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ISSN 0394 3291
Caleidoscopio
Italiano
Serie Mosaici Romani
Riccardo Morganti
Mauro Pistello
Marialinda Vatteroni
Monitoraggio
dell’efficacia dei
farmaci antivirali
Ruolo del laboratorio di virologia
Direttore Responsabile
Sergio Rassu
129
Via Rio Torbido, 40 - Genova (Italy) Tel. 010 83.401
Stampato a Genova 1999
R. Morganti, M. Pistello, M.L.Vatteroni
II
Caleidoscopio
Monitoraggio dell’efficacia dei farmaci antivirali
Caleidoscopio
Italiano
Riccardo Morganti
Mauro Pistello
Marialinda Vatteroni
Unità Operativa di Virologia
Azienda Ospedaliera
Pisa
Serie Mosaici Romani
Monitoraggio
dell’efficacia dei
farmaci antivirali
Ruolo del laboratorio di virologia
Sergio Rassu
129
Via Rio Torbido, 40 - Genova (Italy) Tel. 010 83.401
Stampato a Genova 1999
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1) Björklund B., Björklund V.: Proliferation marker concept with TPS as a model. A preliminary report. J. Nucl.
Med. Allied. Sci 1990 Oct-Dec, VOL: 34 (4 Suppl), P: 203.
2 Jeffcoate S.L. e Hutchinson J.S.M. (Eds): The Endocrine Hypothalamus. London. Academic Press, 1978.
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Dott. Sergio Rassu
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Italiano
Editoriale
L
e infezione virali possono essere affrontate con diversi interventi che
comprendono i vaccini (preventivi, terapeutici e perinatali), la sieroterapia e la chemioterapia.
Qualunque sia il tipo di intervento attuabile o scelto, è importante la valutazione del paziente e soprattutto dello stato dell’infezione. Nel caso infatti
in cui l’opzione sia rappresentata dalla chemioterapia dell’infezione in atto,
è fondamentale valutare la risposta anche in considerazione del fatto che i
farmaci antivirali utilizzati si associano ad effetti collaterali non irrilevanti e
possono essere costosi.
Probabilmente quest’ultimo aspetto, che per una mancata attenzione dei
sanitari passa inosservato, dovrebbe invece richiedere una considerazione
maggiore se si tiene conto che il 20% del budget della spesa farmaceutica di
una Azienda Ospedaliera può essere tranquillamente assorbito per l’acquisto di farmaci antivirali per il trattamento di due sole condizioni patologiche: l’AIDS e le epatopatie croniche di eziologia virale. Una situazione a
dir poco allarmante se si tiene conto che questa spesa è destinata ad aumentare con l’incremento della terapia e delle indicazioni al trattamento antivirale.
Il laboratorio quindi può essere estremamente prezioso a questo scopo e
la razionalizzazione della terapia attraverso un obiettivo monitoraggio dei
risultati ottenuti costituisce un obbligo per tutti noi.
Questa monografia, prendendo lo spunto da questa situazione finisce per
sintetizzare quelle che sono oggi le metodiche diagnostiche in campo virologico: ricerca di antigeni virali, PCR, NASBA, bDNA, sistema a cattura di
ibrido, genotipizzazione, offrendo un quadro completo, sintetico e chiaro.
Le infezioni virali prese in esame in questa monografia sono le più rilevanti sia dal punto di vista epidemiologico che terapeutico: le infezioni da
HIV-1, da HCV e da CMV.
Il Dr. Riccardo Morganti, che abbiamo già avuto modo di conoscere ed
apprezzare quale Autore del Caleidoscopio dedicato alla “Diagnostica
molecolare rapida delle infezioni virali”, è laureato in Scienze Biologiche e
Specialista in Microbiologia e Virologia.
Caleidoscopio
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Ha frequentato prima i laboratori dell’Istituto Nazionale per la Ricerca sul
Cancro e quindi quelli dell’Istituto di Biologia Cellulare del CNR di Roma
per approfondire le conoscenze sulle tecniche di biologia molecolare applicate alla diagnostica.
Ha insegnato per alcuni anni Strumentazione di Laboratorio e Patologia
molecolare presso la Scuola per Tecnici di Laboratorio dell’Azienda Ospedaliera di Pisa e collabora all’insegnamento di Tecniche virologiche presso il
Corso di Diploma Universitario per Tecnici di Laboratorio Biomedico dell’Università di Pisa. Attualmente presta servizio presso l’U.O. Universitaria
di Virologia dell’Azienda Ospedaliera di Pisa. E’ autore di oltre 50 tra pubblicazioni su riviste e comunicazioni a congressi.
Il Dr. Mauro Pistello è laureato in Scienze Biologiche e Dottore di Ricerca
in Immunobiologia dei virus. Durante Il Dottorato di Ricerca ha frequentato
il Laboratory of Virology, Department of Virology, Institute of Infectious Diseases and Immunology, Veterinary Faculty, State University of Utrecht
(NL) e Il Major Research Council Laboratory, Department of Veterinary Pathology, Veterinary School, University of Glasgow (UK).
Attualmente è Ricercatore universitario presso il Dipartimento di Biomedicina Sperimentale Infettiva e Pubblica dell’Università di Pisa e svolge attività assistenziale in qualità di Ricercatore universitario presso l’U.O. Universitaria di Virologia dell’Azienda Ospedaliera di Pisa.
Nel 1996 è risultato vincitore del premio G. B. Rossi quale miglior giovane
ricercatore italiano distintosi nel campo della ricerca sull’AIDS nel 1995. E’
socio di Istituti e Società scientifiche di rilievo internazionale ed è autore di
oltre 70 pubblicazioni e 100 comunicazioni a congressi.
La Dr.ssa Marialinda Vatteroni è laureata in Medicina e Chirurgia,
Specialista in Ematologia e Dottore di Ricerca in Patologia Sperimentale e
Molecolare. Per circa un anno ha lavorato in Francia nei laboratori di ricerca
dell’Unità 25 INSERM diretta dal Prof. Jean Hamburger, sotto la guida dei
Prof. Jean F. Bach e Martine Papiernik, usufruendo di due borse di studio
CNR/INSERM, ha quindi frequentato i laboratori dell’Istituto Nazionale
per la Ricerca sul Cancro di Genova allo scopo di approfondire le conoscenze sulle biotecnologie. Attualmente è Dirigente di I livello presso l’U.O. Universitaria di Virologia dell’Azienda Ospedaliera di Pisa. E’ autrice di oltre
60 tra pubblicazioni su riviste nazionali ed internazionali e comunicazioni a
congressi.
Sergio Rassu
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R. Morganti, M.Pistello, M.L. Vatteroni
Introduzione
Sebbene numerose ed importanti infezioni e malattie virali che colpiscono l’infanzia e gli adulti possano essere prevenute o controllate efficacemente attraverso l’impiego di vaccini e/o sieri opportuni, alcune di esse, per diverse ragioni, non possono essere combattute con tali mezzi.
Ne sono un esempio le affezioni sostenute dai rinovirus, dal citomegalovirus (CMV) e da altri virus herpetici, dal virus dell’immunodeficienza
umana tipo 1 (HIV-1) e da altri retrovirus, dal virus dell’epatite C (HCV) e
da diversi agenti virali presenti in aree tropicali e subtropicali come pure,
per certi versi, dai virus influenzali (Bendinelli et al, 1992 ).
I principali ostacoli all’impiego di vaccini e/o di sieri per combattere determinate infezioni e malattie virali sono rappresentati dalla proprietà che alcuni virus posseggono di produrre infezioni latenti come i virus herpetici, alcuni virus dell’epatite e i retrovirus, dalla capacità di andare incontro a cambiamenti antigenici come HIV-1 ed i virus influenzali ed anche dalla molteplicità dei sierotipi presentata da alcuni virus come i rinovirus e i togavirus.
Per il controllo delle malattie virali per le quali non sono realizzabili
immunoprofilassi ed immunoterapie efficaci, numerosi sforzi sono stati e
vengono attualmente compiuti al fine di individuare farmaci in grado di
interferire con la moltiplicazione virale la quale, direttamente o indirettamente, rappresenta la causa del danno a carico dell’ospite.
Il farmaco antivirale ideale dovrebbe essere in grado da un lato di arrestare la moltiplicazione virale prima che questa raggiunga un’estensione critica e, dall’altro, di ripristinare le funzioni compromesse nelle cellule infettate
senza esercitare nel contempo azioni tossiche di rilievo nei riguardi dell’ospite.
Purtroppo non esiste attualmente alcun farmaco dotato di queste caratteristiche ed è verosimile che anche in futuro difficilmente si possa disporre di
una sostanza che, grazie alla sua azione, consenta di recuperare le cellule
infettate; infatti la compromissione di macromolecole e di funzioni cellulari
avviene precocemente nella maggior parte delle infezioni virali.
Inoltre, data la particolare biologia dei virus, esistono difficoltà consistenti per ottenere l’inibizione selettiva di funzioni virali senza che vengano intaccate quelle cellulari; infatti a differenza di quanto è possibile nel controllo
della moltiplicazione e della vitalità dei batteri (dove i bersagli sono rappresentati da caratteristiche metaboliche, strutturali e molecolari che si diversificano significativamente da quelle presentate dalle cellule animali), nel
controllo della moltiplicazione virale i punti di attacco differenziale sono
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limitati dal fatto che la replicazione virale* è la risultante dell’espressione di
geni virali e cellulari.
Infine, in analogia con quanto avviene nel trattamento chemioterapico
delle infezioni batteriche, un’altra importante limitazione della terapia antivirale è costituita dall’insorgenza di mutanti resistenti; come pure in quel
caso, la loro selezione sarà impedita o rallentata facendo riferimento agli
stessi principi: dosaggio adeguato dei farmaci, impiego di più sostanze ove
possibile, somministrazione solo nei casi chiaramente diagnosticati, ecc.
