Aspetti immunoematologici di un caso di anemia emolitica e aplasia

Aspetti immunoematologici di un caso di anemia emolitica
e aplasia eritroide dopo trapianto allogenico di midollo
osseo ABO ed RhD incompatibile
Massimo Franchini, Giorgio Gandini, Marzia De Gironcoli, Aurora Vassanelli,
Anna Turrini, Fabio Benini, Giuseppe Aprili
Servizio di Immunoematologia e Trasfusione - Azienda Ospedaliera di Verona
We report a case of a bone marrow transplantation
(BMT), HLA matched, with major and minor ABO and
minor RhD incompatibility (anti-RhD antibody in BMT
donor). Along with the engrafment, the BMT recipient
developed erythroid aplasia and an anti-RhD antibody
of donor origin, detected by direct and indirect
antiglobulin tests (DAT, IAT) and showed signs of mild
haemolytic anaemia. With the disappearance of the
recipient RBC, the DAT became negative and
haemolysis disappeared, while the anti-RhD alloantibody persisted in the patient's serum. This case underlines the importance of close immuno-haematological
monitoring in patients undergoing allogeneic BMT
with ABO-RhD incompatibility.
Parole chiave: trapianto allogenico di midollo osseo
(BMT), incompatibilità ABO-RhD, allo-anticorpo, anemia
emolitica.
Key words: bone marrow transplantation, ABO-RhD
incompatibility, alloantibody, haemolytic anaemia.
dirette contro antigeni ABO del donatore ed il midollo del donatore contiene, ed è capace di produrre,
isoemoagglutinine dirette contro antigeni ABO del ricevente). Il ricevente ed il donatore possono differire
anche per altri antigeni eritrocitari (Rh, Kell, Duffy,
Kidd, ecc.). Anche per questi antigeni si definisce una
incompatibilità maggiore o minore secondo i criteri
sopra esposti.
L'immunodepressione dell'ospite, indotta da
chemioterapia e radioterapia pretrapianto, rende
l'alloimmunizzazione verso questi ultimi antigeni
un'evenienza alquanto rara; in letteratura, vengono
descritti soprattutto casi di alloimmunizzazione verso antigeni del sistema Rh. In questo lavoro, riportiamo un caso di anemia emolitica e aplasia eritroide in
un paziente di gruppo B Rh positivo trapiantato con
midollo osseo di donatore HLA-identico di gruppo A
Rh negativo con anticorpi anti-D.
Introduzione
Materiali e metodi
Nell'ambito del trapianto di midollo osseo
allogenico (BMT) vi possono essere tre tipi differenti
di incompatibilità ABO: incompatibilità maggiore (nel
ricevente sono presenti isoemoagglutinine dirette contro antigeni ABO del donatore), incompatibilità minore (il midollo del donatore contiene, ed è capace di
produrre, isoemoagglutinine dirette contro antigeni
ABO del ricevente), incompatibilità maggiore + minore (nel ricevente sono presenti isoemoagglutinine
I test qui riportati [gruppo ABO, fenotipo Rh, TAD
(test di Coombs diretto), TAI (test di Coombs indiretto)] sono stati eseguiti utilizzando la metodica della
agglutinazione su microcolonna contenente biglie di
vetro ("Biovue", Ortho-Clinical Diagnostics, Milano).
La titolazione, per raddoppio, delle isoemoagglutinine
è stata eseguita in fase liquida secondo metodica classica. La titolazione dell'alloanticorpo a specificità antiD è stata eseguita con entrambe le metodiche (fase
liquida e agglutinazione su microcolonna).
Ricevuto: 22 febbraio 1998 – Accettato: 30 marzo 1998
Corrispondenza: Dott. Massimo Franchini
Servizio di Immunoematologia e Trasfusione
Ospedale Policlinico
37134 VERONA
Donatrice di midollo osseo
PL, donna di anni 40, gruppo sanguigno A, ccdee,
Kell neg., titolo anti-B: IgM 512, IgG 64. Lo screening
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LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 44 - num. 1 gennaio-febbraio 1999 (28-32)
Anemia emolitica in TMO ABO ed Rh incompatibile
per gli anticorpi irregolari consentiva di evidenziare
un alloanticorpo a specificità anti-D, con titolo 2. La
donna, nullipara, era stata trasfusa alcuni anni prima,
in altra sede, a causa di una grave anemizzazione in
seguito ad una metrorragia.
senza di precursori eritroidi). Durante il periodo
post-trapianto, veniva controllato settimanalmente il gruppo ABO (determinazione diretta ed indiretta), il fenotipo Rh, il TAD, il TAI ed il titolo
delle isoemoagglutinine.
