doc1Mb
download 
Reclamo Transcript
1Mb
LA BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA VALUTAZIONE DI STABILITÀ DEGLI ALBERI Giovanni Nicolotti e Paolo Gonthier Università degli Studi di Torino Dipartimento di Valorizzazione e Protezione delle Risorse Agroforestali Flormart Padova 16 Febbraio 2007 1 Perenniporia fraxinea Ganoderma resinaceum Inonotus hispidus 2 Valutazione della stabilità stabilità delle piante in piedi Metodi di identificazione Identificazione precoce dell’ dell’agente di carie coinvolto Tecniche molecolari •Analisi caratteri macro e micromorfologici dei basidiomi (Bernicchia 2005) Non sempre possibile, identificazione tardiva •Analisi colture miceliari (Nobles 1965; Stalpers 1978) Isolamento in purezza Variabilità morfo-fisiologica Distinzione taxa vicini •Tecniche immunologiche e biochimiche (Jellison and Jasalavich 2000; Clausen 2003) Isolamento in purezza Estrattivi del legno inibitori ELISA 3 Valutazione della stabilità stabilità delle piante in piedi Metodi di identificazione Identificazione precoce dell’ dell’agente di carie coinvolto Tecniche molecolari Specificità Sensibilità Semplicità Introduzione Taxon specific priming multiplexmultiplex-PCR applicata ad estratti di DNA da legno • Impiego primer taxon-specifici disegnati su porzioni di rDNA per l’identificazione di basidiomiceti (Utomo and Niepold 2000; Moreth and Schmidt 2001; Sicoli et al. 2003; Suhara et al. 2005) • Estrazione DNA fungino direttamente da legno (Bahnweg et al. 1998) • Messa a punto di multiplex-PCR: impiego simultaneamente di più primer in una stessa reazione-presenza di più microrganismi da matrici ambientali (Elnifro 2000; Corbiere Morot- Bizot 2004) 4 Taxa selezionati •Armillaria spp. (Agaricales, Marasmiaceae) •Ganoderma spp. (Polyporales, Ganodermataceae) 3 gruppi •Hericium spp. (Russulales, Hericiaceae) •Inonotus/Phellinus spp. (Hymenochaetales, Hymenochaetaceae) •Laetiporus spp.(Polyporales, Polyporaceae) 6 gruppi (Wagner and Fischer 2002) •Perenniporia fraxinea (Polyporales, Polyporaceae) •Pleurotus spp. (Agaricales, Pleurotaceae) •Schizophyllum spp. (Agaricales, Schizophyllaceae) •Stereum spp. (Russulales, Stereaceae) •Trametes spp. (Polyporales, Polyporaceae) Fasi della messa a punto 4. Primer disegnati per le multiplexmultiplex-PCR Primer name Nucleotide sequence (5'-3') Armi2R AAACCCCCATAATCCAATCC Tm1 Location 56°C ITS II Gano2R TATAGAGTTTGTGATAAACGCA 55°C ITS I Heri2R CAGCCCTTGTCCGGCAGT 61°C nuc-LSU Hyme2R TGCDCCCCCTYGCGGAG 60°C – nuc-LSU 64°C HypoR GCTACGCTTAGGGGATGCTA LaetR CCGAGCAAACGAATGCAA PerR ATCTGCAAAGACCGGTAAGGT Pleu2R AACCAGGAAGTACGCCTCAC 60°C nuc-LSU Schi2R CTCCAGCAGACCTCCACTTC 63°C ITS II Ste2R GTCGCAACAAGACGCACTAA 58°C ITS II TraR 60°C ITS II 54°C nuc-LSU 60°C TTCATAGTCTTATGGAAACCGC 58°C ITS II mt-SSU Use in taxon specific PCR Reverse primer with the forward ITS3 Reverse primer with the forward ITS1f Reverse primer with the forward 25sF Reverse primer with the forward F115 Reverse primer with the forward ITS3 Reverse primer with the forward 25sF Reverse primer with the forward ITS3 Reverse primer with the forward 25sF Reverse primer with the forward ITS3 Reverse primer with the forward ITS3 Reverse primer with the forward MS1 25sF TGGCGAGAGACCGATAGC 58°C nuc-LSU Forward primer F115 TAAGCGACCCGTCTTGAAAC 58°C nuc-LSU Forward primer PCR product size (bp) Identified taxon 185 Armillaria spp. 226228 Ganoderma spp. 200 Hericium spp. 111 Inonotus spp.; Phellinus spp. 219 Hypoxylon sp. 146 Laetiporus spp. 152 P. fraxinea. 