L’interesse nei confronti della chemioterapia antivirale risale agli anni ‘50
in seguito alla scoperta di agenti antitumorali in grado di inibire la sintesi
del DNA e all’individuazione di composti che producevano lo stesso effetto
sul DNA virale (Bean, 1992). I primi farmaci antivirali, il tiosemicarbazone e
la iodoxuridina, sono stati somministrati negli anni ‘60. Verso la fine degli
anni ‘70 è stato prodotto e impiegato nel trattamento di numerose infezioni
da virus herpetici l’acyclovir, il primo farmaco non tossico per l’uomo.
I progressi, tuttavia, sono risultati lenti per la difficoltà di selezionare
composti capaci di interferire solo con la replicazione virale.
L’epidemia di AIDS della fine degli anni ‘80 e dell’inizio degli anni ‘90 e
la scoperta di protocolli terapeutici per il trattamento delle epatiti croniche
da HCV hanno generato da un lato un forte incremento nello sviluppo, nella
produzione e nell’impiego dei farmaci antivirali e dall’altro la conseguente
necessità di selezionare agenti effettivamente più attivi nonché meno tossici
e terapie, combinate e non, più efficaci.
In questo contesto il laboratorio di virologia acquista un ruolo importante
poichè è in grado di fornire ai clinici informazioni quali il valore della carica
virale, di particolare rilevanza nel monitoraggio dell’efficacia della terapia.
In genere nei laboratori di virologia clinica vengono effettuate indagini
per monitorare l’efficacia del trattamento chemioterapico soprattutto delle
infezioni da HIV-1, da CMV in quanto agente opportunistico nei pazienti
immunocompromessi e da HCV.
*Il ciclo di replicazione virale si divide in varie fasi:
1 - adsorbimento del virione alla superficie della cellula ospite;
2 - penetrazione e scapsidamento;
3 - trascrizione e traduzione degli RNA messaggeri virali;
4 - replicazione degli acidi nucleici virali;
5 - assemblaggio e fuoriuscita del virione maturo dalla cellula.
E’ nella fase di sintesi dell’acido nucleico che i processi virali possono divergere
significativamente da quelli cellulari dal momento che spesso entrano in azione enzimi virusspecifici.
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Caleidoscopio
Queste indagini consistono nella valutazione quantitativa di antigeni
virali mediante saggi immunoenzimatici (ELISA) e in immunofluorescenza
(IFA) e di genomi virali con tecniche di ibridazione degli acidi nucleici
(Morganti, 1996) come la Reazione a Catena della Polimerasi Quantitativa
(Q-PCR), la Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA), la
Branched DNA Signal Amplification (bDNA) e il Sistema a Cattura di Ibrido
(HCS) (tabella 1). L’individuazione del genotipo virale infettante e di
mutanti farmaco-resistenti viene effettuata mediante sequenziamento o
tramite particolari applicazioni delle tecniche di amplificazione genomica.
Virus
CMV
Materiale patologico
Indagini virologiche
Ricerca di antigeni
Ricerca di acidi nucleici
LSP*
IFA per p72**
Q-PCR,NASBA, bDNA, HCS
LSP
IFA per pp65***
plasma
HIV-1
plasma
HCV
plasma
Q-PCR
ELISA per p24
Q-PCR,NASBA, bDNA
Q-PCR, bDNA
Per la ricerca di genotipi e mutanti resitenti ai farmaci si impiega il LiPA (Line Probe Assay).
*LSP. Leucociti del sangue periferico.** La ricerca della p72 viene effettuata dopo coltura rapida
su fibroblasti in shell vial: viremia. ***La ricerca della pp65 viene effettuata direttamente negli
LPS: antigenemia
Tabella 1. Indagini virologiche in grado di misurare la carica virale prima,
durante e dopo una terapia con farmaci antivirali.
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Infezione da HCV
Il farmaco attualmente in uso per la terapia delle epatiti croniche da HCV
è l’α-interferone (α-IFN). La terapia “standard” con α-IFN (dose di 3MU
somministrata 3 volte alla settimana per 6 mesi) non dà risultati completamente soddisfacenti dal momento che i responders rappresentano solo il 20%
di tutti i pazienti trattati (Rumi et al, 1996). La tendenza attuale, che sembra
produrre risultati incoraggianti (Saracco et al, 1996; Rossi et al, 1996) è quella
di utilizzare trattamenti prolungati e dosi più elevate rispetto a quelle
impiegate in passato. Tuttavia, in queste condizioni, i problemi di intolleranza riferibili a sintomatologia clinica, crasi ematica e reazioni immunogeniche possono avere incidenza elevata. Del tutto recentemente le possibilità terapeutiche delle epatiti croniche da HCV si sono allargate con l’introduzione, almeno in via sperimentale, di farmaci antivirali come la ribavirina,
che associata all’INF, sarebbe in grado di aumentare le risposte durature con
riduzione delle ricadute frequentemente osservate alla sospensione dell’IFN
stesso (French Multicenter Study Group, 1996).
Interferone
L’infezione delle cellule con la maggior parte dei virus a DNA e ad RNA
induce la sintesi ed il rilascio di interferoni simili. Il componente chiave
nell’induzione della sintesi è l’RNA a doppio filamento (dsRNA). La replicazione di un virus in una cellula comporta la sintesi di RNA virali, in forma di
RNA genomico o messaggero; benché i dsRNA siano spesso solo un sottoprodotto della replicazione virale essi sono presenti in quantità più o meno
abbondanti e sono quindi in grado di stimolare la produzione di IFN. L’IFN
fa parte di una famiglia di glicoproteine ed è prodotto da diversi tipi di
cellule in diverse condizioni.
In risposta all’infezione virale i linfociti sintetizzano principalmente αIFN, mentre l’infezione di fibroblasti induce abitualmente la produzione di
β-IFN. Esiste poi un terzo tipo di IFN detto γ-IFN che non viene indotto
dall’infezione virale ma è sintetizzato dai linfociti in risposta a mitogeni.
L’IFN non protegge la cellula dall’infezione virale direttamente ma,
piuttosto, altera il metabolismo cellulare in vari modi, rendendo la cellula
stessa un ospite meno adatto alla replicazione virale (stato antivirale).
L’infezione virale, in cellule trattate con IFN, viene bloccata in vari stadi del
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Caleidoscopio
ciclo successivi all’adsorbimento ed alla penetrazione del virus. Vengono
ridotti i livelli del genoma virale e della sintesi di mRNA e la traduzione
viene anch’essa repressa. Sono stati configurati due meccanismi per tentare
una spiegazione dello stato antivirale.
1°. L’IFN induce la sintesi di una proteina chinasi che, in presenza di
dsRNA, fosforila il fattore d’inizio della sintesi proteica eIF-2 rendendolo
inattivo.
2°. L’IFN induce anche la sintesi dell’enzima 2’,5’-oligo A sintetasi;
questo enzima attivato da dsRNA, prende parte ad una via metabolica che
alla fine comporta l’attivazione di una ribonucleasi (RNasi L) e quindi la
degradazione di RNA a singolo filamento.
Ribavirina
E’ simile alla guanosina nella struttura (figura 1) e nella funzione
O
N
H2N
N
N
RIBAVIRINA
O
HO
OH
OH
O
O
CH3
HN
O N
l
5
HO O
3l
NH2
N
HN
N
N
N
HO
O
HO
O N
O
N3
ddI
AZT
O
O
N
HN
H2N
HO
N
N
5
l
ddC
O
N
HN
H 2N
HO
N
5l
O
3
l
O
O
O P C
O
O
3 Na +
OH
ACYCLOVIR
GANCICLOVIR
FOSCARNET
Figura 1. Alcuni farmaci antivirali.
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(Streeter et al, 1973). E’ attiva contro una grande varietà di virus a DNA e ad
RNA. E’ trasformata nelle cellule eucariotiche in mono-, di- e trifosfato
(Streeter et al, 1973). La ribavirina-monofosfato è un potente inibitore della
inosina-monofosfato deidrogenasi essenziale per la sintesi del nucleotide
GTP (Streeter et al., 1973). Inoltre inibisce la formazione del c a p p i n g
dell’mRNA virale (Goswami et al, 1979) che rappresenta una fase critica
nella replicazione della maggior parte dei virus. Come trifosfato è in grado
di inibire anche la RNA polimerasi dei virus influenzali (Eriksson et al,
1977). Somministrata da sola, la ribavirina si è dimostrata efficace nel ridurre
i livelli di Alanina Transaminasi (ALT) nei pazienti con infezione cronica da
HCV paradossalmente senza modificare i livelli sierici di HCV-RNA. Tutti i
pazienti trattati sono andati incontro a recidiva dopo sospensione del
trattamento (Reichard et al, 1991; Di Bisceglie et al, 1992). Studi successivi di
piccole dimensioni, in cui è stata impiegata la ribavirina in associazione con
IFN, hanno dimostrato un significativo effetto sinergico dei due farmaci che
si esplica soprattutto nel recupero di pazienti andati incontro a relapse dopo
il primo ciclo di IFN da solo (Kakumu et al, 1993; Brillanti et al, 1994).
Fattori che influenzano la risposta alla terapia
La risposta alla terapia con IFN è dipendente da alcuni fattori legati alle
caratteristiche dell’ospite e della terapia stessa, ma anche ai livelli di viremia
e al genotipo del virus* (Tsubota et al, 1994; Pagliaro et al, 1994).
Elevati livelli di viremia influenzano in modo negativo la risposta all’IFN,
mentre livelli basali di viremia inferiori a 3,5x105 genomi equivalenti per ml
di siero o plasma sono associati in modo statisticamente significativo** a
risposte più durature (Lau et al, 1993).
*Il confronto delle sequenze di numerosi isolati di HCV ha permesso di dimostrare
l’esistenza di gruppi di virus definiti genotipi che presentano un livello di divergenza tra
sequenze genomiche pari al 35%; sono stati identificati almeno sei genotipi (1-6) che si
suddividono in sottotipi (a, b, c). In Italia prevalgono i genotipi 1b e 2c.
**Una diminuzione della carica virale almeno di 1 log10 entro una settimana dall’inizio del
trattamento sembra rappresentare un fattore prognostico favorevole.
