1999) riportano il valore 5‰ come limite al di sotto del quale si possono verificare casi di
mortalità nelle vongole. Gosling (2003) riporta come valori ottimali per la specie
R. philippinarum 13-35‰.
I valori di salinità riscontrati durante la sperimentazione variano a seconda delle zone:
mediamente si possono raggiungere valori minori nella zona A (14,8-33,3‰) rispetto alla zona
B (21,3-35,0‰), in quanto influenzata dall’apporto di acqua dolce dai fiumi che sfociano a
nord della laguna di Marano.
240
La zona B, inoltre, è più protetta, in quanto collocata a ridosso dell’isola della Marinetta
all’interno della laguna. Questo fa sì che il substrato su cui vengono allevate le vongole abbia
una composizione diversa: in particolare varia la presenza di sabbia, inferiore mediamente del
10-20% rispetto alla zona A.
La diversa salinità riscontrata tra le due zone e la diversa composizione del substrato
possono pertanto aver influenzato la variazione del grado di infestazione di Perkinsus.
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242
Parasitological monitoring of commercial native
bivalves from St. Gilla lagoon
(Sardinia, South Western Mediterranean)
Monitoraggio parassitologico di bivalvi autoctoni
di interesse commerciale della Laguna di S.ta Gilla
(Sardegna, Mediterraneo Sud-Occidentale)
Jacopo Culurgioni1, Valeria D’Amico1, Riccardo De Murtas1,
Giorgio Canestri Trotti2, Vincenza Figus1*
2
1
Dipartimento di Biologia Animale ed Ecologia, Viale Poetto 1 - 09126 Cagliari, Italy;
Dipartimento di Biologia Animale e dell’Uomo, Via Accademia Albertina 13 - 10123 Torino, Italy
______________________________
SUMMARY - Between July 2004 and July 2006, a total of 671 commercial bivalves, 399 Tapes (Ruditapes)
decussatus, 149 Cerastoderma glaucum and 123 Mytilus galloprovincialis, from St. Gilla lagoon (Sardinia, South
Western Mediterranean) were examined for protozoan and metazoan parasites. The results showed high total
prevalence of infections in both T. decussatus and C. glaucum (89.5% and 89.3% respectively). They both
presented the unicellular parasites belonging to the genera Perkinsus and Nematopsis. The carpet shells harboured
the higher number of metazoan parasites: the Digenea Bacciger bacciger, Lasiotocus longicystis and
Gymnophallus choledochus, the Turbellaria Paravortex cardii and an unidentified Nematoda larvae, whereas
C. glaucum harboured the Digenea Labratrema minimus and the unidentified Nematoda. On the other hand,
mussels harboured only one Digenea species (i.e. Proctoeces maculatus), one Turbellaria, P. cardii and the above
cited Nematoda larvae, all with low values of prevalence.
RIASSUNTO - Nel periodo compreso tra Luglio 2004 e Luglio 2006 sono stati esaminati 399 Tapes (Ruditapes)
decussatus, 149 Cerastoderma glaucum e 123 Mytilus galloprovincialis, tutti provenienti dalla Laguna di S.ta
Gilla (Sardegna, Mediterraneo Sud-Occidentale), per un totale di 671 esemplari. I risultati hanno evidenziato
un'alta prevalenza totale di infezioni sia in T. decussatus che in C. glaucum (89,5% e 89,3% rispettivamente).
Entrambe le specie inoltre presentano parassiti unicellulari appartenenti ai generi Perkinsus e Nematopsis. La
vongola verace ospita il maggior numero di parassiti metazoi: i digenei Bacciger bacciger, Lasiotocus longicystis
e Gymnophallus choledochus, il turbellare Paravortex cardii e larve di nematodi non identificate, mentre
C. glaucum ospita il digeneo Labratrema minimus e larve di nematodi non identificate. Diversamente, nei mitili
non sono stati individuati protozoi, ma una sola specie di Digenea (Proctoeces maculatus), una di Turbellaria
(P. cardii) e larve di nematodi riportabili a quelle riferite in T. decussatus e C. glaucum, tutti con bassa
prevalenza.
Key words: Parasite infections, Tapes (Ruditapes) decussatus, Cerastoderma glaucum, Mytilus galloprovincialis,
St. Gilla lagoon, Sardinia, Italy.
______________________________
* Corresponding Author: c/o Dipartimento di Biologia Animale ed Ecologia, Viale Poetto 1 - 09126 Cagliari,
Italy. Tel.: 070-6758057; Fax: 070-6758022; E-mail: [email protected].
243
INTRODUCTION
St. Gilla lagoon (Sardinia, South Western Mediterranean), the largest lagoon in South
Sardinia, is one of the most important brackish area of the whole region. Fishing and
aquaculture, actively followed within this area, represent an important share of the entire
fishing sector, but the frequent prohibitions of these practices due to organical pollution
make the resources unbalanced and discontinuous. These interruptions have negative
economic and occupational consequences.
Among the numerous native bivalve species living in this lagoon, Tapes (Ruditapes)
decussatus L. (Veneridae), Cerastoderma glaucum Poiret, 1789 (Cardiidae) and Mytilus
galloprovincialis L. (Mytilidae) are certainly the most valued and exploited. The first two
species live in beds diffused almost in the whole bottom of the lagoon, where they are fished
by traditional technics, while the third one is farmed in long lines situated in the “A” zone
(microbiologically safe water) of the lagoon. A second stock of M. galloprovincialis, not
commercially exploited, lives attached on wood structures named “lavorieri”.
Data concerning parasite infections of T. decussatus, C. glaucum and M. galloprovincialis
from St. Gilla have been previously reported by Figus et al. (2003; 2004a; 2004b; 2006).
The first aim of this study was to verify and analyze the parasite infections of the three
bivalve hosts, then to compare the current results with those previously recorded between
June 2002 and June 2004, in part showed in the above cited literature.
MATERIALS AND METHODS
Between July 2004 and July 2006, 399 T. decussatus, 149 C. glaucum and 123
M. galloprovincialis, 29 of which sampled from “lavorieri”, all of commercial size, were
examined for parasite infections. Within a few hours after sampling the specimens were
measured and opened. Sections (1 cm2) of mantle, gill and intestinal tissues were squashed
between glass slides and examined under a light microscope for unicellular parasites. Mantle
and gill fragments of the same specimens were also incubated in Fluid Thyoglicollate
Medium (Ray, 1952) and examined after 10 days for the presence of Perkinsus hypnospores.
Parts of digestive gland, visceral mass, gonads and foot were observed under a dissecting
stereomicroscope for metazoan parasites. These parasites were identified, counted and fixed
in 70% ethanol or AFA (Alcohol, Formalin and Acetic Acid).
Infection prevalence (P%) and its 95% confidence interval (CI) have been calculated. For
protozoan parasites mean density (MD) ± SE and abundance (A) ± SE (evaluated on the
basis of the mean number of parasites in 10 microscope fields at 400x per tissue sample). For
metazoan parasites mean intensity (MI) ± SE and abundance ± SE, have been determined
according to Bush et al. (1997). Statistical differences between current results and those
previously recorded have been determined by the Chi-square test.
RESULTS
As shown in Table 1, the total prevalence of infections in T. decussatus and in C. glaucum
resulted considerably higher (89.5% and 89.3% respectively) than those observed in
M. galloprovincialis (7.3%). Details by host are reported as follows.
244
245
S, S+ C
Proctoeces
maculatus
L
Nematoda larvae
M
I
0.3 (0-1.4)
13.3 (10.2-17.1)
0
0
1.8 (0.7-3.7)
32.3 (27.8-37.2)
20.3 (16.5-24.6)
30.8
1.8
31.6 (27.1-36.4)
73.2
81.7
83.2 (79.1-86.7)
89.5 (90.0-92.3)
P% (CI)
1.0
4.3 ± 0.7
---
---
3.5 ± 1.0
4.3 ± 0.5
n. e.