Ricevente di midollo osseo
PR, uomo di 50 anni, affetto da leucemia acuta
mieloblastica (classificazione FAB M5) in 1a remissione completa dopo chemioterapia. Il paziente, disponendo di un donatore familiare HLA identico (la
sorella PL), veniva avviato al trapianto allogenico di
midollo osseo.
a) Valutazione pre-trapianto: gruppo sanguigno B,
CcDee, titolo anti-A: IgM 256, IgG 128. TAI: negativo; TAD: negativo.
b) Trapianto di midollo osseo: dall'8.7.1996 al
14.7.1996 il paziente era sottoposto a terapia di
condizionamento (irradiazione corporea totale
iperfrazionata e chemioterapia con ciclofosfamide
ev ad alte dosi). Il giorno 16.7.1996 veniva eseguito il trapianto di midollo osseo dalla sorella:
venivano prelevati dalla cresta iliaca 1.380 mL di
sangue midollare. Data l'incompatibilità ABO maggiore e minore il midollo era sottoposto a
deplasmizzazione mediante centrifugazione a 4.000
rpm per 10 minuti, risospensione isovolumetrica
in soluzione salina 0,9% e, successivamente, a rimozione dei globuli rossi in vitro mediante
sedimentazione con amido-idrossietilico (HES) al
12,5%. Si otteneva una sospensione di 636 mL di
cellule midollari contaminate da una piccola quantità di emazie residue (pari a 15 mL di sangue intero con ematocrito del 40%). Il midollo veniva infuso nel ricevente attraverso un catetere venoso
centrale, con velocità di infusione di 160 mL/ora
(tempo di infusione: 4 ore).
c) Post-trapianto: durante il periodo di aplasia il paziente è stato sottoposto a terapia trasfusionale di
supporto: sono state trasfuse 9 unità di eritrociti
concentrati (gruppo O, ccdee, Kell neg), 12 aferesi
piastriniche (gruppo AB) e 24 concentrati
piastrinici random di gruppo O, deplasmizzati e
risospesi in fisiologica. Tutti gli emocomponenti
erano irradiati (2.400 rads) e filtrati (filtri RCXL
1 PALL per le emazie e filtri PL 100 PALL per le
piastrine). L' attecchimento del midollo si verificava in 24a giornata (9.8.96) dal trapianto, come
documentato dall'emocromo (neutrofili > 500/µL
e piastrine > 20.000/µL) e dalla mielocentesi (presenza di precursori mieloidi e megacariocitari, as-
Il giorno 9.8.1996 (giorno +24 dal trapianto), in
concomitanza con l'attecchimento midollare, si assisteva a debole positivizzazione del TAD utilizzando
sieri polivalenti e monospecifici (polispecifico +; IgG +; C3d -), mentre il TAI si manteneva negativo. Il
test di eluizione non risultava conclusivo. Il controllo
del gruppo ABO mostrava, alla determinazione diretta, una doppia popolazione eritrocitaria: eritrociti di
gruppo O di origine trasfusionale ed eritrociti di gruppo
B del ricevente. La determinazione indiretta del gruppo ABO mostrava agglutinazione unicamente con le
emazie A1. Anche nell'ambito del fenotipo Rh, si
evidenziava la presenza di una doppia popolazione
eritrocitaria: una con l'antigene D e C e l'altra senza.
Tale quadro corrispondeva, in fase liquida, alla presenza di un aspetto microscopico mixed field. Il titolo
anti-A1 (IgG ed IgM) era 16. Dal giorno +18 (3.8.96)
erano comparsi segni clinici e laboratoristici sfumati
di emolisi (subittero, aumento di bilirubina prevalentemente indiretta e di LDH, calo dell'aptoglobina ed
aumento del fabbisogno trasfusionale).
Il giorno 20.8.1996 (giorno +35 dal trapianto) si
positivizzava il TAI: nel siero era identificato un
alloanticorpo a specificità anti-D, titolo 4. Il TAD rimaneva positivo (polispecifico +; Ig-G +; C3d -). Il
test di eluizione confermava la presenza di un anticorpo
a specificità anti-D. Il controllo di gruppo ABO (determinazione diretta ed indiretta) ed il fenotipo Rh risultavano sovrapponibili ai precedenti. Il titolo antiA1 (IgG e IgM) appariva in calo: 4. Vi era una riduzione dei segni di emolisi e del fabbisogno
trasfusionale. Lo stesso giorno il paziente veniva dimesso, per proseguire gli accertamenti e le cure in
regime di Day Hospital. Non erano presenti segni clinici di Graft versus Host Disease acuta (aGvHD) al
momento della dimissione.
