Caretta caretta

Biol. Mar. Mediterr. (2012), 19 (1): 251-254
M. Giannetti, M.C. Fossi, M. Baini, D. Coppola, S. Maltese, C. Panti, T. Campani,
I. Caliani, L. Carletti, L. Pireddu1, G. Fara1, S. Casini, L. Marsili, D. Denurra1
Dipartimento di Scienze Ambientali “G. Sarfatti”, Università di Siena, Via Mattioli, 4 - 53100 Siena, Italia.
[email protected]
1
CRAMA, Centro Recupero Animali Marini Asinara, Isola dell’Asinara, Sardegna, Italia.
EFFETTI TOSSICOLOGICI IN ESEMPLARI
DI CARETTA CARETTA (LINNEO, 1758)
CAMPIONATI NEL CENTRO RECUPERO ANIMALI MARINI
DEL PARCO NAZIONALE DELL’ASINARA (SARDEGNA)
TOXICOLOGICAL EFFECTS
IN CARETTA CARETTA (LINNEO, 1758)
FROM CRAMA RESCUE CENTRE
OF ASINARA NATIONAL PARK (SARDINIA, ITALY)
Abstract - Three species of sea turtle are found in the Mediterranean basin, Chelonia mydas,
Dermochelys coriacea and the most common Caretta caretta. The loggerhead turtle (Caretta caretta)
and green turtle (Chelonia mydas) are currently classified as ‘‘endangered” species worldwide by IUCN
(International Union for Conservation of Nature). In addition to the accumulation of pollutants from
food the threats for the Mediterranean population of these species are fishing, degradation of nesting
beaches and solid wastes. Therefore, there is a need to develop tools to investigate the health status
of the Mediterranean population of turtles. The main aims of this study were: a) to develop a nondestructive sampling method (blood, skin biopsies, excreta and carapace), b) to develop and apply a set
of ecotoxicological biomarkers in order to explore different levels of interaction between contaminants
and the organism, c) to investigate levels of contaminants most commonly present in the Mediterranean
and d) to evaluate the responses of a set of biomarkers in the loggerhead specimens after an oil-spill.
There is a lack of information concerning in particular the toxicological effects of pollutants on this
endangered species, hence the need to develop sensitive non-invasive tools to evaluate the exposure to
and effects of contaminants. The main results of this work are a non-lethal sampling methodology, and
the assessment of biomarker responses to different levels of contaminants. This work is a contribution
for the development of a complete protocol of analysis for the monitoring and protection of endangered
species of turtles, highly stressed in the Mediterranean Sea.
Key-words: non-destructive testing, sea turtle, biological stress, marine parks.
Introduzione - Nel Mar Mediterraneo è possibile ritrovare tre specie di tartarughe
marine, la tartaruga verde (Chelonia mydas - Famiglia Cheloniidae), la tartaruga liuto
(Dermochelys coriacea - Famiglia Dermochelyidae) e la tartaruga comune (Caretta
caretta - Famiglia Cheloniidae). Caretta caretta, attualmente classificata a livello
mondiale dalla IUCN come specie EN “endangered”, nonostante sia la più diffusa
nel bacino Mediterraneo, ha una popolazione nidificante considerata scarsa o molto
scarsa già da due decenni (Goombridge, 1990). Come riportato nell’Action Plan
per la Conservazione delle tartarughe marine nel Mar Mediterraneo (UNEP MAC
RAC/SPA, 2007), c’è una chiara evidenza dell’impatto negativo delle attività umane
su queste specie. Fra queste le principali sono: 1) il deterioramento degli habitat di
nidificazione, 2) l’impatto diretto dell’uomo (catture accidentali nella pesca, uccisioni
volontarie e collisioni con le imbarcazioni), 3) l’ingestione di materiali plastici presenti
in mare, e 4) l’inquinamento antropico, con influenza sia sulla popolazione che sugli
habitat. Il lungo periodo di vita di questi Rettili (long-living species) e la loro posizione
nella catena trofica marina con un’alimentazione basata principalmente su crostacei,
molluschi e pesci, rende le tartarughe marine particolarmente soggette agli effetti
dei tossici presenti. Diversi studi hanno dimostrato che i livelli di organoclorurati
(OCs) e metalli pesanti rilevati nel materiale biologico di esemplari di C. caretta
252
M. Giannetti
et al.