MI ± SE
3.3 ± 0.4
0.8 ± 0.3
10.7 ± 0.8
15.3 ± 1.9
MD± SE
0.003 ± 0.0
0.6 ± 0.1
---
---
0.1 ± 0.03
1.4 ± 0.2
n. e.
1.0 ± 0.2
0.02 ± 0.01
7.9 ± 1.4
12.5 ± 1.6
A ± SE
1.3 (0-4.9)
0
0
0.7 (0-3.8)
0
0
0
77.9
85.2
89.3 (83.0-93.7)
6.0
11.4
11.4 (6.9-17.8)
89.3 (83.0-93.7)
P% (CI)
1.0
---
---
n. e.
---
---
---
MI ± SE
3.9 ± 0.5
9.9 ± 1.1
1.0 ± 0.5
3.3 ± 0.6
MD± SE
0.01 ± 0.01
---
---
n. e.
---
---
---
3.0 ± 0.4
8.5 ± 1.0
0.1 ± 0.03
0.4 ± 0.1
A ± SE
Cerastoderma glaucum (149)
2.4 (0.3-7.1)
0.8 (0-4.6)
4.1 (1.2-9.4)
0
0
0
0
0
0
7.3 (3.4-13.6)
P% (CI)
2.0 ± 0.6
1.0
n. e.
---
---
---
---
MI ± SE
---
---
MD± SE
Tabella 1 - Infezioni parassitarie in bivalvi commerciali autoctoni della laguna di S.ta Gilla, da Luglio 2004 a Luglio 2006.
Legenda: HS = ipnospora; OC = oocisti; S = sporocisti; C = cercaria; MC = metacercaria; A = adulto; J =giovanile; L = larva.
I = intestino; Gi = branchie; Go = gonadi; VM = massa viscerale; F = piede; S = sifone; M = mantello; BV = vasi sanguigni; n.e. = non calcolabile.
0.05 ± 0.03
0.01 ± 0.01
n. e.
---
---
---
---
---
---
A ± SE
Mytilus galloprovincialis (123)
Table 1 - Parasitic infections of commercial native bivalves from St. Gilla Lagoon, from July 2004 to July 2006.
Legenda: HS = hypnospore; OC = oocyst; S = sporocyst; C = cercaria; MC = metacercaria; A = adult; J = juvenile; L = larva.
I = intestine; Gi = gills; Go = gonads; VM = visceral mass; F = foot; S = syphon; M = mantle; BV = blood vessels; n.e. = not evaluable.
A, J
Paravortex cardii
Turbellaria
VM, M
S, S+ C
Labratrema minimus
VM, M,
BV
VM, M
S, MC
Go, VM
I
Gi
tot
I
Gi
tot
Site
F, S
S, S+ C
OC
HS
Stage
MC
Lasiotocus
longicystis
Gymnophallus
choledochus
Bacciger bacciger
Digenea
Nematopsis
Apicomplexa
Perkinsus
Dinoflagellata
Parasites
Tapes decussatus (399)
Tapes decussatus
The prevalence of Perkinsus sp. Levine, 1978 infection was 83.2%, with a mean density in
gill samples examined of 15.3 hypnospores per 10 microscope field at 400x. The elements of
this unicellular parasite, which has been recently shown to be closely related to
Dinoflagellata (Siddall et al., 1997; Bushek et al., 2002), were recognized by the round
shape and the diameter of 15.1-60.0 µm after Ray’s technique.
Isolated and irregularly distributed oval oocysts of Nematopsis sp. 1 Schneider, 1892
(Apicomplexa, Eugregarinorida) measuring 8.3-14.2 x 5.6-8.1 µm, were observed in 31.6%
of 399 carpet shells examined, with a mean density in intestinal tissues of 3.3 per 10
microscope fields at 400x.
Among Digenea, sporocysts and cercariae of Bacciger bacciger (Rudolphi, 1819) Nicoll,
1914 (Fellodistomidae) were detected in 81 (P% = 20.3) specimens of T. decussatus. The
different development of his larval stages, heavily infecting the gonads and/or the whole
visceral mass, and the high number of elements irregularly distributed in host's organs, didn’t
allow to evaluate the intensity of infection.
Encapsuled metacercariae of Lasiotocus longicystis Bartoli, 1965 (Monorchiidae), were
present embedded in the foot and siphons epithelia of 32.3% of the carpet shells analyzed.
This infection appeared with a mean intensity of 4.3.
Non-encapsuled metacercariae of Gymnophallus choledochus Odhner, 1900
(Gymnophallidae) free in the visceral mass and in the mantle cavity of 7 (P% = 1.8)
T. decussatus were observed with a mean intensity of 3.5.
Adults and juvenile stages of the Turbellaria Paravortex cardii Hallez, 1909 (Graffillidae)
were observed in the intestinal lumen with a prevalence of 13.3% and mean intensity of 4.3.
One specimen of an unidentified Nematoda, associated to the epithelium of one carpet
shell’s mantle, was detected.
Cerastoderma glaucum
The prevalence of Perkinsus sp. was 11.4%, with mean density of 3.3 evalued in gill tissue.
Diameter of its hypnospores ranged between 16.1 and 45.9 µm.
Nematopsis sp. 2 oocysts, morphologically different and slightly smaller than those found
in T. decussatus, isolated or aggregated in clusters, containing from 2 to numerous elements,
were observed. This infection was present in 89.3% of the examined cockles with a mean
density of 9.9 in intestinal samples.
Only one out of 149 C. glaucum examined harboured a massive infection by sporocysts
and cercariae of the Bucephalidae Labratrema minimus (Stossich, 1887) Maillard, 1975
invading the visceral mass and the pallial cavity. Intensity of this heavy infection could not
be exactly determined.
The specimens of observed Nematoda larvae seemed, by morphological evidence, to
belong to the same species of that observed in T. decussatus. The larvae were detected on the
mantle of 1.3% of cockles.
Mytilus galloprovincialis
The mussels were infected by the Fellodistomidae Proctoeces maculatus (Loos, 1901)
Odhner, 1911 (syn. Cercaria tenuans) with a prevalence of 4.1%. Their gonads, the mantle
and the blood vessels were heavily infected by bright orange sporocysts and tailless
cercariae. In some case the tissues of the host appeared destroyed showing the aspect named
"orange sickness". The high number of parasites didn't allow to estimate the mean intensity,
as seen in T. decussatus and in C. glaucum for the other massive infections by Digenea.
246
Figure 1 – Perkinsus sp. hypnospores in the gill tissue of Tapes (Riditapes) decussatus.
Figure 2 – Nematopsis sp. 1 oocysts in the intestine of Tapes (Ruditapes) decussatus.
Figure 3 – Nematopsis sp. 2 oocysts in the gill tissue of Cerastoderma glaucum.
Figura 1 – Ipnospore di Perkinsus sp. in tessuto branchiale di Tapes (Ruditapes) decussatus.
Figura 2 – Oocisti di Nematopsis sp. 1 nell’intestino di Tapes (Ruditapes) decussatus.
Figura 3 – Oocisti di Nematopsis sp. 2 in tessuto branchiale di Cerastoderma glaucum.
