Kit Per L`identificazione Di Gruppo Degli Streptococchi

Devono essere portati a temperatura ambiente prima dell’uso. E’ essenziale
che i reagenti al lattice siano agitati energicamente prima dell’ uso in modo da
ottenere una sospensione omogenea delle particelle.
Al momento dell’uso il reagente enzimatico deve essere ricostituito con acqua
distillata, come indicato in etichetta. Il controllo positivo contiene estratti di
tutti i sei gruppi di antigeni.
Key Code TSMX3981F
www.oxoid.com/ifu
Europe + 800 135 79 135 CA 1 855 805 8539
US 1 855 236 0910
ROW +31 20 794 7071
Kit Per L’identificazione
Di Gruppo Degli
IT
Streptococchi
5.
SALUTE E SICUREZZA
Conservanti
5.1. Ogni reagente al lattice e reagente di controllo positivo contiene 0,1% di
sodio azide che è classificato come nocivo in caso di ingestione.
5.2. L’enzima di estrazione contiene l’1,7% di thiomersal e acromopeptidasi
al 7,32% che è classificato come tossico e un sensibilizzatore. Di seguito
sono riportate le indicazioni appropriate di pericolo (H) e precauzione (P):
PERICOLO
H332
Nocivo se inalato.
H311
Tossico per contatto con la pelle.
H301
Tossico se ingerito.
H373
Può provocare danni agli organi in
caso di esposizione prolungata o.
H334
Può provocare sintomi allergici o
asmatici o difficoltà respiratorie se
inalato.
H317
Può provocare una reazione allergica
cutanea.
H412
Nocivo per gli organismi acquatici con
effetti di lunga durata.
P301+P310
IN CASO DI INGESTIONE: contattare
immediatamente un CENTRO ANTIVELENI o un medico
P280
Indossare guanti/indumenti protettivi/Proteggere gli occhi/il viso.
P302+P352
IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE:
lavare abbondantemente con acqua
e sapone.
P333+P313
In caso di irritazione o eruzione della
pelle: consultare un medico.
P285
In caso di ventilazione insufficiente
utilizzare un apparecchio respiratorio.
P260
Non respirare la polvere/i fumi/i gas/
la nebbia/i vapori/gli aerosol.
P312
In caso di malessere, contattare un
CENTRO ANTIVELENI o un medico.
P304+P340
IN CASO DI INALAZIONE: trasportare
l’infortunato all’aria aperta e
mantenerlo a riposo in posizione che
favorisca la respirazione.
DR0585A............................................50
1.
FINALITÀ D’USO
Test di agglutinazione al lattice per l’identificazione degli streptococchi di
gruppo A, B, C, D, F, G
Lancefield1 ha dimostrato che la maggioranza degli streptococchi patogeni
possiede carboidrati con caratteristiche antigeniche specifiche che permettono
la loro classificazione in gruppi. I differenti antigeni di gruppo possono essere
estratti dalle cellule e la loro presenza dimostrata mediante particelle di lattice
preventivamente sensibilizzate con anticorpi gruppo-specifici.
Le particelle di lattice agglutinano in presenza dell’antigene omologo e
rimangono invece in sospensione omogenea in assenza di detto antigene. Il
kit Oxoid per la identificazione di gruppo degli streptococchi permette quindi,
mediante una semplice reazione di agglutinazione al lattice, di classificare gli
streptococchi nei gruppi, A, B, C, D, F, G.
L’adozione di un nuovo procedimento di estrazione enzimatica accorcia
considerevolmente il tempo richiesto per l’estrazione dell’antigene e ne
incrementa la resa, in particolar modo per gli streptococchi di gruppo D.
2.
KIT COMPONENTS
DR0586G................................ Reagente al lattice gruppo A
DR0587G................................ Reagente al lattice gruppo B
DR0588G................................ Reagente al lattice gruppo C
DR0589G................................ Reagente al lattice gruppo D
DR0590G................................ Reagente al lattice gruppo F
DR0591G................................ Reagente al lattice gruppo G
DR0592G................................ Controllo positivo polivalente
DR0593G................................ Enzima per l’estrazione dell’antigene
DR0500G................................ Cartoncini di reazione monouso
3.
DESCRIZIONE, PREPARAZIONE PER L’USO E RACCOMANDATI
CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE
Vedi anche le avvertenze e le precauzioni
Conservare a 2-8°C al riparo dalla luce. Usare entro la data di scadenza indicata
sull'etichetta. Tutti i componenti devono essere conservati a temperatura
ambiente (15-28°C) prima dell'uso; mescolare accuratamente per inversione.
I componenti del kit sono intercambiabili con i componenti di lotti aventi lo
stesso codice. I componenti possono essere acquistati anche singolarmente.