158 Pleurotus spp. 191 Schizophyllum spp. 234240 Stereum spp. 220 Trametes spp. 5 Fasi della messa a punto 4. Disegno Primer da usare in multiplexmultiplex-PCR Inonotus spp./Phellinus spp. Primer name Nucleotide sequence (5'-3') PCR Use in taxon specific product PCR size (bp) Reverse primer with nuc-LSU 258bp the forward 25sF* Tm1 GC% Location FomR CCCAGCCCATGTATACAATAG 60 48 FuscR 58 61 nuc-LSU IdryaR ACCGACGCATACAACAAAGG 58 50 nuc-LSU InocuR CCTCAGTCCCCGACGGT 60 71 nuc-LSU InssR GGCGCTACATTCCCTCTG 58 61 nuc-LSU PhssR GATGTTGACCCGTCCGAC 58 61 nuc-LSU CACACTCCGAAGAGTGCC Reverse primer with the forward 25sF Reverse primer with the forward 25sF Reverse primer with the forward 25sF Reverse primer with the forward 25sF Reverse primer with the forward 25sF Identified taxon Fomitiporia 225bp Fuscoporia 254bp Pseudoinonotus 265bp Inocutis 214bp Inonotus s.s. 173bp Phellinus s.s. Ganoderma spp. Primer name Nucleotide sequence (5'-3') GaR CAGGCAACAAGTGCGCTC 58 61% ITS1 GlR TTCACGAAGCCCCGCAAG 58 61% ITS1 GrR AAGAGCCCGCTTCACAACG 60 58% ITS1 Tm1 GC% Location Use in taxon PCR Identified taxa specific PCR product size G. australe Reverse primer with 218bp G.applanatum the forward ITS1f Reverse primer with G. lucidum 202 bp the forward ITS1f G. resinaceum Reverse primer with 185 bp G.pfeifferi the forward ITS1f Fasi della messa a punto 1. Scelta delle regioni del rDNA per disegno dei primer 2. Disegno Primer da usare in multiplexmultiplex-PCR 3. Valutazione efficienza e specificità specificità Primer in PCR 4. Sensibilità Sensibilità Taxon specific Primer multiplexmultiplex-PCR Simulazione estrazione di DNA fungino da legno 6 Fasi della messa a punto 7. Sensibilità Sensibilità Taxon specific Primer multiplexmultiplex-PCR M1 M2 M 1P 2P 3P 4P 5P 1Q 2Q 3Q 4Q 5Q C+ M M 1P 2P 3P 4P 5P 1Q 2Q 3Q 4Q 5Q C+ M 1P= 1 ng fungal DNA in wood DNA extract solution of P. hybrida 2P= 0.1 ng fungal DNA in wood DNA extract solution of P. hybrida 3P= 10 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from P. hybrida 4P= 1 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from P. hybrida Species and related isolate used G. resinaceum-FGR1 0.1 pg M1 P. tuberculosus-FPT1 1pg 1pg I. hispidus-FIH2 1pg 1pg 5P= 0.1 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from P. hybrida 1Q= 1 ng fungal DNA in wood DNA extract solution from Q. kellogii 2Q= 0.1 ng fungal DNA in wood DNA extract solution from Q. kellogii M2 3Q= 10 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from Q. kellogii 4Q= 1 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from Q. kellogii 5Q= 0.1 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from Q. kellogii DNA am ount threshold 1 Q. agrifolia P. hybrida PCR protocol tested M3 C+= 1ng fungal DNA C-= no DNA Hypoxylon sp. specific PCR 0.01 pg H. flagellum-654 0.1 pg 0.01 pg P. ostreatus-2470 0.1 pg 0.1 pg L. sulphureus-FLS2 0.1 pg 0.1 pg Armillaria sp.-T4D 1pg 1pg S. hirsutum-DP49 0.1 pg 0.1 pg T. versicolor-2473 1 pg 1 pg S. commune-DP61 0.1 pg 0.1 pg 0.1pg P. fraxinea-FPF5 0.1pg U. deusta-108703 0.1pg 0.1pg Hypoxylon sp.-P1 0.1 pg 0.1 pg Descrizione del metodo Prelievo Carota o tassello di legno Estrazione DNA M1 7 Descrizione del metodo M1 Nuc-rDNA 18 S ITS1 ITS1F ITS2 5.8 S ITS4 Gano2R Fungi 25 S F115 Hyme2R 600-800bp Ganoderma spp. M 1 228bp M Inonotus/ Phellinus spp. 1 2 3 111 bp 1000 1. Trametes versicolor 2. Phellinus punctatus 3. Ganoderma resinaceum L. DNA ladder 100 bp IT S 500 228 200 111 Descrizione del metodo Prelievo Carota o tassello di legno Estrazione DNA •Estrazione non efficiente Inonotus/ Ganoderma spp. Phellinus spp. 111 bp 228 bp 700 bp M1 - Nessun fungo presente M3 M2 8 Descrizione del metodo M2 Nuc-rDNA ITS2 5.8 S ITS3 M 25 S Armi2R 25sF 185bp Armillaria spp. Laetiporus spp. Pleurotus spp. M 2 Hericium spp. 1 2 3 4 LaetR Heri2R Pleu2R 146bp 158bp 200bp 1 0 0 0 1. Armillaria mellea 2. Laetiporus sulphureus 3. Pleurotus ostreatus 5 0 0 2 1 1 1 2 0 0 0 8 5 4 0 5 8 6 4. Hericium flagellum L. DNA ladder 100 bp 1 0 0 Descrizione del metodo M3 Nuc-rDNA ITS2 5.8 S ITS3 PereR 25 S M3 Ste2R M Schi2R P. fraxinea 1 2 3 4 152bp Schizophyllum spp. Stereum spp. 1000 190bp 240bp 500 Mt-rDNA ssu MS1 Trametes spp. 200 TraR 220bp 1. S. hirsutum 2. T. versicolor 3. S. commune 