Nocentini - istituto zooprofilattico sperimentale del piemonte, liguria

Istituto Zooprofilattico delle Regioni
Lazio e Toscana
“APPROCCIO ANALITICO
ALL’ANALISI
TOSSICOLOGICA IN
AMBITO VETERINARIO”
Dr. Mila Nocentini
Responsabile Laboratorio Chimico Sezione di Firenze
V CONVEGNO NAZIONALE DEGLI ISTITUTI ZOOPROFILATTICI SPERIMENTALI
SPERIMENTALI
SULL’
SULL’ALIMENTAZIONE ANIMALE
Indice di Presentazione
•
Confronto fra tossicologia in ambito umano e veterinario
•
Aspetti normativi
•
Risultati ottenuti nel periodo 2005-2011
•
Dati tossicologici di alcune sostanze
•
Principi di farmacocinetica
•
Quali matrici?
•
Quali metodi analitici?
•
Conclusioni
Shapes: Introductory basics you can't live without
Tossicologia umana
“Clarke’s Analysis of drugs and poisons”
Edited by A. Moffath et al. 3TH edition
Part 1 Chapters
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Hospital toxicology
Drugs of abuse
Alcohol, drugs and driving
Workplace drug testing
Forensic toxicology
Post mortem toxicology
Drugs in saliva
Hair analysis
9. Drug abuse in sport
10. Therapeutic drug monitoring
11. Quality control and assessment
12. Farmacocinetics and metabolism
13. Natural toxins
14. Pesticides
15. Volatile substances
….
Shapes: Introductory basics you can't live without
Tossicologia veterinaria
Veterinary toxicology: basic and clinical principles
Edited by Ramesh C. Gupta.
Chapters
1. General
2. Organic toxicity
3. Nanoparticle, radiation and
carcinogenesis
4. Drugs of use and abuse
5. Metals and micronutriens
6. Insecticides and molluscicides
7. Rodenticides and avicides
8. Herbicides and fungicides
9. Industrila toxicans
10. Enviromental toxicology
11. Bacterial toxins
12. Poisons and venomous organism
13. Extrogenic toxicants
14. Poisonus plants
15. Mycotoxins
16. Feed and water contaminants
….
Shapes: Introductory basics you can't live without
Aspetti normativi
Legge Regionale 16 Agosto 2001 N. 39
(Bollettino Ufficiale della Regione Toscana n. 27 del
27/08/01)
“ Norme sul divieto di utilizzo e detenzione di esche
avvelenate”
Art. 7: Analisi di laboratorio
“…anche ricorrendo alle strutture dell’Istituto
Zooprofilattico
di cui alla legge regionale 29 luglio 1999 n. 44…”
Shapes: Introductory basics you can't live without
Aspetti normativi
ORDINANZA 10 febbraio 2012
del Ministero del Lavoro, della Salute e delle Politiche Sociali
(Gazzetta Ufficiale n. 58 del 09/03/12)
“Norme sul divieto di utilizzo e di detenzione di esche o di bocconi avvelenati”
Art. 3. Istituti Zoooprofilattici Sperimentali
1. Gli Istituti zooprofilattici sperimentali sottopongono a necroscopia l'animale ed effettuano
gli opportuni accertamenti e analisi di laboratorio sui campioni pervenuti o prelevati in sede
necroscopica.
2.
Gli Istituti eseguono la necroscopia entro quarantotto ore e le analisi entro trenta giorni
dall'arrivo del campione, comunicandone gli esiti al medico veterinario che ha segnalato
l'evento, al Servizio veterinario dell'azienda sanitaria locale territorialmente competente, al
sindaco e, in caso di accertato avvelenamento, all'Autorita' giudiziaria.
Shapes: Introductory basics you can't live without
Risultati periodo 2005-2011
ANNO
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
Totale
Numero di
Campioni
345
819
896
959
961
1049
1123
6152
Numero di
Analisi
effettuate
1316
2981
3530
3700
3411
3495
3367
21800
Campioni Percentuale
Positivi di Positività
184
14,0
624
20,9
815
23,1
679
18,4
576
16,9
699
20,0
513
15,2
4090
Shapes: Introductory basics you can't live without
Distribuzione delle positività nel periodo 2005/2011
50
45
2005
2006
2007
2009
2010
2011
2008
% Positività
40
35
30
25
20
15
10
5
0
nin
c
i
Str
a
C
a
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P.
org
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.
