ARRIGONI2016 Latte individuale e di massa

Bologna, 21 settembre 2015
Latte individuale e di massa:
potenzialità analitiche in laboratorio e in campo
Norma Arrigoni
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Sezione di Piacenza
Il latte: uno strumento di
sorveglianza epidemiologica
Vantaggi:
• Campionamento semplice ed economico
Utilizzo:
• Valutazione di rischi sanitari collegati alla sanità animale e/o alla salubrità
degli alimenti
• Indicazioni per azioni di gestione sanitaria degli allevamenti
• Indicazioni ai fini dell’uso prudente del farmaco
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Il latte: uno strumento di
sorveglianza epidemiologica
RICERCHE
ANTICORPALI
RICERCHE MICROBIOLOGICHE/PCR
RICERCHE CHIMICHE
Microrganismi indicatori
(CBT, coliformi, PIC, LPC)
Brucellosi
LEB
IBR
BVD
Paratubercolosi
Neospora
Salmonella spp
Listeria monocytogenes
Campylobacter jejuni
VTEC
Sostanze inibenti
Aflatossine M1
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Mycoplasma bovis
Prototheca zopfi
PCB
Pesticidi
Metalli pesanti
Trattamenti illeciti
(Cortisonici, Isoniazide)
M.avium sp. paratuberculosis
BVD
Febbre Q??
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IBR anticorpi
(fonte Dr.M.Boldini, IZSLER CR)
• Si utilizza per la sorveglianza in Lombardia (frequenza semestrale)
• Tutti i focolai sono stati identificati grazie alla sorveglianza su latte di massa
Target
Test
Espressione del
risultato
Anticorpi Totali
ELISA anticorpi (Kit IZS BS)
POS (S/P) O NEG
Anticorpi vs. gE
KIT IDEXX
POS O NEG
Anticorpi Totali
Anticorpi vs. gE
Situazione di allevamento
POS
POS
INFETTO
POS
NEG
Sieronegativo con capi in lattazione vaccinati
NEG
NEG
Sieronegativo con capi in lattazione non vaccinati
Da abbinare ad un controllo degli animali in ingresso
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BVD Anticorpi
• Ab NS 2-3 (vs. proteine non strutturali, prodotte durante la replicazione virale)
• Allevamenti
• non vaccinati o vaccinati con vaccini spenti
• che non introducono animali sieropositivi
• che hanno eliminato l’ultimo PI da almeno 3-4 anni
Esempi:
• Stalla mai vaccinata con S/P elevato (>1): probabile presenza PI nelle vacche
• Vado a cercare il PI nelle vacche e a verificare la presenza di PI nella rimonta
• Campione di 10 soggetti di 7-15 mesi
• Non vaccinati o vaccinati con spento/vivo TS
• Se sieropositività>70%: rischio presenza PI
• Risano e vaccino
• Stalla mai vaccinata con S/P basso <0.8: probabile circolazione virale senza PI
• Vaccino subito (circolazione virale in mandria scoperta!!!)
• Frequenza consigliata: trimestrale (da bimestrale a semestrale)
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BVD virus (PCR)
• Utile a ridurre i costi della ricerca dei PI nelle vacche
• Molto sensibile (individua 1 vacca su >200)
• In caso di positività: approfondimento con test in pool e individuali
• Ripetere il controllo dall’animale PCR+ dopo 3-4 settimane
• Se uso vaccino vivo: attendere 3 settimane dopo la vaccinazione
• In situazione epidemiologica nota (test precedenti sempre negativi):
controllo le primipare
• Non congelare! (Si utilizza la frazione cellulare dopo centrifugazione)
• Frequenza consigliata: trimestrale (da bimestrale a semestrale)
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Paratubercolosi anticorpi
• Malattia né a rapida, né ad elevata sieroconversione!
Studio di 1 anno:
• 8 campioni di latte di massa (BTM)
• 5 campionamenti di latte individuale da
tutti i capi dell’allevamento
Correlazione tra S/P BTM e prevalenza:
altamente significativa, ma che
incertezza!!
