k I - Spiro
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k I - Spiro
Tecniche di super-risoluzione . (F)PALM – STORM – PALMIRA – 3D STORM Schema dei contenti - Rivelazione di una singola molecola fluorescente - Proteine fluorescenti fotoattivabili - Tecniche stocastiche di super-risoluzione: sincrona (FPALM e STORM) asincrona (PALMIRA) con presentazione di alcuni risultati per ciascuna tecnica - Nuove frontiere: 3D-STORM intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Rivelazione di una singola molecola fluorescente Determinazione del centroide e del rms generato dalla radiazione emessa da una singola molecola fluorescente y Minimizzazione di1 χ 2 ( x) = ∑ ( n − N ( x)) i σ i 2 i 2 i ni: # fotoni contati nella cella i-esima a ni Ni(x): # fotoni attesi dalla cella i-esima generati dalla molecola posta in x σi2 = Ni(x) + b2 x (distrib. Poisson: molti fotoni incidenti con una piccola sez. d’urto di rivelazione) piano oggetto b: background (fotoni per cella; viene assunto costante) dχ =0 dx 2 ∆x ≃ − espans. Ni(x)-Ni(x0)≈0 ' 2 ∆ n N σ ∑ i i i i ' 2 N σ ∑ i i i Ni’(x): derivata di Ni(x) calcolata in x0 ∆ni = Ni(x0) - ni 1: trattazione solo lungo l’asse x; analogamente per l’asse y ( ∆x ) 2 = 1 ∑ Ni' σ i2 i intro Super resolution Assumendo che ( ∆x ) 2 PA-FPs Ni = N e s 2π (F)PALM/STORM − i2 2 s2 e sostituendo PALMIRA ∑ → ∫ di 3D-STORM si ottiene i s 2 + a 2 12 (se σi2 = Ni(x)) rumore statistico N = 4 π s 3b 2 aN 2 (se σi2 = b2 ) rumore di background che generalizzato a due dimensioni con Ni, j = N e s 2π − i2 + j2 2 s2 a 2 12 e aggiunto il termine statistico dovuto alla distribuzione uniforme N ( ∆x ) 2 s ≃ R0 = s + a 12 8π s b = + 2 2 N a N 2 0.61λ0 NA 2 4 2 - N (# fotoni raccolti) deve essere il più grande possibile - b deve essere il più piccolo possibile - occorre trovare il giusto rapporto a/s s: rms della distribuzione dello spot (riportato nel piano oggetto) generato dal sistema ottico che focalizza la molecola fluorescente intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Limiti della trattazione a 2 12 è necessario aggiungerlo a posteriori N 2 - introduzione errore costante (-10% su ( ∆x ) ) dovuto al calcolo infinitesimale - il rumore statistico ∑ → ∫ di i - errore (scelta volta alla velocizzazione del fit) nell’approssimazione Ni , j = − N e s 2π i2 + j2 2 s2 Linea: teoria Linea tratteggiata: simulazione Cerchi: dati b=0.7 fotoni s=208nm a=130nm Linea: teoria Il primo grafico mostra che esiste uno scarto del 30% tra la teoria e i dati raccolti Il secondo grafico mostra che esiste un valore ottimale per il rapporto a/s a 96π b = N s 4 Linea tratteggiata: teoria + 30% Cerchi: simulazione N=100 Thompson et al., Biophys. J. 82, 2775 (2002) Se a>>s (gli N fotoni sono in gran parte contenuti in un unico pixel) la simulazione diverge dalla teoria; 2 ( ∆x ) dovrebbe tendere ad a 2 12 (indipendente da N) 2 intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Problemi e limiti dei microscopi a fluorescenza convenzionali Per quanto visto fino ad ora, una singola molecola fluorescente può essere localizzata con precisione arbitraria, dipendente solo da N, b, a/s L’osservazione di un campione richiede però la localizzazione di un gran numero di molecole fluorescenti. Problemi da affrontare - Axial blurring - Limite di diffrazione http://www.olympusfluoview.com/theory/confocalintro.html Confocale: risolve il problema dell’axial blurring PSF: ∆x,∆y ≈ 200nm ∆z ≈ 500nm 4Pi: miglioramento del limite di diffrazione lungo z PSF: ∆x,∆y ≈ 200nm ∆z ≈ 80-150nm Hell, S.W., Science 