P
P
Shapes: Introductory basics you can't live without
50
Anticoagulanti
2005
2009
45
40
2006
2010
2007
2011
2008
Positivi (%)
35
30
25
20
15
10
Brodifacoum
Difenacoum
flo
cu
m
af
en
ar
ol
o
m
cu
W
ar
fa
r in
Di
Di
fe
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Co
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et
um
at
di
fa
co
um
Co
Br
o
m
Cumarina
Br
o
ad
io
lo
n
e
5
0
Coumatetralyl
Bromadiolone
Warfarin
Coumachlor
Pesticidi
PESTICIDI ORGANOCLORURATI
I pesticidi organoclorurati sono composti nei quali esiste almeno un legame
carbonio- cloro
Questi insetticidi sono generalmente molto lipofili e non vengono trasformati in metaboliti più
idrofli ed escreti. Sono così capaci di suddividersi nei tessuti grassi e bioaccumularsi.
PESTICIDI ORGANOFOSFORATI
I pesticidi organofosforati sono ampiamente utilizzati in
agricoltura nelle coltivazioni di frutta vegetali e cereali.
L intossicazione acuta da organofosforici è determinata dall inattivazione
irreversibile dell enzima acetilcolinesterasi che blocca la degradazione del
neurotrasmettitore acetilcolina.
PESTICIDI CARBAMMATI
I carbammati e i ditiocarbammati sono utilizzati come insetticidi, erbicidi e
fungicidi. Preferiti agli organoclorurati perché meno stabili, si
decompongono facilmente. Agiscono causando inibizione della
colinesterasi per inattivazione reversibile dell'enzima acetilcoliesterasi.
Shapes: Introductory basics you can't live without
Molecole appartenenti alle 3 famiglie di pesticidi, clorurati, fosforati e
carbammati che hanno mostrato la maggior incidenza
100
90
80
2005
2006
2007
2009
2010
2011
2008
Positivi (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
Endosulfan
Coumaphos
Isofenphos
Methiocarb
Carbofuran
Altri
Endosulfan: pesticida organoclorurato è costituito dagli isomeri alfa e beta
che possono essere metabolizzati in solfato di endosulfan e diolo di
endosulfan
Coumaphos, isofenfos: Pesticidi organofosforati, il primo usato come acaricida
il secondo come insetticida
Methiocarb, carbofuran: pesticidi carbammati , il primo è usato come lumachicida,
il secondo è un insetticida spesso usato in combinazione con
isofenfos
DISTRIBUZIONE DELLE POSITIVITA’
70
60
Positivi (%)
50
40
2005
2006
2007
2009
2010
2011
2008
30
20
10
0
Esche
CANE
GATTO
VOLATILI
AN SELVATICI
CAVALLO
OVINI
LAGOMORFI
Dati tossicologici di alcune sostanze
STRICNINA
ENDOSULFAN
METALDEIDE
FOSFURO DI ZINCO
COUMARINICI
Shapes: Introductory basics you can't live without
STRICNINA
La stricnina è un alcaloide che si presenta sotto forma di
polvere bianca, cristallina, inodore ed insolubile in acqua.
Si estrae Strychnos nux vomica L. (Fam. Loganiacee’
Pianta arborea originaria delle zone tropicali dell Asia
Tra gli animali domestici i gatti sono quelli più suscettibili alla stricnina. Suini e cani
mostrano la stessa sensibilità, mentre gli equini sono capaci di tollerare quantità
relativamente elevate di stricnina. I bovini sono molto resistenti all’ingestione di stricnina,
presumibilmente dovuto alla parziale distruzione che ne effettuano nel rumine.
La dose letale di stricnina negli animali è compresa tra 0.2 e 1.0 mg/kg:
Nei cani va da 0.5 e 0.8 mg/kg
la stricnina determina delle alterazioni a carico della muscolatura
scheletrica con iperestensione degli arti e rigidita' della maggior parte
dei muscoli estensori poiche' inibisce l'azione della glicina che e' un
neurotrasmettitore inibitorio.