• La sensibilità del test nel rilevare gli allevamenti infetti varia:
• in funzione della prevalenza di animali infetti in allevamento
• in funzione del numero di campioni prelevati
(ma solo il 25% dei campioni era positivo per più di 2 volte su 8 !!)
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ELISA latte massa
PCR filtro
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ELISA+PCR filtro
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Paratubercolosi:
PCR SU LATTE DI MASSA
• I test attualmente in uso hanno limiti di rilevabilità (LOD 15 cellule/ml) non
adeguati a rilevare bassi livelli di contaminazione
• Dato che la pastorizzazione viene ritenuta in grado di abbattere almeno 4-7
logaritmi di MAP, la PCR può verificare il livello di rischio del latte alla stalla
(probabilità di sopravvivenza alla pastorizzazione).
• Il controllo sporadico sul prodotto finito ha però limitate capacità nel rilevare la
presenza dell’infezione in allevamento e nel limitare la contaminazione della
catena alimentare.
• Scarsa correlazione con la sieroprevalenza intra-aziendale
• Probabilmente correlato a:
• Presenza di animali ad alta escrezione (con o senza forma clinica)
• Igiene dell’allevamento (Hygienic score)
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Neospora Anticorpi
624 allevamenti: 55% BTM+
• Infezione molto diffusa (50% circa degli allevamenti BTM+)
• Bovine siero+: rischio di trasmissione 80-95% e rischio aborto 2-3 volte > bovine siero• Sensibilità: 47-61% ; Specificità 92-94% (Bartels, 2005)
• Limite di rilevabilità: prevalenza > 10-15% (se Prev.15%: VPN:86%)
• Mobilizzazione tachizoiti a 3-4 mesi di gravidanza: siero+ ELISA da BTM: utile per
verificare la presenza di animali siero+
• Se BTM+: testare gli animali oltre i 3-4 mesi di gravidanza (immunità di breve durata)
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Febbre Q: PCR
• Zoonosi. Sintomi nell’uomo: mal di testa, febbre, dolori muscolari, polmonite,
endocardite, epatite, aborto
• In presenza del caso umano: applicazione dell’art.142 del RPV
• isolamento animali infetti, distruzione feti e invogli fetali, obbligo trattamento termico risanatore sul latte (sia
per consumo umano che animale), stagionatura almeno 30 giorni, lotta alle zecche, isolamento e cura cani infetti
• Negli animali generalmente asintomatica (nei ruminanti infertilità, metrite, rar. aborto)
• Coxiella escreta con il latte per periodi prolungati, fino a 32 mesi (Angelakis, 2010)
• In presenza di PCR+ da BTM senza sintomi clinici: quale intervento???
• In presenza di PCR+ da BTM e quadro clinico concomitante: opportuno un
approfondimento: sierologia e PCR da tamponi cervicali di capi sospetti
• Utilità del latte di massa????
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Contagiosi: IMI
Conte elevate per tutti i germi:
mungitrice e/o frigorifero
Klebiella/Serratia: IMI, lettiera
Pseudomonas: IMI, acqua
Streptococchi ambientali/Coliformi:
Lettiera, IMI
Stafilococchi coagulasi negativi:
dipping
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Prelievo per indagini microbiologiche o PCR
• Prelievo manuale con attrezzature sterili
• Dalla superficie della massa dopo agitazione
• Non dal rubinetto (inquinamento)!
• Non con il lattoprelevatore automatico (trascinamento!)
Per analisi per SCC, aflatossine, anticorpi
non è influente la sterilità, né il trascinamento
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Patogeni contagiosi mammari
• 4 principali: Streptococcus agalactiae, S.aureus, Mycoplasma bovis, Prototheca sp.