316, 1153-1158 (2007) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Superamento del limite di diffrazione Problema: due molecole fluorescenti adiacenti, distanti meno di 0.61λ0/NA non sono risolvibili se fatte fluorescere contemporaneamente Soluzione: occorre che le due molecole non fluorescano contemporaneamente d< A1 0.61λ0 NA A2 Si considerino due stati, A e B, nei quali una molecola fluorescente può trovarsi AB transiz. fotoinducibile kAB= IσAB BA transiz. che può avvenire in ogni modo kBA= E + kBAsp + IσABab agenti esterni spontanea indotta da I NA, NB : # di molecole, normalizzato, in A o B dN A dN = − N A k AB + N B k BA = − B dt dt N A + NB = 1 Hell, S.W., Phys. Lett. 326, 140-145 (2004) intro Super resolution PA-FPs k BA 1 N A∞ = N A ( t → ∞ ) = = k AB + k BA 1 + I I sat (F)PALM/STORM con I sat ≡ PALMIRA k BAspont σ AB = 3D-STORM 1 σ ABτ B N A∞ E’ importante osservare che se I>>Isat allora ∞ I I sat N Sfruttando la relazione non lineare tra A e N A∞ → 0 è possibile superare il limite di diffrazione di Abbe. Si consideri un profilo di intensità del tipo I ( x ) = f ( x ) I max Se I(x) = 0 per certi x, allora in tali punti N A∞ = 1 ∞ L’idea è quella di creare un profilo I(x) tale che la regione in cui N A = 1 sia sufficientemente piccola. intro Super resolution Se ad esempio PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM 2π x f ( x ) = sin 2 λ AB allora la FWHM della regione all’interno della quale le molecole si trovano nello stato A, circondate da molecole nello stato B, è Hell, S.W., Phys. Lett. 326, 140-145 (2004) 1 ∆x ≃ arcsin 2 NA 1 + I max I sat λAB e se λAB 1 ≃ 2 NA 1 + I max I sat I max I sat ≫ 1 allora ∆x → 0 Si osserva inoltre che se Imax=0 (transizione spontanea) si ottiene il noto limite di diffrazione di Abbe NB: questo meccanismo di localizzazione delle molecole entro ∆x non è diffracion limited intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Problema: la richiesta Imax >> Isat impone delle intensità eccessive con le quali illuminare il campione. Ad esempio: fluorescina τ fluorescina = 1 k BAspont ≈ 4 ⋅10−9 s σ ( 488nm ) = 3 ⋅10−16 cm2 ⇒ I sat 1 W = = 3.4 ⋅10 τσ cm 2 I max I sat > 10 Con la tecnica STED si è arrivati ad un fattore ma per spingersi a valori ancora più elevati non si può aumentare eccessivamente Imax, quanto piuttosto occorre ridurre Isat occorre aumentare τ 5 intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Esempio: GSD (Ground State Depletion) sfrutta il livello T1 per incrementare τ 103 ns < 1 spont k BA < 106 ns ⇒ I sat = 10 ÷ 104 W cm 2 Con la tecnica GSD si riduce Imax anche di 104 volte, a parità di risoluzione, rispetto a STED Hell, S.W., Science 316, 1153-1158 (2007) La situazione ideale è quella nella quale gli stati A e B sono stabili, e quindi ben controllabili (Isat0) proteine fluorescenti fotoattivabili Le PA-FPs sono degli oggetti estremamente non lineari, in quanto funzionano come degli interruttori on-off intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Proteine fluorescenti fotoattivabili (PA-FPs) Proteine aventi la capacità di modificare le loro proprietà fluorescenti se illuminate con una particolare radiazione. Il cambiamento delle proprietà fluorescenti può essere reversibile PA-GFP KAEDE assorb max: 400nm emiss max: 515nm attivazione: UV-violetto (irreversibile) assorb max: 508nm assorb max: 504nm emiss max: 517nm assorb max: 572nm emiss max: 518nm attivazione: UV-violetto (irreversibile) emiss max: 580nm Spetto di emissione di PA-GFPs prima (B) durante (C) e dopo (D) l’attivazione (405nm laser) sotto la illuminazione di un laser Ar+ (488nm) (Hess et al., Biophys J 91:4258–4272 (2006)) Lukyanov et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:885–891 (2005) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM PA-FPs disattivabili Coppia di molecole legate tramite un segmento di DNA o un anticorpo: un fluoroforo e un cromoforo (rispettivamente Cy5 e Cy3 in figura (a)) Cy5: molecola fluorescente il cui dark state è lo stato di tripletto (τtripl~100ms) Il cromoforo Cy3 modifica le proprietà fluorescenti di Cy5 in funzione della distanza R (fig (a) e (b)): si crea un nuovo dark state particolarmente stabile (τoff~1hour). La nuova molecola fotoattivabile è in grado di essere attivata e disattivata centinaia di volte prima del bleaching. I grafici in basso mostrano il meccanismo di accensione e spegnimento della molecola Cy5/DNA/Cy3 - un laser verde (532 nm) attiva le molecole del campione per un certo periodo di tempo - un laser rosso (638 nm) fa fluorescere le molecole attivate e le disattiva - se il laser verde non attiva le molecole, non si osserva fluorescenza Bates et al., Phys. Rev. Lett. 94, 108101 (2005) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Oltre alla coppia Cy3-Cy5, è possibile creare molte molecole fotoattivabili e disattivabili tramite la combinazione, per mezzo di un segmento di DNA o un anticorpo, di un fluoroforo e di un cromoforo. Fluorofori: Cy5, Cy5.5, Cy7, Alexa647 Cromofori: Cy2, Cy3, Alexa405 Esempio: Cy2/Cy5 e Cy3/Cy5 hanno entrambe un picco di emissione fluorescente a ~650nm, ma è possibile distinguerle (assegnando al centroide dello spot rivelato un certo colore: fig A-C) poiché hanno differenti spettri di attivazione. Multicolor-STORM applicata a tre differenti molecole legate ad un filamento di DNA Bates et al., Science 317, 1749–1753 (2007) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM PA-FPs: rates di attivazione, disattivazione e photobleaching kAΦA+k0+kxΦRA NI kBC+kDΦD kxΦB NA NB NI, NA, NB: numero di molecole Inattivate, Attivate, Bleached ka, k0: rate di attivazione, attivazione spontanea kx: rate di diseccitazione delle molecole attivate kBC: rate di disattivazione spontanea kD: rate di disattivazione indotta dal read out laser ΦA: rendimento del processo di attivazione ΦRA: rendimento del processo di attivazione dovuto al readout laser ΦB: rendimento del processo di photobleaching ΦD: rendimento del processo di disattivazione indotta dalla radiazione dN I = − N I ( k AΦ A + k0 + k x Φ RA ) + N A ( k BC + k D Φ D ) dt dN A = − N A ( k BC + k D Φ D + k x Φ B ) + N I ( k AΦ A + k0 + k x Φ RA ) dt dN B = N AkxΦ B dt NI + N A + NB = C intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM kAΦA+k0+kxΦRA NI kBC+kDΦD PALMIRA 3D-STORM kxΦB NA NB Date le equazioni precedenti si vuole determinare il rapporto tra NI ed NA ottimale, e successivamente anche il massimo NA ottenibile in una sola immagine, per poter acquisire delle immagini che diano informazioni sulla distribuzione spaziale delle PAFPs con una risoluzione migliore rispetto al limite di Abbe È possibile scegliere kx e kA in modo tale che da cui N A = NI k AΦ A + k0 + k x Φ RA ≪ NI k BC + k x Φ B + k D Φ D N A ≪ NI e dN A =0 dt Condizione non necessaria, ma utile per ottenere un’espressione per NA/NI Affinché sia possibile distinguere le PAFPs con una risoluzione migliore del limite di Abbe occorre che esse siano attivate ed eccitate in un numero sufficientemente piccolo, precisamente S ≫ R0 2 + 4 Dtm NA S: area illuminata dal laser di