Cit. TOXNET - Databases
on toxicology,
hazardous
chemicals,
environmental
health, and toxic releases.
Shapes:
Introductory
basics
you can't
live without
http://toxnet.nlm.nih.gov
Endosulfan
Pesticida organoclorurato, usato come insetticida in
agricoltura, in particolar modo nelle coltivazioni di
cotone
E’ costituito dagli isomeri alfa e beta che possono essere
metabolizzati in solfato di endosulfan e diolo di endosulfan.
Dopo ingestione, l’endosulfan è rapidamente assorbito dal tratto gastrointestinale e distribuito ai
reni, al fegato e, in misura minore, ad altri tessuti. L’isomero beta è più facilmente assorbito
dell’isomero alfa.
I cani mostrano sintomi di intossicazione da Endosulfan per ingestione di
pesticida superiori a 200 mgkg.
Salivazione, emesi e convulsioni sono i tipici segnali mostrati.
L’ingestione di circa 8g di endosulfan risulta letale per un bovino entro le 15 ore
successive. Una dose di 8 mg/kg giornaliera per due giorni consecutivi produce
segnali di avvelenamento negli ovini
Cit. TOXNET - Databases
on toxicology,
hazardous
chemicals,
environmental
health, and toxic releases.
Shapes:
Introductory
basics
you can't
live without
http://toxnet.nlm.nih.gov
Metaldeide
La metaldeide è un tetramero ciclico dell’acetaldeide
che si presenta come una polvere bianca dall’odore di
aldeide. Questo composto è un lumachicida molto
efficace e molto usato perché presenta un particolare
tropismo nei confronti dei gasteropodi
Essa è rapidamente assorbita dal tratto gastrointestinale
probabilmente in differenti frammenti di polimeri di acetaldeide
Nei cani tipici sintomi sono emesi, depressione, tremori, perdita di coordinazione,
iperpnea, tachicardia prostazione e cianosi.
Nei gatti i sintomi di tossicità sono simili a quelli dei cani, ma spesso si evidenzia
anche il nistagmo
Gli avicoli mostrano eccitabilità, tremori, spasmi muscolari e diarrea
La dose letale di metaldeide negli animali è compresa tra 100 e 1000 mg/kg:
Nei cani va da 250 e 1000 mg/kg
Cit. TOXNET - Databases
on toxicology,
hazardous
chemicals,
environmental
health, and toxic releases.
Shapes:
Introductory
basics
you can't
live without
http://toxnet.nlm.nih.gov
Fosfuro di zinco
Il fosfuro di zinco è usato come rodenticida. Si presenta sotto
forma di polvere grigia, insolubile in acqua ed in etanolo. e che in
ambiente acido si decompone per dare origine a fosfina.
Il fosfuro di zinco, una volta ingerito reagisce con acqua ed HCl nel tratto
gastro-intestinale per produrre il gas fosfina (PH3), gas altamente
tossico.
La sua tossicità è dovuta proprio al rilascio dopo ingestione di FOSFINA
mentre la componente metallica non sembra mostrare tossicità
La dose letale per bovini, ovini, suini, cani e gatti è compresa tra 20 e 40 mg/kg
Negli avicoli è compresa tra 10 e 30 mg/kg
Cit. TOXNET - Databases
on toxicology,
hazardous
chemicals,
environmental
health, and toxic releases.
Shapes:
Introductory
basics
you can't
live without
http://toxnet.nlm.nih.gov
Coumarinici
Gli anticoagulanti si dividono in sostanze di prima generazione e di seconda
generazione.
Alla prima generazione appartengono warfarin, coumatetralyl. I composti della
seconda generazione includono difenacoum, bromadiolone, brodifacoum
Questi agiscono con due diverse modalità: alterano il processo della coagulazione del sangue ed
inibiscono a livello intestinale la crescita dei microorganismi preposti alla sintesi di Vitamina K.
Questa vitamina, che è coinvolta nell’attivazione di ben quattro fattori della coagulazione: fattore II
(PROTROMBINA), fattore VII (PROCONVERTINA) , fattore IX (FATTORE ANTIEMOFILICO B) e
fattore X (FATTORE DI STUART).
