Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno

Transcript

Ricerche Microbiologiche: Procedure
Standard del Regno Unito
Identificazione di specie Bordetella
Emesso da the Standards Unit, Microbiology Services Division,PHE
Batteriologia - Identificazione | ID 5 | Emissione no:3 | Data emissione: 07.11.14 | Pagina 1 di 22
© Crown copyright 2014
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica
del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web
https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-inclinical-laboratories. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che
sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare
https://www.gov.uk/government/groups/standards-for-microbiology-investigations-steeringcommittee).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori
di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si
ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website:https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-andconsistency-in-clinical-laboratories
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
Loghi corretti al momento della pubblicazione
Batteriologia – Identificazione | ID 5 | Emissione no: 3 | Data emissione: 07.11.14 | Pagina: 2 di 22
UK Standards for Microbiology Investigations | Issued by the Standards Unit, Health Protection Agency
Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................4
RICERCHE MICROBIOLOGICHE STANDARD DEL REGNO UNITO: SCOPO E
OBIETTIVO.................................................................................................................................6
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................9
INTRODUZIONE .........................................................................................................................9
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ...............................................................................12
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .....................................................................13
2
MICRORGANISMI BERSAGLIO ..................................................................................13
3
IDENTIFICAZIONE ......................................................................................................13
4
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE BORDETELLA ..........................................................17
5
REFERTAZIONE ..........................................................................................................18
6
INVIO.............................................................................................................................18
7
NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE ....................................................................19
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................20
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for
Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più
dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation
Tabella delle Modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono
specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
[email protected].
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il
sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/Data.
9/07.11.14
Emissione eliminata. no
2.3
Emissione inserita no.
3
Sezione(i) interessate
Modifica.
Documento intero .
Collegamenti ipertestuali aggiornati a gov uk.
Pagina 2
Aggiornati i loghi aggiunti
Intero documento
Il titolo del documento è stato aggiornato per includere tutte
le specie Bordetella
Documento formato presentato in nuovo formato
Scopo del docummento
Lo scopo è stato aggiornato per includere tutte le specie di
Bordetella isolate da materiale clinico, ma con più enfasi
sulle due specie associate alla pertosse negli esseri umani.
È stato aggiunto un collegamento Web per B 6
La tassonomia delle specie Bordetella è stata aggiornata.
Introduzione
Ulteriori informazioni sono state aggiunte alla sezione
Caratteristiche. Le specie clinicamente importanti sono
menzionati e le loro caratteristiche descritte.
La Sezione sui Principi d’Identificazione è stata aggiornata
per inserire il nome attuale del laboratorio di riferimento in
cui inviare le presunte specie Bordetella.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Aggiunta di informazione riguardante i terreni agar descritti e
riferimento bibliografico
Considerazioni sulla Sicurezza
Questa sezione è stata aggiornata per la necessità che il
personale di laboratorio lavori in cabina di sicurezza e sono
state incluse le voci bibliografiche.
Microrganismi bersaglio
La sezione dei organismi bersaglio è stata aggiornata e
presentata in modo chiaro.La bibliografia è stata aggiornata
Identificazione
Gli aggiornamenti sono stati apportati a 3.1, 3.2 e 3.4 per
riflettere standard nella pratica.
Punto 3.5, è stato aggiornato per includere i metodi
molecolari rapidi
Diagramma di flusso per
identificazione
La modifica del diagramma di flusso per l'identificazione
delle specie di Bordetella è stato fatto per facilitare la
lettura.
Refertazione
Sottosezione 5.4 è stata aggiornata per rispecchiare la
procedure di refertazione
Invio
Aggiornato l’indirizzo del laboratorio di riferimento
Bibliografia
Bibliografia in parte aggiornata.
Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito#:
Scopo e Obiettivo
Utilizzatori delle SMI
• Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai
professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive.
• Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio
riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni
forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di tests appropriati.
• Le SMI forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della
sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la
salute (sia clinica che pubblica) per la propria popolazione.
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del
processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di
laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).
Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi
differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono
metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione
della prova.
La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una
condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le
attività di ricerca e di sviluppo.
Collaborazione Paritaria
La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS,
Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali.
L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito https://www.gov.uk/ukstandards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories.
L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del
processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno
parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei
rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle
organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti
rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse
sono ricercate con un processo di consultazione.
Le SMI sono sviluppate, revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione
Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General
Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.
Assicurazione di Qualità
Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai
Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte
dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008.
Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono
attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno
Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e
neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito.
Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche
addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti
dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere
verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo.
Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e
delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo
commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I
laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative
procedure del controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento
dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari,
ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a
soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla
consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al nostro sito web
Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni
possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di
garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity . I
Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace
con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione Legale
Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra
organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente,
escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o
connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche
a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel
corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo
da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente
accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti quando
appropriato.
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England (2014) Identification of species Bordetella. UK Standards for Microbiology
Investigations. ID 5 Emissione 3. https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigationssmi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories
Scopo del Documento
Questa SMI descrive l’identificazione a livello di specie Bordetella, le due associate nell’uomo a
pertosse (tosse asinina) Boerdetella pertussis e Bordetella parapertussis isolate da campioni clinici
a livello di specie. Per informazioni fare riferimento a B 6 - Investigation of Specimens for
Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis
Questa SMI deve essere usata congiuntamente con le altre SMI.
Introduzione
Tassonomia
Il genere Bordetella è formato attualmente da otto specie nel genere Bordetella; Bordetella
pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella hinzii, Bordetella
holmesii, Bordetella trematum, Bordetella avium, e Bordetella petrii .Una specie 'Bordetella
ansorpii' è ancora in attesa di una classificazione ufficiale. Di queste nove specie, tutte possono
potenzialmente causare infezioni negli esseri umani, anche se raramente in alcuni casi1-3.
Caratteristiche
Le specie Bordetella sono Gram-negative, di aspetto coccobacillare, 0.2 - 0.5 x 0.5 - 2.0 µm. Al
microscopio i microrganismi si presentano isolati o accoppiati, raramente formano catene4.
Presentano spesso una colorazione bipolare. Le cellule sono mobili o non mobili. Sono
strettamente aerobicie (tranne che per una specie, B. Petrii) e la temperatura ottimale è di 3537°C. Sulle piastre le colonie su appaiono lisce, convesse, perlate, scintillanti, quasi trasparenti e
circondate da una zona di emolisi, senza limite periferico definito. Il metabolismo è di tipo
respiratorio e mai fermentativo. Le specie di Bordetella richiedono nicotinamide, aminoacidi e zolfo
organico, per esempio cisteina. Specie Bordetella utilizzano per via ossidativa acido glutammico,
prolina, alanina, acido aspartico e serina con produzione di ammoniaca e CO25.
Bordetella pertussis
B. pertussis può svilupparsi su in tre giorni su terreno selettivo (agar sangue carbone con
cefalexina) (ma di solito per l’isolamento primario è richiesta un’incubazione di 5-7 giorni. Le
piastre di Petri dovrebbero essere incubate 7 giorni prima di essere scartate come negative6. Lo
sviluppo delle sottocolture richiede un’incubazione più breve(3 giorni). Le colonie sono lisce,
convesse, perlacee, brillanti, grigie-bianche e butirrose. B. pertussis non si sviluppa su agar
nutriente ed in modo ridotto su agar sangue.B. pertussis è debolmente ossidasi positiva e non è
mobile. Sono anche ureasi negative e agglutinano con antisiero polivalente anti B. pertussis e
debolmente o non agglutinano con antisiero polivalente anti B. parapertussis in funzione di come
è stato accuratamente eseguito l’assorbimento crociato6.