attivazione R0 = 0.61λ0 NA D: coefficiente di diffusione (se la molecola alla quale la PAFP è legata è fissata, allora D = 0 µ m 2 s ) 4Dtm: area potenzialmente spaziabile dalla PAFP durante il tempo tm di acquisizione del frame E’ possibile scegliere S = β ( R0 2 + 4 Dtm ) con β=16 NA intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Un esempio: stima di NA e di tm necessari per la visualizzazione di PA-GFPs fissate (D=0µm2/s) con una risoluzione di 80 nm Nota: per poter parlare di risoluzione di 80 nm occorre che le molecole distino tra loro meno di tale distanza. In questo esempio si impone che σx = σy = 80 nm Si suppone che NPA-GFPs = 100 su di un’area 80 nm x 80 nm se STOT = 10 µm x 10 µm allora NTOT=1.56 106 molecole Supponendo che solo il 10% delle molecole ricopra un’area interessante del campione S = 10 µm2 N=1.56 105 molecole Ricordando la richiesta D=0µm2/s S S NA ≪ 2 = 2 R0 + 4 Dtm R0 N 1.56 ⋅105 = = 1.76 ⋅104 NA 9 ⇒ S 10µ m 2 NA = = =9 β R0 2 16 ⋅ ( 0.263µ m )2 # frames da acquisire Parametri: b=1.02 photons/pixel a=0.121 µm R0=0.263 µm s 2 + a 2 12 8π s 4b 2 + 2 2 ⇒ Nγ = 48.4 # fotoni rivelati per molecola ( ∆x ) = 80nm = Nγ a Nγ Nγ Nγ 48.4 γ molec Se Iread-out<Isat allora = = = 0.0121 s frame emiss ( rivelati ) k PA Φ Φ I 4000 s ⋅ molec σ λ γ ( ) −GFP DET FL ( RA ) RA ms tTOT = 0.0121 ⋅1.73 ⋅104 frames = 209.3s frame 2 intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Un esempio: immagine di una goccia di PA-GFP Sovrapposizione delle immagini di una goccia di soluto contenente PA-GFPs ottenute con le tecniche di microscopia wide-field (macchie verdi) e FPALM (punti gialli) (Hess et al., Biophys J 91:4258–4272 (2006)) All’aumentare del numero di frames acquisiti, il numero di fotoni per frame diminuisce esponenzialmente a causa del photobleaching delle molecole già visualizzate intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Proprietà che le PAFPs devono avere per poter essere sfruttare nelle tecniche di super-risoluzione (F)PALM/STORM o PALMIRA kAΦA+k0+kxΦRA NI kBC+kDΦD kxΦB NA NB 1) kx ΦB >> kBC + kD ΦD ((F)PALM/STORM - sincrono) kx ΦB << kBC + kD ΦD (PALMIRA - asincrono) kA ΦA + kx ΦRA >> k0 k Φ +k +k Φ 2) kx ΦB + kBC + kD ΦD >> kA ΦA + kx ΦRA + k0 N A = N I A A 0 x RA ≪ N I k BC + k x Φ B + k D Φ D 3) N >>1 : # fotoni acquisiti il più grande possibile 4) b≈0 GFP 5) ΦB piccolo ma non nullo tlifetime = 2.11ns ΦA , ΦFL ≈ 1 1 γ k BC = GFP = 4.74 ⋅108 ≈ 0 ((F)PALM/STORM - sincrono) tlifetime s ΦRA = k BC W γ I sat = = 7.13 ⋅1024 2 = 2.805 ⋅106 2 > 0 (PALMIRA - asincrono) cm s cm σ ( λRA ) NB: la condizione 3) è molto importante. Il rate di fotoni rivealti è (con IRA<Isat) kemiss = Φ DET Φ FLσ ( λRA ) I RA e nel caso di PA-GFP, con un readout laser di intensità 64W/cm2 sul campione, con ΦFL=0.79, ΦDET=0.05 e con σ(λRA=504nm) = 6.65·10-17cm2 (hν=2.46 eV) si ottiene circa emiss ( rivelati ) k PA = 4000 photons ( s ⋅ molec ) − GFP intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM PA-FP Caratteristiche (extinction coefficient, cross section, lungh d’onda d’attivazione, eccitazione ed emissione, …) delle PA-FPs che verranno usate nelle tecniche (F)PALM/STORM e PALMIRA λattiv [nm] λeccit [nm] λemis [nm] ΦFL ε(λeccit) [l/M·cm] η (I<Isat) [phot/s·molec] Cy2 -- 489 506 0.12 150000 ? Cy3 -- 550 570 0.04 150000 ? Cy5 -- 649 670 0.28 250000 ? Alexa 405 -- 401 421 34000 ? Alexa 647 -- 652 668 0.33 237000 ? PA-GFP UV-viola 504 517 0.79 17400 4000 Kaede UV-viola 572 580 0.33 60400 ? Cy3/Cy5 verde 649 670 0.28 250000 ? Cy3/Alexa 647 verde 652 668 0.33 237000 ? Cy2/Alexa 647 blu 652 668 0.33 237000 ? Alexa 405/Cy5 viola 649 670 0.28 250000 ? rsFastLime 384 496 522 0.68 125000 ? Nota: il rate di attivazione delle molecole del tipo Cy3/Cy5, ecc … dipende anche dalla distanza R intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM (F)PALM / STORM Le due tecniche sono molto simili, poiché sfruttano entrambe il principio secondo il quale attivando ed osservando poche molecole per volta è possibile localizzarle con una risoluzione piccola a piacere. Le due tecniche si distinguono per i tipi di fluorofori utilizzati (disattivabili nel caso di STORM) - Activation: un laser di attivazione a bassa potenza illumina un’area del campione attivando un certo numero di molecole NA - Readout: le molecole attivate vengono fatte fluorescere tramite un secondo laser (segue il photobleaching o la disattivazione) - Registrazione e localizzazione: tramite una Camera si localizzano gli “spot” di ciascuna molecola e ad ognuno si assegna un centroide ed uno scarto quadratico medio - Ciclizzazione delle fasi di attivazione e di readout tramite uno shutter (S) (Hess et al., Biophys J 91:4258–4272 (2006)) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM (F)PALM (Fluorescence) Photoactivation Localization Microscopy FPALM: Hess et al., Biophys J 91:4258–4272 (2006) Microscopio: Olympus IX71 (inverted microscope) Activation: 405 nm (7.3 W/cm2 sul campione) (impulso di 10s) Readout: Ar+ laser (64 W/cm2 sul campione) (illuminazione continua) 24.8% @ 476.5nm 72.0% @ 496.5nm 3.2% @ <470nm Acquisizione: 400 frames da 1 s ciascuno (una sola attivazione) totale: 400 s (48746 molecole su 33µm x 33µm) Fluoroforo: FA-GFP Si introduce una soglia (ad es. 30γ/pixel/frame) per distinguere le molecole fluorescenti dal fondo: soluzione al problema dell axial blurring Costruzione dell’immagine: - se un pixel di un frame supera la soglia allora viene centrato in una regione di interesse di dimensioni 7px x 7px - se due regioni di interesse si sovrappongono allora vengono scartate - se il massimo di un evento si verifica nello stesso pixel in frames successivi, allora tutti gli eventi aventi il massimo in quel pixel vengono sommati tra loro - viene fatto un fit gaussiano della regione di interesse Sovrapposizione delle immagini di una goccia di soluto contenente PA-GFPs ottenute con le tecniche di microscopia wide-field (macchie verdi) e FPALM (punti gialli) (Hess et al., Biophys J 91:4258–4272 (2006)) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA PALM: Betzig et al., Science 313, 1642–1645 (2006) Microscopio: Olympus Fluoview FV1000 (fluor. microscope) + TIRF Activation: 405 nm (12.7 W/cm2 sul campione) (impulso di 0.11.0s) Readout: Ar+ laser (51 W/cm2 sul campione) (illuminazione continua) 24.8% @ 476.5nm 72.0% @ 496.5nm 3.2% @ <470nm Acquisizione: 20 frames da 0.5 s ciascuno (per 1000 attivazioni) totale: 10000 s (10858 molecole su 7.2µm x 7.2µm) Fluoroforo: KAEDE 3D-STORM Crescita esponenziale per compensare il numero sdi molecole disattivate permanentemente Le PA-FPs utilizzate nella tecnica (F)PALM non sono disattivabili: una volta attivate le si fa fluorescere fino al photobleaching Per massimizzare Nγ occorre che ΦB sia piccolo, quindi il rate di photobleaching kxΦB = IRAσ(λRA)ΦB deve essere piccolo, ma non nullo: compromesso tra risoluzione e tempo di acquisizione Proteina CD63 evidenziata con PA-FPs KAEDE. Confronto fra TIRF convenzionale (A) e PALM (B) (Betzig et al., Science 313, 1642–1645 (2006)) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM STORM Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy Apparato strumentale identico a quello della tecnica (F)PALM Molecole in genere utilizzate per la tecnica - Cy3/Cy5 - Cy3/Alexa647 - Cy2/Cy5 - Alexa405/Cy5 -… Attivabili e disattivabili centinaia di volte prima che raggiungano un dark state irreversibile. Localizzazione ripetuta della stessa molecola e media del cluster ottenuto (v. figure) In alto: due molecole Cy3/Cy5 legate direttamente ad una catena di DNA. A fianco: DNA ricoperto da RecA, sul quale sono legati anticorpi trasportanti molecole Cy3/Cy5. M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang, Nature Methods 3, 793-795 (2006) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM STORM: Rust, et al., Nature Methods 3, 793-795 (2006) Microscopio: Olympus IX71 (inverted microscope) TIRFM Activation: Nd:YAG laser (532nm) (1 W/cm2 sul campione) impulso <0.1s (un impulso ogni 5s, per 60 volte) Readout: He-Ne laser (633 nm) (30 W/cm2 sul campione) illuminazione continua Acquisizione: 50 frames da 0.1 s ciascuno (per 60 attivazioni) totale: 300 s Fluoroforo: Cy3/Cy5 300nm Costruzione dell’immagine finale: - fit dello spot di ciascun frame con una gaussiana 2D ellissoidale: se σx e σy - se i due differiscono di più del 15% allora il fit viene scartato - se il fit contiene meno di 2000 fotoelettroni allora viene scartato - ciascun cluster (centroidi contenuti nello stesso pixel) di punti ottenuti viene infine mediato con un fit gaussiano pesato Localizzazione di molecole fluorescenti Cy3/Cy5, tramite TIRFM (in alto) e STORM (in basso), trasportate da anticorpi legati a RecA, il quale ricopre un catena di DNA Schema della ciclizzazione dei processi di attivazione e radout. In azzurro gli eventi che soddisfano ai requisiti e che vengono utilizzati per formare l’immagine finale intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Multicolor-STORM: Bates et al., Science 317, 1749–1753 (2007) Microscopio: Olympus IX71 (inverted microscope) TIRFM Activation: Ar+ (457nm) - Diode (532nm) illuminazione a impulsi 0.05s (2 µW) Readout: He-Ne laser (633 nm) illuminazione continua (40 mW) Acquisizione: 9 frames da 0.05 s ciascuno (per ogni laser) (20Hz) totale: 100-5000 s Fluorofori: Cy2/A647 – Cy3/A647 Microtubuli (in verde - Cy2/Alexa 647) e vescicole (in rosso - Cy3/Alexa 647) osservate in wide field (A) e con STORM (B e C) localizzate tramite due laser di attivazione (457nm e 532nm) sotto la continua azione di un readout laser (657nm) Bates et al., Science 317, 1749–1753 (2007) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM Problemi STORM e multicolor-STORM Drift del campione durante l’acquisizione. Soluzioni: - microsfere fluorescenti - correlazione tra centroidi adiacenti (un cluster di localizzazioni potrebbe presentare una forma non sferica) Cross-talk. Attivazione del fluoroforo da parte i) del readout laser (633nm) ii) del laser di attivazione sbagliato Soluzioni: - i) si risolve aumentando l’intensità degli activation laser e riducendo l’intensità del readout laser - per risolvere ii) occorrerebbero degli activation laser con lungh. d’onda alle quali un solo fluoroforo è sensibile PALMIRA 3D-STORM intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Considerazioni su (F)PALM/STORM Vantaggi: - tecnica molto semplice dal punto di vista strumentale, quindi costi contenuti per la realizzazione (ad esempio il gruppo di ricerca del prof. Barry (Denver, Colorado) ha modificato un microscopio TIRF della Zeiss aggiungendo i due laser necessari per la tecnica PALM