• Utilità dell’analisi su BTM:
• di routine, abbinato al monitoraggio delle mastiti cliniche
• in allevamenti infetti in corso di risanamento (monitorare eventuale reinfezione di gruppi)
• in caso di acquisto di animali da allevamenti di stato sanitario sconosciuto
• Frequenza controllo per allevamenti chiusi
• STAG: utile per allevamenti risanati fino a che hanno partorito tutte le vitelle che hanno
bevuto latte contaminato (almeno 2 anni dopo)
• SAU, Prototheca e Mycoplasma: ripetere regolarmente (infezioni che insorgono/riemergono
anche in assenza di introduzione di animali) almeno 4 volte l’anno (preferibilmente mensile)
• Frequenza controllo per allevamenti che introducono regolarmente:
• Tutti i patogeni almeno 2 volte al mese
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Indagine 2015 in provincia di Piacenza:
patogeni contagiosi nel latte di massa
• Doppio campionamento di tutte le aziende da latte del territorio:
• primavera 2015 (n=303 allevamenti)
• autunno 2015 (n=296 allevamenti)
• Prelievo contestuale con monitoraggio Brucellosi e Leucosi
• direttamente dalla cisterna dopo accurata agitazione della massa
• senza aggiunta di conservante
• Analisi microbiologica per ricerca di:
• Staphylococcus aureus (terreno BP-RPF)
• Streptococcus agalactiae (terreno TKT)
• Prototheca sp (terreno PIM)
• Mycoplasma bovis (terreno PPLO)
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Indagine 2015 sul latte di massa delle
aziende in provincia di Piacenza: risultati
%
39,7
40
35
30
29,4
27,4
25
S.aureus
20
15
10
5
Prototheca
10,9
5,0
1,3
0
Mycoplasma
6,4
6,7
3
0,7
1 campione
S.agalactiae
13,7
2 campione
2
totale
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Patogeni contagiosi mammari
• Sensibilità (terreni selettivi e volume inoculo almeno 0,1 - 0,2 ml):
• BUONA per S.agalactiae e Prototheca (eliminati in numero elevato)
• BASSA per S.aureus (>5% prevalenza)
• PER MIGLIORARLA: PRELIEVO RIPETUTO DA PIU’ GIORNI
• Talvolta la presenza di patogeni (Streptococchi e Prototheca)
causa un aumento di carica batterica:
• chiedere al laboratorio la caratterizzazione della carica batterica
• Dato quantitativo (UFC) rilevante
• correlato al numero di capi infetti
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Indagine 2015 patogeni sul latte di massa: S.aureus
distribuzione di frequenza allevamenti in base alle UFC
N.Allevamenti
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Conteggio di UFC di Staphilococcus aureus nel latte di massa
come dato predittivo del livello d’infezione intra-allevamento
Bertocchi L. et all., XII Congresso Nazionale SIDILV, Genova, 27-29 ottobre 2010
14
12
10
8
6
2 allevamenti
> 1500 UFC/ml
4
2
0
UFC/ml
55% degli allevamenti a bassa prevalenza (<100 UFC/ml)
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Indagine 2015: S.aureus su latte di massa
Approfondimento relativo a MRSA
•
•
•
9 aziende/300 (3%) positive per MRSA
Tutte le aziende sono di dimensioni medie o grandi (> scambi di animali)
Basso conteggio di UFC (<10 UFC/ml): bassa prevalenza
•
•
•
attuare sistemi di monitoraggio su latte di massa
attuare piani di controllo vs. S.aureus negli allevamenti infetti
intervenire in allevamenti positivi per MRSA con piani mirati (campionamento su capi singoli,
ambiente e personale di stalla)
Data la rilevanza per l’uomo, la sporadicità dell’infezione mammaria nel bovino e la resistenza
al trattamento antibiotico, è consigliabile l’eliminazione dei capi infetti
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Ricerca patogeni contagiosi: PCR
• Kit in-house (con prearricchimento)
• Kit del commercio
• 3 patogeni contagiosi (S.aureus, S.agalactiae, Mycoplasma)
• 12 patogeni (solo batteri) ambientali e contagiosi, gene di R al penicillina
• 16 patogeni ambientali e contagiosi, inclusi Mycoplasma bovis e spp, Lieviti, Prototheca, gene R a penicillina
• VANTAGGI
• Tempi rapidi (senza arricchimento: 1 giorno invece di 2-7 gg)
• Sensibilità superiore alla coltura per allevamenti a bassa prevalenza (volume di
inoculo 0,35 ml vs. 0,1 ml coltura)
• SVANTAGGI
• Costo 7-8 volte superiore alla coltura (proponibile solo su latte di massa)
• Rileva anche batteri morti (DNA nei macrofagi per settimane in infezioni risolte)
• Non permette una valutazione delle modalità di prelievo
• Se il prelievo non è sterile: valutazione semi-quantitativa (+/++/+++/++++) per
distinguere i veri positivi (MA: come distinguo i deboli + veri dai falsi + per carry over?)
