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Protocollo sperimentale dei Macachi di Modena
11 giugno 2014 alle ore 0.14
Programma di ricerca
ASPETTI MOTORI E COGNITIVI DELLA FUNZIONE CEREBELLARE
Università di riferimento
Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA - SCIENZE BIOMEDICHE - MODENA(MO)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Leopoldo BON
Descrizione
L'architettura anatomica dei loops cerebellari con la corteccia prefrontale e le evidenze sperimentali di
consistenti connessioni tra la corteccia prefrontale e le cortecce uditive, suggeriscono il coinvolgimento
del cervelletto ed in particolare del nucleo dentato, nei processi cognitivi, come proposto da Kelly and
Stick (2003), nonché la sua integrazione con il sistema uditivo. Inoltre, le connessioni dell'area 9 e 8B con
gli strati profondi del collicolo superiore, le proiezioni delle aree 8B e 8A all'area 6 dorsale, e le ulteriori
evidenze su consistenti proiezioni tra le aree prefrontali e di queste con l'area 6 dorsale, suggeriscono
l'esistenza di un robusta rete di integrazione tra la corteccia prefrontale dorsale e l'area 6 dorsale con il
collicolo superiore. Indagini elettrofisiologiche hanno dimostrato la presenza di neuroni la cui attività è
correlata con i movimenti dell'occhio e dell'orecchio nelle aree 8B e 8A (Bon and Lucchetti 1994, Schall et
al. 1995) e del capo nell'area 8A e nell'area 6 dorsale (Bizzi and Schiller 1970, Bon and Lucchetti 1991 ,
Sparks et al. 2001), quella di neuroni uditivi nelle aree 9,8B, 8A e nell'area 6 dorsale (Fuster 2000).
Inoltre, è stato dimostrato che la microstimolazione dell'area 6 dorsale evoca incrementi di attività
elettromiografica a livello del collo (Schlag and Schalg-Rey 1987, Bon and Lucchetti 1991, Luppino et al.
2003). Tutti questi dati anatomici ed elettrofisiologici suggeriscono una integrazione ulteriore del
cervelletto nei processi di orientamento occhio-orecchio e nel controllo dei movimenti della testa.
Lo scopo di questa ricerca è quello di studiare in quale tipo di processi cognitivi è coinvolto il
cervelletto. Quindi, si indagherà prima in merito al ruolo svolto dalle aree prefrontali dorsali 9 e 8B, e
successivamente dal nucleo dentato del cervelletto nell'orientamento dell'occhio e dell'orecchio e nella
funzione di controllo del capo. In particolare si studieranno i processi di memorizzazione delle saccadi, gli
aspetti comportamentali delle cellule uditive, il processo di orientamento dell'occhio-orecchio, l'effetto
dell'attenzione sulle cellule uditive, la funzione di controllo premotorio e motorio del collo.
Durante il primo anno di attività sperimentale si condizionerà l'animale e si deriverà l'attività dei singoli
neuroni dalla corteccia prefrontale. Nel secondo anno si deriverà l'attività unitaria dal cervelletto ed in
particolare dal nucleo dentato, e si procederà all'analisi dati ed alla ricostruzione della mappa delle
penetrazioni.
Per quanto attiene le interazioni tra le diverse unità di ricerca, questa unità, che intende sviluppare
il suo progetto su un modello animale ad alto sviluppo neurologico, potrà senza ombra di dubbio
interagire, per quanto attiene gli aspetti cognitivi, con il gruppo della prof. Leggio Maria Giuseppa
il cui programma di ricerca verte sugli aspetti cognitivi del cervelletto (memoria ed attenzione) nei
pazienti con danno cerebellare. Inoltre, sempre per quanto riguarda gli aspetti cognitivi, potrà trovare
interazioni di tipo comparativo anche con l'attività dell'unità diretta dal prof. Guido Livolsi, che si
interesserà degli aspetti anatomici delle connessioni cerebellari nel ratto. Infine, visto lo studio
vertente sulla funzione cella corteccia prefronale e del cervelletto nel controllo del movimento, sarà di
grande interesse l'interazione con l'unità diretta dal prof. Vincenzo Perciavalle che si interesserà
di rappresentazione, a livello cerebellare, dei movimenti dell'arto anteriore del ratto.