Negli animali domestici i sintomi di avvelenamento compaiono dopo un periodo
che va da 12 ore a parecchi giorni e possono includere sanguinamento gengivale,
sangue nelle urine eccessivo sanguinamento per piccole abrasioni,
La dose letale (es brodifacoum) negli animali è compresa tra 0.05 e 4 mg/kg
Negli cani è compresa tra 0.25 e 3 mg/kg
Cit. TOXNET - Databases
on toxicology,
hazardous
chemicals,
environmental
health, and toxic releases.
Shapes:
Introductory
basics
you can't
live without
http://toxnet.nlm.nih.gov
Farmacocinetica
3 principali processi
A) assorbimento
B) distribuzione nei tessuti
C) eliminazione
Modalità di assunzione:
prevalentemente orale
Shapes: Introductory basics you can't live without
Assorbimento
Organo pH
Stomach
Area
Superficiale
1-3
<5 m2
Small S1 5-7
intestine S2 7-8
200 m2
Colon
<5 m2
7-8
Assorbimento
delIntroductory
tossico nel
tratto
gastro
intestinale
Shapes:
basics
you can't
live without
Eliminazione attraverso il fegato
Shapes: Introductory basics you can't live without
Eliminazione attraverso i reni
Rappresentazione
di un
nefrone
Shapes: Introductoryschematica
basics you can't
live
without
Metabolizzazione
La metabolizzazione è parte integrante
dell’eliminazione del tossico
Queste biotrasformazioni avvengono principalmente a
livello epatico e anche renale.
A) Trasformazioni sintetiche o coniugazioni
B) Trasformazioni non sintetiche
Shapes: Introductory basics you can't live without
Trasformazioni sintetiche o coniugazioni
Glicuronazione
Solfatazione
Glicil coniugazione
Acetilazione
Metilazione
Trasformazioni non sintetiche
Ossidazioni
Riduzioni
Idrolisi
Shapes: Introductory basics you can't live without
Endosulfan
Shapes: Introductory basics you can't live without
Parathion
Fosfuro di zinco
Zn3P2 + 6H+
2PH3 + 3 Zn2+
Shapes: Introductory basics you can't live without
Quali matrici?
Matrici non omogenee
Esche
Stomaco, contenuto gastrico, vomito: Campione essenziale nella
procedura di screening, contiene normalmente la dose più alta
di tossico in seguito ad un’assunzione per via orale
Sangue: contiene il tossico ed i suoi metaboliti, è un buon
campione nel caso di avvelenamento da gas o composti volatili,
se il campione viene adeguatamente conservato.
Urine: via di eliminazione del tossico e dei metaboliti
Shapes: Introductory basics you can't live without
Quali matrici?
Fegato: I tossici e loro metaboliti tendono ad essere presenti nel
fegato in concentrazione più elevata rispetto alla concentrazione
nel sangue.