Il giorno 11.9.1996 (giorno +57 dal trapianto) erano ripetuti i seguenti accertamenti: mielocentesi (midollo ricco e maturante in tutte e 3 le linee
emopoietiche); gruppo ABO (alla determinazione diretta presenza di una doppia popolazione eritrocitaria: una di gruppo O, di origine trasfusionale, ed una
di gruppo A, donatore-correlata; alla determinazione
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M Franchini et al.
Tabella I: riassunto dei dati
Giorno
post-BMT
ABO
Rh
Titolo Anti-A1
TAD
TAI
Titolo Anti-D
Bilirubina totale
Reticolociti
LDH
Aptoglobina
concentrati
eritr. trasfusi
+ 24
+35
+57
mf
(RBC O + B)
mf
(antigeni C,D)
16
pos.
neg.

3,4 mg/dL
0,1%
(4 x 10 /L)
450 U/L
indosabile
5 unità dal giorno
+4 al giorno +24
mf
(RBC O + B)
mf
(antigeni C,D)
4
pos.
pos. (anti-D)
4
2,2 mg/dL
0,3%
(10,3 x 10 /L)
330 U/L
indosabile
3 unità dal giorno
+25 al giorno +35
weak mf
(RBC O + A)
ccdee
2
neg.
pos. (anti-D)
8
1,3 mg/dL
0,9%
(26 x 10 /L)
235 U/L
1,3 g/L
4 unità dal giorno
+36 al giorno +57
+90
+ 180
weak mf
(RBC O + A)
ccdee
A
2
neg.
pos. (anti-D)
4
1,2 mg/dL
5,6%
(162 x 10 /L)
230 U/L
0,7 g/L
2 unità
(giorno +72)
ccdee
assente
neg.
pos. (anti-D)
8
0,4 mg/dL
1,4%
(78 x 10 /L)
180 U/L
1,5 g/L

mf = agglutinazione mixed field; LDH (lattico deidrogenasi) = v.n. 80-200 U/L; aptoglobina = v.n. 0,6-2 g/L
indiretta presenza di agglutinazione unicamente con
emazie A1, titolo 2) e fenotipo Rh (ccdee); TAI (positivo: si conferma la presenza di alloanticorpo a specificità anti-D, titolo: 8); TAD (negativo: polispecifico,
IgG e C3d). Lo stesso giorno, veniva valutata, a livello midollare e del sangue periferico, la presenza di
chimerismo tra donatore e ricevente mediante l'analisi delle VNTR (Variable Number Tandem Repeat) con
metodica PCR (Polymerase Chain Reaction). È emersa la presenza di chimerismo completo del donatore. I
segni di emolisi persistevano sfumati, per scomparire
ad un successivo controllo, eseguito 10 giorni più tardi (20.9.96, giorno +66 dal trapianto). Non erano presenti segni clinici di GvHD acuta.
Il giorno 17.10.96 (giorno + 93 dal trapianto) il
paziente era rivalutato: il gruppo ABO (determinazione diretta ed indiretta), il fenotipo Rh, il titolo antiA1 ed il TAI risultavano sovrapponibili al precedente
controllo (11.9.96). Il TAD rimaneva negativo; il titolo anti-D era 4 in fase liquida e 2 in microcolonna.
Non vi erano segni clinici e/o laboratoristici di emolisi;
il paziente era trasfusione-indipendente dal 26.9.96.
Dal giorno 13.01.97 (giorno +180 dal trapianto) nel
paziente non erano più evidenziabili emazie O di origine trasfusionale: il gruppo ABO ed il fenotipo Rh
risultava, pertanto, A ccdee.
Un follow-up a 15 mesi dal BMT (ottobre 1997)
evidenziava la scomparsa dell'anticorpo anti-A1 e confermava la presenza dell'anticorpo anti-D (titolo 8).
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Il monitoraggio del post-trapianto è riassunto nella tabella I.