Il test di sensibilità agli antibiotici non è eseguito di routine a parte due pubblicazioni che
suggeriscono l’esistenza di ceppi di Bordetella pertussis resistenti all’eritromicina7,8. L’esecuzione
del test di sensibilità della pertosse è complicata dalla lenta crescita del microrganismo e dalla
ridotta crescita su alcuni tereni6.
Gli isolati di B. pertussis dovrebbero essere indirizzati per la conferma e la sierotipizzazione alla
Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit. B. pertussis. ha tre principali
agglutinogeni di superficie (1, 2 e 3), che sono rilevabili dall’ agglutinazione batterica tramite
antisieri cross-assorbiti. Sono noti tre sierotipi che possono causare malattia nei soggetti umani
1,2, 1,3 e 1,2,3. Attualmente il meno frequente 1,2,36. Il tipo 1,3 rimane predominante e
rappresenta la maggior parte degli isolati4.
Bordetella parapertussis
Le colonie di B. parapertussis sono simili a quelle di B. pertussis, ma sono più grandi, più opache e
divengono visibili prima. Crescono rapidamente e possono essere visualizzate su piastre di agar
entro 2-3 giorni. Diversamente da B. pertussis, crescono su agar nutriente producendo nel terreno
una colorazione marrone dopo diversi giorni.
B. parapertussis non è mobile, ossidasi negativa e ureasi positiva. Sono agglutinate dall’antisiero
polivalente di B. parapertussis e in modo lento, se non per nulla, dall’antisiero di B. pertussis6.
Bordetella bronchiseptica
La morfologia delle colonie di questo microrganismo, quando coltivato su piastre di agar varia da
liscia a rugosa. Su terreni contenenti sangue il microrganismo si presenta con colonie scintillanti βemolitiche e sviluppa un diametro medio di 2,0 millimetri in 1 o 2 giorni. Le colonie crescono
altrettanto bene su agar MacConkey. Sono ossidasi positive e mobili per flagelli peritrichi. Sono
nitrato e ureasi positive (di solito entro 4 ore); ciò rappresenta un carattere differenziale da B.
pertussis 9.
Bordetella ansorpii
Crescono sia sangue e agar MacConkey. Sono negative per ossidasi, ureasi, riduzione dei nitrati,
esculinasi, mannitolo e arginina diidrolasi, ma positive per citrato, adipato, malato, attività
gelatinasica e motilità1.
Bordetella trematum
B. trematum sono mobili per presenza di flagelli peritrichi. La motilità non varia in modo
significativo quando le cellule sono coltivate a 25, 30, o 37 °C. In 16-24 ore le culture su agar
sangue, la cellule sono mediamente di 0,5 a 0.6μm di larghezza e 1 - 1.8μm di lunghezza; i
bastoncini più grandi sono lunghi fino a 2.4μm. Su agar sangue formano colonie convesse,
circolari, e grigio crema bianche con bordi continui. Non necessitano di particolari fattori di crescita
e si svilupano sui terreni convenzionali. La loro crescita non è inibita da una temperatura di 42° C,
ma si riduce notevolmente a 25° C. I ceppi crescono in microaerofilia, ma non in condizioni
anaerobiche. Le colonie coltivate per 16 a 24 ore su transparent Diagnostic Sensitivity Test a 37 °
C presentano, a luce trasmessa obliquamente sotto un stereo microscopio, iridescenza dal giallo
verdastro al giallo-rosso10.
Sono negative per ossidasi, attività dell'ureasi, fermentazione del glucosio, ma presentano risultati
variabili durante il test per la riduzione dei nitrati e ciò dipende dal ceppo10.
Bordetella holmesii
Si tratta di piccoli bastoncini coccoidi, di media ampiezza, si osservano occasionalmente cellule più
lunghe. Su agar sangue, le colonie sono punteggiate, semiopache, convesse, e rotonde con bordi
continui. Sui terreni si osserva una zona di doratura o verdeggiante. Sono ossidasi negativi, non
mobili, asaccarolitici , esigenti e producono un pigmento solubile di colore marrone. Non crescono
su Aga Citrate di Simmons, ma sulle piastre di agar MacConkey 3-7 giorni dopo incubazione a
35°C11. Sono negative per motilità, crescita aerobica a 25° C e a 42° C, attività dell'ureasi,
fermentazione del glucosio, ma positive per arginina, pralina e leucil glicine10.
Bordetella hinzii
Le cellule sono mobili per mezzo di flagelli peritrichi. Si verificano due distinti tipi di colonie. Alcuni
ceppi su piastre di agar sangue sviluppano colonie rotonde, convesse, lucenti, grigiastre di circa 1
a 2 millimetri di diametro dopo 24-48 ore di incubazione a 37 ° C in aria contenente il 5% di CO2.
Nelle stesse condizioni, altri ceppi producono colonie piatte asciutte, increspate con diametro fino
a 5 mm di diametro. Bordetella hinzii cresce anche su agar MacConkey, ed è positiva per catalasi,
ossidasi e assimilazione di adipato citrato, L-malato e fenilacetato. Esse forniscono risultati variabili
per produzione di ureasi e non riducono nitrati1. Sono anche negative per la fermentazione di
glucosio e crescono in aerobiosi a 25 ° C e 42° C10.
Bordetella petrii
Queste sono caratterizzate dalla capacità di crescere in condizioni aerobiche, microaerofile e
anaerobie. Le cellule possiedono fimbrie di diverso diametro. Il microrganismo può essere coltivato
su agar MacConkey e sviluppa su agar sangue colonie bianco crema non-emolitiche. Sono batteri
asaccharoltici, non-fermentanti. Sono positivi per i test ossidasi e di riduzionedel tetrazolo; hanno
reazione negativa per la produzione di ureasi, riduzione dei nitrati e motilità. Possono assimilare,
citrato, adipato, L-malato e D-Gluconate13.
Sono sensibili a eritromicina, gentamicina, ceftriaxone, e piperacillina/tazobactam e sono resistenti
ad amoxicillina, co-clavulanico, tetraciclina, clindamicina, ciprofloxacina e metronidazolo14.
Bordetella avium
Questi batteri non sono lattosio fermentanti, b astoncini di piccole dimensionie che si
caratterizzano per la capacità di crescere in condizioni aerobiche. Possono crescere su Trypticase
soy agar arricchito con 5% di sangue di montone, agar cioccolato e agar MacConkey incubati a 35
°C in 5% di CO2. Su agar sangue formano colonie non-emolitiche15. Sono positivi alle prove per
motilità, ossidasi, catalasi e riduzione tetrazolio; e negativi per la riduzione dei nitrati e produzione
di ureasi. Essi possono assimilare L-malato, adipato e fenilacetato anche se alcuni ceppi possono
presentare una debole reazione per L-malato e adipato10,13.
Principi di Identificazione
Le colonie di Bordetella isolate su agar selettivo sono identificate in modo preliminare per il loro
aspetto, colorazione Gram e l’agglutinazione con antisiero polivalente.
I saggi biochimici ed altre prove addizionali sono utili per differenziare le specie del genere
Bordetella da quelle microrganismi simili.
Gli isolati sospetti e confermati positivi di B. pertussis e B. parapertussis devono essere inviati alla
Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit.
L’identificazione molecolare completa utilizzando, ad esempio, con PCR e Matrix Assisted Laser
Desorption Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) può essere utilizzata
per identificare i ceppi a livello di specie.
Tutti i laboratori della PHE che dispongono del saggio PCR per B. pertussis dovrebbero inviare
tutti i campioni positivi al PHE Colindale per scopi di sorveglianza.