4.
PRECAUZIONI
Tutti i reagenti sono indicati esclusivamente per uso diagnostico “in vitro”.
I reagenti al lattice non devono essere congelati.
Preparazione dei reagenti
I reagenti al lattice sono pronti per l’uso.
6.
CONSERVAZIONE
A. Reagenti al lattice
Tutti i flaconi di lattice devono essere conservati in posizione
verticale a 2-8°C. In queste condizioni mantengono la loro
validità sino alla data riportata in etichetta.
B. Enzima per l’estrazione
L’enzima di estrazione, allo stato liofilo, deve essere conservato
a 2-25°C. In queste condizioni conserva la sua attività sino
alla data riportata in etichetta. Dopo ricostituzione con acqua
distillata, conservare la soluzione a 2-8°C. In queste condizioni
rimane stabile per 4 mesi.
CONTROL + C. Controllo positivo
Conservare il controllo positivo polivalente a 2-8°C. In queste
condizioni mantiene la sua validatà sino alla data indicata in
etichetta.
7.
PREPARATION OF CULTURES
Samples for identification should be grown on a blood agar plate overnight
at 37°C. Note the haemolytic reaction of suspect colonies. It is also advisable
to carry out a Gram stain and catalase test to confirm the presence of Grampositive, catalase-negative cocci. For further details, please consult standard
texts.2
For each culture to be grouped:
7.1. Reconstitute a bottle of Oxoid Streptococcus Extraction Enzyme (DR593)
with sterile distilled water to the amount shown on the label. Label test
tubes appropriately and dispense 0.4 ml of enzyme into each test tube.
7.2. Select 2-5 test colonies equivalent to 2-3 mm of growth with a
bacteriological loop and emulsify in the enzyme preparation. If the
culture is mixed, avoid obvious contamination.
8.
PREPARAZIONE DELLE COLTURE
I campioni da sottoporre ad identificazione devono essere coltivati a 37°C per
una notte su un terreno agarizzato al sangue.
Prendere nota della reazione emolitica delle colonie sospette. E’ consigliabile
inoltre eseguire una colorazione di Gram ed il test della catalasi per confermare
la presenza di cocchi Gram-positivi, catalasi-negativi.
Per ulteriori dettagli consultare sull’argomento i testi classici.2
Per ogni coltura da sottoporre ad identificazione di gruppo:
8.1. Ricostituire un flacone di enzima di estrazione Streptococcus Extraction
Enzyme Oxoid (DR593), aggiungendo la quantità di acqua distillata sterile
riportata sulla etichetta. Contraddistinguere opportunamente le provette
e distribuire in ciascuna di esse 0.4ml di enzima.
8.2. Prelevare 2-5 colonie di 2-3mm di diametro con un’ansa da batteriologia
e stemperarle nella soluzione enzimatica. In caso di coltura non pura
evitare di prelevare le colonie inquinanti.
8.3. Incubare per 10 minuti a 37°C in bagnomaria. E’ importante che, dopo i
primi 5 minuti di incubazione, le provette vengano agitate vigorosamente
per 2-3 secondi; continuare quindi l’incubazione per il tempo previsto a
37oC. Quindi rimuovere le provette e lasciarle raffreddare a temperatura
ambiente.L’estratto è ora pronto per l’uso.
9.
ESECUZIONE DEL TEST
9.1. Portare i reagenti al lattice a temperatura ambiente, eventualmente
riscaldando i flaconi con le mani. Agitare vigorosamente le sospensioni
al lattice per assicurare l’omogeneità delle sospensioni. Eliminare il
lattice eventualmente trattenuto nel contagocce al fine di ottenere una
miscelazione ottimale.
9.2. Distribuire una goccia di ognuno dei reagenti al lattice all’interno delle
aree circolari predisposte sul cartoncino di reazione (DR 500).
9.3. Con una pipetta Pasteur aggiungere una goccia di estratto ad ognuna
delle sei aree evidenziate sul cartoncino di reazione.
9.4. Servendosi dei bastoncini per la miscelazione, distribuire la miscela
reattiva in tutta l’area di reazione. Utilizzare un bastoncino nuovo per
ogni area di reazione.
9.5. Ruotare delicatamente il cartoncino. L’eventuale agglutinazione, in una
o più aree di reazione, deve avvenire entro 30 secondi. Non ruotare il
cartoncino per più di 1 minuto. Non utilizzare lenti di ingrandimento per
la lettura.
9.6. Usare il controllo positivo secondo le istruzioni sopra riportate per
assicurarsi dell’efficacia dei reagenti al lattice in uso.