Discussione
I pazienti che vengono sottoposti a BMT con incompatibilità ABO maggiore e minore sono a rischio
di sviluppare severe reazioni emolitiche acute e ritardate dovute alle isoemoagglutinine del donatore o del
ricevente. Per prevenire queste complicanze, il midollo osseo prelevato da un donatore per un trapianto
allogenico ABO-incompatibile deve essere manipolato prima di poter essere infuso nel ricevente1. L'incompatibilità maggiore ABO richiede la rimozione degli eritrociti dal midollo del donatore mediante
separatori automatici o agenti sedimentanti, come
l'amido idrossietilico (HES). Altre metodiche comprendono il plasma-exchange nel ricevente al fine di rimuovere le isoemoagglutinine2. L'incompatibilità minore ABO, invece, necessita della rimozione del plasma dal midollo osseo del donatore prima dell'infusione.
Anche nell'ambito del sistema Rh, si può parlare
di incompatibilità maggiore D (anticorpi anti-D nel
ricevente) o minore D (anticorpi anti-D nel donatore)3. Ambedue queste incompatibiltà vengono trattate
allo stesso modo, allo scopo di eliminare o ridurre il
grado di emolisi post-trapianto.
Un paziente RhD-positivo che riceva il midollo
osseo di un donatore Rh-negativo può sviluppare un
Anemia emolitica in TMO ABO ed Rh incompatibile
alloanticorpo anti-D nel post-trapianto, perché i suoi
globuli rossi residui (Rh positivi) possono essere sufficienti per stimolare la produzione dell'anticorpo da
parte dei linfociti trapiantati4. Comunque, una tale evenienza va considerata fortemente improbabile, dal
momento che la produzione anticorpale donatorecorrelata inizia in genere non prima di 6 mesi dopo
l'attecchimento del midollo osseo5, e, dopo tale periodo, se persiste il chimerismo completo del donatore,
non vi sono più emazie Rh-positive del ricevente in
circolo.
Un'altra possibilità è l'alloimmunizzazione, in pazienti trapiantati da donatore RhD negativo, nei confronti di trasfusioni piastriniche ottenute da donatori
RhD positivi.
Tale evenienza sembra tutt'altro che rara: l'incidenza di anticorpi anti-D in pazienti con neoplasie
maligne6 e in pazienti onco-ematologici sottoposti ad
autotrapianto di midollo osseo e trasfusi con piastrine
sembra essere attorno al 20%7. Alcuni Autori6 propongono addirittura la somministrazione di immunoglobuline anti-D ev durante le trasfusioni piastriniche,
allo scopo di prevenire l'alloimunizzazione verso l'antigene D. Nel nostro caso, comunque, le piastrine erano da considerarsi prive di inquinamento eritrocitario.
L'alloimunizzazione verso antigeni dei globuli rossi
diversi dal sistema ABO-RhD in pazienti sottoposti
a trapianto autologo o allogenico di midollo osseo
sembra essere poco frequente (circa il 2% )8,9.
Nel presente lavoro, è descritto un episodio di anemia emolitica e aplasia eritroide dopo un trapianto
allogenico di midollo osseo con incompatibilità ABO
maggiore e minore (donatrice A; ricevente B) ed incompatibilità Rh minore (donatrice ccdee con anti-D;
ricevente CcDee). A causa di tali incompatibilità, il
midollo osseo del donatore è stato sottoposto a
deplasmizzazione e rimozione dei globuli rossi prima
dell'infusione nel ricevente. Nei giorni immediatamente
successivi al trapianto, non sono comparsi segni clinici e/o laboratoristici di emolisi. Dal giorno +24 si è
avuta positivizzazione del TAD e sono comparsi segni clinico-laboratoristici sfumati di emolisi. Il test di
eluizione non era conclusivo. La positivizzazione del
TAD poteva essere riconducibile o alla presenza
dell'alloanticorpo anti-D o all'anticorpo anti-B, entrambi donatore-correlati. È improbabile che tali anticorpi
siano stati trasferiti passivamente dal donatore al ricevente, dal momento che il midollo osseo è stato
deplasmizzato prima di essere infuso e l'emolisi è comparsa tardivamente. Sono segnalati, in letteratura,
numerosi casi di anemia emolitica immune dopo BMT
ABO incompatibile. Tale anemia, correlata alle
isoagglutinine del donatore, si verifica generalmente
dopo 7-10 giorni dal trapianto e raggiunge il massimo
in 15a-20a giornata10, suggerendo che il meccanismo
più probabile di emolisi sia la produzione di anticorpi
da parte dei linfociti passenger del donatore piuttosto
che il trasferimento passivo di anticorpi durante l'infusione del midollo. Questo meccanismo patogenetico
potrebbe spiegare la comparsa tardiva di emolisi nel
nostro paziente.