METODI
Metodi comportamentali
L'attività elettrica di singoli neuroni verrà registrata in una scimmia della specie Macaca fascicularis e
verrà testata con: a) l'esecuzione di compiti visuomotori 2) la presentazione di stimoli uditivi in condizione
di spontaneità; c) la presentazione degli stessi stimoli uditivi durante la fissazione. I compiti visuomotori
saranno i seguenti: 1) fissazione visiva 2)saccadi visive 3) saccadi memorizzate. L'allenamento
preliminare sarà eseguito con l'apparato di condizionamento montato sulla gabbia in cui l'animale vive
abitualmente. 'animale apprenderà a premere una leva per provocare l'accensione di un LED bicolore
(rosso-verde) di luce rossa. Dopo un periodo variabile tra 0.5 e 5.0 s la mira visiva diventerà verde per
0.5 s e l'animale in tale periodo dovrà rilasciare la leva per ricevere il premio, costituito da alcune gocce di
acqua dolcificata. Quando l'animale avrà imparato tale compito nella gabbia, verrà posto a sedere in una
sedia per primati e portato in una gabbia di Faraday, dove riprenderà l'allenamento sempre con il compito
di fissazione. In questa nuova condizione la difficoltà del compito verrà incrementata. L'animale dovrà
sempre premere una leva, posizionata in fronte a lui, con l'arto controlaterale all'emisfero da dove si
registrerà l'attività unitaria, ed una mira visiva tricolore (rosso-giallo-verde) diventerà rossa (periodo
rosso),dopodiché diventerà gialla (periodo giallo) e quindi verde (periodo verde).L'informazione visiva
rossa rappresenterebbe il segnale di "attesa" la gialla di "preparazione al rilascio" la verde il comando di
"rilascio". Quando le risposte corrette raggiungeranno l'80-90%l'animale sarà allenato per apprendere il
compito di saccade visiva. In questo compito più mire visive diventeranno rosse in successione fino
all'ultima che diventerà anche verde. Ogni mira visiva diventerà rossa allo spegnimento della precedente.
L'animale dovrà rilasciare la leva durante il periodo verde per ricevere il premio. Quando si riterrà che
l'animale abbia imparato sufficientemente bene i compiti e non mostrerà segni di insofferenza nello stare
sulle sedia, sarà preparato per l'impianto del sistema di contenzione indolore e per la derivazione del
movimento oculare.
Dopo due settimane dall'intervento l'animale verrà allenato ad eseguire i compiti di fissazione e di
saccade, con la testa fissa, finché avrà raggiunto l'80-90% di risposte corrette. Inizierà allora ad imparare
il compito disaccade memorizzata. In questo compito, l'animale eseguirà una fissazione verso una mira
visiva centrale, dopo 1.0-1.5 s una mira visiva periferica si accenderà per 150 ms. La mira visiva centrale,
1.0 s dopo il flash della mira visiva periferica si spegnerà e l'animale dovrà eseguire una saccade verso la
mira periferica per ricevere il premio. Un segnale acustico segnalerà l'inizio del compito e l'animale potrà
iniziare a lavorare a suo piacimento. Il segnale acustico resterà acceso durante tutta la successione delle
prove e si spegnerà al compimento delle prove corrette. Le mire visive (LEDs) avranno un diametro di
0.05° e saranno posizionate a 114 cm davanti all'animale. Nell'esecuzione di qualunque compito, la prova
sarà abortita se l'animale farà una extra-saccade.