9.7. Eliminare i cartoncini utilizzati in una soluzione disinfettante.
9.8. Qualora si debba eseguire un limitato numero di test, i cartoncini possono
essere tagliati con le forbici. Conservare le porzioni non utilizzate per
ulteriori determinazioni.
10. CONTROLLO DI QUALITÀ
Le prove di controllo qualità dovrebbero essere eseguite su ogni spedizione e
ogni nuovo numero di lotto dei kit ricevuti. Ogni laboratorio è tenuto a seguire
le disposizioni locali e statali vigenti nel proprio Paese.
Possono essere adottate le seguenti procedure per controllare le performance
dei reagenti al lattice:
a)Test per la reattività delle sospensioni di lattice (procedura di controllo
positivo) Per un singolo test: Dispensare una goccia (40µl) di antigene di
controllo positivo sulla carta di test e miscelare con la sospensione di lattice.
Miscelare il contenuto del cerchio con una bacchetta di miscelazione nuova.
Dopo una leggera oscillazione della carta per un minuto, dovrebbe apparire
una distinta agglutinazione in tutti i reagenti al lattice di test.
b)Test per la specificità dell’agglutinazione (procedura di controllo negativo)
In caso di debolissima agglutinazione, è opportuno ripetere i test positivi
in parallelo con una goccia di un estratto preparato (come descritto
nella procedura di test su terreni di coltura solidi) con una bacchetta di
miscelazione senza inoculo o con un’ansa da inoculo. La sospensione di
lattice non dovrebbe mostrare una significativa agglutinazione e il risultato
può servire da controllo per la comparazione diretta del test eseguito con
estratto batterico.
c)Attuare la procedura completa di test sulle colture di riferimento dei gruppi
noti.
Reazione negativa sul cartoncino
ß-emolitico
α o non emolitico
Ripetere l’estrazione
su un numero
maggiore di colonie
Saggiare con bile-esculina ed in brodo
contenente il 6.5% di NaCl
Ripetere il test
+/+
+/-
Gruppo D
Gruppo D
enterococcob
non-enterococco
Se negativo
“Non gruppo
A, B, C, D, F o G”
-/Streptococchi
viridanti
Reazione positiva sul cartoncino
ß-emolitico
Non ß-emolitico
Reagisce unicamente
Reagisce con il
Positivo con più di un
con il reagente A, B,
reagente D
reagente
C,
F
o
G
Riportare il
gruppo
Test in brodo
contenente il
6.5% di NaCl
Eseguire una sottocoltura quindi
risaggiare
Crescita (+)
Gruppo D
enterococco
Crescita (–)
Gruppo D non
enterococco
Se il problema
non si risolve
eseguire prove
biochimiche di
identificazionee
Reagisce con il
reagente B
Reagisce con il
reagente D
Reagisce con il reagente A, C, F o G
Gruppo B non
emolitico
Saggiare con
bileesculina ed in
brodo contenente
il 6.5% di NaCl
Eseguire prove
biochimiche di
identificazione
+/+
Gruppo D
enterococcob
+/Gruppo D
non enterococco
-/Streptococchi
viridanti
11. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Reazione positiva: presenza di agglutinazione evidente con uno dei sei reagenti
o quando uno di questi mostra una reazione più forte rispetto agli altri.
Reazione negativa: assenza di agglutinazione.Ignorare nella lettura le deboli
granulazioniche possono, a volte, essere presenti.
12. LIMITAZIONI DEL TEST
Utilizzando una inadeguata quantità di coltura il test può dare risultati
falsamente negativi.
Quasi tutti gli streptococchi beta-emolitici isolati nel corso di infezioni
umane possiedono carboidrati con caratteristiche antigeniche specifiche che
permettono il loro riconoscimento mediante reazionisierologiche. I tentativi
per estendere queste procedure agli streptococchi non beta-emolitici sono stati
infruttuosi, fatta eccezione per gli streptococchi di gruppo B,D ed N.
Gli streptococchi di gruppo N non sono stati mai riconosciuti quali responsabili
di infezioni umane.5
E’ da notare che il reagente al lattice di gruppo D può non reagire con alcuni
ceppi di S. bovis: per l’dentificazione di tali ceppi possono rendersi necessari
ulteriori test.
Il seguente schema riassume la procedura raccomandata per I’dentificazione
degli streptococchi mediante l’impiego del test di agglutinazione al lattice Oxoid.