In 24a giornata, l'attecchimento midollare era documentato dall'esame emocromocitometrico e dalla
mielocentesi. Il midollo osseo, pur essendo ricco della
componente mieloide e megacariocitaria, era privo dei
precursori eritroidi. Questa aplasia eritroide pura non
è di raro riscontro nei trapianti allogenici di midollo
osseo con incompatibilità ABO maggiore ed è causata dall'inibizione della crescita eritroide esercitata dalle
isoemoagglutinine del ricevente1. Nel nostro caso, è
ipotizzabile una inibizione sui precursori eritroidi (portatori degli antigeni ABH) del donatore (gruppo A)
da parte delle isoemoagglutinine anti-A (del ricevente), ancora titolabili nel siero del paziente trapiantato.
Va ricordato che, in un trapianto di midollo osseo con
incompatibilità ABO maggiore, generalmente le
isoagglutinine anti-A persistono più a lungo rispetto
a quelle anti-B: di conseguenza, a causa dell'effetto
antiproliferativo di questi anticorpi sui precursori
eritroidi, gli eritrociti di gruppo A richiedono più tempo
per essere evidenziabili nel sangue periferico rispetto
a quelli di gruppo B12.
Dal giorno +35 si positivizzava il test di Coombs
indiretto e veniva isolato nel ricevente (nel siero e mediante eluizione dalle emazie) un anticorpo anti-D a
basso titolo, mentre il titolo anti-A1 appariva in calo.
Il TAD persisteva debolmente positivo, mentre i segni
di emolisi si andavano progressivamente attenuando.
Il gruppo ABO e il fenotipo Rh mostravano la presenza di due popolazioni eritrocitarie: una di origine
trasfusionale e un'altra ricevente-correlata. In 57a giornata dal BMT, veniva documentata la comparsa dell'
antigene A donatore-correlato. Si confermava l'assenza
dell'antigene B del ricevente. Questo riscontro era in
sintonia con la presenza a livello midollare e del sangue periferico di chimerismo completo del donatore.
Il titolo anti-A1 era ulteriormente ridotto.
La mielocentesi, eseguita in questa data, mostrava
una ricca serie eritroide: con la riduzione del titolo
anti-A1, cessava verosimilmente l'effetto inibitore sul
midollo eritroide che poteva, pertanto, produrre emazie. Era riconfermata, inoltre, la presenza dell'
31
M Franchini et al.
anticorpo anti-D, con titolo 8. L'ipotesi più verosimile è che tale anticorpo, comparso precocemente nel
post-trapianto (giorno +24), sia stato prodotto da cellule B memory trasferite dal donatore. Un meccanismo analogo si verificherebbe nel trasferimento dell'immunità (dal donatore al ricevente) verso i principali vaccini. È alquanto improbabile che tale anticorpo
(di classe IgG) sia stato prodotto con un meccanismo
immune di tipo primario dal momento che, nel primo
anno post-trapianto, i linfociti B derivati dalle cellule
staminali inoculate nel ricevente sono incapaci di dare
origine ad una risposta immunitaria contro neoantigeni. A ciò si deve aggiungere il fatto che i linfociti B,
per montare una risposta immune primaria, necessitano della cooperazione dei linfociti T, la cui funzione resta depressa per almeno 6 mesi nel post-trapianto13.
In letteratura, esistono poche segnalazioni analoghe al caso descritto. Le implicazioni cliniche sottolineano l'importanza di uno stretto monitoraggio
immunoematologico a partire dall'immediato post-trapianto in pazienti sottoposti a trapianto allogenico di
midollo osseo con incompatibilità ABO-Rh.
Riassunto
Viene descritto un caso di trapianto allogenico di
midollo osseo, HLA identico, con incompatibilità
ABO maggiore e minore (ricevente di gruppo B e
donatrice di gruppo A) ed incompatibilità RhD minore (ricevente RhD positivo e donatrice RhD negativa con alloanticorpo anti-D). Nel post-trapianto,
in corrispondenza dell'attecchimento midollare, il
paziente ha sviluppato una aplasia eritroide, verosimilmente legata all'inibizione dell' anti-A1 (ricevente-correlato) sul midollo eritroide di gruppo A (donatore-correlato), ed un anticorpo anti-D (donatore-correlato). Tale anticorpo si è accompagnato a
moderata anemia emolitica, verosimilmente causata
dal legame dell'anti-D alle residue emazie D positive ricevente-correlate (TAD positivo; eluato:
anticorpo anti-D).
32
Con la riduzione del titolo anti-A1 e la scomparsa delle emazie D, positive si è risolta sia l'aplasia
eritroide che l'anemia emolitica.
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