247
In 3 mussels, an unidentified Nematoda by morphological evidence belonging to the same
species of the larvae observed in T. decussatus and C. glaucum was found. Only 1 mussel
harboured in the intestine the Turbellaria P. cardii.
DISCUSSION AND CONCLUSIONS
The absence of Perkinsus sp. and Nematopsis sp. infections in examined mussels
determined the different values of total parasite prevalences between M. galloprovincialis
and the other two monitored bivalves. Otherwise these infections in T. decussatus and in
C. glaucum reached high prevalences.
In detail, the prevalence of Perkinsus sp. was higher in T. decussatus than in C. glaucum.
This significative difference (χ2 = 238.73) may be due to a better immune response of
cockles to parasite or to a greater specificity of Perkinsus sp. for T. decussatus.
On the contrary, Nematopsis infection was higher in cockles than in carpet shells, with the
more significative differences in gill tissue than in intestinal tissue (respectively χ2 = 404.76;
χ2 = 95.65). These dissimilarities suggest that Nematopsis sp. 1 infecting T. decussatus,
morphologically and dimensionally different from the congeneric one Nematopsis sp. 2
infecting C. glaucum, may be strongly organ-specific and that the carpet shell may have a
better resistance to parasites of this genus.
With regard to Digenea, none of the detected species was common to the three monitored
bivalves.
The infection of B. bacciger has been already reported in T. decussatus and Paphia (Tapes)
aurea from St. Gilla lagoon (Figus et al., 2002a; 2002b; 2004b). Sporocyst and cercariae of
this parasite were observed in P. aurea from Gulf of Naples (Palombi, 1933; 1934) and from
the Adriatic Sea (Polenta & Froglia, 1997; Orecchia et al., 1998). Metacercariae occur in
Copepoda (Palombi, 1934) while the adults infect teleosts (Orecchia et al., 1988; Radujković
et al., 1989). Adults of B. bacciger were also found in Atherina boyeri from St. Gilla lagoon,
with a prevalence of 10.0% (Figus et al., 2002c).
L. longicystis metacercariae were already been reported in T. decussatus and in other
Veneridae from St. Gilla lagoon (Figus et al., 2004b). This parasite was detected and
described for the first time by Bartoli (1965) in T. decussatus and in Tapes aureus from
Camargue Sea (France), with a prevalence higher than those found in specimens examined in
this work, respectively of 47% and 32.3%.
Sporocysts and metacercariae of G. choledochus were previously detected in C. glaucum
from Marceddì lagoon and from St. Gilla lagoon (Figus et al., 2004a; 2004b). The
occurrence of its larval stages was detected in Cerastoderma spp. from Mediterranean sea by
Loos-Frank (1969) as reported by Lauckner (1983).
Larval forms of L. minimus are reported for the first time in C. glaucum from St. Gilla
lagoon while their presence was already observed in specimens from Marceddì lagoon
(Figus et al., 2004a). Palombi (1934) observed this parasite as Bucephalopsis haimeana in T.
decussatus and T. aureus from Gulf of Naples. Recently, this parasite was detected during a
monitoring study in one specimen of P. aurea from St. Gilla lagoon (Culurgioni, 2006).
Larval stages of P. maculatus (syn. Cercaria tenuans) have been reported in
M. galloprovincialis from Venice lagoon (Munford et al., 1981; Sigovini et al., 1981;
Brisinello et al., 1986) and from the Gulf of Trieste by D’Alba et al. (1986). This is the first
record of this parasite in M. galloprovincialis from Sardinian waters. Furthermore, adults of
P. maculatus were recently detected in the intestine of one specimen of Conger conger from
Gulf of Cagliari (Sardinia).
248
249
S, S+ C
Proctoeces
maculatus
0.9 (0-3.3)
L
Nematoda larvae
0.3 (0-1.4)
13.3 (10.2-17.1)
0
0
1.8 (0.7-3.7)
32.3 (27.8-37.2)
20.3 (16.5-24.6)
31.6 (27.1-36.4)
83.2 (79.1-86.7)
0.26
2.17
---
---
2.54
69.17
17.28
110.3
5
0.75
3.35
χ2
0
0.9 (0-5.2)
0
0
8.4 (3.9-15.5)
0
0
81.3 (72.5-88.1)
28.0 (19.9-37.6)
84.1 (75.6-90.4)
2002-2004
(223)
1.3 (0-4.9)
0
0
0.7 (0-3.8)
0
0
0
89.3 (83.0-93.7)
11.4 (6.9-17.8)
89.3 (83.0-93.7)
2004-2006
(399)
P% (CI)
0.23
0.03
---
0.03
10.63
---
---
2.63
10.41
1.05
χ2
0.8 (0-4.6)
2.4 (0.3-7.1)
1.24
4.1 (1.2-9.4)
0
0
---
Tabella 2 - Infezioni parassitarie in bivalvi commerciali autoctoni della laguna di S.ta Gilla. Confronto tra le prevalenze registrate in due bienni successivi.
Legenda: HS = ipnospora; OC = oocisti; S = sporocisti; C = cercaria; MC = metacercaria; A = adulto; J = giovanile; L = larva.
0.37
0.13
--0
---
---
---
---
3.25
0
0
0
0
7.3 (3.4-13.6)
2004-2006
(399)
χ2
0
0
0
0
0
2002-2004
(223)
P% (CI)
Table 2 - Parasitic infections of commercial native bivalves from St. Gilla Lagoon. Comparison between prevalences recorded in two biennal periods.
Legenda: HS = hypnospore; OC = oocyst; S = sporocyst; C = cercaria; MC = metacercaria; A = adult; J = juvenile; L = larva.
9.0 (5.6-13.6)
A, J
Paravortex cardii
Turbellaria
0
S, S+ C
Labratrema minimus
0
0
S, MC
35.9 (29.6-42.6)
75.8 (69.6-81.2)
79.8 (73.9-84.8)
67.3 (60.6-73.3)
S, S+ C
OC
HS
89.5 (90.0-92.3)
94.2 (90.1-96.8)
MC
Lasiotocus
longicystis
Gymnophallus
choledochus
Bacciger bacciger
Digenea
Nematopsis
Apicomplexa
Perkinsus
Dinoflagellata
2004-2006
(399)
2002-2004
(223)
P% (CI)
0
Stage
0
Parasites
Mytilus galloprovincialis
0
Cerastoderma glaucum
0
Tapes decussatus
A comparison with previous data concerning parasitic infections in bivalves from St. Gilla
lagoon monitored between June 2002 and June 2004 is pointed out in Table 2.
In T. decussatus the prevalence of Perkinsus sp. increased lightly from 79.8% to 83.2%,
while there was a significative decrease of Nematopsis sp. 1 infection from 75.8% to 31.6%
(χ2 = 110.35).
On the contrary, in C. glaucum there was a significative decrease of prevalence, from
28.0% to 11.4% (χ2 = 10.41) of Perkinsus sp. infection, while the prevalence of Nematopsis
sp. 2 infection rised from 83.6% to 89.3%.
Concerning to Digenea infections of B. bacciger and L. longicystis in T. decussatus, in the
current study a significative decrease of prevalences compared with those evalued in the
period June 2002-June 2004, has been recorded (Table 2). Furthermore, in C. glaucum
infection of G. choledochus disappeared. On the other hand, in the last two-years period,
new infections as G. choledochus in T. decussatus, L. minimus in C. glaucum and
P. maculatus in M. galloprovincialis, were detected. It is noticeable that P. maculatus
infection occurred only in specimens of mussels collected from “lavorieri” and at this
moment this parasite has not been observed in M. galloprovincialis from the long lines of the
farm.
