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ESTRATTI VEGETALI:
POTENZIALI STRATEGIE GREEN PER IL CONTROLLO DEL
BIODETERIORAMENTO DEI BENI CULTURALI
Valentina ROTOLO, Giovanna BARRESI, Enza DI CARLO, Ambra GIORDANO, FRANCO PALLA
Università di Palermo, Laboratorio di Biologia e Biotecnologie per i Beni Culturali, Dipartimento di Scienze e Tecnologie
Biologiche, Chimiche e Farmaceutiche (STEBICEF) – Sez. di Botanica ed Ecologia vegetale, Via Archirafi 38 - 90123 Palermo,
[email protected], [email protected].
Riassunto
Il biodeterioramento dei manufatti artistici è correlato a diversi sistemi biologici, inclusi funghi e batteri, che attraverso la loro attività metabolica e lo
sviluppo vegetativo hanno un diretto effetto sulla conservazione dei beni culturali.
Per il controllo della crescita microbica, di norma, sono utilizzati diversi biocidi di natura chimica, tossici sia per l’ambiente sia per l’uomo (operatori,
visitatori). Al fine di individuare biocidi alternativi, in particolare per il controllo della colonizzazione da parte di funghi e batteri, in questo studio
sono stati saggiati alcuni prodotti naturali.
In particolare è stata saggiata l’attività antimicrobica di tre prodotti naturali, Tea tree Oil (olio essenziale), Calamintha nepeta e Allium sativum L. nei
confronti di Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Penicillium chrysogenum e Aspergillus spp (isolati da manufatti artistici), attraverso tre saggi
antimicrobici in vitro (micro-dilution in microtiter plates, well plates diffusion e agar disc diffusion method). I saggi biologici mostrano una diversa
suscettibilità microbica agli estratti vegetali, definendo per ciascuno dei microrganismi utilizzati la minima concentrazione inibente (MIC) e
definendo l’entità dell’alone d’inibizione della crescita.
Questi risultati sono in accordo con quanto riportato nella letteratura correlata, suggerendo un loro possibile utilizzo nel controllo di
biodeterioramento dei beni culturali.
Parole chiave: Biodeteriogeni, Attività antimicrobica, Prodotti naturali, Saggi antimicrobici, Beni culturali
Introduzione
Gli estratti vegetali sono già utilizzati come biocidi negli alimenti, in medicina e in diversi settori dell'industria
farmaceutica. Negli ultimi anni, sono in fase di sperimentazione in altri campi di applicazione, come il loro possibile
utilizzo anche nel controllo del biodeterioramento del patrimonio culturale [1-8], come valida alternativa ai tradizionali
biocidi, che sono generalmente tossici e persistenti nell'ambiente. Gli estratti vegetali possono agire in diversi modi
agendo sul metabolismo intermedio, alterando le strutture delle membrane, attivando/bloccando reazioni enzimatiche
[9].
L’attività antimicrobica di alcuni oli essenziali, in particolare nei confronti dei microrganismi isolati da archivi,
biblioteche e musei [3,10,11] è stata recentemente saggiata per il controllo del biodeterioramento [12], ma le
informazioni sono ancora insufficienti.
Nel presente studio, tre prodotti naturali, olio essenziale di Tea Tree Oil, estratti di Calamintha nepeta e Allium sativum
L., sono stati selezionati e ne è stata testata la loro attività antimicrobica contro quattro ceppi microbici (Bacillus
subtilis, Micrococcus luteus, Penicillium Chrysogenum, Aspergillus spp.), precedentemente isolati da opere d’arte
colonizzate. L'attività antimicrobica dei tre prodotti vegetali è stata valutata ricorrendo a tre protocolli metodologici:
micro-dilution in microtiter plates, well plates diffusion e agar disc diffusion.
Materiali e metodi
Materiali vegetali e preparazione degli estratti
Il Tea Tree Oil (TTO) è un olio essenziale estratto da Melaleuca alternifolia, una pianta originaria dell'Australia,
ampiamente utilizzato per le sue proprietà antimicrobiche e spesso aggiunto come ingrediente vari prodotti (alimentari e
cosmetici)[13].