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Caleidoscopio
Il genotipo 1 (1a, 1b), maggiormente rappresentato in Italia (75%),
manifesta una scarsa propensione alla risposta duratura all’IFN. Percentuali
di risposta sensibilmente più elevate si ottengono nei soggetti infettati con i
genotipi 2a, 2b, 3 (Martinot-Peignoux et al, 1995). Per il genotipo 2c, molto
prevalente in Italia (Pistello et al, 1994; Cammarota et al., 1995) non esistono
ancora informazioni consolidate.
Dosaggio sierico di HCV-RNA
Il dosaggio sierico di HCV-RNA è quindi indispensabile per consentire
un intervento terapeutico più mirato in quei soggetti che hanno maggiori
possibilità di risposta alla terapia con IFN da solo o in associazione ad antivirali come la ribavirina e per accertare una guarigione definitiva*.
La valutazione della carica virale di HCV nel siero o in altri materiali
patologici può essere effettuata con PCR quantitativa o con bDNA. Per la
determinazione del genotipo e del sottotipo si ricorre al sequenziamento o a
tecniche alternative quali la RT-PCR seguita da digestione enzimatica
dell’amplificato (RFLP) o da ibridazione con sonde tipo e sottotipo specifiche
adese su micropiastra (DEIA) o su nitrocellulosa (LiPA) e la RT-PCR con
primers tipo e sottotipo specifici.
*In un recente studio italiano (Chemello et al, 1996) il 100% dei pazienti HCV-RNA negativi
al termine del trattamento e dodici mesi dopo, sono risultati guariti da epatite C in controlli
sequenziali condotti lungo un arco di quattro anni (responders). Al contrario il 50% dei pazienti
che rimanevano HCV-RNA positivi, aveva avuto una ripresa dell’epatite durante i quattro anni
di follow-up (non-responders).
Caleidoscopio
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Infezione da HIV-1
L’eradicazione di HIV-1 rimane un obiettivo primario ma a tutt’oggi non
raggiunto. Negli ultimi anni sono stati compiuti importanti progressi nella
conoscenza della patogenesi della malattia da HIV-1 (Pantaleo et al, 1993),
nello sviluppo di tecniche virologiche utili per il monitoraggio della replicazione virale (Ho et al, 1995) e nell’introduzione nella terapia antiretrovirale
di nuovi farmaci quali gli inibitori non nucleosidici della trascriptasi e gli
inibitori della proteasi. Alcuni di questi farmaci sono già entrati nella pratica
clinica, altri saranno registrati anche in Italia nei prossimi mesi, altri ancora
sono in avanzata fase di sperimentazione.
Inibitori della trascriptasi inversa (RTI)
La trascriptasi inversa (RT) svolge un ruolo fondamentale nel ciclo di
replicazione di HIV-1 in quanto catalizza la trascrizione da RNA a DNA che,
attraverso una integrasi virale, si inserisce nel genoma della cellula ospite
(DNA provirale).
a) Analoghi dei substrati (nucleosidici)
Vengono anche detti inibitori dell’RT analoghi dei nucleosidi (NRTI) o
analoghi 2’,3’-didesossinucleosidici e sono caratterizzati dalla sostituzione
del radicale -OH in posizione 3 dell’anello saccaridico di desossinucleosidi
pirimidinici o purinici con azoto, idrogeno o fluoro. I più noti della serie
sono la zidovudina (AZT), la didanosina (ddI), la zalcitabina (ddC) (figura
1), la stavudina (D4T) e la lamivudina (3TC). L’attività dell’AZT e degli altri
quattro agenti prevede la preliminare fosforilazione nella forma trifosfato ad
opera di chinasi cellulari (Furman et al, 1986). Tale fosforilazione si realizza
più efficacemente nelle cellule infettate che non in quelle normali.
Schematicamente sembrano esistere due meccanismi attraverso i quali
l’AZT e gli altri composti possono interagire con il bersaglio:
1 - inibizione dell’RT attraverso un processo di competizione rispetto al
substrato naturale; l’AZT compete infatti con il dTTP legandosi alla RT
molto più efficacemente del suo naturale competitore e costituendo perciò il
substrato preferito (Furman et al, 1986; St. Clair et al, 1987). L’inibizione
dell’RT avviene ad una concentrazione pari a 1/100 rispetto a quella necessaria per inibire la DNA polimerasi cellulare (Furman et al, 1986);
2 - interruzioni della catena di DNA dopo incorporazione all’estremità 3’
(Furman et al, 1986; St. Clair et al, 1987; Yarchoan et al, 1989); ad es. nell’AZT
il posto dell’idrossile in posizione 3 dell’ anello saccaridico è occupato da un
azido-gruppo (N 3 ) che perciò impedisce il legame a qualsiasi altro nucleotide.
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Caleidoscopio
b) Analoghi non nucleosidici
Gli inibitori dell’RT analoghi non nucleosidici (NNRTI) non interagiscono con i siti leganti il substrato della DNA polimerasi, sia RNA dipendente o
DNA dipendente, e perciò è da ritenere che siano meno tossici degli NRTI
(De Clercq 1992, 1993). Quelli maggiomente impiegati, tra cui la nevirapina e
la delavirdina, sono rappresentati in figura 2.
S
H
N
R
O
CH
N
CH3
R’
HN
CH3
9 8
N
N
O
C
CH
CH2
R
CH3
CH 3
CH3
X
O
R’
HEPT
TIBO
X=S
R= H; R=9-Cl; R=8-Cl
CH3
R=H R’=CH3
X=CH2
R=CH3 R’=H
R
O
H
N
N
CH 2
H3C
N
N
R,R’=H
X=CH2
X
O
N
H3 C
Nevirapina
R
O
N
H
Piridinone
X=CH2
R=H
X=NH
R=Cl
O
R
N
O
Si
CH3
CH3
CH
O
O
NH
H 2N
R
O
N
N
H
CH3
N
N
O
O
Si
S
N
O
O
BHAP
TSAO
R=H: Atevirdina
R=H
R=NHSO2CH3: Delavirdina
R=CH3
CH3
NH2
O
Br
Cl
S
N
H
Cl
α-APA
COCH3
N
N
H
N
H
N
PETT
Figura 2. Alcuni Inibitori Non Nucleosidici della Trascriptasi Inversa di
HIV-1 (NNRTI).
Caleidoscopio
13
R. Morganti, M. Pistello, M.L. Vatteroni
Inibiscono la trascrizione dell’RNA a DNA ad opera dell’RT ma in modo
non competitivo rispetto al substrato e al complesso stampo-primer (De
Clercq, 1995). Interagendo con un sito dell’enzima diverso dal sito di legame
del substrato alterano la conformazione della molecola enzimatica in modo
tale da provocare un’inattivazione reversibile del sito catalitico.
Inibitori della proteasi
Gli inibitori dell’RT possono prevenire la formazione di nuove molecole
di DNA provirale in cellule non ancora infettate da HIV-1 ma non possono
prevenire la riattivazione del virus nelle cellule già infettate dal momento
che l’RT non è coinvolta in questo processo. I prodotti dei geni gag e pol, tra
cui la RT, sono sintetizzati come polipeptidi precursori. Queste molecole
vengono poi tagliate e processate prima di essere impaccate nel virione maturo. La proteasi di HIV-1, un’aspartico proteinasi codificata dal gene pol, è
responsabile di questi processi ed è essenziale quindi per l’assemblaggio e la
maturazione dei virioni.
Sono stati identificati in questi ultimi tempi agenti capaci di prevenire la
riattivazione del virus poichè interferiscono con fasi avanzate del ciclo di
replicazione di HIV-1. Alcuni di questi agenti costituiscono un gruppo detto
degli inibitori della proteasi (PI) (figura 3). Si tratta di composti peptidomimetici dello stato di transizione della reazione enzimatica che, sostituendosi
al naturale substrato, determinano la formazione di uno stato di transizione
non più idrolizzabile (De Clercq, 1991). I più impiegati sono il saquinavir, il
ritonavir, l’indinavir, il nelfinavir (figura 3) ed il VX-478.
Resistenza del virus ai farmaci
In assenza di pressione selettiva da farmaco una popolazione di virus è
caratterizzata da molte varianti genetiche che costituiscono la quasispecie
virale (per es. in un soggetto infettato da HIV-1 si calcola vi siano circa 1000
sottopopolazioni di varianti del virus). La presenza di un agente antivirale
altera la pressione selettiva e molte varianti “preesistenti” conseguono un
vantaggio rispetto ai loro competitori wild-type. Con l’andar del tempo si
selezionano quindi varianti virali resistenti il cui numero tende ad
aumentare rispetto a quello dei wild-type determinando così la formazione di
una popolazione predominante di virus resistenti (Richman, 1996).
14
Caleidoscopio
O
H
N
Saquinavir
N
O
N
H
N
H
Ph
OH
N
S
O
CH3
O
H
N
O
H
OH
H 2NOC
Ritonavir
NHtBu
O
H
N
N
H
N
S
N
O
Ph
Indinavir
Ph
OH
N
OH
H
N
N
H2SO4
O
O
BuHtN
Nelfinavir
O
O
S
HO
N
H
NHtBu
N
H
CH3SO3H
OH
H
Figura 3. Inibitori della Proteasi di HIV-1 (PI).
Caleidoscopio
15
Le mutazioni che conferiscono resistenza avvengono frequentemente
durante l’infezione (poiché l’RT non è in grado di controllare il corretto
appaiamento delle basi durante la trascrizione dell’RNA in DNA) e indipendentemente dalla presenza dell’agente antivirale (tabella 2).
La prevalenza di una mutazione che conferisce resistenza dipende da:
- velocità di mutazione;
- velocità di turnover virale;
- fitness dei virus con quella mutazione.
Ci sono 11 nuovi agenti antiretrovirali approvati in USA per il trattamento delle infezioni da HIV-1 e sono state isolate le varianti di HIV-1 resistenti
a ciascuno di essi. Il significato clinico di molte di queste varianti non è completamente chiarito, ma la resistenza agli agenti antivirali è considerata la
prima causa del fallimento della terapia nelle infezioni da HIV-1.
