USO - Genedia

I tamponi usati nell' elettroforesi del DNA sono il TBE e il TAE che essendo a pH basico rendono il
fosfato del DNA carico negativamente e , quindi, il DNA migra verso l' anodo. Quando il DNA non
deve essere recuperato e i frammenti da separare sono inferiori a 12 Kb è preferibile utilizzare il
TBE anche in virtù della migliore capacità tampone rispetto al TAE. Inoltre non è necessaria la
ricircolazione del tampone per corse lunghe, in quanto la deplezione del TBE avviene molto più
lentamente.
Il tampone deve ricoprire il gel di 3-5 mm per evitare che il gel secchi, mentre l'eccessiva altezza
diminuisce la resistenza del circuito, causando una diminuzione del flusso di corrente e la
diminuzione della forza del gel che si traduce in una diminuzione della mobilità del DNA con
distorsione delle bande.
La tecnica più comune per separare il DNA è l'elettroforesi orizzontale submarine in agarosio 0.56.0% in funzione della taglia dei frammenti da separare. Vedi Tab.
%GEL
0.5
0.6
1.0
1.2
2.0
4.0
Intervallo risoluzione ottimale (Kb)
30-0.1
12-0.8
10-0.5
7-0.4
3-0.1
<100
Ricerca e Sviluppo: Traversa Michele Pietravalle, 11 80100 NAPOLI Tel. 081 5465026
Email: [email protected]
Sede Amministrativa e Produzione: Via Lombarda 169/A 55013-LAMMARI (LU) Tel/Fax 0583-962672
Email: [email protected]
AGAR KIT
Rivelazione frammenti di DNA
GD 212
Per ottenere una ottima risoluzione è necessario che lo spessore del gel non superi i 3-4 mm. Il
volume della soluzione agarosio/tampone deve essere calcolata moltiplicando l'area della camera di
polimerizzazione per lo spessore del gel desiderato. Il gel deve correre per circa il 50% della sua
lunghezza. L' aumento del tempo di corsa migliora la discriminazione fra 2 frammenti di DNA vicini.
La minima quantità di DNA che può essere visualizzata, come singola banda, in Etidio Bromuro è di
10 ng. Il loading buffer che viene caricato insieme al campione ha la funzione di aumentarne la
densità favorendone la deposizione nel pozzetto, di aggiungere colore al campione onde seguirne la
progressione nel gel e di avere una mobilità nota così da permettere di monitorare il processo
elettroforetico.
Il voltaggio di corsa, nell' elettroforesi orizzontale, è determinato in base alla distanza in cm fra gli
elettrodi ed è compreso tra 4 e 10 V/cm. Quando il voltaggio è troppo elevato le bande si muovono
troppo velocemente lasciando una scia, mentre quando è troppo basso viene ridotta la mobilità,
soprattutto dei frammenti minori di un Kb, provocando l' allargamento della banda in seguito a
diffusione. Il Bromuro di Etidio è un colorante fluorescente che si intercala nel DNA single o double
stranded. Il complesso Bromuro di Etidio - DNA viene visualizzato nell' ultravioletto. A 250 nm la
luce ultravioletta viene assorbita dal DNA e trasmessa al colorante; a 302 nm e 366 nm la luce
viene assorbita dal colorante stesso. In entrambi i casi la radiazione è riemessa a 590 nm nella
regione rosso-arancio dello spettro visibile.
ISTRUZIONI D’USO
Edizione 1 Rev. 11 Giugno 2001
Prodotto e Distribuito da:
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Fig:1 Agarosio 3% rivelazione Bromuro di Etidio
GeneDia Via Lombarda 169/A 55013-LAMMARI (LU) Tel/Fax 0583-962672
Web:www.genedia.it - Email [email protected]
PREPARAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO AL 2% E MIGRAZIONE:
INTRODUZIONE:
Il kit Agar garantisce la buona esecuzione della separazione poichè l'agarosio in esso contenuto è
stato selezionato per le caratteristiche di bassa elettroendosmosi e trasparenza ottica; i reagenti
utilizzati per la preparazione dei tamponi di migrazione sono specifici per elettroforesi. Il contenuto
del kit permette la preparazione di 12 gels al 2%, utilizzando un gel tray che possa contenere 50
ml di agarosio. Il numero di migrazioni dipende dal tipo di pettine utilizzato per la preparazione dei
pozzetti in cui viene depositato il campione: normalmente sul gel è possibile caricare fino a 12
campioni di 20 µl di volume o, mediante una doppia migrazione, 24 campioni.
• Preparare 500 ml di TBE 0,5 x aggiungendo a 450 ml di acqua bidistillata 50 ml di tampone TBE 5 x.
