Caratterizzazione dell`attività dell`enzima tirosina

Giornata del Dottorato – Curriculum in Scienze e Biotecnologie degli Alimenti 2015
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agro-Alimentari, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, Cesena, 27 Marzo 2015
Caratterizzazione dell’attività dell’enzima tirosina-decarbossilasi (tdc) in batteri lattici
di interesse alimentare
Eleonora Bargossi (email: [email protected])
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agro-Alimentari, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna
Corso di Dottorato: Scienze e Tecnologie Agrarie, Ambientali e Alimentari
Curriculum: Scienze e Biotecnologie degli Alimenti; Ciclo di dottorato: XXVIII; Anno di frequenza: III
Tutor: Fausto Gardini
1. Stato dell’arte
Le ammine biogene (AB) rappresentano un serio problema di tipo igienico-sanitario per diverse classi di alimenti, tra le
quali una delle principali è quella degli alimenti fermentati. L’intenso processo di proteolisi cui sono sottoposti questi
alimenti comporta la liberazione nel mezzo di amminoacidi liberi che possono essere utilizzati dai microrganismi dotati
di enzimi decarbossilasici per di produrre diverse AB (Gardini & Suzzi, 2003; Gardini et al., 2008). L’assunzione di
dosi elevate di tali molecole può causare diversi problemi per la salute umana, soprattutto quando assunte in
concomitanza con alcol e farmaci antidepressivi. L’organismo umano è dotato di appositi sistemi di detossificazione,
che però, giunti a saturazione, rilasciano questi composti direttamente nel circolo sanguigno con conseguenti
manifestazioni tossicologiche la cui gravità dipende non solo dalla dose, ma soprattutto dal tipo di AB.
La tiramina, in particolare, è il prodotto della decarbossilazione dell’aminoacido tirosina da parte dell’enzima tirosina
decarbossilasi (tdc) ed è considerata responsabile della sindrome definita come “cheese reaction”, i cui effetti
tossicologici consistono in un aumento del battito cardiaco con concomitante vasocostrizione ed emicrania. In termini
igienico-sanitari risulta essere particolarmente importante sottolineare che l’enzima produttore di tale ammina è in
grado di utilizzare come substrato anche la fenilalanina, con conseguente produzione di 2-feniletilamina come
dimostrato da Landete et al. (2007).
L’entità della produzione di AB in un determinato substrato è funzione principalmente di diversi fattori quali:
disponibilità di precursore e cofattori, temperatura, concentrazione di NaCl, temperatura, pH, oltre la presenza di
microrganismi in grado di decarbossilare gli amminoacidi per produrre ammine biogene (Gardini et al., 2001; Tabanelli
et al., 2012). Diversi sono i ceppi di microrganismi Gram positivi caratterizzati dalla presenza di tale enzima, tra di essi
diversi appartengono al gruppo dei batteri lattici (LAB). In particolare, specie appartenenti al genere Enterococcus (i.e.
E. faecalis, E. faecium e E. durans) sono in grado di produrre quantità anche rilevanti di tiramina. Questi microrganismi
hanno un ruolo piuttosto controverso in quanto sono coinvolti nei processi di degradazione delle matrici alimentari, ma
allo stesso tempo svolgono importanti attività fermentative e a volte probiotiche. La loro presenza nelle matrici
alimentari può però costituire un serio problema per la salute umana in quanto alcuni ceppi sono antibiotico resistenti.
Date queste considerazioni risulta perciò fondamentale comprendere a pieno quali siano gli specifici effetti che i singoli
fattori e le loro combinazioni possono avere rispetto allo sviluppo microbico e all’accumulo di AB in diversi substrati,
considerando anche l’attività dell’enzima puro in assenza della mediazione della cellula microbica. Gli approcci
utilizzabili per raggiungere tale scopo sono diversi ma complementari. Infatti, se da un lato la ricerca genica può
produrre risposte inerenti alla presenza e alla localizzazione dei geni implicati nella sintesi di tali enzimi, dall’altro è
necessario verificare in vitro come reagiscono i microrganismi alla modulazione dei diversi fattori influenti sul processo
di decarbossilazione valutando se la sintesi di tali enzimi viene o meno attivata a livello cellulare e con quale efficienza.