Alta velocità di replicazione virale
Alta velocità di mutazione
Alto turnover cellulare
Terapia con incompleta soppressione della replicazione virale (es. monoterapia)
Tabella 2. Fattori associati a rapida comparsa di resistenza virale ai
farmaci.
Le più importanti mutazioni associate a resistenza verso i maggiori composti antiretrovirali già in uso clinico e in corso di sviluppo sono riportate
nella tabella 3. Esistono anche mutazioni che sopprimono l’effetto di altre:
per es., la mutazione 184V, che determina resistenza alla lamivudina, sopprime l’effetto delle due mutazioni M41L e T215Y che conferiscono resistenza
alla zidovudina.
Resistenza fenotipica e genotipica
A livello fenotipico la sensibilità degli isolati virali ai vari agenti si determina con l’uso di colture cellulari in cui viene fatto crescere il virus (fenotipizzazione) e si esprime come IC 50 che è la concentrazione di farmaco
(espressa in µg/ml o µM) necessaria a inibire del 50% la crescita del virus.
Se la IC 50 aumenta di 5-8 volte allora siamo in presenza di resistenza
fenotipica (RF). L’individuazione della resistenza genotipica si effettua invece accertando la presenza di mutazioni che sappiano conferire RF e si
determina mediante sequenziamento dei tratti di genoma virale coinvolti
oppure, più semplicemente, caratterizzando amplificati delle stesse regioni
con sonde fissate a idonei supporti (LiPA, vedi sotto).
16
Caleidoscopio
Agente
Classe
Sostituzione di aminoacido
associata a resistenza
Zidovudina
NRTI
M41L, D67N, K70R, T215Y/F
Didanosina
NRTI
K65R, L74V, V75T, M184V
Zalcitabina
NRTI
K65R, L74V, T69D, V75T, M184V
Stavudina
NRTI
V75T
Lamivudina
NRTI
M184V/I/T
1592
NRTI
K65R, L74V, M184V
Nevirapina
NNRTI
K103N, V106A, V108I
Delavirdina
NNRTI
K103N/T, Y181C, P236L
NMP-266
NNRTI
L100I, V179D, Y181C
Ritonavir
PI
V82A/F/S/T
Indinavir
PI
M461/L, V82A/F/T
Saquinavir
PI
G48V, L90M
Nelfinavir
PI
D30N
141
PI
M46I, I47V, I50V
Tabella 3. Mutazioni puntiformi nel genoma di HIV-1 associate a resistenza
contro i più importanti agenti antiretrovirali (Schinazi et al, 1997). NRTI =
Inibitori Nucleosidici della RT; NNRTI = Inibitori Non Nucleosidici della
RT; PI = Inibitori della Proteasi. A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G,
Gly; H, His; I, Ile; K, Lys;L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S,
Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; Y, Tyr. L'aminoacido (aa) a sinistra è nel wildtype, quello a destra è nel mutante, mentre il numero interposto indica la
posizione nella catena aminoacidica.
Combinazione di terapie
La combinazione di terapie determina una diminuita tossicità a causa
della riduzione nel dosaggio dei singoli composti, un ridotto rischio di
Caleidoscopio
17
sviluppo della resistenza del virus al farmaco se risultante da mutazioni
diverse nel genoma virale, una sinergica attività antivirale se l’azione anti
HIV-1 ha come bersaglio differenti proteine virali o siti differenti di una
stessa proteina (De Clercq, 1995).
La terapia d’esordio va di norma praticata con combinazioni di 2 NRTI +
1 PI. Queste associazioni permettono di ottenere la riduzione della carica
virale sotto la soglia misurabile in circa il 40% dei pazienti. L’associazione di
2 NRTI + 1 NNRTI o di 2 NRTI + 2 PI è ancora in fase sperimentale.
Le ultime linee guida di terapia antiretrovirale ( Ho et al, 1995; Aiuti et al,
1995; Carpenter et al., 1995; BHIVA, 1997; Carpenter et al., 1997) conferiscono particolare valore predittivo alla determinazione della viremia plasmatica
(HIV-1-RNA), dato che la concentrazione plasmatica di HIV-1-RNA è considerata il miglior marker della progressione della malattia e che la prognosi
nell’infezione da HIV-1 è direttamente correlata al livello di viremia. Una
riduzione della viremia in risposta alla terapia dovrebbe quindi migliorare la
prognosi; si considerano significative, ai fini della condotta terapeutica,
variazioni della concentrazione plasmatica di HIV-1-RNA superiori o uguali
a 0.5 log10 (Saag et al, 1996).
Dosaggio plasmatico di HIV-1-RNA
I metodi di laboratorio più largamente in uso per determinare la concentrazione plasmatica (in copie/ml) di HIV-1-RNA sono attualmente la PCR
quantitativa, la NASBA e la tecnica del bDNA.
18
Caleidoscopio
Infezione da CMV
I farmaci impiegati nella cura delle patologie sostenute da CMV, che
colpiscono prevalentemente pazienti immunocompromessi come malati di
AIDS o soggetti sottoposti a trapianto d’organo o di midollo, sono principalmente tre: l’acyclovir, il ganciclovir e il foscarnet.
Acyclovir
L’acyclovir (figura 1) ha il miglior indice terapeutico tra gli agenti
antivirali disponibili ed è largamente usato per il trattamento delle infezioni
herpetiche. E’ un analogo della guanosina ma al posto di un anello completo
di ribosio (legato alla base purinica), possiede una parte aciclica.
L’acyclovir diffonde liberamente nelle cellule, ma agisce solo nelle cellule
infettate dai virus herpetici perché la prima fase di attivazione, la fosforilazione in posizione 5’ della molecola (parte aciclica), è catalizzata da una
timidina chinasi virale (Elion et al, 1977). Le fosforilazioni successive a di- e
trifosfato sono catalizzate da enzimi cellulari (Elion et al., 1977). Durante la
replicazione del DNA l’acyclovir trifosfato compete con il substrato naturale
(il dGTP) per il legame alla DNA polimerasi virale ed avendo una maggiore
affinità per l’enzima rispetto al dGTP, è perciò incorporato preferenzialmente nella catena nascente di DNA virale (Elion et al., 1977). Dato che
nella molecola di acyclovir inserita nella catena nascente di DNA manca
l’idrossile in posizione 3’, il successivo nucleotide non può essere incorporato e la replicazione del DNA ha termine (Derse et al. 1981). Inoltre,
quando l’acyclovir si lega allo stampo di DNA in presenza del successivo
nucleotide, si forma un complesso irreversibile e la polimerasi viene completamente inattivata (Derse et al., 1981).
Nel loro insieme queste proprietà rendono l’acyclovir altamente selettivo
nella inibizione della replicazione virale mentre l’effetto sulle funzioni della
cellula ospite è modesto; infatti, la concentrazione di acyclovir necessaria per
inibire il virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) è 3000 volte inferiore a quella
necessaria per inibire le cellule in cui HSV-1 cresce.
Ganciclovir
E’ un analogo dei nucleosidi identico all’acyclovir tranne per la presenza
di un gruppo idossile in posizione 3’ (figura 1). E’ attivo contro tutti i virus
Caleidoscopio
19
herpetici (Field et al., 1983) ed è oltre 100 volte più efficace dell’acyclovir nei
confronti del CMV (Tocci et al., 1984). E’ tuttavia più tossico dell’acyclovir e
per questa ragione è stato soprattutto impiegato nel trattamento di malattie
da CMV in pazienti immunocompromessi. Il ganciclovir non è un terminatore di catena come l’acyclovir in quanto possiede un idrossile in posizione 3’, tuttavia è un potente inibitore della polimerasi virale (e cellulare).
Foscarnet
Il foscarnet o fosfonoformato sodico (figura 1) è un analogo dei
pirofosfati che, come altri agenti antivirali attualmente in uso, non necessita
di attivazione da parte di chinasi virali o cellulari. La molecola si lega direttamente ai siti leganti il pirofosfato della RNA e DNA polimerasi inibendo i
due enzimi in modo non competitivo rispetto ai substrati nucleotidici (Bean,
1992). Si pensa che il foscarnet, legato alla polimerasi, formi un intermedio
instabile con i monofosfati nucleosidici determinando una degradazione
degli acidi nucleici (Oberg, 1989). Il foscarnet agisce sia sulle polimerasi
virali che su quelle cellulari ma, rispetto alle concentrazioni necessarie per
inibire gli enzimi cellulari, quelli virali sono inibiti da concentrazioni notevolmente inferiori (da 1/10 a 1/2).
Nei pazienti con retinite da CMV il foscarnet e il ganciclovir sembrano
essere egualmente attivi nel prevenire la progressione della malattia. Il
potenziale vantaggio del foscarnet, rispetto al ganciclovir, in questo settore
terapeutico è dovuto alla sua minore tossicità per il midollo osseo e al suo
possibile uso in combinazione con la zidovudina. Il foscarnet è anche molto
utile nel trattamento dei pazienti affetti da AIDS con infezioni da HSV o
VZV (virus della varicella zoster) che sviluppano resistenza all’acyclovir.
Misura della carica virale
Le indagini di laboratorio più importanti in grado di misurare la carica
del CMV prima durante e dopo la terapia si dividono in due gruppi:
1° - ricerca della proteina virale precoce pp65 direttamente negli LSP del
paziente (antigenemia) oppure di quella immediatamente precoce p72 dopo
loro coltura rapida (24 ore) su fibroblasti diploidi in shell vial (viremia);
2° - ricerca del DNA virale nel sangue o in sue frazioni attraverso PCR
quantitativa, bDNAe HCS e dell’mRNA della pp65 mediante NASBA.
20
Caleidoscopio
Ricerca di antigeni virali
Gli antigeni (Ag) virali più comunemente ricercati per monitorare l’efficacia di terapie antivirali sono la pp65 e la p72 di CMV e la p24 di HIV-1.