Per informazioni, rivolgersi al laboratorio o consultare il seguente sito per i dettagli: :
https://www.gov.uk/rvpbru-reference-and-diagnostic-services.
Informazione Tecnica
Terreni con agar
Le piastre devono essere incubate aerobicamente in camera umida per 5 a 7 giorni a 35 a 37° C.
Non incubare in atmosfera aerobica arricchita di anidride carbonica.
La cefalexina è inclusa nei terreni con carbone come inibitore di molti batteri Gram-positivi e di
alcuni Gram-negativi presenti nella normale flora faringea, ma non è completamente inibitoria
verso tutti gli organismi. La crescita di B. pertussis è moderatamente ritardata sui terreni contenenti
cefalexina. Si ritiene che alcuni ceppi di B. pertussis siano inibiti dalla cefalexina; pertanto, è stato
sostenuto l'uso di entrambi terreni, selettivi e non selettivi16.
Può essere utilizzato un'altro terreno selettivo, ciclodestrina Solid Medium (MCS) modificato con
cefdinir, questo ha dimostrato di migliorare l'isolamento selettivo di B. pertussis da campioni clinici,
per una maggiore sensibilità e inibizione della flora del rinofaringe rispetto al terreno con
cefalexina. Un altro vantaggio di questo di questo terreno è dovuta al lungo periodo di
conservazione in quanto alla maggior parte dei laboratori di microbiologia clinica sono raramente
richiesti esami colturali per pazienti con pertosse17. Il costo del terreno MCS è simile a quello degli
altri terreni utilizzati.
1
Considerazioni sulla Sicurezza18-34
Microrganismi del Gruppo di Rischio 2.
Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza della manipolazione per tutti i microrganismi
presentati in questa SMI.
Eseguire le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza
microbiologica26.
Se è utilizzato un tampone per raccogliere la crescita da una piastra e si esegue l’emulsione in
fisiologica per il test di agglutinazione, può insorgere il rischio di infezione; ciò dovrebbe essere
incluso nella valutazione del rischio locale.
In caso di espettorato, o altro materiale del tratto respiratorio inferiore, ove il rischio è
rappresentato dalla possibilità che questi campioni possano contenere Mycobacterium tuberculosis
vitali (MTB); tutte le procedure operative devono essere effettuate in strutture di Contenimento di
Livello 3
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con la valutazione del rischio.
Può manifestarsi rischio d’infezione, che deve essere incluso nella valutazione del rischio locale,
se per le prove di agglutinazione si utilizza un tampone per emulsionare in fisiologica colonie
prelevate da una piastra.
E’ essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto.
2
Microrganismi Bersaglio
Specie Bordetella segnalate come causa di pertosse4 Bordetella pertussis, Bordetella
parapertussis
Altre Bordetella segnalate come agenti causali di infezione nell’uomo - Bordetella
bronchiseptica35, Bordetella trematum10, Bordetella hinzii12, Bordetella holmesii11, ‘Bordetella
ansorpii’1, Bordetella petrii14, Bordetella avium15.
3
Identificazione
3.1
Aspetto Microscopico
Colorazione Gram (TP 39 - Staining Procedures)
Coccobacilli sottili, Gram negativi, si presentano isolati o in coppia, raramente in catene. Alcuni
ceppi possono essere dotati di capsula.
3.2
Terreno di Primo Isolamento
Per l’isolamento primario si usa agar carbone selettivo, incubato per 7 giorni a 35°C - 37°C in
aerobiosi, con elevata concentrazione di umidità e buona circolazione d’aria. Tuttavia, estendendo
l’ incubazione della piastra fino a 12 giorni si è verificato nei campioni clinici un miglioramenti nel
recupero di specie di Bordetella 36 .
3.3
Aspetto delle Colonie
Su agar carbone sangue con cefalexina le colonie di B. pertussis sono lisce, convesse, perlacee e
brillanti, grigio-bianche e butirrose; nelle sottocolture si manifestano dopo 3 giorni e nell’isolamento
primario dopo incubazione più prolungata. Le colonie di B. parapertussis sono simili, ma più
larghe, più opache e si sviluppano in due giorni. Su agar nutriente le colonie delle sottocolture di B.
parapertussis producono un pigmento scuro che diffonde nel terreno. B. pertussis non cresce su
agar nutriente.
3.4
Procedura di Prova
3.4.1 Prove biochimiche
Prova dell’ossidasi (TP 26 – Prova dell’ossidasi)
B. parapertussis è ossidasi-negativa, B. pertussis è ossidasi-positiva
Agglutinazione (vetrino) con antisiero specifico
.Seguire le istruzioni del produttore e, prima dell'uso, le confezioni devono essere validate e aver
dimostrato di essere idonee allo scopo. Preparare su un vetrino da microscopio una sospensione
della colonia sospetta in soluzione fisiologica. Antisiero specifico di B. pertussis, B. parapertussis o
soluzione fisiologica devono essere aggiunti alle sospensioni e miscelate.
Un risultato positivo è indicato dalla presenza di agglutinazione con antisiero specifico e assenza
di agglutinazione nella soluzione fisiologica. Se il risultato di agglutinazione è dubbio, inviare
l'isolato
Per una caratterizzazione più approfondita inviare al Respiratory and Vaccine Preventable
Bacteria Reference Unit gli isolati sospetti di B. pertussis e B. parapertussis.
3.4.2 Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass
spectrometry (MALDI-TOF MS)
Questo strumento ha dimostrato di essere rapido e potente per la sua riproducibilità, velocità e
sensibilità dell'analisi. Il vantaggio di MALDI-TOF rispetto ad altri metodi di identificazione è che i
risultati delle analisi sono disponibili entro poche ore anziché diversi giorni. La velocità e la
semplicità di preparazione del campione e l'acquisizione del risultato associato a costi di consumo
minimi rendono questo metodo adatto per la routine con elevata produttività37.
Questa nuova tecnica, che richiede minor impegno operativo, è stata utilizzata per ottenere
identificazione delle specie a livello affidabile per la specie Bordetella di non frequente isolamento,
come nel caso di endocardite su protesi valvolare aortica da omotrapianto causata da Bordetella
holmesii che il test di routine di laboratorio aveva inizialmente ed erroneamente identificato come
ceppo di specie Acinetobacter, mentre il sequenziamento del gene 16S rRNA, quello del gene
codificante la proteina A (ompA) della membrana esterna e l’identificazione con MALDI-TOF MS
sono state tutte coerenti per B. holmesii38.
3.4.3 Nucleic Acid Amplification Tests (NAATs)
La PCR è generalmente considerata un buon metodo perché è semplice, sensibile e specifica. La
base per le applicazioni diagnostiche della PCR in microbiologia sono la rivelazione di agenti
infettivi e la discriminazione fra ceppi non patogeni dai ceppi patogeni in virtù di geni specifici.
Si tratta di uno strumento prezioso per rafforzare la sorveglianza epidemiologica e per la
disponibilità di una rapida diagnosi di pertosse, in cui i risultati possono giovare alla gestione del
paziente (e del contatto). Questo metodo è stato usato con successo per l'identificazione di
Bordetella pertussis39,40. Questa opportunità (tramite la Respiratory and Vaccine Preventable
Bacteria Reference Unit) è utilizzata per bambini di età ≤6 mesi ricoverati in unità di pediatrica con
malattia respiratoria compatibile con la pertosse.
3.5
Identificazione Successiva
Metodi Rapidi molecolari
I metodi molecolari hanno avuto un impatto enorme sulla tassonomia di Bordetella. Le analisi delle
sequenze geniche hanno aumentato la comprensione delle relazioni filogenetiche delle specie
Bordetella e ciò ha comportato la rilevazione di nuove specie. Le tecniche molecolari hanno
consentito l’ identificazione di molte specie in modo più rapido e preciso di quanto sia possibile
con le tecniche fenotipiche.