Gli stimoli uditivi saranno prodotti in laboratorio durante le sedute di allenamento, con l'animale seduto
sulla sedia per primati. Gli stimoli uditivi utilizzati saranno; 1) toni singoli generati da tastiera elettronica, 2)
un singolo tono seguito da un periodo silente (rotardo) di 150 ms e quindi dal rilascio di alcune gocce di
acqua zuccherata come premio; 3) stimoli ambientali: le voci degli sperimentatori come parlato, grida o
parole singole, apertura e chiusura delle porte del laboratorio, scalpiccio dei piedi, movimenti delle sedie
del laboratorio, passi dei ricercatori in avvicinamento o in allontanamento dall'animale, tamburellamento
delle dita o di penne sulle superfici del laboratorio. Si genereranno anche stimoli non usuali come colpi di
martello, schioccare delle bretelle, percussione di bicchieri, voci umane non note e vocalizzazioni di
animali. Tutti gli stimoli saranno registrati precedentemente e riprodotti mediante quattro altoparlanti
posizionati ad una distanza di 100 cm a destra e a sinistra dell'animale, due davanti e due dietro con una
angolazione di 45° rispetto alla linea interemisferica. Gli stimoli saranno prodotti a destra, a sinistra od in
entrambi i lati. Gli stimoli ambientali e quelli non usuali saranno prodotti anche direttamente in laboratorio,
senza l'ausilio degli altoparlanti. L'ultimo test consisterà nella produzione dei medesimi stimoli uditivi
mentre l'animale eseguirà il compito di fissazione visiva con l'occhio in posizione primaria. Questa prova
permetterà di verificare se l'orientamento volontario dell'attenzione modifica l'attività dei neuroni uditivi.
Inoltre, per verificare se la corteccia prefrontale dorsale (aree 9 e 8B) é coinvolta nel controllo dei
meccanismi che regolano la funzione motoria della testa, si studieranno gli effetti delle istruzioni visive ed
uditive di tipo preparatorio sulla attività delle cellule correlate agli aspetti funzionali del collo. L'istruzione
preparatoria nel compito di fissazione è rappresentata dal giallo, mentre nel test uditivo l'istruzione
preparatoria è rappresentata dal ritardo tra il tono ed il premio. Per verificare se la scarica é in relazione
al periodo di preparazione oppure alla forza esercitata dall'animale durante il leccamento del beccuccio
da cui verrà dato il premio, si userà un Multi PurposeRobot (MUPRO) (Bon et al. 2002), che permetterà di
misurare le forze esercitate a livello del capo sul piano orizzontale. Per verificare se esiste una relazione
tra scarica e forza, si posizionerà il beccuccio a diverse distanze dalla bocca dell'animale. Inoltre, con il
medesimo apparato, si potranno registrare i movimenti passivi ed attivi di rotazione del capo.
Alla fine delle diverse fasi di allenamento, l'animale sarà preparato per la registrazione dell'attività
unitaria.
Metodi chirurgici.
In una prima fase, in anestesia generale (Zoletil 10mg/kg i.m, o ketamina10mg/kg i.m., con 0.1 mg/kg
Xylazine i.m.) ed in condizioni di asepsi, verrà applicato un perno di acciaio inossidabile sulla teca
dell'animale mediante quattro viti e del cemento acrilico, per permettere la contenzione indolore
dell'animale. Allo stesso tempo una spira in acciaio teflonato sarà applicata sotto la congiuntiva
oculare, per permettere la registrazione dei movimenti oculari (Judge et al. 1980), e quattro fili in
acciaio pure essi ricoperti diteflon saranno inseriti nei muscoli nucali per la derivazione dell'EMG.
Inoltre, nel primo anno, una camera di registrazione, per l'attività unitaria, sarà impiantata a livello
della corteccia prefrontale sulla base di coordinate stereotassiche.
Nel secondo anno di attività sperimentale, una camera di registrazione sarà impiantata a livello
cerebellare per la registrazione dell'attività unitaria dal nucleo dentato.
Dopo ogni fase chirurgica si somministreranno analgesici, antibiotici ecortisonici per due settimane.
Metodi fisiologici ed analisi dati.
I movimenti oculari saranno registrati mediante il sistema del campo magneticousando il metodo di
rilevamento della fase dei campi magnetici (Judge et al1980; Remmel 1984). La medesima tecnica sarà
applicata per derivare i movimentidel padiglione auricolare. In questo caso la spira sarà applicata
all'orecchiomediante un sottile nastro autoadesivo all'inizio di ogni seduta sperimentale(Bon and Lucchetti
1994). Questo sistema permetterà di individuare l'inizio ela fine del movimento, ma non potranno essere
ottenuti altri parametri poichéil sistema della spira, qui utilizzato, definisce i movimenti in due
dimensioni(X-Y), mentre i movimenti dell'orecchio sono in tre dimensioni (X-Y-Z). A complemento verrà
usato un sistema televisivo all'infrarosso per osservare i movimenti ed il comportamento dell'animale. Tali
dati saranno anche registratisu computer ed inoltre l'EMG, la scarica nervosa e gli stimoli uditivi saranno
sopra registrati sul video mediante un miscelatore audio. Gli stimoli uditivi saranno registrati mediante un
microfono amplificato ed usati come markers per studiare la sincronizzazione con la scarica nervosa.