Citomegalovirus
La replicazione del CMV è regolata nel tempo. Il periodo immediatamente precoce (IE: 2-4 ore dopo l’infezione) è caratterizzato dalla sintesi della
maggiore proteina IE, la fosfoproteina p72, oltre che da proteine, meno
abbondanti, ma essenziali per l’ulteriore trascrizione genomica. La fase
precoce (E) precede la replicazione del DNA virale e si estende per circa 24
ore. Vari prodotti dei geni E sono enzimi coinvolti nella replicazione del
DNA virale. La più abbondante proteina strutturale del virione, la fosfoproteina pp65, è anch’essa sintetizzata in questa fase, sebbene la sua maggior
sintesi avvenga nel periodo tardivo (L). La fase L inizia 36-48 ore dopo
l’infezione; in questo periodo vengono prodotte proteine strutturali e vengono assemblati e poi rilasciati virioni maturi.
Antigenemia da CMV
Usualmente la valutazione della pp65 si esegue su 2x10 5 LSP. Nel
protocollo standard si effettua fissando le cellule con formalina al 5%, permeabilizzando quindi il preparato con Nonidet P-40 all’1%, saggiando
quindi gli LSP con un pool di anticorpi (Ab) monoclonali anti pp65 (diretti
contro vari epitopi della proteina) marcati con isotiocianato di fluoresceina
(FITC) e infine contando i nuclei fuorescenti al microscopio (Gerna et al,
1992). I risultati sono espressi come numero di LSP pp65 positivi su 2x105
LSP esaminati (Gerna et al, 1994).
Viremia (o Saggio con shell vial) da CMV
Si effettua inoculando 2x105 LSP in una coltura di fibroblasti in shell vial
(piccolo recipiente contenente un vetrino coprioggetti con adesi fibroblasti
diploidi di polmone di embrione umano), centrifugando a bassa velocità per
facilitare l’infezione delle cellule diploidi e incubando a 37°C per 16-24 ore
(coltura rapida) (Gerna et al, 1990). Successivamente si procede alla fissazione delle cellule con metanolo-acetone (1:2), alla colorazione dei nuclei
dei fibroblasti con un pool di Ab monoclonali anti-p72 (diretti contro vari
epitopi della proteina) marcati con FITC e alla conta dei nuclei fluorescenti al
Caleidoscopio
21
microscopio (figura 4). Sulla base dell’osservazione che ogni LSP è capace di
produrre l’infezione di un singolo fibroblasto, i risultati vengono espressi
come numero di nuclei di fibroblasti p72 positivi su 2x10 5 LSP esaminati
(Gerna et al, 1994).
2
1
3
7
4
6
5
Figura 4. Rappresentazione schematica del saggio con shell vial:
1) il campione è seminato direttamente all’interno di una provetta su un
monostrato di cellule posto sulla superficie di un vetrino;
2) la provetta è centrifugata a bassa velocità;
3) e incubata per 24 ore a 37° C;
4) il vetrino viene colorato all’interno della provetta mediante Ab mono clonali anti-CMV marcati;
5, 6) viene rimosso dalla provetta e montato per l’osservazione al mi croscopio;
7) inclusioni fluorescenti che dimostrano la presenza del CMV nel campione.
22
Caleidoscopio
Il saggio per la misura dell’antigenemia da CMV è più rapido e sensibile
rispetto alla coltura rapida (viremia) ed è quindi più idoneo al monitoraggio
dell’efficacia delle terapie anti-CMV (Revello et al, 1994).
L’antigenemia da CMV può essere misurata anche con l’uso della
citometria a flusso (Imbert-Marcille et al, 1997) impiegando Ab monoclonali
anti-CMV marcati con FITC ed esprimendo i risultati come percentuale degli
LSP positivi.
Virus dell’immunodeficienza umana
La misura dell’antigenemia da HIV-1 è rappresentata dalla determinazione dei livelli plasmatici della p24 che è la proteina più abbondante del
nucleocapside. Questo dosaggio si effettua, dopo denaturazione al calore o
dissociazione acida degli immunocomplessi plasmatici che legano la p24,
con un test ELISA su micropiastra che fa uso di Ab anti-p24 legati alla fase
solida (Schupbach et al, 1996). I livelli di p24 sono ottenuti utilizzando una
curva standard ed i risultati sono espressi in pg/ml. Il limite di sensibilità
del saggio è intorno a 0,5 pg/ml.
Caleidoscopio
23
PCR quantitativa
La Reazione Polimerasica a Catena (Polymerase Chain Reaction, PCR) è
una tecnica che permette di ottenere quantità rilevanti di un determinato
tratto di DNA (o RNA dopo che questo è stato convertito in cDNA da una
RT). Dalla sua introduzione, dovuta nel 1984 ad una geniale intuizione del
Dr. Kary Mullis della Cetus Corporation, la PCR ha trovato applicazione in
numerosissimi settori della biomedicina primo tra tutti quello della diagnostica microbiologica perché consente di individuare e quantificare in modo rapido agenti patogeni presenti in piccolissime quantità (Pershing et al, 1993).
La reazione sfrutta l’azione di una DNA polimerasi termostabile per
duplicare uno specifico frammento di DNA delimitato alle sue estremità da
due primer oligonucleotidici specifici che ibridizzano con una specifica sequenza complementare di DNA. Agli oligonucleotidi si attacca la DNA
polimerasi che, incorporando nucleotidi trifosfati presenti nella miscela di
reazione, sintetizza il tratto di DNA compreso tra i due primer. Ogni ciclo di
amplificazione avviene in tre stadi ed a tre diverse temperature:
1) denaturazione del DNA a doppia catena (a temperature superiori a 90°C);
2) ibridizzazione dei primer alla sequenza complementare del DNA (la
temperatura, di solito compresa tra 42 e 70°C, dipende dalla sequenza e
dalla lunghezza dei primer);
3) sintesi di un nuovo filamento di DNA (a temperature comprese tra 68 e
72°C, dipendente dalla polimerasi utilizzata).
I filamenti neoformati sono complementari al filamento stampo e, poiché
il processo di estensione avviene su entrambi i filamenti, al termine di ogni
ciclo il numero di frammenti di DNA sarà doppio rispetto a quello iniziale.
Sfruttando la resistenza all’inattivazione termica propria delle DNA polimerasi termostabili è possibile quindi sottoporre il campione a cicli termici
successivi (generalmente 25-50) ottenendo l’amplificazione esponenziale del
tratto di DNA compreso tra i due primer. In realtà il numero finale di molecole di amplificato dipenderà dall’efficienza con cui è avvenuta la PCR,
secondo la seguente formula: f=i(1+e)n, dove f ed i sono, rispettivamente, la
concentrazione finale ed iniziale del DNA bersaglio; e è il fattore di efficienza
(compreso tra 0 e 1) ed n è il numero di cicli.
Negli ultimi anni sono stati compiuti notevoli sforzi per automatizzare e
standardizzare al massimo la reazione migliorandone quindi le potenzialità
diagnostiche. Oggi sono disponibili in commercio numerosi apparecchi
(termociclizzatori) il cui utilizzo consente di effettuare più reazioni contemporaneamente, in condizioni di temperatura ben controllate e con livelli di
efficienza prossimi al 100%; sono stati introdotti, inoltre, nuovi sistemi
sensibili e specifici per la rivelazione degli amplificati che permettono la
quantificazione dei prodotti di PCR.
24
Caleidoscopio
Il principio su cui si basa la PCR di tipo quantitativo è che la quantità di
prodotto finale è proporzionale alla quantità di DNA bersaglio iniziale. In
teoria sarebbe quindi possibile determinare il numero di copie di DNA
bersaglio di un campione mediante la comparazione del relativo prodotto di
PCR con quelli ottenuti da campioni standard a numero di copie noto. In
realtà questo sistema porta a grossolani errori di quantificazione perché la
quantità di prodotto di amplificazione che si accumula è funzione dell’efficienza di amplificazione, che è diversa per ogni campione. I parametri
che influenzano l’efficienza di amplificazione sono: qualità del DNA stampo,
concentrazione di nucleotidi trifosfati, primer ed enzima, composizione del
tampone di reazione e termociclizzatore (Clementi et al, 1993). Per ovviare a
questo problema sono stati messi a punto metodi di amplificazione che
prevedono la co-amplificazione di standard interni simili, ma non identici
per sequenza o lunghezza, al tratto di acido nucleico del campione da amplificare.
Questi standard sono chiamati anche competitori poiché, alle proprie
estremità, portano sequenze riconosciute dai primer che quindi potranno
legarsi sia al competitore, sia al DNA bersaglio del campione (PCR competitiva). Durante la reazione di amplificazione i due frammenti di DNA
vengono coamplificati allo stesso tempo e con la stessa efficienza ed è quindi
possibile, misurando la quantità dei relativi prodotti di amplificazione e
conoscendo il numero di molecole di competitore, calcolare esattamente il
numero di copie del DNA bersaglio nel campione in esame (Clementi et al,
1993). Operativamente, la PCR competitiva viene di solito allestita in più
provette contenenti una quantità fissa di campione e diluizioni scalari a
concentrazione nota di standard. Al termine della reazione i campioni vengono corsi su gel di agarosio o acrilamide e le densità ottiche (OD) dei
relativi prodotti di amplificazione vengono misurate con un densitometro
ottico. Le OD dello standard e del campione vengono poi riportate su un
grafico (OD su N° di copie) ottenendo così due curve, una per lo standard ed
una per il campione. L’intersezione tra le due curve rappresenta il punto di
equivalenza tra numero di copie dello standard e del campione. La figura 5
riporta un esempio di PCR competitiva con la quale è stato determinato il
numero di copie di DNA provirale di un virus simile ad HIV-1 nel DNA
genomico estratto dal sistema nervoso centrale (CNS) di un animale infetto.
La reazione è stata allestita in sei provette, in ciascuna delle quali è stato
aggiunto 1 µg di DNA genomico ed una quantità nota di competitore
compresa tra 16 x 103 e 0,5 x 103 molecole. Nel grafico sono riportati i valori
di OD ottenuti dai relativi prodotti di amplificazione del competitore (117
paia di basi, indicato come D nel gel e D117 nel grafico) e del campione (138
paia di basi, indicato come C nel gel e CNS nel grafico). La freccia indica il
punto di equivalenza tra le due curve che corrisponde a 4,3 x 103 copie della
sequenza bersaglio per µg di DNA cellulare (Pistello et al, 1994).