del Mar Mediterraneo sono spesso significativamente più elevati rispetto a quelli
riscontrati in esemplari della stessa specie campionati in altre aree marine (Aguilar
et al., 2002). Una mancanza quasi assoluta di informazioni riguarda invece gli effetti
tossicologici che questi contaminanti possono avere su questa e sulle altre specie
di tartarughe marine del Mediterraneo. Da ciò la necessità di sviluppare strumenti
diagnostici non distruttivi e minimamente invasivi per valutarne l’esposizione e
gli effetti. Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare ed applicare un
protocollo non-invasivo, basato sull’integrazione delle risposte di biomarkers e dei
livelli di alcuni contaminanti (organoclorurati (OC), idrocarburi policiclici aromatici
(IPA), ritardanti di fiamma (PBDE) ed elementi in tracce), al fine di indagare le
minacce legate alla contaminazione della Caretta caretta nel Mar Mediterraneo. Gli
obiettivi specifici erano:
a) sviluppare una metodologia di campionamento non-distruttiva di vari materiali
biologici,
b) valutare i livelli di contaminanti presenti nei diversi materiali biologici in
esemplari free-ranging e spiaggiati (sangue, fegato, adipe, carapace),
c) sviluppare ed applicare un set di biomarkers ecotossicologici per evidenziare
i diversi livelli di interazione tra i vari contaminanti e gli organismi (biomarkers di
esposizione, estrogenici, di stress ossidativo, di neurotossicità, di genotossicità e di
danno epatico),
d) l’elaborazione statistica dei risultati ottenuti.
Materiali e metodi - Il numero di esemplari presi in considerazione in questo
studio sono 9 (8 Caretta caretta ed 1 Chelonia mydas), campionati tutti presso il
centro di recupero del CRAMA (Centro Recupero Animali Marini Asinara)
presente in Sardegna nel Parco Nazionale dell’Asinara nell’anno 2011. Su questi
esemplari, classificati in tre classi d’età a seconda della lunghezza del carapace
(CCL) usando il modello di von Bertalanffy: classe I (da 0 a 9 anni), classe II (da
10 a 14 anni) e classe III (oltre 15 anni), i veterinari del CRAMA hanno provveduto
al campionamento di: sangue intero (un’aliquota è stata centrifugata per ottenere il
plasma), carapace, biopsia cutanea (tramite punch da biopsia da 0.4 o 0.6 mm) ed
excreta (dai campioni in cui è stato possibile). Tutti i campioni sono stati conservati
immediatamente in azoto liquido e trasportati presso il “Laboratorio Biomarkers
ed Analisi dei Residui” dell’Università di Siena per le successive indagini. Su questi
campioni sono stati valutati i livelli di idrocarburi policiclici aromatici e le risposte
di alcuni biomakers legati alla presenza di questo tipo di contaminanti (citocromo
1A (CYP1A), Comet assay, ENA assay e stress ossidativo). La valutazione dei livelli
di IPA è stata effettuata su sangue intero secondo la metodica di Marsili et al. (1997)
e la lettura è avvenuta tramite HPLC con detector a fluorescenza. L’induzione del
citocromo P450, valutata sulla biopsia cutanea, è stata analizzata tramite metodica
immunoenzimatica semiquantitativa del Western Blot (Fossi et al., 2008) che consente,
attraverso l’utilizzo di anticorpi specifici, la valutazione dell’espressione proteica di
specifiche isoforme del citocromo P450 (CYP1A). Attraverso i test del Comet assay
(Frenzilli et al., 1999) e dell’ENA assay (Pacheco e Santos, 1997) applicati sul sangue
intero è stato possibile valutare il danno al DNA presente in questi esemplari, da
ricondurre principalmente all’esposizione a contaminanti genotossici, quali i composti
aromatici come gli IPA, ma anche i composti azotati, gli inorganici radioattivi, i
metalli pesanti e le diossine. Tutti questi composti hanno la capacità di interagire
con il DNA delle cellule viventi causandone la perdita dell’integrità strutturale e
funzionale. Lo stress ossidativo è stato valutato nel plasma tramite la metodica
della perossidazione lipidica (LPO) (Bird e Draper, 1984). Questo tipo di danno può
essere causato da numerosi processi fisiologici (catena respiratoria mitocondriale) e
contaminanti genotossici, quali i composti aromatici come gli IPA, ma anche i
composti azotati, gli inorganici radioattivi, i metalli pesanti e le diossine. Tutti questi
composti hanno la capacità di interagire con il DNA delle cellule viventi causandone la
perdita
dell’integrità
strutturale
e funzionale. Lo stress ossidativo è stato valutato nel
Effetti
tossicologici
in esemplari
di C. caretta
253
plasma tramite la metodica della perossidazione lipidica (LPO) (Bird e Draper, 1984).