2. Bibliografia
Gardini F, Bover-Cid S, Tofalo R, Belletti N, Gatto V, Suzzi G, Torriani S (2008) Modeling the aminogenic potential of
Enterococcus faecalis EF37 in dry fermented sausages through chemical and molecular approaches. App Environ
Microb 74: 2740-50.
Gardini F, Martuscelli M, Caruso M, Galgano F, Crudele MA, Favati F, Guerzoni ME, Suzzi G (2001) Effects of pH,
temperature and NaCl concentration on the growth kinetics, proteolytic activity and biogenic amine production of
Enterococcus faecalis. Int J Food Microbiol 64:105-17.
Gardini F, Suzzi G (2003) Biogenic amines in dry fermented sausages: a review. Int J Food Microbiol 88: 41-54.
Landete JM, de las Rivas B, Marcobal A, Muñoz R (2007) Molecular methods for the detection of biogenic amineproducing bacteria on foods. Int J Food Microbiol 117: 258-69.
Tabanelli G, Torriani S, Rossi F, Rizzotti L, Gardini F (2012) Effect of chemico-physical parameters on the histidine
decarboxylase (HdcA) enzymatic activity in Streptococcus thermophilus PRI60. J Food Sci 77: M231-7.
3. Sviluppo della ricerca
La ricerca è stata sviluppata secondo i seguenti punti principali:
A1) Ricerca bibliografica
- 51 -
Giornata del Dottorato – Curriculum in Scienze e Biotecnologie degli Alimenti 2015
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agro-Alimentari, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, Cesena, 27 Marzo 2015
A2) Valutazione “in vitro” dell’attività tirosino-decarbossilasica in funzione di diversi fattori chimico-fisici
A3) Determinazione della posizione del gene, sequenziamento e altre indagini geniche
A4) Studio delle cinetiche di accumulo della tiramina da parte di ceppi tiraminobiogenici coltivati in competizione con ceppi
produttori di batteriocine
A5) Valutazione dell’effetto delle colture microbiche studiate nella produzione di alcuni alimenti fermentati
A6) Preparazione di tesi, articoli e poster
Tabella 1. Diagramma di Gantt dell’attività di ricerca del dottorato
Attività
Mese
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
A1) Ricerca bibliografica
A2) Selezione di ceppi di batteri lattici produttori di tiramina
Valutazione “in vitro” dell’attività tirosino-decarbossilasica in
A3) funzione di diversi fattori chimico-fisici
1) Cellule vive in diversi terreni colturali
2) Cellule vive in sistema tampone
3) Enzima tdc puro
Determinazione della posizione del gene, sequenziamento e
A4) altre indagini geniche
A5) Studio delle cinetiche di accumulo della tiramina da parte di ceppi
tiraminobiogenici coltivati in competizione con ceppi produttori di
batteriocine
A6) Valutazione dell’effetto delle colture microbiche studiate nella
produzione di alcuni alimenti fermentati
1) Produzione di formaggi
A7) Preparazione di tesi, articoli e poster
4. Principali risultati
Il presente progetto di ricerca si propone di valutare la produzione di tiramina da parte di quattro ceppi appartenenti al
genere Enterococcus (E. faecium FC12 e FC643 e E. faecalis EF37 e ATCC29212) in mezzi colturali differenti per
concentrazione del precursore impiegato, pH, concentrazione di NaCl e temperatura di incubazione.
La sperimentazione è stata suddivisa in due differenti prove, la prima svolta in sistema tampone e la seconda in terreno
sintetico.