ottenendo uno strumento di nanoscopia a meno di 100 000 dollari) - usando le molecole fluorescenti fotoattivabili è sufficiente un qualsiasi microscopio a fluorescenza per superare il problema dell’axial blurring, perché le molecole attivate non sovrappongono le loro PSFs: è quindi sufficiente una soglia sul numero di fotoni per scartare gli eventi fuori fuoco Svantaggi: - tempi di acquisizione delle immagini molto lunghi (da pochi minuti a qualche ora) quindi necessità di correggere il drift del campione - necessità di far combaciare bene gli spettri di attivazione ed emissione delle PA-FPs con gli spettri dei laser - PA-FPs non puntiformi: questo comporta un errore nella loro localizzazione e anche una possibile interferenza con la dinamica cellulare intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM PALMIRA PALM with indipendently running acquisition PALMIRA: Egner et al., Biophys J., 93(9):3285-90 (2007) Microscopio: Leica DM IRE2 (inverted microscope) Activation e Readout: Ar+ (5.0 kW/cm2) con CF illuminazione continua Acquisizione: continua a 500Hz totale: 140 s (70000 frames) Fluoroforo: rsFastLime (disattivabile) AOTF: acousto-optical tunable filter CF: cleanup filter (488/10) DF: dichroic filter NF e BP: notch (488-25) e bandpass (525/50) filter Un unico laser (in figura Ar+) è responsabile dell’attivazione e dell’eccitazione delle molecole fluorescenti. Elementi molto importanti nel setup sperimentale sono AOTF, CF e DF per regolare lo spettro della radiazione incidente in modo da trovare il giusto compromesso tra i rate di attivazione e di eccitazione per rispettare la condizione N A ≪ 2 S R0 + 4 Dtm Membrana di E. coli Membrana di E. coli osservata con un microscopio convenzionale wide-field (A) e con la tecnica PALMIRA (B) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM Come per (F)PALM, gli eventi che contribuiscono a formare l’immagine finale (B) devono superare una certa soglia (35γ/evento) Correzione all’errore introdotto dal movimento del campione (10 nm in 2’) introducendo delle microsfere fluorescenti rsFastLime λattiv [nm] λeccit [nm] λemis [nm] ΦFL ε(λec) [l/M·cm] 384 496 522 0.68 125000 Spettro di emissione ed assorbimento di rsFastLime Andresen et al., Nature Biotech. 26, 1035–1040 (2008) PALMIRA 3D-STORM PALMIRA Microscopio: Leica DM IRE2 (inverted microscope) Activation e Readout: Ar+ (3.55.0 kW/cm2) con CF illuminazione continua Acquisizione: continua a 500Hz totale: 120 s (60000 frames) Fluoroforo: rsFastLime (disattivabile) Filamenti di α-tubilina osservati con un microscopio wide-field (A) o con la tecnica PALMIRA (B) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Vantaggi PALMIRA - costi per la strumentazione molto contenuti dato che è richiesto un microscopio a fluorescenza commerciale, un solo laser ed un kit di filtri e specchi dicromatici - riduzione dei tempi di acquisizione (2’-3’) - riduzione del background grazie all’elevato frame rate (500Hz): non è necessario utilizzare dei metodi dedicati alla riduzione del background, come ad esempio TIRFM - rsFastLime è reversibile, quindi ha il vantaggio che se in un ciclo off-onoff non emette un numero sufficiente di fotoni, ha ancora altre possibilità per essere rivelata Progetti per il futuro: studio tridimensionale dei campioni con l’utilizzo, ad esempio, di un processo di attivazione a più fotoni intro PA-FPs Super resolution (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM 3D STORM Sfruttando l’astigmatismo introdotto da una lente cilindrica posta dopo l’obiettivo (fig A), è