L'origine di un olio essenziale non è sempre chiara, dal momento che il nome può fare riferimento a prodotti diversi,
anche in relazione alla posizione geografica in cui la pianta viene raccolta. L’essenza pura al 100 % di TTO utilizzata in
questa sperimentazione è commercializzata dalla ditta Esi®.
La Calamintha nepeta è un'erba aromatica perenne appartenente alla famiglia delle Labiatae, comune in Europa
occidentale e in Asia. La medicina moderna indica la C. nepeta tra gli oli essenziali con più alto valore antimicrobico
[14-16]. L'estratto è stato ottenuto da foglie di C. nepeta per distillazione in corrente di vapore.
L’Allium sativum è una specie appartenente al genere Allium (famiglia Alliaceae), distribuito in tutta Europa, Nord
America, Nord Africa e Asia. Il genere Allium è ricco di flavonoidi, saponina, composti volatili solforati e le
caratteristiche organolettiche derivano dalla presenza di precursori di aromi non volatili, ALK solfossidi (en) y-Lcisteina [17]. Molti composti dello zolfo presenti nelle specie di aglio presentano attività antimicrobiche [18],
antiprotozoici, antiossidanti, anti-ipertensivi, ipolipemizzanti, epatoprotettive o proprietà antitrombotiche [19]. Gli
estratti di C. nepeta e A. sativum sono stati preparati nel Laboratorio del prof. M. Bruno del dipartimento STEBICEF
[20], dove i composti chimici sono stati caratterizzati attraverso gascromatografia-spettrometria di massa (GC / MS).
Microrganismi e condizioni di crescita
I test sono stati eseguiti utilizzando ceppi microbici isolati da diversi manufatti provenienti da più ambienti museali,
individuati attraverso analisi di microscopia ottica e indagini di biologia molecolare [21]. Le colonie batteriche e
fungine appartengono a Bacillus subtilis, Micrococcus luteus e Penicillium chrysogenum, Aspergillus spp., cresciute in
brodo di coltura per 24/36 ore a 30° C, in modo da ottenere sospensioni microbiche ad una concentrazione di 1106
CFU (Unità Formanti Colonia) / ml, riferendosi alla scala McFarland.
Screening antimicrobico
L'attività antimicrobica degli estratti naturali è stata determinata utilizzando tre diversi saggi antibatterici e antifungini
in vitro, per sviluppare il metodo più appropriato, agar disc diffusion, well plates diffusion e micro-dilution in microtiter
plates [22].
Agar disc diffusion. Per l’esecuzione di questo metodo [23], dischi di carta da filtro (4 mm di diametro) sono stati posti
sulla superficie di terreni di coltura, Nutrient e Sabouraud agar (15 ml in capsule Petri da 90 millimetri), e imbevuti con
10 µl di estratti vegetali (a diverse concentrazioni: 100 %, 50%, 25%, 12,5%). I terreni di coltura sono stati in
precedenza inoculati con sospensioni microbiche (concentrazione: 1106 CFU / ml) e incubate per 24/36 ore a 30 ± 1°
C, in condizioni aerobiche. Dopo l'incubazione, è stata osservata una crescita microbica confluente ed è stato misurato
il diametro (mm) delle aree di inibizione della crescita (sensibile > 9 mm, resistente < 9 mm); ogni prova è stata
effettuata in triplicato. Sono stati inclusi, come controlli, dischi imbevuti di etanolo al 70% e cloruro di Benzalconio +
clorexidina (0,2% v / v).
Well plates diffusion. L'inoculo microbico (1106 CFU / ml) è stato uniformemente seminato utilizzando tamponi sterili
di cotone, su piastre Petri (Nutrient e Sabouraud agar); successivamente sono stati praticati, asetticamente, dei fori (4
mm di diametro) [23]. In ciascun pozzetto della piastra, sono state inserite aliquote da 10 microlitri di prodotto naturale
a diverse concentrazioni (100%, 50%, 25%, 12,5%).
Dopo 24/36 h di incubazione a 30 ± 1 °C in condizioni aerobiche, è stato misurato il diametro (mm) delle zone di
inibizione di crescita; ogni saggio è stato eseguito in triplicato.