Sono stati sviluppati numerosi metodi rapidi di tipizzazione per isolati da campioni clinici; Si tratta
di tecniche molecolari come l’Elettroforesi su Gel a Campo Pulsato i (PFGE), Multiple-locus
Variable-Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and16S rRNA gene sequencing. Tutti questi
approcci consentono la tipizzazione dei ceppi non correlati, ma lo fanno in modo diverso per
precisione, potere discriminante e riproducibilità.
Tuttavia, alcuni di questi metodi rimangono accessibili solo a laboratori di riferimento e sono difficili
da implementare in un laboratorio clinico per l’identificazione batterica di routine.
Pulsed Field Gel Electrophoresis Gel (PFGE)
La PFGE rileva variazione genetica tra ceppi con rari tagli ottenuti con enzimi di restrizione e
successiva separazione dei grandi frammenti genomici ottenuti su gel di agarosio.La PFGE è nota
per essere altamente discriminante ed è una tecnica utilizzata frequentemente per le indagini sui
focolai avendo acquisito una vasta applicazione nella caratterizzazione degli isolati
epidemiologicamente correlati. Tuttavia, la stabilità della PFGE può essere insufficiente per
un’applicazione affidabile e in studi epidemiologici a lungo termine. Inoltre, a causa della sua
natura, richiede tempo (30 ore o più per l’esecuzione) e attrezzature speciali. La PFGE non è
diffusamente usata se non nei laboratori di riferimento41,42.
La caratterizzazione molecolare dei ceppi è importante per identificare l’epidemiologia della
pertosse. Questo metodo è stato utilizzato inizialmente, ma è risultato laborioso e i risultati sono
stati difficili da confrontare tra i laboratori43.
Multiple-locus variabile Number Tandem Repeat Analysis (MLVA)
La MLVA è un metodo efficace, semplice e trasportabile, che può essere utilizzato per ottenere
profili di ceppi che possono essere facilmente scambiati per via elettronica. MLVA è stata usata
con successo per tipizzare alcune diverse specie batteriche, dimostrando di essere un metodo
eccellente e dotato di alta risoluzione, particolarmente utile per microrganismi con un ridotto livello
di diversità nella sequenza.
Questo nuovo approccio, MLVA Typing, è stato introdotto ed è usato per analizzare il numero di
sequenze ripetute in tandem nel genoma di B. pertussis43,44. Questa tecnica non richiede la coltura
e può essere applicata direttamente a tamponi nasali o faringei. L’analisi Variable-number tandem
repeat (VNTR) ha rivelato una notevole eterogeneità nel genoma di B. pertussis e l'espansione
clonale durante i periodi epidemici.
16S rRNA gene sequencing
Il metodo di identificazione genotipica, 16S rRNA per il sequenziamento del gene è usato per studi
filogenetici ed è stato successivamente riscontrato di essere in grado di ri-classificare i batteri in
specie completamente nuove, o anche in generi. È stato utilizzato anche per descrivere nuove
specie che non sono mai state coltivate con successo.
Questo metodo è stato utilizzato recentemente per l'identificazione accurata delle specie
Bordetella non classiche (cioè non includenti B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica)
come nel primo caso della setticemia a esito infausto causata da Bordetella hinzii45.
La maggiore variazione di mutazione del gene A (ompA) della proteina della membrana esterna
della Bordetella confrontato al gene 16S rRNA permette l'identificazione univoca delle specie non
classiche di Bordetella. Tuttavia, si deve notare che le sequenze del gene 16S rRNA di B.
pertussis, B. parapertussis e B. bronchiseptica sono identiche e pertanto questo metodo non può
essere utilizzato per fornire una identificazione di specie nell’ambito di queste ultime 3 specie.
Questo vale anche per la sequenza ompA di queste 3 specie46
3.6
Conservazione e Invio
Conservare gli isolati puri su agar carbone sangue a becco di clarino per l’invio al Laboratorio di
Riferimento. La coltura su becco di clarino può richiedere alcuni giorni d’incubazione prima di
manifestare una crescita adeguata.
4 Identificazione di specie Bordetella
Il Diagramma Flusso rappresenta solo un’indicazione
5
Refertazione
5.1
Identificazione Presuntiva
Se si riscontrano appropriate caratteristiche di crescita, aspetto della colonia, colorazione Gram
della coltura, prove dell’ossidasi e risultati sierologici.
5.2
Conferma dell’Identificazione
Successiva al referto del Laboratorio di Riferimento.
5.3
Medico Microbiologo
In accordo con i protocolli locali, informare il medico microbiologo di tutti gli isolati con
identificazione preliminare e confermata di B. pertussis or B. parapertussis.
Seguire i protocolli locali per la refertazione al medico del paziente.
5.4
CCDC
Fare riferimento al Memorandum locale di Informazione.
5.5
Public Health England47
Fare riferimento alle linee guida attuali della PHEe alle indicazioni del COSURV
"La pertosse"tosse asinina” è una malattia soggetta a Denuncia, per la gestione della salute
pubblica dei casi, i contatti e le epidemie,e tutti i casi sospetti devono essere immediatamente
denunciati ai locali Public Health England Centers
Tutti gli isolati clinicamente significativi devono essere notificati dai laboratori diagnostici per
garantire l’avvio urgente di procedure corrette.
5.6
Gruppo Controllo Infezione
Informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati presunti o confermati di B. pertussis o B
parapertussis da pazienti degenti in ospedale con identificazione preliminare e confermata. Gli altri
isolati devono essere segnalati al gruppo di controllo delle infezioni secondo le procedure locali,
specialmente se si sospetta un’epidemia.
6
Invio
6.1 Laboratorio di Riferimento
Contattare gli appropriati laboratori nazionale di riferimento per informazioni sugli accertamenti
disponibili, i tempi di risposta, le procedure di trasporto ed altre informazioni riguardanti il’invio del
campione:
Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit
61 Colindale Avenue
London
NW9 5EQ
Contattare il Centralino: Tel. +44 (0) 20 8200 4400
Inghilterra e Galles
https://www.gov.uk/specialist-and-reference-microbiology-laboratory-tests-and-services
Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nord
http://www.belfasttrust.hscni.net/Laboratory-MortuaryServices.htm
7
Notifica al PHE47,48 o Equivalente49-52
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla
Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva, Le denuncie devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici
e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di
alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
perf Human Immunodeficiency Virus (HIV) & Sexually Transmitted Infections (STIs), Healthcare
Associated Infections (HCAIs) and Creutzfeldt–Jakob disease (CJD) da includere nel ‘Notification
Duties of Registered Medical Practitioners’, e non nel ‘Notification Duties of Diagnostic
Laboratories’.
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/our-governance#healthprotection-regulations-2010
Esistono accordi diversi in. Scotland49,50, Wales51 e Northern Ireland52.
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18. European Parliament. UK Standards for Microbiology Investigations (SMIs) use the term "CE marked leak
proof container" to describe containers bearing the CE marking used for the collection and transport of clinical
specimens. The requirements for specimen containers are given in the EU in vitro Diagnostic Medical Devices
Directive (98/79/EC Annex 1 B 2.1) which states: "The design must allow easy handling and, where
necessary, reduce as far as possible contamination of, and leakage from, the device during use and, in the
case of specimen receptacles, the risk of contamination of the specimen. The manufacturing processes must
be appropriate for these purposes".
19. Official Journal of the European Communities. Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the
Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. 7-12-1998. p. 1-37.
