Lezione Trasformazione Mammiferi - 06-12

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Corso di Genetica Molecolare
Prof. Catello Polito
Transgenesi dei mammiferi
25.09.09
Transgenesi dei
mammiferi
25.09.09
1980
La Corte Suprema Americana,
durante il processo S.A.
Diamond vs. A. M. Chakrabarty,
stabilì che:
“… tutto quello che esiste sotto
il cielo, prodotto dalle mani
dell’uomo, inclusi quindi gli
organismi modificati con le
biotecnologie, è brevettabile.”
Ciò consentì alla Exxon di
brevettare un microrganismo
che “mangia idrocarburi”
25.09.09
1988
Phil Leder e Tim Stewart
brevettarono il primo
organismo transgenico
multicelluare, il topo
OncoMouse.
OncoMouse®
Sequenze LTR del virus del
tumore mammario murino
(MMTV) e dell’oncogene
umano myc, codificante
per un potente fattore di
trascrizione umano.
Mammiferi transgenici :
come si producono?
1) Vettori retrovirali
2) Microiniezione del DNA
GFP
3) Manipolazione di Cellule ES
25.09.09
Requisiti generali per la produzione di organismi
transgenici
1) Una metodica che consenta fisicamente di far entrare in
contatto il transgene con il DNA dell’organismo da
trasformare.
2) Un sistema molecolare che consenta il trasferimento della
molecola di DNA ricombinante nel genoma dell’organismo
ospite.
3) Un marcatore molecolare che
l’avvenuto trasferimento genico.
4) Un sistema di espressione
all’organismo da modificare.
consenta
del
di
transgene
monitorare
appropriato
5) Un sistema che consenta la trasformazione di tutte le cellule
dell’organismo bersaglio.
Trasformazione di
cellule della linea
germinale
Animali
Piante
Propagazione
clonale di cellule
totipotenti
25.09.09
b) Integrazione
illegittima
a) Ricombinazione
omologa
Integrazione illegittima
25.09.09
1) I vettori retrovirali
Ciclo vitale di un retrovirus
• Genoma a RNA, 2 copie.
• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel
citoplasma della cellula infetta.
• Il DNA lineare migra nel nucleo e
viene integrato nel DNA della cellula
ospite. Il DNA integrato è chiamato
provirus.
•L’apparato della cellula ospite
trascrive il provirus producendo RNA
virali che fungono sia da mRNA che
da genomi e saranno impaccati nei
nuovi virioni.
• 2 copie di RNA genomico vengono
inserite in ogni virione.
25.09.09
Struttura genomica ed espressione genica di un
retrovirus
• Un tipico genoma retrovirale contiene 3 “regioni”:
– Gag (geni per componenti del core proteico del capside)
– Pol (geni per trascrittasi inversa, integrasi e proteasi)
– Env (geni per le proteine della superficie esterna)
Genoma retrovirale
25.09.09
Trascrittasi inversa e integrasi
Proteine strutturali capside
Proteine per involucro
Regione Psi+ non codificante ma
indispensabile. per confezionamento dell’RNA
nel capside.
Lunga sequenza terminale ripetuta (inserzione)
Vettore retrovirale
Inserito nelle
cellule eucariotiche
con bassissima
efficienza tramite
trasfezione o
elettroporazione
Lunghezza massima: 8Kb
Con alta efficienza
Mediante
INFEZIONE
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Accoppiamento con maschio e prelievo di ovociti
fecondati.
Infezione in cellule in divisione (i retrovirus
infettano solo queste).
Impianto in una madre “adottiva”, resa pseudo gravida dall’accoppiamento con un maschio
vasectomizzato.
Selezione dei topi transgenici (Southern blot o
PCR su frammento di coda). Per incroci
successivi si può ottenere una linea transgenica
pura.
