CONTA DI CELLULE:

CONTA DI CELLULE:
Tramite il software ImageJ è possibile effettuare la conta di cellule principalmente in due modi:
a) Conta automatica
b) Conta manuale
Caso a): CONTA AUTOMATICA
Prima di utilizzare la conta automatica è necessario sogliare l’immagine. (N.B. non è possibile sogliare direttamente
immagini che sono di tipo RGB -> in questo caso bisogna cambiare loro tipo andando su Image -> Type -> 8 bit ).
La soglia viene effettuata tramite il comando Threshold (Image -> Adjust -> Threshold):
Una volta selezionato il comando compare questa finestra
Da questa è possibile settare i valori minimo e
massimo in pixel che si vogliono utilizzare per
l’immagine.
Nelle opzioni è comodo lasciare impostato
Black&White.
Dopo essere stata sogliata l’immagine che si presenta è di questo tipo:
Un’alternativa alla sogliatura consiste nella binarizzazione dell’immagine tramite il comando Make Binary che si
trova sotto Process -> Binary ->Make Binary; questo rende l’immagine binaria tramite una soglia automatica, che in
generale risulta appropriata per immagini ben contrastate. In caso contrario è preferibile procedere tramite
sogliatura manuale. La presentazione dell’immagine è simile alla figura precedente.
POSSIBILE PROBLEMA:
Alle volte la binarizzazione dell’ immagine porta ad una fusione tra cellule vicine -> per poter risolvere questo
problema si utilizza il comando Watershed (Process -> Binary -> Watershed) .
Vediamone un’applicazione pratica:
Presentazione dell’immagine prima di utilizzare Watershed:
Immagine ottenuta dopo l’utilizzo di Watershed:
Come si vede dall’immagine alcune cellule,
che dall’immagine precedente risultavano
fuse, ora sono state separate (messe in
evidenza con cerchi rossi).
Una volta che l’immagine è stata sogliata è possibile utilizzare i seguenti comandi per la conta automatica, a scelta in
base alle proprie esigenze:
-
Se si vuole ottenere una conta automatica di cellule che comprende anche il calcolo della loro area -> si
utilizza il comando ANALYZE PARTICLES (Analyze-> Analyze Particles):
In questa finestra è possibile settare varie opzioni:
-
Size -> setta la dimensione minima e
massima dell’area che si vuole includere
nella conta in pixel. (come minimo
mettere pure 50 per eliminare gli
artefatti).
-
Show -> sono le varie modalità di
rappresentazione della conta: per
comodità meglio selezione Outlines che
traccia il contorno delle cellule.
-
Nelle caselline da spuntare l’importante è
lasciare selezionato “Display Results”, che
mostra in una finestra i risultati della
conta.
Il risultato dovrebbe essere tipo:
-
Se invece è sufficiente contare le cellule oppure si vuole poter lavorare sull’immagine dopo la conta, magari
aggiungendo alcune cellule manualmente, si può utilizzare il comando FIND MAXIMA (Process -> Binary ->
Find Maxima).
Questo comando è utilizzabile sia per immagini binarizzate che per immagini originali.
In entrambi i casi la finestra del comando Find Maxima è così presentata:
Da qui è possibile selezionare:
1.La tolleranza al rumore (in pixel), vengono cioè
selezionate solo le cellule che si trovano sopra quel
valore -> rappresenta il valore minimo a partire dal
quale viene considerato il segnale.
2.Il tipo di Output -> selezionare Point Selection.
Selezionare “Light Background” se il background
dell’immagine è chiaro (utile soprattutto se
l’immagine è stata binarizzata).
E’ utile utilizzare il comando “Preview Point
Selection” per visualizzare i punti che vengono
selezionati, in modo da poter verificare se può
andare bene.
Caso 1 ) Se l’immagine è stata prima binarizzata il risultato dovrebbe essere del tipo:
Se si nota che mancano alcune cellule dalla conta è
poi possibile inserire eventualmente altri punti a
mano selezionando il comando “Point Selection”,
ossia la crocetta con il quadratino giallo al centro
, e tenendo premuto il tasto Alt per ogni
inserimento -> il programma inserisce
automaticamente un punto con il numero della
cellula aggiornato.
Caso 2) In alternativa, è possibile utilizzare l’immagine originale non sogliata. Questo è possibile nei casi in
cui il segnale proveniente da una cellula abbia un picco di intensità al centro. L’immagine risultante sarà in
questo caso del tipo:
Anche in questo caso è possibile aggiungere
manualmente delle cellule se si nota che non sono
state incluse nella conta.
Caso b): CONTA MANUALE
È possibile utilizzare altrimenti l’inserimento manuale che consente inoltre di contare più cellule differenti
nella stessa immagine -> è quindi molto utile nel caso in cui sia necessario distinguere tra i tipi di cellule.
Questo è possibile grazie al plug-in “Cell counter” (Plugin-> Analyze -> Cell Counter)
Questo plugin consiste nell’incremento del numero di cellule mano a mano che vengono selezionate
dall’utente.
La finestra del Cell Counter è cosi fatta:
Sull’immagine vengono poi selezionati punti di
colore diverso per ogni tipo selezionato.
Inizialmente viene chiesto di selezionare un tipo e
di inizializzare la conta tramite il pulsante Initialize;
dopodiché ogni volta che viene selezionata una
cellula il contatore si aggiorna presentando sulla
casellina a lato del tipo il numero delle cellule di
quel tipo contate fino a quel momento.