Reni: nel caso di avvelenamento da metalli, i reni mostrano danni
evidenti, e il tossico tende ad accumularsi in questo tessuto. Nel
caso di tossicità cronica l’ accumulo avviene a livello dei capelli
ed ossa
Shapes: Introductory basics you can't live without
Tabella matrici
Tabella matrici
Tabella matrici
Tabella matrici
ESCA
ESAME VISIVO
METODO
ANALITICO
In caso di decesso dell’animale
prelievo di altre matrici
Dati relativi
alla Provincia
L. R 39/2001
Sintomi clinici
dati necroscopici
Tossico o suoi metaboliti
Matrice
Metodo di Analisi
Tecniche analitiche
Saggi colorimetrici
Fosfuri: (Alluminio, Magnesio, Zinco e Calcio)
MxPy + H+
yPH3 + Mx+
Bumbrah G.S., et al. “Phosphide poisoning: a review of literature”Forensic Sci Int
214(2012) 1-6
Metaldeide:
Con acido solforico e guaiacolo→
→sviluppo colorazione fucsia
Matrici principali:
Esche, Contenuto gastrico
Shapes: Introductory basics you can't live without
Tecniche analitiche
ANALITI
TECNICA
MATRICE
Metalli
ICP MS
Esca, fegato, rene,
contenuto gastrico
Pesticidi
(Organoclorurati,
organofosforati, piretroidi,
carbammati…)
Esca, fegato, contenuto
gastrico
GC MS
Esca,contenuto gastrico
Fosfuro di zinco
Rodenticidi
(derivati della cumarina
ed altri)
Pesticidi basso bollenti
Esca, fegato
HPLC MS
Esca, fegato, contenuto
gastrico
Shapes: Introductory basics you can't live without
Tecniche analitiche: estrazione
Mineralizzazione a microonde
in ambiente acido
METALLI
Estrazione in GPC
PESTICIDI
Metodo QuEChERS
Estrazione Colonne SPE
RODENTICIDI
Metodo QuEChERS
Shapes: Introductory basics you can't live without
Tecniche analitiche: estrazione
QuEChERS (Quick, Easy, Cheap Effective, Rugged, Safe)
Step 0
Omogeneizzazione del campione
di fegato
Step 1
Trasferimento di 3g nella provetta QuEChERS di
estrazione e aggiunta 12 ml di acqua
Step 2
Step 3
Step 4
Step 5
15 ml di 1% AcOH in MeCN. Aggiunta della
fase QuEChERS di estrazione
(MgSO4+ NaOAc).
Trasferimento di 8 ml del surnatante nelle
provette QuEChERS d-SPE
(PSA + MgSO4). Purificazione con florisil
Evaporazione di 4 ml a 50°C con N2 fino al
volume di 0.3-0.5 ml. Aggiunta di toluene
fino a 1 ml
Analisi GC-MS/ HPLC MS
Lehotay S. J., (2007) J. AOAC INT 90,2, 485-520;
Murphy L. et al., (2010) J. Anal Toxicol vol 34 june 273-279
Shapes: Introductory basics you can't live without
RT: 0.0 0 - 31 .0 0
Cromatogramma di
un campione di fegato
di cane
estratto in GCP
95
90
85
80
75
70
65
60
R
e
la
tiveA
bu
n
da
nc
e
NL :
3 .16 E8
TIC F:
MS
1 8 7 43 -2
2 0 .6 0
100
1 8 .36
1 8 .6 8
20 .1 4
1 9 .9 7
2 0 .80
55
(gel permeation
chromatography)
50
45
40
2 1.9 1
35
2 2 .5 1
2 7 .30
1 6 .1 5
30
25
20
1 6 .2 6
15
2 4 .3 1
2 4 .7 1
2 2.8 0
10
1 1 .9 5
9 .9 0
5
8 .6 2
9 .2 9
2 9 .72
3 0 .4 0
2 3 .4 0
1 2.1 8
2 8 .3 0
2 5 .7 2
10 .5 5
1 3 .5 4
15 .7 1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tim e (m in)
18
20
22
24
26
28
30
R T: 0.00 - 31.01
N L:
3.39E8
TIC F: MS
8099
21.10
20.98
100
95
Cromatogramma di
un campione di fegato
di cane
estratto con i
QuEChERS
90
85
80
75
70
65
RelativeAbundance
60
55
50
21.20
18.99
45
40
35
22.96
30
25
20
24.85
15
27.86
10
23.18
5
10.42
8.69
11.08
14.06
9.15
16.49
16.00
18.53
17.85
21.40
20.07
23.48
25.25
29.79
27.78
30.06
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tim e (m in)
18
20
22
24
26
28
30
Conclusioni
•Campioni omogenei
(fegato e rene)→metodi quantitativi
•Campioni non omogeni
(esche, contenuto gastrico)→metodi qualitativi
•Accreditamento delle prove
•Per ottenere buoni risultati nelle analisi tossicologiche
restano fondamentali alcune informazioni quali:
sintomatologia e dati necroscopici
•Informatizzazione dei dati relativi alle schede di
accompagnamento (O.M 10/02/2012)
Shapes: Introductory basics you can't live without
Collaboratori
-Claudia Focardi
-Martina Fortini
-Chiara Giannetti
Shapes: Introductory basics you can't live without