To date, it seems difficult to ascribe this unhomogeneous and discontinuous pattern of
infections to abiotical factors as water salinity and temperature recorded by the local PMPASL (Presidio Multizonale di Igiene e Prevenzione, Azienda Sanitaria Locale n. 8, Cagliari).
In fact, the mean annual values of these parameters, during this four-years period, didn’t
have such significative variations as they would influence so markedly all the prevalences of
several infections in different hosts.
Further studies may give more elements to find correlations between abiotical causes and
variations in parasite infections level in bivalves from St. Gilla lagoon.
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252
Metazoan parasite fauna of conger eel
Conger conger L. from
Sardinian waters (Italy)
Parassitofauna in grongo, Conger conger L.,
delle acque della Sardegna
Jacopo Culurgioni, Valeria D’Amico, Elisabetta Coluccia,
Antonello Mulas, Vincenza Figus*
Dip. Biologia Animale ed Ecologia, Università di Cagliari, Viale Poetto 1 - 09126 Cagliari, Italy
_______________________________
SUMMARY - Between March and May 2006, 26 specimens of conger eel Conger conger L (Osteichthyes,
Congridae) caught from waters near to Sardinian coast, were examined for metazoan parasites. Twenty taxa,
thirteen of which identified morphologically to the species level, were recorded. The checklist compiled after this
preliminary study includes 2 ectoparasites species, the copepod Hatschekia sp. and the polychaeta Ichthyotomus
sanguinarius, and 18 endoparasites species comprising 8 digeneans, 3 cestodes, 6 nematodes and 1
acanthocephala. Most of this parasite species have been previously reported in conger eel from Mediterranean Sea
except for Hatschekia sp., Proctoeces maculatus, Scolex pleuronectis and Cucullanus bioccai, new records for this
host in the Mediterranean basin.
RIASSUNTO – Da Marzo a Maggio 2006 sono stati esaminati parassitologicamente 26 esemplari di grongo
Conger conger L. (Osteichthyes, Congridae), pescati nelle acque circostanti le coste della Sardegna. Sono stati
individuati 20 taxa, 13 dei quali identificati morfologicamente a livello di specie. L’elenco stilato dopo questo
studio preliminare include 2 specie ectoparassite, il copepode Hatschekia sp. e il polichete Ichthyotomus
sanguinarius, e 18 endoparassiti comprendenti 8 digenei, 3 cestodi, 6 nematodi e 1 acantocefalo. Gran parte di
queste specie è stata precedentemente segnalata in gronghi del Mar Mediterraneo, eccetto Hatschekia sp.,
Proctoeces maculatus, Scolex pleuronectis e Cucullanus bioccai, nuove segnalazioni in questo ospite nel bacino
Mediterraneo.
Key words: Conger eel, Conger conger, Parasites, Mediterranean basin, Sardinian Sea.
_______________________________
* Corresponding Author: c/o Dipartimento di Biologia Animale ed Ecologia, Viale Poetto 1 - 09126 Cagliari,
Italy. Tel.: 070-6758057; Fax: 070-6758022; E-mail: [email protected]
253
INTRODUCTION
The conger eel, Conger conger L. (Osteichthyes, Congridae) is a benthic species living in
rocky and sandy bottoms between 10 and 1000 m. It is widely distributed in the Eastern
Atlantic, in the Western Black Sea and it is very common in all the Mediterranean Sea
(Relini et al., 1999). Its diet is mainly based on Osteichthyes, Crustaceans, Molluscs and
Polychaeta, with feeding pattern varying in relation to living depth and to its reproductive
cycle (Cau & Manconi, 1984). Previous studies on its parasitic fauna, with particular
attention to Digenea, in different areas of the Mediterranean basin have been done.
From the Adriatic Sea, records of parasites of conger eel were reported by Orecchia et al.
(1985; 1988) and Radujković et al. (1989); from the Tyrrhenian and Ligurian Sea by
Orecchia & Paggi (1978), Paggi et al. (1998); from the western Mediterranean by Bartoli et
al. (2005), but, to date, there are no detailed reports on parasite communities in specimens
fished in Sardinian waters. The aim of this first study was to characterize the parasitic fauna
of conger eel stock from these waters moreover contributing to the knowledge of its
metazoan parasites in Mediterranean Sea.
Between March and May 2006, 26 specimens of conger eel, ranging from 39 to 106 cm
total length, fished at different depths in the Gulf of Palmas (600 m), Gulf of Cagliari (400
m) and Gulf of Arbatax (40 m) have been examined for parasitic infections. The specimens
were transported to the laboratory, measured and weighed, then dissected by using standard
parasitological techniques. The viscera and the gills were removed and observed together
with body surface and cavities. All the parasites were removed, identified according to
morphological criteria, counted and then preserved in 70% ethanol or in AFA (Alcohol,
Formalin and Acetic Acid). Life stages of parasites and their sites of infections are reported
in Table 1. Parasite prevalence and its 95% confidence intervals, mean intensity and
abundance, listed in Table 1, were calculated according to Bush et al. (1997).
RESULTS
Twenty parasite taxa, thirteen of which identified to the species level, were recorded. Their
list and the site of infection in the hosts are reported in Table 1. All the examined fishes were
infected by at least one parasite species, reaching 100% of total prevalence of infection.
The ectoparasites were represented by two species: Hatschekia sp. Poche, 1902 (Copepoda)
(Fig. 1, 2, 3) and Ichthyotomus sanguinarius Eisig, 1906 (Polychaeta) (Fig. 4, 5). The
copepod specimens collected from the gills of 8 (P% = 30.8) conger eels have been
morphologically ascribed to genus Hatschekia. The mean intensity of infection was 4.1,
ranging from 1 to 12 parasites per host. The polychaete I. sanguinarius, the only species of
the family Ichthyotomidae, has been found attached on fins and on skin of 11.5% of conger
eels examined, with mean intensity of 17.3 but with a wide intensity range, being one
C. conger heavily infected by 50 of these ectoparasites.
Endoparasites collected included 8 species of Digenea, 6 of Nematoda, 1 of
Acanthocephala and 1 species of Cestoda with several larval stages belonging to
Tetraphyllidaea and Trypanorhyncha.
254
Conger conger (26)
Infected
Infected by:
Digenea
Lecithochirium rufoviride
Lecithochirium fusiforme
Hemiuridae sp.
Prosorhynchus crucibulum
Prosorhynchus aculeatus
Dolichoenterum longissimum
Helicometra fasciata
Proctoeces maculatus
Cestoda
Tetraphyllidea spp. *
Scolex pleuronectis *
Trypanorhyncha spp. *
Nematoda
Hysterothylacium sp. *
Cucullanus bioccai
Nematoda sp. *
Anisakis simplex type I *
Cristitectus congeri *
Anisakis simplex type II *
Acanthocephala
Acanthocephala sp.
Polychaeta
Ichthyotomus sanguinarius
Copepoda
Hatschekia sp.