1) Vettori retrovirali
25.09.09
25.09.09
Vettori Retrovirali
25.09.09
Vantaggi
• Alta efficienza di trasduzione
Svantaggi
• Possibilità
di
generare
nuovi
virus
patogeni
per
ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite.
• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in
maniera casuale nel genoma).
• Molecole di DNA di dimensioni limitate (8 Kb).
• Reazioni immunitarie.
• Costi elevati.
2) Microiniezione di DNA
25.09.09
Gli organismi transgenici possono essere ottenuti
modificando cellule embrionali totipotenti mediante
iniezione di materiale genetico ricombinante.
Promotore
Pronucleo femminile
Introne
1
2
ATG
Pronucleo maschile
poly-A
3
4
5
*
Iniezione di costrutti di espressione
lineari, che si integrano spesso sotto
forma di concatameri a partire dai
primissimi stadi di sviluppo.
Stimolazione della ovulazione di femmine
donatrici con iniezione di siero di cavalla gravida
e, dopo 48h, di gonadotropina corionica umana.
Si ottengono così fino a 35 ovuli per femmina.
Le femmine superovulate vengono accoppiate
con maschi e poi sacrificate per la raccolta delle
uova fecondate.
Prima della fusione dei nuclei si effettua la
microiniezione del costrutto ricombinante nel
pronucleo maschile, più grande e facile da
localizzare.
Impianto delle uova iniettate in una madre “adottiva”,
resa pseudo - gravida dall’accoppiamento con un
maschio vasectomizzato.
Selezione dei topi transgenici (Southern blot o
PCR su frammento di coda). Per incroci
successivi si può ottenere una linea transgenica
pura.
2) Microiniezione di DNA
25.09.09
Microiniezione di DNA
25.09.09
Vantaggi
• Possibilità di integrare costrutti più grandi di 8Kb.
• Costi relativamente bassi.
Svantaggi
• Integrazione casuale del transgene.
• Mutagenesi inserzionale.
• Spesso integrazioni multiple e conseguente effetto tossico
per l’organismo accettore.
• Bassa efficienza di integrazione (50 transgenici per 1000
uova iniettate).
Nonostante tutto è la metodica ad oggi più utilizzata per
generare topi transgenici ed in generale mammiferi transgenici
Efficienza della microiniezione del DNA
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Nei topi al massimo
il 5% degli ovuli
inoculati genera
prole transgenica.
25.09.09
Using the mammary gland as a bioreactor (see
adjacent figure):
•Increase casein content in milk.
•Express lactase in milk (to remove lactose).
•Resistance to bacterial, viral, and parasitic
diseases.
Some exogenous proteins that have been expressed
in the mammary glands of transgenic animals:
•Erythropoietin
•Factor IX
•Factor VIII
•Fibrinogen
•Growth hormone
•Hemoglobin
•Insulin
•Monoclonal antibodies
•Tissue plasminogen activator (TPA)
• α1-antitrypsin
Pesci transgenici
25.09.09
AquAdvantage Salmon
In normal salmon, the gene that controls the
production of Growth Hormone is activated by light,
so the fish generally grow only during the sunny
summer months.
But by attaching a constitutive "promoter sequence",
Aqua Bounty ended up with salmon that make growth
hormone all year round.
25.09.09
3) Manipolazione di Cellule staminali embrionali (ES
cells)
25.09.09
cells)
25.09.09
cells)
25.09.09
cells)
•Le cellule ES sono cellule embrionali pluripotenti, che possono
dare origine a cellule di tutti i tessuti embrionali.
•Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna
della blastocisti (cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in
coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il
differenziamento.
•In queste condizioni
le
cellule
ES
mantengono
intatta
la loro capacità di
differenziarsi in modo
appropriato
in
qualunque
tessuto,
una volta reintrodotte
in un embrione
Nodo
embrionale
Come si coltivano le cellule ES?
25.09.09
•Le cellule del nodo embrionale si
possono prelevare mediante
l’utilizzo di un micromanipolatore
e possono essere messe in coltura
su piastre contenenti un monostrato di cellule “nutrici”.