Questo tipo di danno può essere causato da numerosi processi fisiologici (catena
patologici, e dall’esposizione a sostanze di sintesi e naturali (IPA, metalli, diossine e
respiratoria che
mitocondriale)
e patologici,
e dall’esposizione
a ossidanti,
sostanze di
sintesi
e
radiazioni),
possono aumentare
la produzione
di sostanze
dette
specie
naturali
(IPA,
metalli,
diossine
e
radiazioni),
che
possono
aumentare
la
produzione
di
reattive dell’ossigeno (ROS, Reactive Oxygen Species).
sostanze ossidanti, dette specie reattive dell’ossigeno (ROS, Reactive Oxygen Species).
Risultati
primo
risultato
questo
studio
è stato
quello
di aver
confermato
Risultati
- Il- Il
primo
risultato
di di
questo
studio
è stato
quello
di aver
confermato
la
lavalidità
validità
della
metodologia
non
distruttiva
per
il
campionamento
di
materiale
della metodologia non distruttiva per il campionamento di materiale biologico
biologico
da tartarughe
marinedi aestinzione.
rischio diUno
estinzione.
Uno dei
principali
risultati
da tartarughe
marine a rischio
dei principali
risultati
ottenuti
dalle
ottenuti
dalle
analisi
riguarda
i
livelli
di
IPA
rilevati
in
tutti
gli
esemplari
campionati
analisi riguarda i livelli di IPA rilevati in tutti gli esemplari campionati nel centro
nel centro CRAMA. Il test statistico non parametrico di Kolmogorov-Smirnov
CRAMA. Il test statistico non parametrico di Kolmogorov-Smirnov ha infatti
ha infatti evidenziato che i livelli di IPA rilevati in queste tartarughe erano
evidenziato
che i livelli
di IPA
rilevatidiinquelli
questeritrovati
tartarughe
significativamente
significativamente
più elevati
(p<0,05)
neglierano
esemplari
di C. caretta
più elevati
(p<0,05) di quelli
ritrovati
negli esemplari
di quali
C. caretta
analizzati
analizzati
precedentemente
dal nostro
laboratorio,
alcuni dei
addirittura
giunti
dalBrancaleone
nostro laboratorio,
alcuni deidiquali
addirittura
al centro
alprecedentemente
centro CRTM di
ancora ricoperti
petrolio
(Casini,giunti
comunicazione
CRTM di Brancaleone
di petrolio
comunicazione
personale).
Per questo ancora
motivo,ricoperti
in accordo
con (Casini,
i veterinari
del centropersonale).
CRAMA,
èPer
stato
deciso
di effettuare
prelievi
di sanguedel
negli
esemplari
ospedalizzati
a più
questo
motivo,
in accordo
con i veterinari
centro
CRAMA,
è stato deciso
di
riprese:
a distanza
circa 2negli
mesiesemplari
dal recupero
la primaa volta
e, successivamente,
effettuare
prelievi didisangue
ospedalizzati
più riprese:
a distanza di
ogni
I risultatila preliminari,
solamente
degli 8 Iesemplari
circa settimana.
2 mesi dal recupero
prima volta e,riguardanti
successivamente,
ogni 2settimana.
risultati
dipreliminari,
C. carettariguardanti
indagati solamente
(Françoise2 degli
e Nicolà),
hanno
evidenziato
una diminuzione
8 esemplari di C. caretta indagati
(Françoise
media
del livello
di IPA del una
77%,diminuzione
il cui trendmedia
potràdel
anche
confermato
e Nicolà),
hanno evidenziato
livelloessere
di IPA
del 77%, ildalle
cui
analisi effettuate sui successivi prelievi (Fig. 1). I livelli di IPA, fino a circa 3 ppm,
trend potrà anche essere confermato dalle analisi effettuate sui successivi prelievi (Fig.
ritrovati negli esemplari campionati presso il centro CRAMA sono stati ricondotti
1). I livelli di IPA,
fino sversamento
a circa 3 ppm,
neglida
esemplari
campionati
pressonel
il
principalmente
ad uno
di ritrovati
idrocarburi
un impianto
industriale
centro
CRAMA
sono
stati
ricondotti
principalmente
ad
uno
sversamento
di
idrocarburi
Golfo di Porto Torres a Gennaio 2011.
da un impianto industriale nel Golfo di Porto Torres a Gennaio 2011.