Site(s)
P%(CI)
MI±SE
A±SE
100 (87.5-100)
62.2 ± 21.6
62.2 ± 21.6
S
S
S
I
I
S
I
I
69.2 (48.6-85.4)
42.3 (23.8-62.6)
26.9 (11.7-47.4)
30.8 (14.6-51.4)
26.9 (11.7-47.4)
3.8 (0.0-19.4)
3.8 (0.0-19.4)
3.8 (0.0-19.4)
6.3 ± 2.1
6.8 ± 3.5
3.0 ± 1.1
3.7 ± 1.1
59.0 ± 23.5
1.0
2.0
13.0
4.4 ± 1.5
2.9 ± 1.6
0.8 ± 0.4
1.3 ± 0.5
15.9 ± 7.9
0.04 ± 0.04
0.1 ± 0.1
0.5 ± 0.5
I
I
I - GB
38.5 (20.6-58.9)
34.6 (17.6-55.2)
7.7 (0.0-24.9)
56.0 ± 35.3
16.5 ± 4.9
5.5 ± 0.5
21.5 ± 14.2
5.1 ± 2.1
0.4 ± 0.3
VC
S-I
I - VC
S-I
I
I
61.5 (41.0-79.4)
46.2 (27.0-66.2)
23.1 (9.0-43.3)
11.5 (1.69-29.9)
7.7 (0.0-24.9)
3.8 (0.0-19.4)
3.3 ± 0.6
6.3 ± 2.4
1.8 ± 0.4
1.0 ± 0.0
1.5 ± 0.5
1.0
2.0 ± 0.5
2.9 ± 1.3
0.4 ± 0.2
0.1 ± 0.1
0.1 ± 0.1
0.04 ± 0.04
I
3.8 (0.0-19.4)
1.0
0.04 ± 0.04
F
11.5 (1.69-29.9)
17.3 ± 16.3
2.0 ± 1.9
G
30.8 (14.6-51.4)
4.1 ± 1.4
1.2 ± 0.5
Legenda: * = larvae; G = gills; F = fins; S = stomach; I = intestine; GB = gall bladder; VC = ventral cavity.
(* = larva; G = branchie; F = pinne; S = stomaco; I = intestino; GB = vescica natatoria; VC = cavità ventrale).
Table 1 - Parasite species of Conger conger from Sardinian waters.
Tabella 1 - Specie parassite di Conger conger delle acque della Sardegna.
Adults of Digenea belonging to 8 species included in 4 families were identified by
morphological analysis. Among these families, Hemiuridae, represented by Lecithochirium
rufoviride (Rudolphi, 1819) Lühe, 1901 (Fig. 7), Lecithochirium fusiforme Lühe, 1901, and
an unidentified species, showed the higher prevalence of infection (80.8%). All the
specimens were collected from the hosts’ stomach.
Bucephalidae of the species Prosorhynchus crucibulum (Rudolphi, 1819) Odhner, 1905,
Prosorhynchus aculeatus Odhner, 1905 (Fig. 6), both in intestine, and Dolichoenterum
longissimum Ozaki, 1924, in stomach, infected 12 conger eels (P% = 33.3).
Helicometra fasciata (Rudolphi, 1819) Odhner, 1902 (Opecoelidae) and Proctoeces
maculatus (Looss, 1901) Odhner, 1911 (Fellodistomidae) (Fig. 8) showed prevalence of
3.8%, being both detected in the intestine of one host.
Larval stages of Cestoda occurred in 38.4% of conger eels. Identification to species level
was possible only for Scolex pleuronectis Muller, 1788 (Fig. 9), while morphology of
Tetraphyllidaea and Trypanorhyncha larvae (Fig. 10) didn’t allow further identification. All
the specimens were found in the intestine, except for one infection by Trypanorhyncha,
observed also in gall bladder.
255
1
2
3
4
5
Plate 1 – Figure 1 – Hatschekia sp., cephalothorax. Figure 2 – Hatschekia sp., uropods. Figure 3 – Hatschekia
sp., portion of an egg sac. Figure 4 – Ichthyotomus sanguinarius, hindbody. Figure 5 – Ichthyotomus
sanguinarius, eggs between pseupods.
Tavola 1 – Figura 1 – Hatschekia sp., cefalotorace. Figura 2 – Hatschekia sp., uropodi. Figura 3 – Hatschekia
sp., porzione di sacca ovigera. Figura 4 – Ichthyotomus sanguinarius, estremità posteriore. Figura 5 –
Ichthyotomus sanguinarius, uova.
256
6
7
9
8
10
Plate 2 – Figure 6 – Prosorhynchus aculeatus, adult. Figure 7 – Lecithochirium rufoviride, adult. Figure 8 –
Proctoeces maculatus, adult. Figure 9 – Scolex pleuronectis. Figure 10 – Trypanorhyncha sp., larva.
Tavola 2 – Figura 6 – Prosorhynchus aculeatus, adulto. Figura 7 – Lecithochirium rufoviride, adulto. Figura 8 –
Proctoeces maculatus, adulto. Figura 9 – Scolex pleuronectis. Figura 10 – Trypanorhyncha sp., larva.
257
12
11
13
14
16
15
17
Plate 3 – Figure 11 – Anisakis simplex Type I, head. Figure 12 – Anisakis simplex Type I, ventriculum.
Figure 13 – Anisakis simplex Type I, caudal portion. Figure 14 – Cristitectus congeri, adult.
Figure 15 – Cristitectus congeri, anterior portion. Figure 16 – Cucullanus bioccai adult female, anterior portion.
Figure 17 – Cucullanus bioccai adult female, caudal portion.
Tavola 3 – Figura 11 – Anisakis simplex Tipo I, estremità anteriore. Figura 12 – Anisakis simplex tipo I,
ventricolo. Figura 13 – Anisakis simplex Tipo I, estremità caudale. Figura 14 – Cristitectus congeri, adulto.
Figura 15 – Cristitectus congeri, adulto, estremità anteriore. Figura 16 – Cucullanus bioccai femmina adulta,
estremità anteriore. Figura 17 - Cucullanus bioccai femmina adulta, estremità posteriore.
258
Six taxa of Nematoda were detected: Anisakis simplex Type I (Fig. 11, 12, 13) and Type II
larvae (sensu Berland 1961), Cristitectus congeri Petter, 1970 (Cystidicolidae) (Fig. 14, 15),
both found in intestine, Cucullanus bioccai Orecchia & Paggi, 1987 (Fig. 16, 17) found both
in intestine and stomach and Hysterothylacium sp. larvae Ward & Magath, 1917 encysted on
the connective tissues in the visceral cavity. Almost all of these worms were not viable so
that it was difficult to determine their species. Larvae belonging to an undetermined species,
encysted in intestine and ventral cavity of 6 conger eels (P% = 23.1) were also observed.
Altogether, Nematoda infections occurred in 84.6% of the sample.
Only one Acanthocephala sp. in the posterior intestine of one specimen of C. conger was
found (P% = 3.8). The morphological features of this specimen didn’t allow to have a further
classification.
DISCUSSION AND CONCLUSION
Results obtained in this study indicate that all the parasite species recognized in conger eel
from Sardinian waters were already reported in specimens from different areas of
Mediterranean Sea, except for Hatschekia sp., P. maculatus, S. pleuronectis, C. bioccai and
C. congeri, new records for Mediterranean conger eel populations.
The occurrence of the Copepoda Hatschekia sp. is a new finding in C. conger both from
Mediterranean and Eastern Atlantic areas. Belonging to the same family, Congericola
pallidus was already reported by Paggi et al. (1998) in specimens from central and southern
Tyrrhenian sea.
The presence of I. sanguinarius was already mentioned by Stoch (2003) in Gulf of Naples.
This parasite, as reported by Martin & Britayev (1998), is specific for Congridae. Normally
the infection is due to a couple of worms (male and female) that lives attached to the fins.
Otherwise, in this study a very heavy infection by 25 couples of worms, attached also to the
skin, was observed.