1° prova
La prima prova è stata svolta inoculando le cellule
microbiche in concentrazione pari a circa 8.2-8.5 log
UFC/ml (risospese dopo centrifugazione in soluzione
fisiologica 0.9% NaCl) in tampone citrato-fosfato
contenente una concentrazione di tirosina pari a 1000 mg/l
e caratterizzato da pH, concentrazione di NaCl e
temperatura di incubazione diversi. Nelle medesime
condizioni è stata anche valutata l’attività dell’enzima
Figura
1:
piano
sperimentale 1° prova
commerciale tyrDC estratto e purificato da E. faecalis,
addizionandone al tampone 0.075U. Il piano sperimentale
della prova è riportato in Figura 1.
Le colture sono state poi poste in incubazione, la vitalità cellulare e la produzione di tiramina è stata monitorata per 48h.
Parallelamente a questa prova è stata determinata la sequenza dei geni tirosina decarbossilasi (tyrDC) e tirosina
permeasi (tyrP) al fine di verificare la presenza di una correlazione tra la produzione di tiramina specifica del ceppo e le
caratteristiche genetiche dell’operone coinvolto.
I risultati inerenti l’attività dell’enzima tyrDC puro hanno evidenziato che l’accumulo di tiramina è superiore a pH 5 e 6
anche se in queste condizioni i valori erano piuttosto simili. Questo suggerisce che il pH ottimale in cui opera l’enzima
è compreso tra questi due valori. A pH 7 tale accumulo risulta dimezzato, mentre a pH 4 trascurabile. L’incremento
della concentrazione di sale comporta una riduzione dell’accumulo, ma le quantità di tiramina sono comunque rilevanti,
ciò significa che l’enzima riesce comunque ad operare con un’ottima efficienza di conversione nonostante lo stress
osmotico. La temperatura sembra rallentare le cinetiche di accumulo sia ai valori bassi (20°C) sia a quelli alti (45°C)
testati, mentre a 30 e 37°C l’enzima ha operato al massimo della sua efficienza senza differenze significative.
I risultati inerenti la vitalità cellulare hanno evidenziato che in nessuna condizione dopo due ore si ha una riduzione del
carico cellulare rilevante (<0.2 log UFC/ml), che invece si osserva in modo marcato a 24h nelle condizioni di pH 4 e
45°C per tutti e quattro i ceppi testati.
I dati inerenti la produzione di tiramina a 2h e 24h sono riportati in forma di istogrammi in Figura 2, è inoltre riportato il
rapporto tra tale produzione e quella nelle medesime condizioni dell’enzima puro.
- 52 -
Giornata del Dottorato – Curriculum in Scienze e Biotecnologie degli Alimenti 2015
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agro-Alimentari, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, Cesena, 27 Marzo 2015
Figura 2: produzione di
tiramina da parte delle cellule
vive (istogramma) e rapporto
con la produzione dell’enzima
puro dopo 2h e 24h. I risultati
sono la media di tre ripetizioni.
Dai risultati ottenuti emerge che i ceppi ATCC29212 e FC643 (non riportati in figura poiché al di sotto del limite di
determinazione) non sono stati in grado di produrre tiramina in nessuna delle condizioni considerate. I ceppi EF37 e
FC12 hanno invece mostrato una buona efficienza produttiva in tutte le condizioni testate, occorre evidenziare però che
il ceppo EF37 risulta inibito nella sintesi della tiramina dalla presenza di NaCl già a 2h, mentre non risulta esserlo il
ceppo FC12 che non presenta significative differenze nell’accumulo alle quattro diverse concentrazioni. Importante è
anche la maggiore produzione di tiramina da parte del ceppo EF37 quando coltivato a pH 4 e 5 o a temperature di 20°C.
Dalle indagini genetiche svolte sui ceppi è emerso che l’operone codificante per l’enzima tyrDC dei due ceppi di E.
faecalis ha un elevato grado di similarità rispetto quello depositato in Gen Bank, se non per alcune mutazione nella
sequenza amminoacidica, ma di tipo silente. I risultati di tale analisi sono mostrati in Figura 3.