4. P. fraxinea 234 220 190 152 100 9 Descrizione del metodo Prelievo Carota o tassello di legno Mgano Mhyme Estrazione DNA •Estrazione non efficiente Inonotus/ Ganoderma spp. Phellinus spp. 111 bp 228 bp M1 700 bp M3 Nessun fungo presente Schizophyllum spp. Stereum spp. Trametes spp. P. fraxinea M2 Armillaria spp. Hericium spp. Laetiporus spp. Pleurotus spp. - Altro fungo Descrizione del metodo Multi-Hyme Nuc-rDNA ITS2 25 S 25sF PhssR FuscR FomiR InssR Phellinus s.s. Inonotus s.s. Fuscoporia I. dryadeus Fomitiporia Inocutis 173bp IdryaR InocuR (P.tubercolosus, P.igniarius, P.tremulae) (I.andersonii, I.hispidus, I.cuticularis) 212bp 223bp (P.gilvus, P.torulosus) 254bp 258bp 265bp (P.robustus, P.punctatus) (I.dryophilus, I.tamaricis) 10 Descrizione del metodo Multi-Hyme: Genescan analysis P.tubercolosus I.hispidus P.torulosus I.dryadeus P.punctatus I.dryophilus Descrizione del metodo Multi-Gano Nuc-rDNA ITS1 18 S GrR ITS1f 5.8 S GaR GlR G. resinaceum-G. pfeifferi G. lucidum G. applanatumG. australe Multi-gano M 1 2 185bp 3 4 5 6 M 202bp 1000 218bp 1. G. australe 2. G. applanatum 3. G. resinaceum 4. G. pfeifferi 5. G. lucidum 6. G. lucidum M 100 bp 500 218 202 185 100 11 Fomitiporia Fuscoporia Inonotus dryadeus Inocutis Inonotus s.s. Phellinus s.s. Descrizione del metodo G. resinaceumG. pfeifferi G. lucidum G. applanatumG. australe Prelievo Carota o tassello di legno Mgano Mhyme Estrazione DNA •Estrazione non efficiente Inonotus/ Ganoderma spp. Phellinus spp. 111 bp 228 bp 700 bp M3 M2 Armillaria spp. Hericium spp. Laetiporus spp. Pleurotus spp. M1 - Nessun fungo presente Schizophyllum spp. Stereum spp. Trametes spp. P. fraxinea Altro fungo Validazione •118 campioni di legno (tasselli o carote prelevate mediante trivella di Pressler) da piante affette da carie e con carpofori •Risultati attesi 9da analisi visiva dei corpi fruttiferi ritrovati •Risultati ottenuti 9da protocollo messo a punto •Confronto tra i risultati attesi e i risultati ottenuti mediante protocollo molecolare 12 Validazione • Efficienza metodo nell’ nell’individuazione del fungo agente di carie direttamente da legno 8% 4% 88% individuazione fungo agente di carie no funghi individuati fungo contaminante o saprofita Validazione • Efficienza metodo nell’ nell’individuazione del fungo agente di carie direttamente da legno • Specificità Specificità del metodo 1 107 amplifcazione aspecifica no amplificazioni aspecifiche 13 Validazione • Efficienza metodo nell’ nell’individuazione del fungo agente di carie direttamente da legno • Specificità Specificità del metodo • Individuazione simultanea di più più taxa Validazione • Efficienza metodo nell’ nell’individuazione del fungo agente di carie direttamente da legno • Specificità Specificità del metodo • Individuazione simultanea di più più taxa • Specificità Specificità: MultiMulti-Hyme (49/49 (49/49)) MultiMulti-Gano (15/15 (15/15)) 14 Applicazioni e prospettive • metodo complementare per affinare VTA Analisi da carote di legno estratte con trivella di Pressler Presenza agente fungino anche ad uno stadio precoce di colonizzazione Previsione dell’evoluzione del processo cariogeno all’interno della pianta • metodo di controllo fitosanitario Standardizzazione metodo di campionamento Più approfondita conoscenza relazioni specie fungina/specie ospite • metodo per studi ricerca di base e applicata Esempio applicativo Armillaria Controlli negativi Controllo positivo di Armillaria 15 Esempio applicativo E A B F C D Pianta (schiantata) con presenza di Armillaria Pianta con presenza di Ganoderma Pianta con presenza di Perenniporia Pianta sana Pianta non esaminata Pianta non esaminata – sostituzione (giovane esemplare) INFORMAZIONI Laboratorio di Patologia Forestale c.a. Prof. Giovanni NICOLOTTI Università di Torino – DI.VA.P.R.A. Patologia Vegetale Via Leonardo da Vinci 44 – 10095 GRUGLIASCO (Torino) [email protected] 16