Se negativo
“Non gruppo
A, B, C, D, F o G”
Nell’identificazione sierologica degli streptococchi è necessario, inizialmente, eseguire le seguenti osservazioni: (i) presenza di emolisi;a,c (ii)
morfologia cellulare;b,c (iii) valutazione della crescita delle colonie per quanto concerne la purezza e la quantità.d
(a) Escludere Strep. pneumoniae. Questo streptococco è α-emolitico, solubile ai sali biliari e sensibile all’optochina. Gli altri streptococchi non sono
solubili ai sali biliari e sono resistenti all’optochina.5
(b) Gli aerococchi non sono ß-emolitici, crescono in brodo contenente il
6.5% di NaCl e danno reazione variabile con il test bile-esculina. Possono
essere differenziati dagli enterococchi poichè si dispongono in tetradi
o in cellule isolate, mentre gli enterococchi assumono configurazione a
diplococco o a corta catena.5
(c) Gli stafilococchi e Listeria monocytogenes sono ß-emolitici: si distinguono dagli streptococchi per la morfologia delle colonie e per la reazione
alla catalasi.6,7
(d) Eseguire una sottocoltura se il microrganismo sospetto evidenzia una
sovracrescita o si è sviluppato in modo insufficiente.
(e) Sono stati rilevati ceppi che possiedono entrambi gli antigeni D e G.4
Caratteristiche del metodo
Di recente è stata migliorata la formulazione del reagente dell’enzima di
estrazione. Le prestazioni di Oxoid Streptococcal Grouping Kit con il nuovo
enzima sono state valutate presso un centro clinico nell’ Australia del Sud.
La tabella sotto riportata riassume i risultati ottenuti.
Sensibilità e specificità dei Streptococcal Grouping Kit
Sensitivity and specificity of Streptococcal Grouping Kits
* All strains were tested with each of the six grouping reagents
1
A number of Lancefield Group D organisms yielded a D/G reaction.
These results have been included in the calculations as true positive Group Ds
and false positive Group Gs. It is acknowledged in literature that Group D strains
exist which also yield G antigens upon enzymatic extraction.
13. REFERENCES
1. Lancefield R.C. (1938) Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 38, 473.
2. Facklam R.R. (1980) in ‘Manual of Clinical Microbiology’, 3rd Edition. American
Society for Microbiology, Washington, D.C., pp. 88-110.
3. McIllmurray M.B. (1984) Lancet, I, 1353.
4. Birch B.R., Keaney M.G.L. and Ganguli L.A. (1984) Lancet, I, 856-857.
5. Facklam R.R. and Carey R.B. (1985) in ‘Manual of Clinical Microbiology’, 4th
Edition. Eds. Lennette E.H., Balows A., Hausler W.J., Shadomy H.J., Amer. Soc.
for Microbiol., Washington, D.C., pp. 154-175.
6. Kloos W.E. and Jorgensen J.H. (1985) in ‘Manual of Clinical Microbiology’,
4th Edition, pp. 143-153.
7. Bortolussi R., Schlech W.F. and Albritton W.L. (1985) in ‘Manual of Clinical
Microbiology’, 4th Edition, pp. 205-208.
14. SIMBOLO LEGGENDA
Numero catalogo
Dispositivo medico per la diagnostica in vitro
Fare riferimento alle Istruzioni per l’uso
Limiti di temperatura (temp. di
conservazione)
N
Contenuto sufficiente per "n" saggi
Numero lotto
Data di scadenza
Prodotto da
Oxoid Ltd, Wade Road, Basingstoke
Hants RG24 8PW, UK
IFU X3981F, Revisione Maggio 2016
Per l’assistenza tecnica rivolgersi al distributore locale
Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping
Kit e reagente per estrazione
Kit e reagente per estrazione
enzimatica ORIGINALE
enzimatica MIGLIORATO
Ceppi testati*
Kit competitore
gruppo Lancefield
No.
SENSITIVITY %
SPECIFICITY %
SENSITIVITY %
SPECIFICITY %
SENSITIVITY %
SPECIFICITY %
Nessuno
56
Non Disponibile
99.4
Non Disponibile
99.1
Non Disponibile
99.4
A
30
100
100
100
100
100
100
B
29
100
100
100
100
100
100
C
30
96.6
99.5
96.6
99.5
96.6
99.5
83.7
100
92
99.7
63.3
100
92
99.4
92
99.4
92
99.4
D (Streptococchi)
2
D (NonStreptococchi)
47
F
25
1
1
G
32
100
94.7
100
95.2
100
96
TOTALE
251
94.3
98.9
96.4
98.9
89.2
99.2
* Tutti i ceppi sono stati testati con ciascuno dei sei reagenti di gruppo.
1
Una serie di organismi di gruppo D di Lancefield ha fornito una reazione
D/G. Tali risultati sono stati inclusi nei calcoli come veri positivi di gruppo
D e falsi positivi di gruppo G. In letteratura è nota l’esistenza di ceppi del
gruppo D che producono antigeni di gruppo G quando utilizzati con la
tecnica di estrazione enzimatica.