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Utilizzo prudente dell’antibiotico
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Stima della probabilità di guarigione
batteriologica in base all’eziologia e alla
durata della terapia i.m. di mastiti cliniche in
bovine primipare e pluripare
Guarigione batteriologica %
Durata della terapia
(giorni)
Primipare
Pluripare
S.aureus
0
2
5
8
5
15
25
40
0
10
20
35
Gillespie 2002
Deluyker 2005
Oliver 2004
Streptococchi ambientali
0
2
5
8
30
60
70
80
25
55
65
75
Morin 1998
Deluyker 2005
Hoe 2005
McDougall 2007
CNS
0
2
5
8
60
75
80
85
55
70
75
80
Oliver 2004, Hoe 2005,
McDougall 2007,
Van den Borne 2010
E.Coli
0
2
5
8
80
90
90
90
75
85
85
85
Wilson 1999
McDougall 2007
Bradley 2009
Van den Borne 2010,
Suojala 2010
Klebsiella
0
2
5
8
40
50
50
50
35
45
45
45
Smith 1985
Pyorala 1998
Roberson 2004
Hoe 2005
Eziologia
Negativo
Nel
0
2
25-40%
5
8
dei casi
Fonte bibliografica
90
95
90
95
Roberson 2004
di mastite
risulta negativo
Pinzon-Sanchez
2010
90
95 clinica l’esame batteriologico
90
95
(dati National Mastitis Council)
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Dati IZSLER 2012: Percentuali di isolamento
da 22.800 analisi da sospette mastiti cliniche
Ci sono spazi per la riduzione del consumo dei
farmaci se si tratta su base eziologica
Roberson, VCNA 2003: “La terapia antibiotica non è
giustificata per almeno il 50% dei casi di mastite”
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Vantaggi potenziali della terapia mirata
• Riduzione delle spese/costi per le terapie (farmaci, latte scartato)
• Riduzione dei rischi di residui nel latte
• Riduzione del rischio di AMR
• Miglioramento dell’efficacia della terapia mirata
• Necessità di un esito in 18-24 ore
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On farm culture
• Prelievo sterile
• Semina
• su terreni selettivi
• con tampone (1 campione/piastra)
• al Bunsen
• Incubazione capovolta a 37 °C per 18-24 ore
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Diagnosi on farm
NECESSARIO
• Prelievo in doppio per validazione dei dati di campo attraverso il confronto con
i risultati del laboratorio:
• sistematicamente nelle fasi iniziali,
• a campione nelle fasi successive
Sperimentazione nell’ambito del PSR RER 2016-2018
“Approccio integrato per ridurre il consumo di antibiotici nella produzione del
latte destinato alla produzione di formaggi DOP Regionali, contribuendo a
diminuire il rischio di insorgenza dei fenomeni di antibiotico-resistenza”
• Valutazione periodica dati di consumo di farmaci
• Stesura linee guida per utilizzo responsabile
• Applicazione strumenti innovativi per la riduzione del consumo (inclusa OFC)
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The role of veterinarians in udder health programs
(Ruegg P., Proc. 29th WBC 2016)
Potential components of an annual udder health monitoring plan
•
•
•
•
•
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Lavorare in team
Utilizzare indicatori e risultati dei test
Fissare obiettivi
Assegnare compiti e responsabilità
Valutare periodicamente i risultati
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Grazie per l’attenzione
Norma Arrigoni
IZSLER Sez. Piacenza
[email protected]
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