Micro-dilution in microtiter plates. La Minima Concentrazione Inibente (MIC) e Minima Concentrazione Battericida /
Fungicida (MBC / MFC) sono state valutate con il metodo delle microdiluizioni, eseguito su piastre da 96 pozzetti,
distinguendo tra azione biocida o biostatica [24]. In ciascun pozzetto, sono stati aggiunti 30 µl di estratti vegetali a
differenti concentrazioni (100%, 50%, 25%, 12,5%) e un uguale volume di sospensione microbica (1106 CFU / ml).
Per facilitare la dispersione dell'estratto nel mezzo liquido, è stato aggiunto 1% di Tween 80 (non tossico per le cellule
microbiche). Le soluzioni acquose dei biocidi, benzalconio cloruro + clorexidina (0,2% vol/vol) e Nipagina
(Methylparaben, 2,5 mg /ml) sono stati usati come agenti antimicrobici controllo. La crescita microbica, dopo 24/36
ore di incubazione a 3± 1 °C, è stata rivelata misurando la densità ottica a 500-600 nm.
Il valore della MIC è stato determinato come la più bassa concentrazione del prodotto naturale che non ha permesso
alcuna crescita microbica visibile dopo il tempo di incubazione.
La MBC e MFC indicano, invece, la più bassa concentrazione di estratto capace di uccidere il 99,5% dei microrganismi
presenti dell'inoculo microbico originale [25].
Risultati e discussioni
Le tabelle (Tab. 1, 2) mostrano aloni di inibizione della crescita microbica rivelata attraverso i saggi agar disc diffusion
e well plates diffusion, mettendo in evidenza la diversa sensibilità dei quattro ceppi microbici ai prodotti naturali testati.
Diametri degli aloni di inibizione (mm)
Penicillium
Conc. (%)
Bacillus subtilis
Micrococcus luteus
Aspergillus spp.
chrysogenum
100
15
7
8
2
Tea Tree Oil
50.0
10
6
4
0
25.0
8
4
2
0
12.5
4
4
2
0
100
10
11
8
6
Calamintha nepeta L.
50.0
5
8
6
4
25.0
5
6
4
2
12.5
2
2
4
0
100
15
*
20
4
Allium sativum
50.0
10
*
15
2
25.0
10
*
8
2
12.5
5
*
3
0
Tabella 1. Well plates diffusion method: valori medi dei diametri di inibizione di crescita ( mm ) per i diversi estratti testati. Attività
antimicrobica: Positivo ≥ 9 millimetri; Moderato: 6 – 9 mm; Negativo ≤ 6 millimetri; inibizione totale della crescita ( * ) .
Prodotti naturali
Diametri degli aloni di inibizione (mm)
Penicillium
Conc. (%)
Bacillus subtilis
Micrococcus luteus
Aspergillus spp.
chrysogenum
100
36
31
41
0
Tea Tree Oil
50.0
22
21
24
0
25.0
21
14
21
0
12.5
16
10
21
0
100
15
12
10
9
Calamintha nepeta L.
50.0
10
8
7
4
25.0
7
6
4
2
12.5
2
0
4
0
100
20
9
*
*
Allium sativum
50.0
11
4
*
*
25.0
11
3
*
*
12.5
6
3
*
*
Tabella 2. agar disc diffusion method: valori medi dei diametri di inibizione di crescita ( mm ) per i diversi estratti testati. Attività
antimicrobica: Positivo ≥ 9 millimetri; Moderato: 6 - 9 mm; Negativo ≤ 6 millimetri; inibizione totale della crescita ( * ).
Prodotti naturali
Il TTO ha mostrato un'attività positiva (superiore a 9 mm) contro i batteri (Bacillus subtilis, Micrococcus luteus) alla
massima concentrazione (100%) e una moderata attività alle altre concentrazioni (50%, 25%) (Fig.1 a, b). Attività
antimicrobica è stata rivelata anche nei confronti di Penicillium chrysogenum (Fig. 2); nessuna attività, invece, contro
Aspergillus spp.
La Calamintha nepeta ha mostrato risultati simili al Tea Tree Oil per i batteri, ma ha presentato attività ridotta contro i
ceppi fungini (Tab. 1, 2).