20. Health and Safety Executive. Safe use of pneumatic air tube transport systems for pathology specimens.
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21. Department for transport. Transport of Infectious Substances, 2011 Revision 5. 2011.
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23. Home Office. Anti-terrorism, Crime and Security Act. 2001 (as amended).
24. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The Approved List of Biological Agents. Health and Safety
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51. The Welsh Assembly Government. Health Protection Legislation (Wales) Guidance. 2010.
52.
Home Office. Public Health Act (Northern Ireland) 1967 Chapter 36
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica
del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web
https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-inclinical-laboratories. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che
sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare
https://www.gov.uk/government/groups/standards-for-microbiology-investigations-steeringcommittee).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori
di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si
ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Health Protection Agency
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website:https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-andconsistency-in-clinical-laboratories
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
Loghi corretti al momento della pubblicazione
Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................4
RICERCHE MICROBIOLOGICHE STANDARD DEL REGNO UNITO: SCOPO E
OBIETTIVO.................................................................................................................................6
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................9
INTRODUZIONE .........................................................................................................................9
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ...............................................................................12
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .....................................................................13
2
MICRORGANISMI BERSAGLIO ..................................................................................13
3
IDENTIFICAZIONE ......................................................................................................13
4
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE BORDETELLA ..........................................................17
5
REFERTAZIONE ..........................................................................................................18
6
INVIO.............................................................................................................................18
7
NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE ....................................................................19
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................20
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for
Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più
dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation
Tabella delle Modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono
specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
[email protected].
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il
sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/Data.
9/07.11.14
Emissione eliminata. no
2.3
Emissione inserita no.
3
Sezione(i) interessate
Modifica.
Documento intero .
Collegamenti ipertestuali aggiornati a gov uk.
Pagina 2
Aggiornati i loghi aggiunti
Intero documento
Il titolo del documento è stato aggiornato per includere tutte
le specie Bordetella
Documento presentato in nuovo formato
Scopo del docummento
Lo scopo è stato aggiornato per includere tutte le specie di
Bordetella isolate da materiale clinico, ma con più enfasi
sulle due specie associate alla pertosse negli esseri umani.
È stato aggiunto un collegamento Web per B 6
La tassonomia delle specie Bordetella è stata aggiornata.
Introduzione
Ulteriori informazioni sono state aggiunte alla sezione
Caratteristiche. Le specie clinicamente importanti sono
menzionate e le loro caratteristiche descritte.
La Sezione sui Principi d’Identificazione è stata aggiornata
per inserire il nome attuale del laboratorio di riferimento in
cui inviare le presunte specie Bordetella.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Aggiunta di informazione riguardante i terreni agar descritti e
riferimento bibliografico
Considerazioni sulla Sicurezza
Questa sezione è stata aggiornata per la necessità che il
personale di laboratorio lavori in cabina di sicurezza e sono
state incluse le voci bibliografiche.
Microrganismi bersaglio
La sezione dei microrganismi bersaglio è stata aggiornata e
presentata in modo chiaro. La bibliografia è stata aggiornata
Gli aggiornamenti sono stati apportati a 3.1, 3.2 e 3.4 per
riflettere gli standard nella pratica.
Identificazione
Punto 3.5, è stato aggiornato per includere i metodi
molecolari rapidi
Diagramma di flusso per
identificazione
La modifica del diagramma di flusso per l'identificazione
delle specie di Bordetella è stato fatto per facilitare la
lettura.
Refertazione
Sottosezione 5.4 è stata aggiornata per rispecchiare la
procedure di refertazione
Invio
Aggiornato l’indirizzo del laboratorio di riferimento
Bibliografia
Bibliografia in parte aggiornata.
Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito#:
Scopo e Obiettivo
Utilizzatori delle SMI
• Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai
professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive.
• Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio
riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni
forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di tests appropriati.
• Le SMI forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della
sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la
salute (sia clinica che pubblica) per la propria popolazione.
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del
processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di
laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).
Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi
differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono
metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione
della prova.
La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una
condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le
attività di ricerca e di sviluppo.
Collaborazione Paritaria
La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS,
Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali.
L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito https://www.gov.uk/ukstandards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories.
L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del
processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno
parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei
rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle
organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti
rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse
sono ricercate con un processo di consultazione.
Le SMI sono sviluppate, revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione
Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General
Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.
Assicurazione di Qualità
Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai
Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte
dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008.
Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono
attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno
Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e
neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito.
Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche
addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti
dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere
verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo.
Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e
delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo
commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I
laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative
procedure del controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento
dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari,
ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a
soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla
consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al nostro sito web
Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni
possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di
garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity . I
Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace
con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione Legale
Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra
organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente,
escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o
connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche
a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel
corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo
da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente
accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti quando
appropriato.
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England (2014) Identification of species Bordetella. UK Standards for Microbiology
Investigations. ID 5 Emissione 3. https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigationssmi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories
Scopo del Documento
Questa SMI descrive l’identificazione a livello di specie Bordetella e in modo particolare, le due
associate nell’uomo a pertosse (tosse asinina) Boerdetella pertussis e Bordetella parapertussis
isolate da campioni clinici a livello di specie. Per informazioni fare riferimento a B 6 - Investigation
of Specimens for Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis
Questa SMI deve essere usata congiuntamente con le altre SMI.
Introduzione
Tassonomia
Il genere Bordetella è formato attualmente da otto specie nel genere Bordetella; Bordetella
pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella hinzii, Bordetella
holmesii, Bordetella trematum, Bordetella avium, e Bordetella petrii .Una specie 'Bordetella
ansorpii' è ancora in attesa di una classificazione ufficiale. Di queste nove specie, tutte possono
potenzialmente causare infezioni negli esseri umani in alcuni casi, anche se raramente 1-3.
Caratteristiche
Le specie Bordetella sono Gram-negative, di aspetto coccobacillare, 0.2 - 0.5 x 0.5 - 2.0 µm. Al
microscopio i microrganismi si presentano isolati o accoppiati, raramente formano catene4.
Presentano spesso una colorazione bipolare. Le cellule sono mobili o non mobili. Sono
strettamente aerobie (tranne che per una specie, B. Petrii) e la temperatura ottimale è di 35-37°C.
Sulle piastre le colonie appaiono lisce, convesse, perlate, scintillanti, quasi trasparenti e circondate
da una zona di emolisi, senza limite periferico definito. Il metabolismo è di tipo respiratorio e mai
fermentativo. Le specie di Bordetella richiedono nicotinamide, aminoacidi e zolfo organico, per
esempio cisteina. Le specie Bordetella utilizzano per via ossidativa acido glutammico, prolina,
alanina, acido aspartico e serina con produzione di ammoniaca e CO25.
Bordetella pertussis
B. pertussis può svilupparsi in tre giorni su terreno selettivo (agar sangue carbone con cefalexina)
ma di solito per l’isolamento primario è richiesta un’incubazione di 5-7 giorni. Le piastre di
dovrebbero essere incubate 7 giorni prima di essere scartate come negative6. Lo sviluppo delle
sottocolture richiede un’incubazione più breve (3 giorni). Le colonie sono lisce, convesse, perlacee,
brillanti, grigie-bianche e butirrose. B. pertussis non si sviluppa su agar nutriente o su agar
MacConkey e cresca in modo ridotto su agar sangue. B. pertussis è debolmente ossidasi positiva
e non è mobile. E’ anche ureasi negativa e agglutina con antisiero polivalente anti B. pertussis e o
non agglutina con antisiero polivalente anti B. parapertussis, ciò dipende dall’accuratezza con cui è
stato eseguito l’assorbimento crociato6.