L'EMG sarà usato per monitorare i tentativi di muovere il capo quando l'animale si troverà col capo
fisso. L'attività dei singoli neuroni sarà isolata mediante un sistema multielettrodo (Miniature FiberElectrode MiniMatrix-05 ed il sistema di amplificazione, filtraggio e discriminazione MAF-05 entrambi della
della Thomas Recording GmbH) per cui si chiede il finanziamento. I movimenti dell'occhio e della
pinna, il marker degli stimoli uditivi, l'EMG, l'attività unitaria e le componenti X-Y delle forze del capo
saranno campionate ad 1KHz e memorizzate mediante un sistema GWI-Macintosh per l'analisi off-line. Il
software SuperscopeII (GWI) sarà utilizzato sia per la registrazione, sia per l'analisi dei dati. Per l'analisi
statistica si utilizzerà il test di Wilcoxon (Wilcoxonsigned-rank test) per comparare due livelli di una
variabile.
Alla fine degli esperimenti, verranno eseguite delle marcature in alcuni siti di penetrazione mediante
corrente continua (10µA per 15 s) per la ricostruzione istologica, post mortem, della mappa delle
penetrazioni. Alla fine di tutte le sedute sperimentali, sotto anestesia profonda, l'animale verrà perfuso
prima con una soluzione allo 0.9% di NaCl e poi con una soluzione di formalina al 5%. Quindi il cervello
sarà sezionato in fette di 60µ e colorato con tionina.
Tutte le fasi sperimentali seguiranno gli standard stabiliti dalla ComunitàEuropea e le vigenti leggi Italiane
(D.L. 116/92).
Risultati attesi
Poiché le lesioni dell' area 9 e dell'area 8B non producono deficit consistenti nei compiti di
memorizzazione e nella esecuzione di saccadi guidate dallo stimolo visivo, si può supporre che la
presenza dei neuroni correlati alle saccadi- memorizzate sia percentualmente scarsa (Petrides 2000,
Lucchetti etal. 1997). Risultati consistenti possono essere attesi, invece per quanto concerne i neuroni
uditivi viste le evidenze anatomiche ed elettrofisiologicheprecedenti. Si può anche ritenere che i neuroni
uditivi si attiveranno solo per stimoli ambientali (laboratorio), visto l'alto livello gerarchico di queste aree
corticali; mentre i neuroni uditivi-motori saranno attivi sia per gli stimoli uditivi, sia per i movimenti di
orientamento dell'occhio e dell'orecchio. Per quanto concerne l'effetto dell'attenzione, si ritiene che
l'orientamento dell'attenzione verso una mira visiva possa produrre unainibizione della scarica dei neuroni
uditivi o/e uditivi-motori, come è stato dimostrato a livello del collicolo superiore (Bell et al. 2003). Più
complessi sono i risultati attesi in merito alla funzione di controllo dei movimenti del capo. E' possibile che
esista un vasto repertorio di neuroni con attività specifiche, per esempio: neuroni- premotori, la cui attività
potrebbe essere specifica per "cues" premotorie uditive o visive; neuroni motori, la cui attività potrebbe
essere in relazione alla forza esercitata dall'animale per leccare il beccuccio erogante il premio; neuroni di
posizione la cui attività potrebbe essere in relazione a differenti posizioni del capo sul piano orizzontale;
neuroni di movimento la cui attività potrebbe essere in relazione ai movimenti torsionali eseguiti verso
stimoli uditivi e visivi di orientamento.
Per quanto attiene alla attività derivata a livello cerebellare si dovrebbero trovare delle attività di scarica
che rappresentino delle funzioni di trasferimento delle informazioni codificate a livello della corteccia
prefrontale (Lamarre et al. 1983).
Se tali risultati attesi saranno confermati sperimentalmente si capirà meglio in quali processi cognitivi il
cervelletto è coinvolto.
fonte: http://www.ricercaitaliana.it/prin/unita_op-2005052747_003.htm (pagina attualmente non
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