Among Digenea, the most abundant group in terms of number of species, the Hemiuridae
L. rufoviride and L. fusiforme were reported in Mediterranean areas. L. rufoviride by
Orecchia & Paggi, (1978) and by Paggi et al. (1998), both by Bartoli et al., (2005). Their
infections, each with a prevalence of more than 80%, were detected and noticed as most
common in the Eastern Atlantic (Vilas & Paniagua, 2004).
The Hemiuridae sp. observed in this study may be L. musculus, yet reported in C. conger
from Mediterranean Sea (cited by Radujiković et al., 1989), but its morphological features
didn’t allow an accurate identification. A proper diagnosis should be obtained by molecular
analysis as done by Vilas et al. (2003) for specimens collected in Eastern Atlantic.
The Bucephalidae P. crucibulum and D. longissimum were already detected in different
Mediterranean areas (Orecchia et al., 1988; Radujković et al., 1989; Paggi et al., 1998). P.
crucibulum and P. aculeatus were recently detected by Bartoli et al. (2005) in specimens
from the Scandola Nature Reserve off Corsica, both with prevalences higher than those
recorded in this investigation.
The infection prevalences of H. fasciata and P. maculatus were very low. H. fasciata has
already been detected in conger eels from Mediterranean areas, as cited by Radujiković et al.
(1989) and observed by Bartoli et al. (2005), while P. maculatus is, in this study, firstly
reported in this host. Several species of Teleosts harbour the adults of this Fellodistomidae,
while larval stages usually occur in mussels. Sporocysts and cercariae, infecting Mytilus
galloprovincialis from St. Gilla lagoon (Gulf of Cagliari) have been recently found
(unpublished data).
259
Digenea is the most well represented taxa within the whole parasite community of
C. conger. Among this group the species L. rufoviride has the greatest prevalence of
infection (P% = 69.2), and P. aculeatus shows the greatest mean intensity and abundance,
respectively of 59.0 and 15.9.
In spite of this the Cestoda reached the higher number of specimens. Larvae of
Trypanorhyncha spp. and Tetraphyllidea spp. were previously detected in this host by
Orecchia & Paggi (1978) and Paggi et al. (1998), while S. pleuronectis was observed in
Eastern Atlantic conger eels by Sanmartìn et al. (2000), with prevalence (24.32 %), mean
intensity (4.17) and mean abundance (1.01) lower than those estimated in this study.
Six species of Nematoda have been detected, all at larval stage except for C. bioccai which
has previously reported by Orecchia & Paggi (1987) in Mugil cephalus caught in Lake
Sabaudia. The most represented Nematoda was Hysterothylacium sp., larvae found in 61.5%
of conger eels, with a low mean intensity of 3.3. Different species of this genera, H.
aduncum (Orecchia & Paggi, 1978; Orecchia et al., 1985) and H. fabri (Hristovsky & Jardas,
1991) were observed in Mediterranean. Larvae of C. congeri showed a value of prevalence
similar to that recorded by Quintero et al. (1989) from Eastern Atlantic, respectively of 7.7%
and 8.2%. Larvae of Anisakis Type I and Type II, identified by morphological analysis sensu
Berland 1961, were found with different prevalences, respectively of 11.5% and 3.8%. Paggi
et al. (1998) reported adults of A. pegreffii in specimens from Tyrrhenian sea. Diagnostic
enzymatic analysis would be useful to determine the correct identification of the larvae
collected.
The results of this study indicate that the parasite fauna of conger eel may be different in
the three fishing areas, but the low number and the dishomogeneity of the samples from each
of these suggest the advisability of widening this research in order to give a correlation
between parasite communities, geographical areas, living depth and age of hosts. Additional
data may allow to indicate the use of parasite species as biological tags for C. conger stocks
discrimination.
Furthermore, considering the whole sample and comparing the results of this study with
those carried out in Atlantic conger eel populations it appears that the parasite fauna of
conger eels in the Mediterranean basin is more varied since the number of species detected
results higher than those reported in Eastern Atlantic by previous authors (Quinteiro et al.,
1989; Sanmartìn et al., 2000; Santos & Gibson, 2002; Vilas et al., 2003; Vilas & Paniagua,
2004).
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261
262
Gastro-protective effect of capsaicin in
Anguilla anguilla (Linnaeus, 1758): evidence
from an experimental study on gastric bags
Effetto gastro-protettivo della capsaicina in
Anguilla anguilla (Linneo, 1758):
studio sperimentale su sacchetti gastrici
Maria Gabriella Denaro1*, Gabriella Caruso2, Lucrezia Genovese2
1
Dpt. di Fisiologia Generale e Farmacologia, Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali, Università di
Messina, Salita Sperone, 31 - 98166 S. Agata (ME); 2 Istituto per l’Ambiente Marino Costiero (IAMC), Consiglio
Nazionale delle Ricerche, Spianata S. Raineri, 86 - 98122 Messina
_______________________________
SUMMARY - An experimental, macroscopical, study was undertaken in european eel (Anguilla anguilla) to
assess the gastro-protective effect of capsaicin, the active component contained in pepper. Gastric bags were
prepared from specimens of Anguilla anguilla and used for in vitro study of the ability of capsaicin to recover
ulcers induced by aspirin or ethanol. Gastric ulcers were experimentally induced and comparison was made with
the same experiment repeated in presence of capsaicin at different concentrations (10-6, 10-5, 10-4 mol/l).
Macroscopical observations showed that capsaicin at low doses (10-6 mol/l) was effective in repairing the
mucosal layer injured, thus proving in vitro its protective effect on the gastrointestinal tract of this fish species.
Moreover, the similar physiological behaviour of the protective effect found between our study and other in vivo
studies performed on rats supported the possibility of using the gastro-intestinal tract of eel as a model substrate
for pharmacological and toxicological studies.
RIASSUNTO – Uno studio sperimentale, macroscopico, è stato effettuato in anguilla (Anguilla anguilla) per
valutare l’effetto gastro-protettivo della capsaicina, un principio attivo contenuto nel peperoncino. Sacchetti
gastrici sono stati preparati da esemplari di anguilla ed utilizzati per studiare in vitro la capacità della
capsaicina di prevenire la formazione di ulcere indotte dall’aspirina o dall’etanolo. Sono state indotte
sperimentalmente ulcere gastriche; in parallelo lo stesso esperimento è stato ripetuto in presenza di capsaicina a
differenti concentrazioni (10-6, 10-5, 10-4 mol/l). L’osservazione macroscopica ha evidenziato come la capsaicina
a basse dosi (10-6 mol/l) sia efficace nel prevenire l’alterazione dello strato mucosale, dimostrando in vitro il suo
effetto protettivo sul tratto gastrointestinale di questa specie di pesci. Inoltre, il comportamento simile fra quanto
riscontrato in vitro ed altri studi condotti in vivo su ratti, suggerisce la possibilità di utilizzare il tratto
gastrointestinale di anguilla come modello sperimentale per saggi farmacologici e tossicologici.
Key words: Anguilla anguilla, Gastric ulcer, Capsaicin, Aspirin, Ethanol.
_______________________________
* Corresponding Author: c/o Dpt. di Fisiologia Generale e Farmacologia, Facoltà di Scienze Matematiche,
Fisiche e Naturali, Università di Messina, Salita Sperone, 31 – 96166 S. Agata (ME), Italia; Tel.: 090-6765210;
Fax: 090-394030; E-mail: [email protected]
263
INTRODUCTION
Peptic ulcer represents one of the most spread human diseases in the world; generally, in
healthy conditions, mucosal damaging agents and gastric mucosal defences are well
balanced (Grossman, 1980). Among these latter, the mucus, covering with a thin layer the
surface epithelial cells of the gastrointestinal tract, represent a first line of defence against the
acidic environment created by pepsin. Also, mucosal prostaglandins are reported to be
involved in modulating gastric mucosal defense mechanisms (Mózsik et al., 1977a; 1977b);
their reduction has been considered as a predisposing factor in the genesis of gastric ulcer
(Miller, 1983). Other factors which play a role in the mucosal protection include the tight
junctions between the surface epithelial cells and the cell turnover, bicarbonate secretion,
gastric mucus phospholipids, gastric mucosal blood flow (Miller, 1988).