Caleidoscopio
25
138bp
117bp
C
D
1
2
3
4
5
6
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
1
2
3
D117
4
5
6
7
CNS
Figura 5. Esempio di PCR competitiva.
Nonostante sia in grado di fornire dati quantitativi molto precisi, questa
tecnica è poco adatta ad un uso routinario o per numeri elevati di campioni,
perché piuttosto costosa (per ogni campione bisogna effettuare parecchie
amplificazioni in parallelo) e indaginosa (i prodotti di amplificazione, potenti sorgenti di contaminazione, devono essere corsi su gel e letti con un densitometro ottico). Per ovviare a questi svantaggi, la maggior parte dei sistemi
diagnostici oggi in commercio prevede l’aggiunta di uno o più standard
interni come controlli di amplificazione con i quali è possibile verificare
l’efficienza di amplificazione e normalizzarla rispetto a standard esterni
(Revets et al, 1996). In questo modo è possibile costruire una curva di taratura esterna con la quale quantificare vari campioni. La rilevazione dei
prodotti amplificati avviene inoltre con l’ausilio di primers biotinilati,
incorporati durante l’amplificazione e che permettono di fissare i prodotti di
amplificazione sul fondo di pozzetti di micropiastre. Il dosaggio del DNA
avviene poi tramite avidina coniugata con perossidasi e successivo saggio
enzimatico (figura 6). Infine, nei kit commerciali di ultima generazione per
26
Caleidoscopio
Regione di gag da amplificare (142 bp)
Regione di QS da amplificare, della
stessa lunghezza e con la stessa
composizione in basi (ma diversa
sequenza) della regione di gag da
amplificare
Primers 5’ biotinilati
5’ B
B 5’
RNA di HIV-1
Standard interno ad RNA
(Competitore o Standard
per la quantificazione: QS)
Stesso tubo di reazione
Coamplificazione di gag e QS tramite RT-PCR con
primers 5’ biotinilati che si appaiano alle stesse
sequenze del cDNA (sintetizzato dall’RT) di gag e QS
5’ B
5’ B
B 5’
B 5’
Prodotto dell’amplificazione di
una regione del gene gag
Prodotto dell’amplificazione di
una regione di QS
Rivelazione dei prodotti della PCR su micropiastra a 96
pozzetti mediante saggio colorimetrico che fa uso di
avidina coniugata con perossidasi (HRP)
Fase solida
Fase solida
5’ B
5’ B
Avidina
Avidina
Sonde legate alla fase solida
che ibridano con il prodotto
della PCR per gag
HRP
Sonde legate alla fase solida
che ibridano con il prodotto
della PCR per QS
HRP
Aggiunta di substrato, sviluppo di colore e lettura fotometrica
La concentrazione plasmatica dell’RNA di HIV-1 (in copie/ml) si ottiene in base alla O.D.
dei due pozzetti e alla concentrazione (nota) di QS
Figura 6. Rappresentazione schematica di una QC-PCR (PCR Quantitativa e Competitiva) in cui
campione e standard vengono coamplificati (Mulder et al, 1994).
Caleidoscopio
27
misurare la viremia plasmatica di HIV-1 ed HCV sono stati introdotti sistemi
di prevenzione della contaminazione da carry-over, dovuto principalmente a
prodotti di amplificazione presenti nell’ambiente.
E’ prevista inoltre l’aggiunta dei controlli interni di amplificazione prima
dell’estrazione dell’acido nucleico dal campione.
Mediante la normalizzazione dei prodotti di amplificazione è possibile
quindi quantificare la sequenza bersaglio compensando la perdita di acido
nucleico avvenuta durante la fase di estrazione.
Data l’importanza che la valutazione quantitativa della carica virale
riveste per il management dei pazienti, le ditte produttrici di sistemi di amplificazione degli acidi nucleici hanno cercato di fornire kit sempre più maneggevoli e accessibili anche ai laboratori privi di una particolare expertise nelle
tecniche di biologia molecolare.
La ricerca nel campo della biotecnologia ha oggi permesso la distribuzione commerciale di sistemi automatizzati sia per la fase di estrazione
degli acidi nucleici che per la fase di amplificazione e analisi dei risultati.
28
Caleidoscopio
NASBA
La Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA), descritta da
Compton (1991) ed applicata alla diagnostica virologica da Kievits e collaboratori (Kievits et al, 1991), permette l’amplificazione selettiva di molecole
di RNA mediante l’azione di tre enzimi: la RT del virus della leucemia
aviaria, l’RNasiH e la T7 RNA polimerasi. A differenza della PCR, la NASBA
è una reazione isotermica che può avvenire in un normale bagnomaria a
41°C, temperatura alla quale i tre enzimi sono attivi contemporaneamente e
per tutta la durata del processo. La reazione, illustrata nella figura 7, avviene
mediante cicli continui ripetuti di retrotrascrizione e trascrizione di RNA e si
compone delle seguenti fasi:
1) ibridazione del primer antisenso, che possiede una coda contenente la
sequenza del promotore per la T7 RNA polimerasi, alla sequenza complementare dell’RNA bersaglio a polarità positiva;
2) trascrizione del filamento di DNA a polarità negativa ad opera della
RT; in questa fase avviene l’incorporazione del promotore per la T7 nel
filamento di DNA neoformato;
3) degradazione del filamento di RNA a polarità positiva ad opera
dell’RNasiH;
4) ibridizzazione del primer senso al filamento di DNA;
5 e 6) la RT polimerizza il filamento di DNA a polarità positiva, producendo così DNA doppia catena che contiene il promotore per la T7 RNA
polimerasi;
7 e 8) trascrizione di migliaia di filamenti di RNA a polarità negativa ad
opera della T7 RNA polimerasi;
9-12) l’RNA neoformato, a sua volta, rientra nel ciclo di amplificazione
attraverso la sintesi di DNA doppia catena identico a quello ottenuto al
punto 6;
13) dal DNA doppia catena si possono nuovamente ottenere migliaia di
filamenti di RNA a polarità negativa.
NASBA è molto efficiente in quanto si ottengono amplificazioni dell’ordine di 10 9 in 90 minuti (Malek et al, 1992) e, rispetto alla PCR, ha sensibilità
e linearità uguale o superiore (Saag et al, 1996). La reazione è inoltre meno
suscettibile alle contaminazioni in quanto il prodotto di amplificazione,
RNA a singola catena, è molto più labile rispetto al DNA. Accanto a questi
innegabili vantaggi rispetto alla PCR, NASBA presenta alcuni svantaggi:
procedura di estrazione dell’acido nucleico laboriosa che rende difficile
processare più di dieci campioni contemporaneamente; apparecchiatura per
la misurazione dei prodotti di reazione piuttosto costosa; tecnica complessa
che può essere difficile sviluppare e mettere a punto nei laboratori diagnostici. E’ stato probabilmente quest’ultimo punto che ha penalizzato
Caleidoscopio
29
5’
3’
1A-
5’
5’
3’
RT
5’
RNA bersaglio
DNA
RNA bersaglio
DNA
5’
RNA bersaglio
DNA
5’
DNA
3’
5’
DNA
3’
5’
5’
3’
DNA
DNA
3’
5’
5’
3’
DNA
DNA
3’
3’
3’
3’
3’
T7 RNA Pol
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
5’
3’
2A
RNasiH
3’
RT
5’
3’
5’ 2A
3’
RT
RNA
5’
DNA
RNA
3’
5’
DNA
RNA
3’
DNA
DNA
RNasiH
10
5’
11
5’
RT
1A-
5’
12
3’
5’
5’
3’
DNA
DNA
13
3’
5’
5’
3’
DNA
DNA
T7 RNA Pol
Figura 7. Rappresentazione schematica della NASBA.
30
Caleidoscopio
fortemente la sua diffusione rispetto alla PCR; NASBA ha infatti trovato
applicazione limitata nel campo biomedico. Per la diagnostica virologica, ad
esempio, ad oggi sono presenti sul mercato solo sistemi di quantificazione di
HIV-1 su plasma e di rilevazione dell’RNA messaggero della proteina p65 di
CMV negli LSP.
Dal punto di vista metodologico, rispetto alla PCR quantitativa, NASBA
prevede la quantificazione dei campioni mediante una curva standard
interna ottenuta con tre standard (chiamati anche calibratori) aggiunti prima
della fase di estrazione e che vengono coamplificati con l’acido nucleico
bersaglio. Al termine dell’amplificazione il campione viene aliquotato in
quattro provette a ciascuna delle quali viene aggiunto una sonda specifica
per i tre calibratori e per il campione. Le sonde sono marcate con un atomo
di Rutenio che, in presenza di un opportuno substrato, emette un segnale
elettrochemioluminescente che viene registrato ed elaborato da apposito
strumento. Il risultato finale sarà costituito quindi da curve di taratura
propria, una ciascuna per il campione e per gli standard dalle quali sarà
possibile calcolare esattamente il numero di copie della sequenza bersaglio
tenendo conto anche delle perdite avvenute durante la fase di estrazione.
Caleidoscopio
31
bDNA
La Branched DNA Signal Amplification o bDNA è una tecnica basata
sull’amplificazione del segnale (Urdea et al, 1991) (figura 8) che consente la
ricerca quantitativa di genomi virali. Questo metodo è dotato di buona
riproducibilità e semplicità di esecuzione ed è inoltre caratterizzato da un
rischio di contaminazione minore rispetto alla PCR, ma anche da un limite di
sensibilità lievemente inferiore rispetto ai metodi di amplificazione genomica.
Lisi delle particelle virali
e rilascio dell’RNA
Ibridazione delle sonde al
bersaglio e alla fase solida
Lisi delle particelle
virali, rilascio e
denaturazione del DNA
Sonde Target
Sonde Target
Sonde Target
Sonde a Cattura
Lavaggio e ibridazione
del bDNA
Superficie dei pozzetti della
micropiastra
Lavaggio e ibridazione
delle sonde, marcate
con fosfatasi alcalina,
al bDNA
Aggiunta del substrato (derivato del diossetano) e misura della chemiluminescenza
Figura 8. Rappresentazione schematica della tecnica del bDNA.