Un’elevata attività antimicrobica è stata mostrata dall’ Allium sativum (Fig. 3), contro i quattro i ceppi microbici, a tutte
le concentrazioni testate. L’inibizione batterica (MIC) è stata valutata con il metodo della microdiluizione (Tab. 3).
Anche in questo caso, l’attività è stata diversa: il Tea Tree Oil e l'estratto di Calamintha nepeta hanno mostrato attività
biocida contro M. luteus e B. subtilis; l’Allium sativum ha presentato attività sia biocida che biostatica contro M. luteus
e attività biocida contro B. subtilis.
La diversa attività dei prodotti naturali si potrebbe ricondurre alla solubilità degli estratti o alla diversa suscettibilità dei
microrganismi alle sostanze naturali, in quanto presentano differenze nella struttura della parete cellulare, nella
composizione lipidica e proteica della membrana citoplasmatica, nonché nei processi fisiologici [3, 26].
Estratti naturali
M. luteus
B.subtilis
Tea Tree Oil
Biocida (0.6%)
Biocida (0.6%)
Biocida (1.56%)
Biocida (1.56%)
Biocida (100%)
Biostatico (50% - 25%)
Biocida (100%)
Calamintha nepeta L.
Allium sativum
Tabella 3. Minima Concentrazione Battericida (%): azione biocida o biostatica degli estratti testati.
Conclusioni
Recentemente, anche nel settore dei beni culturali è stata riconosciuta l'attività antimicrobica di estratti vegetali contro
microrganismi biodeteriogeni, ma sinora è stato pubblicato un ridotto numero di studi applicativi.
In questo lavoro, l’attività antimicrobica dei tre prodotti vegetali Tea Tree Oil, Calamintha nepeta e Allium sativum L.
è stata saggiata mediante tre test in vitro: micro-dilution in microtiter plates, well plates diffusion e agar disc diffusion.
I risultati ottenuti confermano i dati riportati in letteratura circa l'attività antimicrobica ad ampio spettro degli estratti
vegetali, permettendo di ipotizzare l'uso di questi prodotti come biocidi naturali nel controllo del biodeterioramento di
manufatti d’interesse storico-artistico.
Il TTO è già stato applicato nel campo di protocolli conservativi di manufatti litici e di materiali organici. Invece C.
nepeta ha messo in evidenza un potenziale utilizzo, mostrando due vantaggi: ha attività biocida ed è anche un prodotto
economico, grazie alla sua facile disponibilità nel nostro territorio, proprio come Allium sativum.
Ulteriori studi sono stati pianificati per valutare la loro permanenza e attività sulle superfici di manufatti
conservati/esposti sia in spazi aperti che ambienti confinati, ma gli estratti naturali potrebbero diventare prodotti
concretamente applicabili e valide alternative ai biocidi tradizionali, per la protezione e disinfestazione dei beni
culturali, senza impatti ambientali negativi e nel rispetto della salute umana, in perfetto accordo ai dettami del moderno
restauro conservativo.
Ringraziamenti
Una parte di questi risultati sono stati presentati al IX Congresso Nazionale AIAr , ricevendo il premio "miglior
poster"; gli autori ringraziano il Comitato Scientifico e Organizzatore.
Ente finanziatore
Questo studio fa parte del progetto di ricerca It@cha, PON "Ricerca e Competività 2007-2013" PON 01_00625.
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Fig. 1. Agar well diffusion method. Differenti diametri degli aloni di inibizione (cerchi rossi) per Tea Tree Oil
( concentrazione al 100% , 50% , 25%) contro Bacillus subtilis ( a) e Micrococcus luteus ( b) (Rotolo et al.,2016).
Fig. 2. Agar disc diffusion method. Differenti diametri degli aloni di inibizione (cerchi rossi) per Tea Tree Oil al 100%
(a), 50% e 25% (b) contro Penicillium chrysogenum (Rotolo et al.,2016).
Fig. 3. Agar well diffusion method. Differenti diametri degli aloni di inibizione (cerchi rossi) per Allium sativum al
100%, 50% e 25% contro Bacillus subtilis (Rotolo et al.,2016).