Different drugs have been tested to experimentally induce gastric ulcer and to study their
pathogenesis (Szabò & Goldberg, 1990). For some chemicals (acetic, acetylsalicylic acids,
bile salts and ethanol) the capability of breaking the gastric mucosal barrier has been
demonstrated (Davenport, 1969). On the other hand, several other compounds such as
atropine (Mózsik et al., 1980), antacids and cimetidine (MacKercher et al., 1977), or some
coating agents, barrier agents or mucosally active drugs have been used in the treatment of
acid peptic disorders (Hollander & Tarnawski, 1987). Particular interest is also addressed to
compounds of natural origin, showing significant pharmacological properties for the therapy
of peptic ulcer disease, such as compounds derived from peppers. Since ancient times, this
fruit (Capsicum annuum, belonging to the family of Solanaceae) has been known for the
therapeutical properties of its active components, particularly concerning its content in
capsaicin (8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide). This alkaloid, responsible for the pungent
nature of pepper, is detected in this fruit in amounts ranging from 0.01 to 0.22%, while in
form of essential oil (capsicol) it is present in concentrations ranging from 1 to 1.5%. This
substance induces pyrexia (Szolcsànyi, 1982), but a lot of studies have suggested its
application in medicine for its therapeutic potential (Szallasi & Blumberg, 1993; AbdelSalam et al., 1997). Capsaicin is known to have protective effects not only in the stomach
but also in the neonatal pre-treatment of chronic colitis induced in the rat by trinitrobenzene
sulfonic acid (Evangelista & Meli, 1989). Concerning the mechanism of action of capsacin,
its receptor is a cationic channel which, during its activation, allows a flux of Ca2+ and Na2+
ions (Winter, 1987; Wood et al., 1988) which induces the depolarisation of neuronal
membranes of fibres involved in pain generation; then this sensation is transmitted to the
brain via the dorsal ganglion.
Previous research (Faggio et al., 2000) showed that the gastric mucosa of Teleosts exhibits
physiological responses similar to those observed in superior Vertebrata; therefore, it is
possible to use fish as experimental models in pharmacological and toxicological
experimentation.
A study was carried out in order to evaluate the protective effect of capsaicin on gastric
ulcers experimentally induced on a Teleost species, Anguilla anguilla (European eel), with
the objective of verifying whether, even in in vitro condition (in absence of any nervous
regulation and blood flow) this effect is still present.
Studied specimens
The specimens under experimentation were European eel (Anguilla anguilla) of average
age 48 months, showing a mean weight 133 ± 2.3 g and length of 26 cm. They were
264
maintained in the aquaculture plant of the Istituto per l’Ambiente Marino Costiero (IAMC)
of Messina, in circular tanks of PVC (capacity 300 l) under natural photoperiod.
After a period (thirty days) of acclimatisation, during which fish were not feed, eels were
sacrificed after treatment with MS 222 (final concentration 10 g/l), their gastrointestinal tract
were removed and the stomach isolated (Figure 1). This organ, Y-shaped, includes two
regions (cardial and fundal) with gastric glands, and a third one, the pyloric, folded and
without glands. After its removal, the stomach underwent to depletion of the muscle and
connectival layers in Petri dishes containing physiological Ringer solution, buffered with
HCO3-, under proper oxygenation, then filled with a not-buffered solution and enclosures
were made in order to obtain some “gastric bags”.
Figure 1 - Removal of the gastrointestinal tract from Anguilla anguilla.
Figura 1 - Prelievo del tratto gastrointestinale di Anguilla anguilla.
During a first series of experiments, these bags were incubated for 6 h in a beaker
containing Ringer solution buffered with HCO3- or with HEPES NaOH. The chemical
composition of the solutions used is reported in Table 1; the incubation media (RingerHCO3- or Ringer-HEPES buffers) were also added with histamine 10-4 mol/l, a substance
which stimulates the acid secretion by the gastric mucosa of eel (Trischitta et al., 1988).
The pH of all the solutions was 8.0 ± 0.1. Tissue oxygenation was ensured by the addition
to the solutions of a gas mixture containing 99 ml/l O2 + 1 ml/l CO2, for Ringer–HCO3buffer solution, and containing 100 ml/l O2, for Ringer-HEPES solution.
During the second series of experiments, the formation of ulcers (both acid and not-acid)
on the gastric mucosa was experimentally induced by treatment with ethanol 10% or aspirin
(10-3 mol/l) (used as control gastric bags). Each of the compounds tested during the
experiments were added to the incubation beaker at the beginning of the experiment, except
for ethanol 10%, which was dissolved in the not-buffered solution and tested by direct
inoculation inside the gastric bag. Aspirin was dissolved in methanol (final concentration in
the incubation medium, 1 g/l).
In order to test the gastro-protective potential of capsaicin, both the experiments were
repeated, including as a final step the treatment with this ingredient, dissolved in methanol,
and tested at decreasing concentrations (10-4, 10-5, 10-6 mol/l).
265
Ions
Na+
K+
ClMg2+
Ca2+
HCO3H2PO4
Glucose
Gluconate
HEPES
Ringer-HCO3(1)
Ringer-HEPES (2)
153
4
144
1.4
2.5
20
0.8
20
/
/
153
4
144
1.4
2.5
/
0.8
20
15
4.5
Solution without
buffer (3)
153
4
144.8
1.4
2.5
/
/
20
20
/
1
T Solutions (1) and (2) were added with 99 ml/l O2 and 1ml/l CO2, solution (3) was added
with 100 ml/l O2
Table 1 - Composition of the solutions (concentration in mmol/l).
Tabella 1 – Composizione delle soluzioni (concentrazione in mmol/l).
After incubation, the gastric bags were opened and underwent to macroscopic observation,
in order to detect the presence of gastric ulcers and their recovery after treatment with
capsaicin. Each kind of experiment was repeated 6 times.
Plate 1: Figure 2 - Gastric mucosa of Anguilla anguilla in normal conditions; Figure 3 - Gastric mucosa of
Anguilla anguilla after incubation for 6h in Ringer-Hepes and histamine (10-4 mol/l); Figure 4 - Gastric mucosa
of Anguilla anguilla after incubation for 6h in Ringer-Hepes, histamine (10-4 mol/l) and capsaicin (10-6 mol/l);
Figure 5 - Gastric mucosa of Anguilla anguilla after incubation for 6h in Ringer-HCO3- histamine (10-4 mol/l) and
ethanol. The gastric bag is supported by a plastic sheet due to the tissue damage induced by ethanol; Figure 6 Gastric mucosa of Anguilla anguilla after incubation for 6h in Ringer-HCO3- histamine (10-4 mol/l), ethanol and
capsaicin (10-6 mol/l); Figure 7 - Gastric mucosa of Anguilla anguilla after incubation for 6 h in Ringer-HCO3histamine (10-4 mol/l) and aspirin (10-3 mol/l); Figure 8 - Gastric mucosa of Anguilla anguilla after incubation for
6h in Ringer-HCO3- histamine (10-4 mol/l), aspirin (10-3 mol/l) and capsaicin (10-6 mol/l).