possibile ricavare delle informazioni riguardo alla posizione z della molecola fluorescente osservata (Cy3/A647) Osservando a varie posizioni z una singola molecola fluorescente, si valutano le FWHM lungo le direzioni x ed y del fit gaussiano di ogni 2 “spot” osservato 2 y− y G ( x, y ) = he −2 ( x − x0 ) wx2 −2 ( 0 w2y ) +b Il grafico delle FWHM in funzione della posizione z mostra la distanza tra i due piani di messa a fuoco dovuti all’astigmatismo. L’intersezione delle due curve di calibrazione fissa una posizione di riferimento. Tali curve permettono di stimare la posizione z di ogni “spot” rivelato. La figura C mostra l’applicazione della procedura appena descritta ad una singola molecola fluorescente. Le deviazioni standard lungo le tre direzioni sono 9 nm lungo x, 11 nm lungo y e 22 nm lungo z. B. Huang, W. Wang, M. Bates, X. Zhuang, Science 319, 810-813 (2008) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM 3D STORM: Huang et al., Science 319, 810-813 (2008) Microscopio: Olympus IX71 (inverted microscope) Activation: 532nm (< 2 µW) illuminazione a impulsi 0.05s (2 µW) Readout: 657 nm (~40 mW) illuminazione continua (40 mW) Acquisizione: ? frames da 0.05 s ciascuno (per # attivaz)(20Hz) totale: ? s Fluoroforo: Cy3/A647 La fig B mostra l’applicazione della tecnica a dei microtubuli. I falsi colori indicano la profondità rispetto alla posizione di riferimento z=0. Il rettangolo bianco della fig B è riportato nelle figure C, D ed E PALMIRA 3D-STORM Angolo di incidenza dell’illuminazione non eccedente l’angolo critico (pseudo-TIRFM) (Cui et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 104, 13666 (2007)) intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM L’accuratezza della localizzazione di una molecola peggiora allontanandosi dalla posizione di riferimento z=0. Si limita quindi la profondità di analisi del campione a soli 600 nm. Si scartano dall’analisi tutti gli spot che hanno FWHM che non soddisfano queste condizioni: - h > threshold - FWHMx/FWHMy ≈ 1 - FWHM del cluster <1.6*25nm lungo x,y FWHM del cluster <1.6*55nm lungo z Dalla figura precedente si solo localizzati 202 clusters (con ~8 molecole/cluster) separati dai microtubuli (anticorpi non legati in modo specifico nella cellula) e si è valutato il loro FWHM Risoluzione della tecnica 3D STORM nei tre assi 22 nm in x 28 nm in y 55 nm in z come STORM PALMIRA 3D-STORM intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM La sequenza delle figure B-H è una dimostrazione del fatto che con la tecnica 3D STORM si riesce a mostrare la morfologia di strutture cellulari nanometriche. La sequenza mostra delle vescicole di diametro 150-200 nm; in particolare le figure F,G,H mostrano, in falsi colori, che la cavità interna a queste vescicole è risolta. intro Super resolution PA-FPs (F)PALM/STORM PALMIRA 3D-STORM Bibliografia - Thompson, R.E.,Larson, D.R. and Webb, W.W., Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes, Biophysical Journal 82, 2775-83 (2002) - Hell, S.W., Strategy for far-fiald optical imaging and writing without diffraction limit, Phys. Lett. 326, 140-145 (2004) - Hell, S.W., Far-field optical nanoscopy, Science 316, 1153-1158 (2007) - Lukyanov, K.A.,Chudakov, D.M.,Lukyanov, S. and Verkhusha, V.V., Photoactivatable fluorescent proteins, Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 885-91 (2005) - Bates, M., Blosser, T.R. and Zhuang, X., Short-range spectroscopic ruler based on a single-molecule optical switch, Phys. Rev. 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