32
Caleidoscopio
Sono disponibili Kit commerciali per misurare la concentrazione del genoma
ad RNA di HCV ed HIV-1 nel plasma ed il genoma a DNA di CMV dagli LSP.
Il metodo inizia con la lisi delle particelle virali mediante agenti denaturanti per far avvenire il rilascio del genoma. L’acido nucleico virale viene
quindi catturato da oligonucleotidi detti sonde a cattura sulla superficie di
pozzetti di micropiastre (fase solida). Tramite una serie di ibridazioni
successive si legano all’acido nucleico bersaglio numerose molecole ramificate di DNA. La cattura del genoma virale e il suo legame all’oligonucleotide
ramificato (bDNA) sono mediati da particolari sonde dette sonde target,
lunghe circa 50 basi di cui circa 20 servono per legare il genoma virale
ibridando con regioni altamente conservate, mentre le altre mediano la
cattura o l’ibridazione con il bDNA (tabella 4).
Genoma
virale
Gene o Regione
genica ibridata
Sonde target
totali
Sonde target
per la cattura
Sonde target
per il bDNA
HIV-1-RNA
pol
49
10
39
HCV-RNA
5'UTR, CORE
27
9
18
CMV-DNA
gB, UL56
43
9
34
Tabella 4. Caratteristiche delle sonde target impiegate nella tecnica del bDNA.
I bDNA sono poi sottoposti a ibridazione con un gran numero di sonde
(45 per ogni bDNA) marcate con fosfatasi alcalina, la quale trasforma il
substrato diossetano in un prodotto chemiluminescente. L’intensità del
segnale luminoso emessa è direttamente proporzionale al numero di genomi
virali legati alla fase solida. La misura della concentrazione del genoma è
ottenuta per interpolazione automatica con una curva standard ed espressa
in copie/ml per HIV-1-RNA, copie/106 cellule per CMV-DNA ed equivalenti/ml per HCV-RNA, intendendo per equivalente di RNA la quantità di
virus che genera la stessa intensità di luce di una singola molecola standard.
Tutte le fasi di ibridazione vengono effettuate a 53°C, la fase della cattura ha
una durata di 16-18 ore, le altre in genere durano 30’, e tra un’ibridazione e l’altra è necessario lavare i pozzetti della micropiastra con una soluzione tampone.
La sensibilità del dosaggio di HCV-RNA ha un limite inferiore di 2x105
equivalenti/ml e non è sensibilmente influenzata dalla variabilità del
genotipo e del sottotipo del virus (Detmer et al, 1996; Hawkins et al, 1997).
Il limite inferiore di sensibilità del dosaggio di HIV-1-RNA è di 500
copie/ml ed è pressoché equivalente per i sottotipi virali A-F (Kern et al., 1996).
Questa elevata sensibilità è stata ottenuta grazie all’uso di un preamplificatore
che funge da “ponte” tra il genoma virale e il bDNA. Per questo motivo il
metodo è stato chiamato ES bDNA (Enhanced-Sensitivity Branched DNA).
Il limite di sensibilità del dosaggio di CMV-DNA è attualmente 4,4x103
copie/106 cellule (Chernoff et al, 1997).
Caleidoscopio
33
Sistema a cattura di ibrido
Il Sistema a Cattura di Ibrido (HCS) consente la determinazione della
concentrazione di genomi virali coniugando l’alta specificità della reazione
di ibridazione tra acidi nucleici alla elevata sensibilità degli immunodosaggi.
Attualmente l’HCS è particolarmente applicato alla ricerca quantitativa
del CMV-DNA negli LSP. In questo saggio sono impiegate sonde ad RNA
(figura 9) che coprono circa il 16% del genoma virale e due Ab anti-ibrido
RNA-DNA (Veal et al, 1996; Mazzulli et al, 1996).
Il pellet di LSP si ottiene da 3,5 ml di sangue intero contenente EDTA
attraverso i seguenti passaggi: il campione di sangue viene incubato con un
Ibridazione con
sonde di RNA
Denaturazione del
campione
Fase
solida
Cattura
dell’ibrido
Ab anti ibrido
RNA-DNA
Lavaggio
Fosfatasi
alcalina
Reazione con Ab
monoclonali coniugati
con fosfatasi alcalina
Chemiluminescenza
Rivelazione dell’ibrido
Figura 9. Rappresentazione schematica del Sistema a Cattura di Ibrido.
34
Caleidoscopio
tampone di lisi dei globuli rossi per 15’ a 20-25°C; dopo centrifugazione (15’
a 1000 g) viene scartato il surnatante e il pellet viene risospeso in 1,5 ml di
tampone di lisi; vengono quindi contate le cellule e, dopo una seconda
centrifugazione, si ottiene il pellet finale che può essere anche conservato a 20°C per circa tre mesi.
Successivamente si procede alla lisi della membrana cellulare degli LSP
(per consentire il rilascio del genoma virale), alla denaturazione del DNA
(50’ a 70°C) e infine all’ibridazione del DNA virale a singolo filamento con le
sonde di RNA incubando per 2 ore a 70°C (condizioni di alta stringenza).
Gli ibridi RNA-DNA sono quindi trasferiti in provette sulle cui pareti si
trovano fissati Ab anti-ibrido RNA-DNA. L’avvenuta reazione Ag-Ab viene
rivelata con l’aggiunta di un secondo Ab marcato in grado di dar luogo ad
una reazione chemiluminescente (figura 9).
La determinazione della concentrazione del CMV-DNA si effettua con
l’uso di una curva standard e i risultati sono espressi direttamente dal luminometro in pg/106 cellule (Veal et al, 1996) o in pg/ml di sangue (Mazzulli
et al, 1996).
Recentemente è stato messo a punto un saggio su micropiastra basato
sull’HCS per la determinazione della concentrazione plasmatica di HIV-1
espressa come numero di copie/ml. Questo metodo prevede: la concentrazione dei virioni per centrifugazione, la lisi delle particelle virali, l’ibridazione del genoma virale con sonde a DNA biotinilate, la cattura degli ibridi risultanti ad opera di streptavidina legata sulla superficie di pozzetti di
micropiastre, la reazione degli ibridi catturati con Ab anti-ibrido RNA-DNA
coniugati con fosfatasi alcalina e lo sviluppo di una reazione chemiluminescente che determina emissione di luce, la cui intensità è direttamente
proporzionale alla concentrazione del genoma di HIV-1. Sono impiegati
cinque calibratori fino ad una concentrazione di 107 molecole/ml e il limite
di sensibilità è di 500 copie/ml.
Caleidoscopio
35
Genotipizzazione e individuazione di
mutazioni che conferiscono resistenza
agli agenti antivirali
Queste indagini vengono effettuate soprattutto mediante l’impiego del
Line Probe Assay o LiPA. Il LiPA ha, a tutt’oggi, due tipi di applicazione:
- individuazione dei genotipi e sottotipi di HCV;
- individuazione di mutanti di HIV-1 resistenti a determinati farmaci
antivirali.
HCV
Molti studi clinici (Tsubota et al, 1994; Orito et al, 1994; Nousbaum et al,
1995) indicano che le infezioni da HCV con genotipo 1b sono scarsamente
sensibili al trattamento con α-IFN in quanto le risposte positive a lungo
termine riguardano meno del 10% dei pazienti trattati, mentre per i genotipi 1a,
2a, 2b e 3a le risposte positive oscilllano tra il 50 e l’80%. La discriminazione dei
tipi e sottotipi è quindi di particolare importanza prognostica poiché (Qu et al,
1994) la risposta al trattamento con α-IFN sembra essere indipendente dall’età,
dal sesso e dalla durata della malattia. Il LiPA consente la determinazione dei
sei genotipi di HCV e di svariati loro sottotipi. Il saggio è basato sulle diversità
nella regione 5’ UTR tra i differenti genotipi e sottotipi di HCV.
Ancora da definire è il significato della presenza di mutazioni a livello di
una parte del gene NS5a definita come ISDR (interferon sensitivity determining region).
HIV-1
Ci sono almeno due approcci per avere informazioni circa l’esistenza di
mutanti HIV-1 resistenti ai farmaci: la fenotipizzazione e la genotipizzazione.
Fenotipizzazione
E’ la misura della sensibilità effettiva del virus ai farmaci. Nella sua
forma classica richiede l’isolamento del virus del paziente in colture cellulari
36
Caleidoscopio
e la valutazione della sua crescita in presenza di concentrazioni decrescenti
dei vari farmaci.
In alternativa è stato proposto il cosidetto RT-Antivirogramma (sistema
automatico specificamente disegnato per determinare la resistenza fenotipica ai farmaci). Il gene pol viene isolato dall’RNA plasmatico, amplificato
con PCR e successivamente inserito in RNA genomici di HIV-1. La
sensibilità di questi ibridi ai vari agenti antivirali è poi determinata usando
un saggio standardizzato di facile lettura ma che richiede almeno 4-5 settimane di coltura.
Genotipizzazione
E’ più veloce e più semplice della fenotipizzazione e serve ad identificare
le mutazioni puntiformi che conferiscono resistenza. E’ quindi un modo
indiretto per rivelare la presenza di mutanti resistenti. Deve essere usato con
cautela per es. riguardo alla mutazione dell’aminoacido 184 come marcatore
di resistenza alla lamivudina (tabella 3 e 5). Si può effettuare in due modi:
1) sequenziamento diretto preceduto da PCR per amplificare i segmenti
genici in cui compaiono le mutazioni;
2) RT-PCR seguita da ibridazione con sonde specifiche (LiPA)
Il LiPA applicato alla ricerca di mutanti di HIV-1 resistenti a certi farmaci
antivirali (NRTI) consente la simultanea rivelazione di sequenze nucleotidiche mutanti che riguardano i codoni 41, 69, 70, 74, 184, 214 e 215 (Stuyver
et al, 1997).