Tavola 1: Figura 2 - Mucosa gastrica di Anguilla anguilla in condizioni fisiologiche normali; Figura 3 - Mucosa
gastrica di Anguilla anguilla dopo incubazione per 6h in Ringer-Hepes e istamina (10-4 mol/l); Figura 4 Mucosa gastrica di Anguilla anguilla dopo incubazione per 6 h in Ringer-Hepes, istamina (10-4 mol/l) e
capsaicina (10-6 mol/l); Figura 5 - Mucosa gastrica di Anguilla anguilla dopo incubazione per 6h in RingerHCO3- istamina (10-4 mol/l) ed etanolo. Il sacchetto gastrico è adagiato su un supporto di plastica a causa del
danno tissutale prodotto dall’etanolo; Figure 6 - Mucosa gastrica di Anguilla anguilla dopo incubazione per 6h
in Ringer-HCO3- istamina (10-4 mol/l), etanolo e capsaicina (10-6 mol/l); Figura 7 - Mucosa gastrica di Anguilla
anguilla dopo incubazione per 6h in Ringer-HCO3- istamina (10-4 mol/l) e aspirina (10-3 mol/l); Figura 8 Mucosa gastrica di Anguilla anguilla dopo incubazione per 6h in Ringer-HCO3- istamina (10-4 mol/l), aspirina
(10-3 mol/l) e capsaicina (10-6 mol/l).
266
2
3
2
3
4
6
5
7
8
267
RESULTS
Figure 2 shows the aspect of the stomach of eel in normal conditions, with mucosal folding
and clear border (boundaries, margins) of the gastric tissue. After incubation in presence of
HCO3-, the gastric tissue did not show any change (not shown in Figure), while in RingerHEPES a wide erosion of the surface mucosal layer was observed, with a flattening of the
folded surface (Figure 3). Under this condition, the effects of capsaicin addition were
different according to its concentration. In fact, following the incubation with capsaicin at a
10-6 mol/l concentration, the gastric mucosa remained undamaged, with clear borderlines and
folds (Figure 4), while at higher doses (10-5 and 10-4 mol/l) this protective effect was mostly
undetectable.
The treatment with ethanol 10% resulted in a wide erosion of the gastric mucosa, with deep
ulcers (Figure 5). Following the treatment with capsaicin, particularly at the 10-6 mol/l
concentration a regeneration of the mucosal layer was observed (Figure 6), and ulcers
disappeared. The same effect, but not so evident, was recorded after the addition of capsaicin
at the highest concentrations (10-5 and 10-4 mol/l).
The addition of aspirin (10-3 mol/l) caused erosion and ulcers in the mucosal layer (Figure
7). Capsaicin determined a protective effect similar to that one previously described, with a
greater efficacy at the lowest concentration (10-6 mol/l) (Figure 8).
DISCUSSION AND CONCLUSIONS
Results of the experiments performed provided evidence that capsaicin, even “in vitro”
studies, such as those performed in our laboratory, played a protective role on the gastric
mucosa. Following the treatment with this compound, in fact, it was possible to prevent the
erosion of the gastric mucosa caused by the incubation of the gastric bag in solutions
containing histamine, while lacking of bicarbonate. This latter is known for its buffer and
protective properties on gastric mucosa; therefore, the lacking of bicarbonate and the
presence of histamine are equally important for gastric tissue integrity (Trischitta et al.,
1988).
In rat, Alfoldi et al. (1987) have also shown that capsaicin is able to reduce gastric
secretion induced by histamine.
The protective effect of capsaicin was mostly detected at the lowest concentration (10-6
mol/l), confirming what found in in vivo experiments carried out in mammals (Mózsik et al.,
1997c). A similar, gastro-protective, effect of capsaicin was also observed after ethanol
treatment of the gastric bags, causing a deep tissue damage and ulceration; this was also in
agreement with other studies (Holzer & Lippe, 1988; Esplugues & Whittle, 1990; Gyìres &
Barna, 2002) performed “in vivo” in rats treated with the same experimental procedures. The
mucosal microvasculature has been reported to be not only an initial site of damage after
ethanol application, but also the site where prostaglandins likely exert their protective effects
(Trier et al., 1987).
Capsaicin was also effective in recovering gastric damage produced by aspirin; this
compound is an inhibitor of ciclo-oxigenase, enzyme required for the synthesis of
prostaglandins (Faggio et al., 2000), which have a protective action on the gastric mucosa. A
similar effect was observed by application of resiniferatoxin, an analogous of capsaicin, in
rats showing mucosal damage following aspirin and ethanol (Szolcsànyi, 1990; AbdelSalam et al., 1995); both substances (capsaicin and resiniferatoxin) also increased the blood
flow in the gastrointestinal tract of rats (Abdel-Salam et al., 1996). Cimetidine is recognised
268
to exert a protective effect on aspirin- induced gastric damaged mucosa (MacKercher et al.,
1977; Szolcsànyi & Mózsik, 1984); this effect was also observed by Kang et al. (2004).
In our experiment, capsaicin was able, at low concentrations, to repair the ulcers induced
by aspirin, in agreement with what found during in vivo experiments by Holzer et al. (1989)
through intragastric application of capsaicin.
The physiological mechanisms involved in the gastric protection during our in vitro
experiments can be supposed to be related to the production of bicarbonate or mucus, both
acting as a protective barrier inside the gastric bag. Above all consideration, it is interesting
to note that the mechanisms involved in the mucosal protection or regeneration remain
substantially unchanged along the evolutionary scale. As the response of the eel examined to
the capsaicin treatment was similar to the one observed in rat and other superior vertebrates,
then it is likely to propose this fish as a model species for animal experimentation in
pharmacological and toxicological studies. This consideration is in agreement with previous
findings (Trischitta et al., 1988; Faggio et al., 2000), which confirmed the suitability of this
fish, also in relation to its wide commercial distribution and long resistance to be kept in
aquaria, as an animal model for improving knowledge of physiological mechanisms.
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271
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273
Bibliografia: i riferimenti bibliografici vanno elencati in ordine alfabetico e senza
numerazione, come da esempi qui riportati:
Ghittino C., Prearo M., Bozzetta E. & Eldar A. (1995). Caratterizzazione della
patogenicità dell’agente eziologico della Streptococcosi ittica e prove di
vaccinazione in trota iridea. Boll. Soc. It. Patol. Ittica, 16: 2-12.
Austin B. & Austin D.A. (1999). Bacterial fish pathogens. In “Disease of farmed
and wild fish. 3rd Ed.”, Praxis Publishing, Chichester, England.
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Ghittino C., Prearo M., Bozzetta E. & Eldar A. (1995). Caratterizzazione della
patogenicità dell’agente eziologico della Streptococcosi ittica e prove di
vaccinazione in trota iridea. Boll. Soc. It. Patol. Ittica, 16: 2-12.
Austin B., Austin D.A. (1999). Bacterial fish pathogens. In “Disease of farmed and
wild fish. 3rd Ed.” Praxis Publishing, Chichester, England: 48-49.
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Azienda Ittica “Il Padule” di Fornaciari Argo
Castiglione della Pescaia (GR)
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Zoppola (PN)
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Bagolino (BS)
Troticoltura Valchiese S.n.c. di Foglio M. & C.
Storo (TN)
Valle Ca’ Zuliani S.r.l.
Pila di Porto Tolle (RO)
Elenco degli sponsor
della Società Italiana di Patologia Ittica:
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Mozzecane (VR)
Biomar Group Italia
Treviso
Schering Plough Animal Health
Milano
Veronesi
Verona
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