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Applicabilità: su DNA in condizioni non denaturanti (0,1 - 60 Kb)
Numero di test: 12 gels (12/24 migrazioni per gel)
Tempi d’esecuzione: 1- 2 ore (inclusa la preparazione del gel)
Conservazione: 4°C
Stabilità: oltre 12 mesi se correttamente conservato
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CONTENUTO DEL KIT E SUO UTILIZZO:
1)
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n. 12 tubi di agarosio prepesato (1 g.):
PREPARAZIONE:
- pronto all'uso
2) n. 2 confezioni di TBE 5x (150 ml x 2):
• in soluzione
- diluire 1 a 10 con acqua bidistillata
PREPARAZIONE:
CONSERVAZIONE: - 4°C
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3) n. 1 confezione di Loading Buffer 6 x
• in soluzione
- miscelare 2µl di Loading Buffer con 10 µl di campione prima di
PREPARAZIONE:
caricare su gel.
CONSERVAZIONE: - 4°C
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4) n. 1 tubo di Etidio Bromuro 10.000 x.
PREPARAZIONE:
- aggiungere 1 µl di Etidio Bromuro per 10 ml di TBE 0,5 x.
CONSERVAZIONE: - 4°C al buio
5) n. 1 tubo contenente 5 µg di Marcatore di Pesi Molecolari, liofilo.
- risospendere in 250 µl di acqua sterile. Caricare 20 µl per gel.
PREPARAZIONE:
CONSERVAZIONE: - 20°C il liofilo; 4°C la soluzione in uso.
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L'elettrolita, una volta versato nella camera può essere utilizzato per 2 migrazioni. Il volume di 500 ml è
indicativo per una camera standard. Condizione indispensabile perchè la migrazione avvenga correttamente è
che la superficie del gel sia coperta per almeno 4 mm dall'elettrolita.
predisporre il Gel Tray, pulito ed asciutto, su un piano livellato;
porre in sede le barriere di ritenzione del gel e/o avvolgere di nastro adesivo;
posizionare il pettine idoneo.
versare in un beaker o una beuta (usare un contenitore il cui volume sia almeno 4 volte superiore al volume di
TBE utilizzato) 50 ml di TBE 0,5 x;
aggiungere il contenuto di agarosio;
porre su agitatore riscaldante (80-90°C in agitazione) o in forno a microonde (per 2 minuti sulla posizione
"medium")
attendere la completa dissoluzione della polvere.
raffreddare a 50°C;
aggiungere 5 µl di Etidio Bromuro;
agitare e versare lentamente nel Gel Tray predisposto in precedenza, evitando la formazione di bolle d'aria.
attendere la polimerizzazione del Gel;
Il gel necessita di 15-30 minuti per solidificare.
Non spostare il Tray durante la solidificazione.
rimuovere il pettine, le barriere od il nastro;
posizionare il gel nella camera di separazione;
aggiungere TBE 0,5 x fino a sfiorare la superficie del gel, avendo cura di riempire i pozzetti di tampone.
distribuire 2 o 4 µl di Loading Buffer in tubi Eppendorf;
aggiungere 10 o 20 µl di campione;
miscelare con il puntale;
caricare 12 o 24 µl in ciascun pozzetto;
caricare almeno una linea di migrazione con il Marcatore di peso molecolare (20 µl + 4 µl di Loading Buffer).
coprire completamente il Gel con TBE;
chiudere la camera;
attivare la migrazione con i seguenti parametri: 100 volt - 80 - 100 mAmpere.
fermare la migrazione quando il colorante azzurro ha raggiunto il 50% della lunghezza totale del Gel.
Porre sul Transilluminatore e fotografare.
ELETTROFORESI DEL DNA IN GEL DI AGAROSIO
STRUMENTAZIONE RICHIESTA:
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camera elettroforetica orizzontale "submarine" completa di accessori.
alimentatore 10 - 400 Volt.
transilluminatore UV.
apparecchio fotografico Polaroid con accessorio di focalizzazione.
1) da 0.5-10 µl
Set di pipette post PCR
2) da 5-50 µl
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L' elettroforesi è definita come un movimento di ioni e macromolecole cariche attraverso un mezzo
quando è applicato un campo elettrico. L' agarosio è un polisaccaride costituito da circa 400 unità
identiche formanti una lunga catena di massa molecolare di circa 120.000 daltons e forma un gel
che è ideale per la diffusione e il movimento elettrocinetico dei biopolimeri. Per queste proprietà
viene utilizzato in elettroforesi, immunoelettroforesi e immunodiffusione.
Durante l' elettroforesi, l' acqua è idrolizzata generando protoni all' anodo e ioni idrossilici al catodo,
così il catodo diventa basico e l' anodo acido. E' necessario, dunque l'uso di un sistema tampone
quando si devono separare molecole cariche.
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