Principio del LiPA
Sono impiegate strisce di membrana di nitrocellulosa sulle quali si
trovano legate sonde specifiche.
Nel LiPA per genotipizzare HCV è amplificato un frammento della
regione 5’ UTR lungo 250 bp e vengono impiegate 21 sonde specifiche,
lunghe circa 20 bp, per 21 linee. Nel LiPA per individuare mutanti HIV-1
resistenti agli NRTI è amplificato un frammento del gene pol lungo 640 bp e
vengono utilizzate 33 sonde specifiche, la cui lunghezza varia da 12 a 15
nucleotidi, per 20 linee.
I prodotti amplificati con nested PCR e marcati con biotina vengono fatti
ibridare con le sonde della membrana (figura 10). La biotina è incorporata
durante la seconda fase di amplificazione grazie all’impiego di primers 5’biotinilati. Il prodotto marcato ibridizza solo con la sonda perfettamente
complementare.
L’alta specificità del saggio è ottenuta grazie all’impiego di stringenti
condizioni di ibridazione (50° C ± 0,5° C). Dopo l’avvenuta ibridazione viene
Caleidoscopio
37
Linea
Interpretazione
Commento
3
4
5
M41
L41 (TTG)
L41 (CTG)
TS 41
TM 41
TM 41
Codone 41: TS per M (ATG)
Codone 41: TM per L (TTG)
Codone 41: TM per L (CTG)
6
T69K70
7
T69R70
8
D69K70
9
D69R70
10
N69R70
TS 69
TS 70
TS 69
TM 70
TM 69
TS 70
TM 69
TM 70
TM 70
Codone 69: TS per T (ACT)
Codone 70: TS per K (AAA)
Codone 69: TS per T (ACT/A)
Codone 70: TM per R (AGA)
Codone 69: TM per D (GAT)
Codone 70: TS per K (AAA)
Codone 69: TM per D (GAT)
Codone 69: Sequenza per N (AAT)
11
L74V75
TS 74
12
V74V75
TM 74
Codone 74: TS per L (TTA)
Codone 75: Sequenza per V (GAT/G)
Codone 74: TM per V (GTA)
Codone 75: Sequenza per V (GTA)
13
14
M184
V184
TS 184
TM 184
Codone 184: TS per M (ATG)
Codone 184: TM per V (GTG)
15
F214T215
TS 215
16
L214T215
TS 215
17
18
T215
F214Y215
TS 215
TM 215
19
L214Y215
TM 215
20
F214F215
TM 215
Codone 214: Sequenza per F (TTT/C)
Codone 215: TS per T (ACC)
Codone 214: Sequenza per L (CTT)
Codone 215: TS per T (ACC)
Codone 215: TS per T (ACT)
Codone 214: Sequenza per F (TTT)
Codone 215: TM per T (TAC)
Codone 214: Sequenza per L (CTT)
Codone 215: TM per Y (TAC)
Codone 214: Sequenza per F (TTT)
Codone 215: TM per F (TTC)
Tabella 5. Mutazioni, individuate con il LiPA, che possono conferire
resistenza agli NRTI. TS = Tipo Selvaggio (Wild Type); TM = Tipo Mutante.
Le sigle utilizzate per identificare gli aminoacidi sono elencate nella tabella 3.
aggiunta alla membrana streptavidina marcata con fosfatasi alcalina che si
lega agli ibridi biotinilati precedentemente formatisi. L’incubazione
successiva con il substrato costituito da una soluzione di bromocloroindolilfosfato (BCIP/NBT) determina la formazione di un precipitato scuro e
quindi di una banda.
In ambedue i test, la lettura dei risultati è facilitata dall’utilizzo di carte di
interpretazione (figura 11 e tabella 5 e 6).
38
Caleidoscopio
Precipitato
colorato
Fosfatasi
alcalina
Cromogeno
Biotina
Streptavidina
3’
5’
Bersaglio amplificato
Sonda di DNA
Striscia di
nitrocellulosa
Figura 10. Rappresentazione schematica del LiPA.
Altri metodi impiegati per genotipizzare HCV
Per genotipizzare HCV possono essere utilizzati altri metodi:
- sequenziamento di prodotti di varie regioni del genoma amplificati con
RT-PCR;
- nested RT-PCR utilizzando primers tipo-specifici seguita da elettroforesi su gel d’agarosio;
- DNA Enzyme Immunoassay (DEIA), che consiste in una RT-PCR con
primers universali e sottotipo specifici seguita da un’ibridazione dei prodotti amplificati con sonde tipo/sottotipo-specifiche legate sul fondo dei
Caleidoscopio
39
Singole Mutazioni
Composto
Cross-resistenza
M41L
AZT (circa 4 volte)
T69D
ddC (< 10 volte)
K70R
AZT (circa 4 volte)
PMEA
L74V
ddI (< 20 volte)
ddC, ? Abacavir
M184V
3TC (> 500 volte)
ddC, ddI, ? Abacavir
Assente 184
3TC (M184I)
T215F/Y
AZT (circa 16 volte)
Assente T215
ddC (215C può essere rivelata
sulla precedente 215Y)
Combinazione
di mutazioni
Composto/i
Cross-resistenza
41L + 215F/Y
AZT (circa 60 volte)
ddC, ddI
41L + 215F/Y + 184V
3TC
ddC, ddI, ? Abacavir
41L + 215F/Y + 70R
AZT (> 100 volte)
ddC, ddI
41L + 215F/Y + 74V
ddI
ddC
41L + 215F/Y + 69D
AZT + ddC
41L + 69D
AZT
Tabella 6. Interpretazione delle mutazioni rivelate dal LiPA HIV-1 RT. Tra
parentesi è indicata l’entità della diminuzione della sensibilità del virus al
farmaco.
pozzetti di una micropiastra; il DNA ibrido (bersaglio + sonda) è rivelato
dall’aggiunta di un Ab monoclonale anti-DNA a doppio filamento e da
quella di un secondo Ab anti-IgG marcato con perossidasi che catalizza una
reazione colorimetrica (Viazov et al, 1994);
- analisi del polimorfismo dei frammenti di restrizione (RFLP) (Mc
Omish et al., 1994);
- tipizzazione sierologica, che rileva la presenza di anticorpi verso
peptidi sintetici e antigeni ricombinanti gruppo-specifici con un saggio
immunoenzimatico (Tanaka et al, 1994).
40
Caleidoscopio
Caleidoscopio
41
Conclusioni
Ogni metodo in grado di misurare la carica virale presenta vantaggi e
limiti. In genere i metodi di amplificazione genomica come la PCR e il
NASBA sono più sensibili, ma spesso anche più indaginosi e più soggetti a
contaminazione. Gli altri metodi di biologia molecolare come la tecnica del
bDNA o il Sistema a Cattura di Ibrido sono meno sensibili ma anche più
facilmente eseguibili e meno soggetti a contaminazione.
Spesso solo il valore della concentrazione del genoma virale ha significato predittivo sull’andamento e sull’esito della terapia. Quando però è
possibile, è preferibile ricorrere al dosaggio degli Ag virali sia perché i
metodi immunochimici sono più standardizzati rispetto alle tecniche di
biologia molecolare, sia perchè i costi del saggio in immunofluorescenza e di
quello immunoenzimatico sono notevolmente inferiori.
Per poter stabilire l’efficacia di un trattamento antivirale è necessario
verificare nel tempo un notevole abbassamento della carica virale e, sebbene
gli studi in questo settore siano ancora da approfondire, tuttavia le ricerche
condotte fino ad oggi hanno permesso di individuare, almeno per certe
terapie, l’entità della riduzione indicativa di efficacia terapeutica.
Inoltre il recente impiego di particolari tecniche di biologia molecolare
come il LiPA consente di rivelare la presenza nell’organismo di mutanti
resistenti a determinati farmaci indirizzando conseguentemente il clinico
verso la scelta di farmaci veramente efficaci.
Il laboratorio di Virologia ha quindi a tutt’oggi due importanti ruoli, uno
tradizionale finalizzato alla diagnosi delle infezioni virali e l’altro, di recente
acquisizione, legato al controllo dell’efficacia delle chemioterapie antivirali.
***
L’Unità Operativa di Virologia dell’Azienda Ospedaliera Pisana è ormai
da alcuni anni particolarmente attiva nel campo della ricerca qualitativa e
quantitativa di genomi virali in vari materiali patologici. Da vari anni
effettua il monitoraggio dell’efficacia di chemioterapie anti-HCV, anti-HIV-1
e anti-CMV impiegando alcuni dei saggi di biologia molecolare descritti e,
dall’inizio del 1998, anche l’individuazione dei mutanti HIV-1 resistenti agli
NRTI.
42
Caleidoscopio
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Ringraziamenti
Gli Autori ringraziano il Prof. Mauro Bendinelli, direttore dell’U.O.
Virologia dell’Azienda Ospedaliera di Pisa, per l’incoraggiamento ed i
consigli ricevuti durante la stesura della monografia..
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Indice
Editoriale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . pag.
Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Infezione da HCV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Interferone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Ribavirina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Fattori che influenzano la risposta alla terapia . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Dosaggio sierico di HCV-RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Infezione da HIV-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Inibitori della Trascriptasi Inversa (RTI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Analoghi dei substrati (nucleosidici) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Analoghi non nucleosidici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Inibitori della proteasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Resistenza del virus ai farmaci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Combinazione di terapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Dosaggio plasmatico di HIV-1-RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Infezione da CMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Acyclovir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Ganciclovir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Foscarnet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Misura della carica virale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Ricerca di antigeni virali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Citomegalovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Antigenemia da CMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Viremia (o Saggio con shell vial) da CMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Virus dell’immunodeficienza umana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
PCR quantitativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
NASBA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
bDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Sistema a cattura di ibrido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
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Genotipizzazione e individuazione di mutazioni che conferiscono
resistenza agli agenti antivirali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
HCV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
HIV-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Fenotipizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Genotipizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Principio del LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Altri metodi impiegati per genotipizzare HCV . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Conclusioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Indice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
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