Il test di sensibilità agli antibiotici non è eseguito di routine a parte due pubblicazioni che
suggeriscono l’esistenza di ceppi di Bordetella pertussis resistenti all’eritromicina7,8. L’esecuzione
del test di sensibilità della pertosse è complicata dalla lenta crescita del microrganismo e dalla
scarsa crescita su alcuni terreni6.
Gli isolati di B. pertussis dovrebbero essere indirizzati per la conferma e la sierotipizzazione alla
Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit. B. pertussis possiede tre principali
agglutinogeni di superficie (1, 2 e 3), che sono rilevabili dall’ agglutinazione batterica con antisieri
cross-assorbiti. Sono noti tre sierotipi che possono causare malattia nei soggetti umani 1,2, 1,3 e
1,2,3. Attualmente il meno frequente 1,2,36. Il tipo 1,3 rimane predominante e rappresenta la
maggior parte degli isolati4.
Bordetella parapertussis
Le colonie di B. parapertussis sono simili a quelle di B. pertussis, ma sono più grandi, più opache e
divengono visibili prima. Crescono rapidamente e possono essere visualizzate su piastre di agar
entro 2-3 giorni. Diversamente da B. pertussis, crescono su agar nutriente producendo nel terreno
una colorazione marrone dopo alcuni giorni.
B. parapertussis non è mobile, ossidasi negativa e ureasi positiva. Sono agglutinate dall’antisiero
polivalente di B. parapertussis e in modo lento, se non per nulla, dall’antisiero di B. pertussis6.
Bordetella bronchiseptica
La morfologia delle colonie di questo microrganismo, quando coltivato su piastre di agar, varia da
liscia a rugosa. Su terreni contenenti sangue il microrganismo si presenta con colonie scintillanti βemolitiche e sviluppa un diametro medio di 2,0 millimetri in 1 o 2 giorni. Le colonie crescono
altrettanto bene su agar MacConkey. Sono ossidasi positive e mobili per flagelli peritrichi. Sono
nitrato e ureasi positive (di solito entro 4 ore); ciò rappresenta un carattere differenziale da B.
pertussis 9.
Bordetella ansorpii
Crescono sia sangue e agar MacConkey. Sono negative per ossidasi, ureasi, riduzione dei nitrati,
esculinasi, mannitolo e arginina diidrolasi, ma positive per citrato, adipato, malato, attività
gelatinasica e motilità1.
Bordetella trematum
B. trematum sono mobili per presenza di flagelli peritrichi. La motilità non varia in modo
significativo quando le cellule sono coltivate a 25, 30, o 37 °C. Nelle colture su agar sangue a 1624 ore, la cellule sono mediamente di 0,5 a 0.6μm di larghezza e 1 - 1.8μm di lunghezza; i
bastoncini più grandi sono lunghi fino a 2.4μm. Su agar sangue formano colonie convesse,
circolari, e grigio crema bianche con bordi continui. Non richiedono particolari fattori di crescita e si
sviluppano sui terreni convenzionali. La loro crescita non è inibita da una temperatura di 42° C, ma
si riduce notevolmente a 25° C. I ceppi crescono in microaerofilia, ma non in condizioni
anaerobiche. Le colonie coltivate per 16 a 24 ore su transparent Diagnostic Sensitivity Test a 37 °
C presentano, a luce trasmessa obliquamente sotto un stereo microscopio, iridescenza dal giallo
verdastro al giallo-rosso10.
Sono negative per ossidasi, attività dell'ureasi, fermentazione del glucosio, ma presentano risultati
variabili al test per la riduzione dei nitrati e ciò dipende dal ceppo10.
Bordetella holmesii
Si tratta di piccoli bastoncini coccoidi, di media ampiezza, si osservano occasionalmente cellule più
lunghe. Su agar sangue, le colonie sono punteggiate, semiopache, convesse, e rotonde con bordi
continui. Sui terreni si osserva una zona di colore abbronzato o verdeggiante. Sono ossidasi
negative, non mobili, asaccarolitiche , esigenti e producono un pigmento solubile di colore
marrone. Non crescono su Agar Citrato di Simmons, ma sulle piastre di agar MacConkey dopo 37 giorni d’incubazione a 35°C11. Sono negative per motilità, crescita aerobica a 25° C e a 42° C,
attività dell'ureasi, fermentazione del glucosio, ma positive per arginina, pralina e leucil glicine10.
Bordetella hinzii
Le cellule sono mobili per mezzo di flagelli peritrichi. Si manifestano due distinti tipi di colonie.
Alcuni ceppi su piastre di agar sangue sviluppano colonie rotonde, convesse, lucenti, grigiastre di
circa 1 a 2 millimetri di diametro dopo 24-48 ore di incubazione a 37 ° C in aria contenente il 5% di
CO2. Nelle stesse condizioni, altri ceppi producono colonie piatte asciutte, increspate con diametro
fino a 5 mm. Bordetella hinzii cresce anche su agar MacConkey, ed è positiva per catalasi,
ossidasi e assimilazione di adipato citrato, L-malato e fenilacetato. Forniscono risultati variabili per
produzione di ureasi e non riducono i nitrati1. Sono anche negative per la fermentazione di
glucosio e crescono in aerobiosi a 25 ° C e 42° C10.
Bordetella petrii
Queste sono caratterizzate dalla capacità di crescere in condizioni aerobiche, microaerofile e
anaerobie. Le cellule possiedono fimbrie di diverso diametro. Il microrganismo può essere coltivato
su agar MacConkey e su agar sangue sviluppa colonie bianco crema non-emolitiche. Sono batteri
asaccharoltici, non-fermentanti. Sono positivi per i test ossidasi e riduzione del tetrazolo; hanno
reazione negativa per produzione di ureasi, riduzione dei nitrati e motilità. Possono assimilare,
citrato, adipato, L-malato e D-Gluconate13.
Sono sensibili a eritromicina, gentamicina, ceftriaxone, e piperacillina/tazobactam e sono resistenti
ad amoxicillina, co-clavulanico, tetraciclina, clindamicina, ciprofloxacina e metronidazolo14.
Bordetella avium
Questi batteri non sono lattosio fermentanti, bastoncini di piccole dimensionie che si caratterizzano
per la capacità di crescere in condizioni aerobiche. Possono crescere su Trypticase soy agar
arricchito con 5% di sangue di montone, agar cioccolato e agar MacConkey incubati a 35 °C in 5%
di CO2. Su agar sangue formano colonie non-emolitiche15. Sono positivi alle prove per motilità,
ossidasi, catalasi e riduzione di tetrazolio; negativi per riduzione dei nitrati e produzione di ureasi.
Possono assimilare L-malato, adipato e fenilacetato anche se alcuni ceppi possono presentare
una debole reazione per L-malato e adipato10,13.
Principi di Identificazione
Le colonie di Bordetella isolate su agar selettivo sono identificate in modo preliminare per il loro
aspetto, colorazione Gram e l’agglutinazione con antisiero polivalente.
I saggi biochimici ed altre prove addizionali sono utili per differenziare le specie del genere
Bordetella da microrganismi simili.
Gli isolati sospetti e confermati positivi di B. pertussis e B. parapertussis devono essere inviati alla
Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit.
Per identificare i ceppi a livello di specie può essere utilizzata l’identificazione molecolare, ad
esempio,la PCR e la Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight Mass
Spectrometry (MALDI-TOF MS).
Per scopi di sorveglianza, tutti i laboratori della PHE che dispongono del saggio PCR per B.
pertussis dovrebbero inviare tutti i campioni positivi al PHE Colindale
Per informazioni, rivolgersi al laboratorio o consultare il seguente sito per i dettagli: :
https://www.gov.uk/rvpbru-reference-and-diagnostic-services.