Primer
E. faecalis EF37
E. faecalis ATCC 29212T
R1
F2
F1
F3
R3
R2
F4
tyrS
tyrDC
tyrP
tyrS
tyrDC
tyrP
Sequenze ottenute
450 bp
R4
deletion
Figura 3: rappresentazione della sequenza
dell’operone di E. faecalis EF37 e ATCC29212
mutation T/C
mutation A/G
2800 bp
Alla luce dello scarso contributo dell’indagine genica nello spiegare i diversi comportamenti dei diversi ceppi e
considerata la necessità di verificare come tali enzimi agiscono in un mezzo ricco ma di composizione nota è stata
allestita un’ulteriore prova che prevede la crescita di tali ceppi in un terreno sintetico addizionato di quantità diverse e
note di precursori.
2°prova
Questa prova prevede l’inoculo delle colture di Enterococcus faecalis EF37 e ATCC29212 in un terreno sintetico
contenente una miscela nota di amminoacidi (che comprende anche tirosina e fenilalanina precursori delle ammine di
interesse), macronutrienti, micronutrienti e vitamine. Tale terreno è stato preparato utilizzando come base acquosa una
soluzione tampone a pH 5.5, al fine di evitare un’eccessiva caduta del pH del mezzo durante la crescita microbica e la
conseguente morte delle cellule nel periodo di analisi. I due ceppi sono stati inoculati ad una concentrazione di circa 5.5
log UFC/ml e ad intervalli previsti dal piano sperimentale sono state svolte le determinazione della densità ottica (DO) a
600nm, il campionamento microbiologico e la quantificazione del contenuto in ammine biogene. Il terreno sintetico è
stato preparato modulando il contenuto in tirosina (T) e fenilalanina (P) come mostrato in Figura 4.
Figura 4: concentrazione dei precursori adottati nella
2° prova
I dati ottenuti per quanto concerne la determinazione della densità ottica hanno evidenziato che lo sviluppo cellulare per
entrambi i ceppi è massimo a 30 e 40°C, mentre molto rallentato a 20°C. A 56 h entrambi i ceppi raggiungono la fase
stazionaria alle temperature più alte, mentre a 20°C il plateau sembra essere raggiunto a 72h, ma con valori di densità
ottica nettamente inferiori rispetto quelli raggiunti nelle altre condizioni (0.300 rispetto 0.900-1.000). Dai conteggi
microbiologici è emerso che la vitalità cellulare in tutte le condizioni rimane elevata fino a 144 h, ad eccezione dei
campioni inoculati a 40°C dove il carico microbico raggiunge un massimo a 48h (circa 9 log UFC/ml) per poi ridursi di
circa 2 log UFC/ml. Nel complesso non si sono registrate evidenti differenze rispetto la composizione del terreno
impiegato.
In Figura 5 sono riportati i grafici inerenti la quantificazione delle ammine per i due ceppi nei diversi terreni. Per quanto
concerne la quantificazione delle ammine di interesse per entrambi i ceppi EF37 e ATCC29212 le concentrazioni nel
terreno che non contiene precursori sono, rispettivamente, al di sotto di 20 e 14 ppm.