Nodo embrionale
•Le cellule “nutrici” sono di solito
cellule embrionali epidermiche,
trattate in modo che non possano
più dividersi. Tali cellule forniscono
il substrato per l’adesione ed il
rilascio di nutrienti per le cellule
ES.
•Le cellule ES, a differenza di
molte altre linee cellulari animali,
possono essere mantenute in
coltura per molte generazioni.
Blastocisti
Cellule “nutrici”
Embrione
Cloni di ES in coltura
Cellule totipotenti
25.09.09
Leukemia Inhibitory Factor (L. I. F.)
Serum free
medium
neuroectoderma
days
BMP4
Epidermide
1
2
3
4
5
6
7
Oct3/4, Fgf4, etc.
mesoderma
endoderma
Sox-1
Cellule βpancreatiche
Neuroni
Cardiomiociti
Muscolo liscio
Eritrociti
25.09.09
Accoppiamento con maschio e prelievo di ovociti fecondati.
Prelievo cellule del nodo embrionale. Allestimento della
coltura di cellule ES.
Trasformazione delle cellule ES mediante una delle tecniche
convenzionali (Calcio Fosfato, Lipofezione o
Elettroporazione. Arricchimento delle cellule trasformate
mediante selezione (resistenza Neo).
Microiniezione delle cellule ES trasformate in una nuova
blastocisti ricevente. Il topo transgenico che si svilupperà
dalla blastocisti manipolata sarà una “chimera”.
Impianto in una madre “adottiva”, resa pseudo - gravida
dall’accoppiamento con un maschio vasectomizzato.
Selezione dei topi transgenici (Southern blot o PCR su
frammento di coda). Per incroci successivi si può ottenere
una linea transgenica pura.
Introduzione di cellule ES nella blastocisti
25.09.09
Cellule ES derivanti dalla
“blastocisti” donatrice da
Topo nero (oppure ES
trasformate contenenti un
transgene)
Blastocisti “ricevente”
da topo albino (oppure da
topo wild-type)
Chimera transgenica
(nel caso delle cellule ES
transgeniche l’effetto
chimera potrebbe essere non
visibile)
25.09.09
Manipolazione di Cellule staminali embrionali (ES
cells)
Vantaggi
• Buona efficienza di integrazione
• Possibilità di utilizzare le metodiche di ricombinazione
omologa e sito-specifica.
Svantaggi
• Necessità di avere a disposizione delle linee cellulari ES.
• Mutagenesi inserzionale (se si sfrutta il meccanismo
dell’inserzione illegittima).
• Costi abbastanza elevati.
25.09.09
Types of Recombination
Homologous - occurs between sequences
that are nearly identical (e.g., during
meiosis).
Site-Specific - occurs between sequences
with a limited stretch of similarity;
involves specific sites.
25.09.09
Tipi di eventi di Ricombinazione
25.09.09
L’esistenza della ricombinazione e della possibilità di
trasformare le cellule ES in coltura prima dell’impianto in una
blastocisti rendono possibile le metodiche di Gene Targeting,
cioè la sostituzione o l’inserimento in punti precisi del genoma
di una molecola di DNA con un’altra.
Nel caso dei mammiferi con genoma completamente
sequenziato tale metodica consente di scegliere il sito esatto
di inserzione/sostituzione.
Questo consente di eliminare il problema dell’effetto di
posizione e della mutagenesi inserzionale.
Come si produce un ceppo transgenico per Gene Targeting?
25.09.09
Costrutto per Gene Targeting in topi
Sequenze di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio
Gene che
conferisce
resistenza
alla G418
TRANSGENE di interesse
Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex).
In presenza di GANCICLOVIR: MORTE
25.09.09
ASPECIFICA
SPECIFICA
25.09.09
ASPECIFICA
SPECIFICA
25.09.09
ASPECIFICA
SPECIFICA
SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA
25.09.09
ASPECIFICA
SPECIFICA
1)
2)
Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA
Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA
25.09.09
Accoppiamento con maschio e prelievo di ovociti fecondati.