Informazione Tecnica
Terreni con agar
Le piastre devono essere incubate in aerobiosi in camera umida per 5 a 7 giorni a 35 a 37° C. Non
incubare in atmosfera aerobica arricchita di anidride carbonica.
La cefalexina è inclusa nei terreni con carbone come inibitore di molti batteri Gram-positivi e di
alcuni Gram-negativi presenti nella normale flora faringea, ma non è completamente inibitoria
verso tutti questi organismi. La crescita di B. pertussis è moderatamente ritardata sui terreni
contenenti cefalexina. Si ritiene che alcuni ceppi di B. pertussis siano inibiti dalla cefalexina;
pertanto, è stato sostenuto l'uso di entrambi terreni, selettivi e non selettivi16.
Può essere utilizzato un'altro terreno selettivo, quale il ciclodestrina Solid Medium (MCS)
modificato con cefdinir, questo ha dimostrato di migliorare l'isolamento selettivo di B. pertussis da
campioni clinici, per una maggiore sensibilità e inibizione della flora del rinofaringe rispetto al
terreno con cefalexina. Un altro vantaggio di questo terreno è dovuta al lungo periodo di
conservazione; tenuto conto che alla maggior parte dei laboratori di microbiologia clinica è
richiesto raramente l’esame colturale per pazienti con pertosse17. Il costo del terreno MCS è simile
a quello degli altri terreni utilizzati.
1
Considerazioni sulla Sicurezza18-34
Microrganismi del Gruppo di Rischio 2.
Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza della manipolazione per tutti i microrganismi
presentati in questa SMI.
Eseguire le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza
microbiologica26.
Se è utilizzato un tampone per raccogliere la crescita da una piastra e si esegue l’emulsione in
fisiologica per il test di agglutinazione, può insorgere il rischio di infezione; ciò dovrebbe essere
incluso nella valutazione del rischio locale.
In caso di espettorato, o altro materiale del tratto respiratorio inferiore, ove è possibile il rischio che
questi campioni possano contenere Mycobacterium tuberculosis vitali (MTB), eseguire tutte le
procedure operative in strutture di Contenimento di Livello 3
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con la valutazione del rischio.
Può manifestarsi rischio d’infezione, che deve essere incluso nella valutazione del rischio locale,
se per le prove di agglutinazione si utilizza un tampone per emulsionare in fisiologica colonie
prelevate da una piastra.
E’ essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto.
2
Microrganismi Bersaglio
Specie Bordetella segnalate come causa di pertosse4 Bordetella pertussis, Bordetella
parapertussis
Altre Bordetella segnalate come agenti causali di infezione nell’uomo - Bordetella
bronchiseptica35, Bordetella trematum10, Bordetella hinzii12, Bordetella holmesii11, ‘Bordetella
ansorpii’1, Bordetella petrii14, Bordetella avium15.
3
Identificazione
3.1
Aspetto Microscopico
Colorazione Gram (TP 39 - Staining Procedures)
Coccobacilli sottili, Gram negativi, si presentano isolati o in coppia, raramente in catene. Alcuni
ceppi possono essere dotati di capsula.
3.2
Terreno di Primo Isolamento
Per l’isolamento primario si usa agar carbone selettivo, incubato per 7 giorni a 35°C - 37°C in
aerobiosi, con elevata concentrazione di umidità e buona circolazione d’aria. Tuttavia, estendendo
l’ incubazione della piastra fino a 12 giorni si è verificato nei campioni clinici un miglioramenti nel
recupero di specie di Bordetella 36 .
3.3
Aspetto delle Colonie
Su agar carbone sangue con cefalexina le colonie di B. pertussis sono lisce, convesse, perlacee e
brillanti, grigio-bianche e butirrose; nelle sottocolture si manifestano dopo 3 giorni e nell’isolamento
primario dopo incubazione più prolungata. Le colonie di B. parapertussis sono simili, ma più
larghe, più opache e si sviluppano in due giorni. Su agar nutriente le colonie delle sottocolture di B.
parapertussis producono un pigmento scuro che diffonde nel terreno. B. pertussis non cresce su
agar nutriente.
3.4
Procedura di Prova
3.4.1 Prove biochimiche
Prova dell’ossidasi (TP 26 – Prova dell’ossidasi)
B. parapertussis è ossidasi-negativa, B. pertussis è ossidasi-positiva
Agglutinazione (vetrino) con antisiero specifico
.Seguire le istruzioni del produttore e, prima dell'uso, le confezioni devono essere validate e aver
dimostrato di essere idonee allo scopo. Preparare su un vetrino da microscopio una sospensione
della colonia sospetta in soluzione fisiologica. Antisiero specifico di B. pertussis, B. parapertussis o
soluzione fisiologica devono essere aggiunti alle sospensioni e miscelate.
Un risultato positivo è indicato dalla presenza di agglutinazione con antisiero specifico e assenza
di agglutinazione nella soluzione fisiologica. Se il risultato di agglutinazione è dubbio, inviare
l'isolato
Per una caratterizzazione più approfondita inviare al Respiratory and Vaccine Preventable
Bacteria Reference Unit gli isolati sospetti di B. pertussis e B. parapertussis.
3.4.2 Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass
spectrometry (MALDI-TOF MS)
Questo strumento ha dimostrato di essere rapido e potente per la sua riproducibilità, velocità e
sensibilità dell'analisi. Il vantaggio di MALDI-TOF rispetto ad altri metodi di identificazione è che i
risultati delle analisi sono disponibili entro poche ore anziché diversi giorni. La velocità e la
semplicità di preparazione del campione e l'acquisizione del risultato associato a costi di consumo
minimi rendono questo metodo adatto per la routine con elevata produttività37.
Questa nuova tecnica, che richiede minor impegno operativo, è stata utilizzata per ottenere
identificazione delle specie a livello affidabile per la specie Bordetella di non frequente isolamento,
come nel caso di endocardite su protesi valvolare aortica da omotrapianto causata da Bordetella
holmesii che il test di routine di laboratorio aveva inizialmente ed erroneamente identificato come
ceppo di specie Acinetobacter, mentre il sequenziamento del 16S rRNA, quello del gene
codificante per la proteina A (ompA) della membrana esterna e l’identificazione con MALDI-TOF
MS sono state tutte coerenti per B. holmesii38.
3.4.3 Nucleic Acid Amplification Tests (NAATs)
La PCR è generalmente considerata un buon metodo perché è semplice, sensibile e specifica. La
base per le applicazioni diagnostiche della PCR in microbiologia sono la rivelazione di agenti
infettivi e la discriminazione fra ceppi non patogeni dai ceppi patogeni in virtù di geni specifici.
Si tratta di uno strumento prezioso per rafforzare la sorveglianza epidemiologica e per la
disponibilità di una rapida diagnosi di pertosse, in cui i risultati possono giovare alla gestione del
paziente (e del contatto). Questo metodo è stato usato con successo per l'identificazione di
Bordetella pertussis39,40. Questa opportunità (tramite la Respiratory and Vaccine Preventable
Bacteria Reference Unit) è utilizzata per bambini di età ≤6 mesi ricoverati in unità di pediatrica con
malattia respiratoria compatibile con la pertosse.
3.5
Identificazione Successiva
Metodi Rapidi molecolari
I metodi molecolari hanno avuto un impatto enorme sulla tassonomia di Bordetella. Le analisi delle
sequenze geniche hanno aumentato la comprensione delle relazioni filogenetiche delle specie
Bordetella e ciò ha comportato la rilevazione di nuove specie. Le tecniche molecolari hanno
consentito l’ identificazione di molte specie in modo più rapido e preciso di quanto sia stato
possibile con le tecniche fenotipiche.