- 53 -
Giornata del Dottorato – Curriculum in Scienze e Biotecnologie degli Alimenti 2015
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agro-Alimentari, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, Cesena, 27 Marzo 2015
Figura 5: Contenuto in amine biogene nei terreni sintetici
La quantificazione delle ammine ha evidenziato che il ceppo ATCC29212 è in grado di produrre entrambe le ammine
biogene, ma in concentrazione nettamente inferiore rispetto il ceppo EF37. Tale ceppo ha inoltre evidenziato una scarsa
propensione all’accumulo di feniletilammina, essa infatti è stata rilevata nel terreno contente solo fenilalanina, ma in
concentrazioni non superiori ai 4 ppm. Nelle altre condizioni la concentrazione di tiramina non supera mai i 130 ppm e
risulta essere superiore a 40°C. Più interessanti sono i risultati ottenuti per il ceppo EF37. Quest’ultimo è in grado di
produrre entrambe le ammine, infatti in assenza di tirosina ha prodotto feniletilammina in concentrazioni da 50 a 80
ppm alle diverse temperature. In presenza di 800 ppm di tirosina, con o senza la fenilalanina, le concentrazioni di
tiramina alle tre diverse temperature sono simili e comprese tra 350 e 400 ppm. Nella condizione di presenza dei due
precursori in concentrazione entrambi di 400 ppm, gli andamenti sono del tutto simile alla condizione con 800 ppm dei
due precursori, ma le concentrazioni relative dimezzate.
5. Elenco delle pubblicazioni prodotte nell’ambito dell’attività di dottorato
Bargossi E, Tabanelli G, Montanari C, Torriani S, Felis G, Lanciotti R, Gardini F. (2013). In vitro tyramine
accumulation by different strains of lactic acid bacteria. International congress “Spoilers in Food”, 1-3 Luglio,
Quimper (Francia). Book of abstract, p. 55.
Bargossi E (2013). Tyramine production by different strains of Lactic Acid Bacteria in relation to the cultural medium.
XVIII Workshop on the Developments in the Italian PhD Research on Food Science Technology and
Biotechnology, 25-27 Settembre, Conegliano, Italia. Book of abstract, p. 317.
Bargossi E (2014). Competition among bacteriocin producing lactococci and aminobiogenic lactic acid bacteria strains.
XIX Workshop on the Developments in the Italian PhD Research on Food Science Technology and
Biotechnology, 24-26 Settembre, Bari, Italia. Book of abstract, p. 129.
Bargossi E, Tabanelli G, Montanari C, Lanciotti R, Gatto V, Gardini F, Torriani S (2015). Tyrosine decarboxylase
activity of enterococci grown in media with different nutritional potential: tyramine and 2-phenylethylamine
accumulation and tyrDC gene expression. Frontiers in Microbiology (accepted).
Montanari C, Tabanelli G, Bargossi E, Lanciotti R, Gatto V, Torriani S, Gardini F (2014). In vitro tyramine
accumulation by different Enterococcus strains. LAB11- Egmond aan Zee, 31 agosto – 4 settembre, Amsterdam,
Olanda. Book of Abstract, B058.
Tabanelli G, Bargossi E, Montanari C, Patrignani F, Lanciotti R, Coloretti F, Grazia L, Gardini F (2013). Control of
tyramine production by Enterococcus faecalis in vitro through the use of Lactococcus lactis bioprotective cultures.
Microbial diversity, MD2013, 23-25 ottobre 2013, Torino, Italia. Book of abstract, p. 327.
Tabanelli G, Bargossi E, Montanari C, Lanciotti R, Gatto V, Torriani S, Gardini F (2014). Tyramine production of
enterococci under different pH, NaCl concentration and incubation temperature. LAB11- Egmond aan Zee, 31
agosto – 4 settembre, Amsterdam, Olanda. Book of Abstract, E045.
Tabanelli G, Bargossi E, Montanari C, Patrignani F, Lanciotti R, Gatto V, Torriani S, Gardini F (2014). Control of
biogenic amine production by Enterococcus faecalis and Streptococcus thermophilus in vitro through the use of
Lactococcus lactis bioprotective cultures. LAB11- Egmond aan Zee, 31 Agosto – 4 Settembre, Amsterdam,
Olanda. Book of Abstract, E053.
Tabanelli G, Montanari C, Bargossi E, Lanciotti R, Gatto V, Felis G, Torriani S, Gardini F (2014). Control of tyramine
and histamine accumulation by lactic acid bacteria using bacteriocin forming lactococci. Int J Food Microbiol
190:14-23.
- 54 -