Prelievo cellule del nodo embrionale. Allestimento della
coltura di cellule ES.
Trasformazione delle cellule ES mediante una delle tecniche
convenzionali (Calcio Fosfato, Lipofezione o
Elettroporazione. Arricchimento delle cellule trasformate
mediante doppia selezione (resistenza Neo + TK).
Microiniezione delle cellule ES trasformate in una nuova
blastocisti ricevente. Il topo transgenico che si svilupperà
dalla blastocisti manipolata sarà una “chimera”.
Impianto in una madre “adottiva”, resa pseudo - gravida
dall’accoppiamento con un maschio vasectomizzato.
Selezione dei topi transgenici (Southern blot o PCR su
frammento di coda). Per incroci successivi si può ottenere
una linea transgenica pura.
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Knock-In
Knock-Out
La ricombinazione sito-specifica: il sistema Cre-lox
25.09.09
Il limite principale dei topi
transgenici Knock-Out (KO) per un
gene e’ la possibile mortalità degli
omozigoti durante lo sviluppo.
Soluzione : l’induzione della mutazione
in modalità tempo e tessuto specifica.
Il sistema Cre-lox
25.09.09
Sistema alla base della tecnica:
Meccanismo di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la
ricombinasi sito-specifica Cre.
Cre
Recombinase
LoxP: locus di crossover (2 sequenze palindromiche di 13bp + regione centrale di
8bp)
LoxP “attira” la ricombinasi CRE la quale ricombina le sequenze di DNA adiacenti.
Il sistema Cre-lox
25.09.09
Sistema alla base della tecnica:
Meccanismo di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la
ricombinasi Cre.
Lox
Lox
Lox
Lox
CRE
Recombinase
Il sistema Cre-lox
25.09.09
Con questo sistema si possono ottenere dei mutanti che perdono
una data regione solo attivando la ricombinasi Cre.
Per fare questo si devono costruire dei vettori con la regione
genetica da eliminare fiancheggiata da siti Lox.
Con questa strategia si possono ottenere topi transgenici per
geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto, con
l’espressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far
avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove si
esprime o dove si induce Cre.
25.09.09
G418
25.09.09
I siti Lox derivano da fago P1 (non esistono nel genoma animale/vegetale)
quindi non possibilità di ricombinazione in altri siti del genoma
25.09.09
25.09.09
Il SISTEMA Cre-Lox permette il controllo dell’espressione genica
nello SPAZIO e nel TEMPO
Utilizzo di un PROMOTORE
TESSUTO SPECIFICO
Utilizzo di un PROMOTORE:
-dipendente dallo STADIO di SVILUPPO
-INDUCIBILE
25.09.09
25.09.09
Referenze
25.09.09
1)
Curr Gene Ther. 2009 Dec;9(6):459-74.
State-of-the-art lentiviral vectors for research use: risk assessment and biosafety
recommendations.
Pauwels K, Gijsbers R, Toelen J, Schambach A, Willard-Gallo K, Verheust C, Debyser Z, Herman
P.
2)
Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Dec;77(12):7380-4.
Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.
Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH.
3)
Cell. 1986 Feb 14;44(3):419-28.
High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome.
Thomas KR, Folger KR, Capecchi MR.
4)
Science. 1995 Sep 8;269(5229):1427-9.
Inducible gene targeting in mice.
Kühn R, Schwenk F, Aguet M, Rajewsky K.
5)
Transgenic Res. 2010 Jun;19(3):363-71. Epub 2009 Sep 26.
Zinc-finger nucleases: a powerful tool for genetic engineering of animals.
Rémy S, Tesson L, Ménoret S, Usal C, Scharenberg AM, Anegon I.

Lezione Trasformazione Mammiferi - 06-12

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