IPA Totali
3000
ng/g p.s.
2500
78%
2000
76%
1500
1000
500
0
Francoise
(Maggio 2011)
Francoise (Luglio
2011)
Nicolà (Maggio
2011)
Nicolà (Luglio
2011)
Fig.
- Livelli
di IPA
nei duecampionati
esemplari campionati
distanza
di due mesi.
Fig. 1 - Livelli
di 1IPA
nei due
esemplari
a distanzaa di
due mesi.
Levels of PAHs in two specimens sampled after two months.
Levels of PAHs in two specimens sampled after two months.
Per quel che riguarda le indagini dei biomarkers, alti livelli di stress ossidativo sono
stati evidenziati nell’unico esemplare di C. mydas (Green). Una possibile spiegazione a
talePer
risultato
può
essere le
data
dalla lettura
della “storia
di vita”
di questo
esemplare:
quel che
riguarda
indagini
dei biomarkers,
alti livelli
di stress
ossidativo
sono
negli
ultimi
due
anni
è
stato
ospedalizzato,
liberato
e
nuovamente
ricoverato
al centro
stati evidenziati nell’unico esemplare di C. mydas (Green). Una possibile spiegazione
a tale risultato può essere data dalla lettura della “storia di vita” di questo esemplare:
negli ultimi due anni è stato ospedalizzato, liberato e nuovamente ricoverato al centro
CRAMA dopo che, grazie ad un tag satellitare collocato sulla tartaruga al momento
della liberazione, se ne era rilevato un successivo spiaggiamento. Tutti i valori di
stress ossidativo degli esemplari di C. caretta (animali campionati in altre zone ed in
tempi diversi) sono invece risultati nella media. I test di genotossicità hanno mostrato
valori superiori alla media per quanto riguarda il test dell’ENA assay ed in linea con
la media di tutti gli altri esemplari da noi campionati e valutati per quanto riguarda
43_Congr SIBM form testi v. 11_feb_2010
254
M. Giannetti
et al.
il Comet assay, non essendo inoltre presenti dati in letteratura su quali effettuare
confronti. L’espressione del CYP1A, valutata tramite la metodica del Western Blot,
è risultata differente tra i diversi esemplari; in particolare hanno mostrato un’alta
attività proteica di questo citocromo la tartaruga verde e tre esemplari di C. caretta
denominati Stefania, Nicolà e Corse. In assoluto i valori di espressione proteica
sono più alti di quelli riscontrati in altri esemplari analizzati precedentemente nel
nostro Laboratorio, considerando inoltre la non presenza di dati in letteratura. Dato
che l’isoforma 1A del citocromo P450 fornisce informazioni sulla contaminazione
dovuta a molecole planari tra cui gli IPA, è probabile che gli elevati livelli di questi
contaminanti presenti nel sangue delle tartarughe siano i responsabili dell’elevata
espressione del CYP1A.
Conclusioni - Le principali conclusioni che si possono trarre da questo studio
sono le seguenti: a) la validazione di metodologie di campionamento non-distruttive
sia su esemplari di C. caretta che per la prima volta su un solo esemplare di C.
mydas; b) l’applicazione e la valutazione di un set di biomarkers sulla C. caretta con
risultati molto interessanti; c) la stima dell’impatto che può avere uno oil-spill su
questi Rettili marini; d) la valutazione della diminuizione a livello ematico degli IPA
durante i due mesi di ospedalizzazione mostrato da 2 esemplari di C. caretta. Infine
riteniamo che i risultati di questo studio potranno contribuire in modo significativo
allo sviluppo di protocolli non invasivi per studiare le problematiche delle tartarughe
marine, legate soprattutto ad una contaminazione di origine antropica. Inoltre
permetteranno di arricchire le conoscenze sullo stato tossicologico di queste specie
nel bacino del Mediterraneo, considerando che non esistono, per quanto riguarda
almeno le nostre conoscenze, dati in letteratura con cui poter effettuare confronti
dei dati ottenuti.
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