Sono stati sviluppati numerosi metodi rapidi di tipizzazione per isolati da campioni clinici; Si tratta
di tecniche molecolari come la Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multiple-locus VariableNumber Tandem Repeat Analysis (MLVA) e la16S rRNA gene sequencing. Tutti questi approcci
consentono la tipizzazione dei ceppi non correlati, ma lo fanno in modo diverso per precisione,
potere discriminante e riproducibilità.
Tuttavia, alcuni di questi metodi rimangono accessibili solo a laboratori di riferimento e sono difficili
da implementare in un laboratorio clinico per l’identificazione batterica di routine.
Pulsed Field Gel Electrophoresis Gel (PFGE)
La PFGE rileva variazione genetica tra ceppi con rari tagli ottenuti con enzimi di restrizione e
successiva separazione dei grandi frammenti genomici ottenuti su gel di agarosio.La PFGE è nota
per essere molto discriminante ed è una tecnica utilizzata frequentemente per le indagini sui
focolai avendo acquisito una vasta applicazione nella caratterizzazione degli isolati
epidemiologicamente correlati. Tuttavia, la stabilità della PFGE può essere insufficiente per
un’applicazione affidabile e in studi epidemiologici a lungo termine. Inoltre, a causa della sua
natura, richiede tempo (30 ore o più per l’esecuzione) e attrezzature speciali. La PFGE non è
diffusamente usata se non nei laboratori di riferimento41,42.
La caratterizzazione molecolare dei ceppi è importante per identificare l’epidemiologia della
pertosse. Questo metodo è stato utilizzato inizialmente, ma è risultato laborioso e i risultati sono
stati difficili da confrontare tra i laboratori43.
Multiple-locus variabile Number Tandem Repeat Analysis (MLVA)
La MLVA è un metodo efficace, semplice e trasportabile, che può essere utilizzato per ottenere
profili di ceppi che possono essere facilmente scambiati per via elettronica. MLVA è stata usata
con successo per tipizzare alcune diverse specie batteriche, dimostrando di essere un metodo
eccellente e dotato di alta risoluzione, particolarmente utile per microrganismi con un ridotto livello
di diversità nella sequenza.
Questo nuovo approccio, MLVA Typing, è stato introdotto ed è usato per analizzare il numero di
sequenze ripetute in tandem nel genoma di B. pertussis43,44. Questa tecnica non richiede la coltura
e può essere applicata direttamente a tamponi nasali o faringei. L’analisi Variable-number tandem
repeat (VNTR) ha rivelato una notevole eterogeneità nel genoma di B. pertussis e l'espansione
clonale durante i periodi epidemici.
16S rRNA gene sequencing
Il metodo di identificazione genotipica, 16S rRNA per il sequenziamento del gene è usato per studi
filogenetici ed è stato successivamente riscontrato di essere in grado di ri-classificare i batteri in
specie completamente nuove, o anche in generi. È stato utilizzato anche per descrivere nuove
specie che non sono mai state coltivate con successo.
Questo metodo è stato utilizzato recentemente per l'identificazione accurata delle specie
Bordetella non classiche (cioè non includenti B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica)
come nel primo caso di setticemia a esito infausto causata da Bordetella hinzii45.
La maggiore variazione di mutazione del gene A (ompA) della proteina della membrana esterna
della Bordetella rispetto al gene 16S rRNA permette l'identificazione univoca delle specie non
classiche di Bordetella. Tuttavia, si deve notare che le sequenze del gene 16S rRNA di B.
pertussis, B. parapertussis e B. bronchiseptica sono identiche e pertanto questo metodo non può
essere utilizzato per fornire una identificazione di specie nell’ambito di queste ultime 3 specie.
Questo vale anche per la sequenza ompA di queste 3 specie46
3.6
Conservazione e Invio
Conservare gli isolati puri su agar carbone sangue a becco di clarino per l’invio al Laboratorio di
Riferimento. La coltura su becco di clarino può richiedere alcuni giorni d’incubazione prima di
manifestare una crescita adeguata.
4 Identificazione di specie Bordetella
Il Diagramma Flusso rappresenta solo un’indicazione
5
Refertazione
5.1
Identificazione Presuntiva
Se si riscontrano appropriate caratteristiche di crescita, aspetto della colonia, colorazione Gram
della coltura, prove dell’ossidasi e risultati sierologici.
5.2
Conferma dell’Identificazione
Successiva al referto del Laboratorio di Riferimento.
5.3
Medico Microbiologo
In accordo con i protocolli locali, informare il medico microbiologo di tutti gli isolati con
identificazione preliminare e confermata di B. pertussis or B. parapertussis.
Seguire i protocolli locali per la refertazione al medico del paziente.
5.4
CCDC
Fare riferimento al Memorandum locale di Informazione.
5.5
Public Health England47
Fare riferimento alle linee guida attuali della PHE e alle indicazioni del COSURV
"La pertosse"tosse asinina” è una malattia soggetta a Denuncia, per la gestione della salute
pubblica dei casi, i contatti e le epidemie,e tutti i casi sospetti devono essere immediatamente
denunciati ai locali Public Health England Centers
Tutti gli isolati clinicamente significativi devono essere notificati dai laboratori diagnostici per
garantire l’avvio urgente di procedure corrette.
5.6
Gruppo Controllo Infezione
Informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati presunti o confermati di B. pertussis o B
parapertussis da pazienti degenti in ospedale con identificazione preliminare e confermata. Gli altri
isolati devono essere segnalati al gruppo di controllo delle infezioni secondo le procedure locali,
specialmente se si sospetta un’epidemia.
6
Invio
6.1 Laboratorio di Riferimento
Contattare gli appropriati laboratori nazionale di riferimento per informazioni sugli accertamenti
disponibili, i tempi di risposta, le procedure di trasporto ed altre informazioni riguardanti il’invio del
campione:
Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit
61 Colindale Avenue
London
NW9 5EQ
Contattare il Centralino: Tel. +44 (0) 20 8200 4400
Inghilterra e Galles
https://www.gov.uk/specialist-and-reference-microbiology-laboratory-tests-and-services
Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nord
http://www.belfasttrust.hscni.net/Laboratory-MortuaryServices.htm
7
Notifica al PHE47,48 o Equivalente49-52
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla
Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva, Le denuncie devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici
e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di
alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
perf Human Immunodeficiency Virus (HIV) & Sexually Transmitted Infections (STIs), Healthcare
Associated Infections (HCAIs) and Creutzfeldt–Jakob disease (CJD) da includere nel ‘Notification
Duties of Registered Medical Practitioners’, e non nel ‘Notification Duties of Diagnostic
Laboratories’.
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/our-governance#healthprotection-regulations-2010
Esistono accordi diversi in. Scotland49,50, Wales51 e Northern Ireland52.
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18. European Parliament. UK Standards for Microbiology Investigations (SMIs) use the term "CE marked leak
proof container" to describe containers bearing the CE marking used for the collection and transport of clinical
specimens. The requirements for specimen containers are given in the EU in vitro Diagnostic Medical Devices
Directive (98/79/EC Annex 1 B 2.1) which states: "The design must allow easy handling and, where
necessary, reduce as far as possible contamination of, and leakage from, the device during use and, in the
case of specimen receptacles, the risk of contamination of the specimen. The manufacturing processes must
be appropriate for these purposes".
19. Official Journal of the European Communities. Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the
Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. 7-12-1998. p. 1-37.
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Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno

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