BCR/ABL Dual Fusion Probe

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BCR/ABL Dual Fusion Probe
Materials Provided
Probe: 100 µl per vial (10 tests)
Amount of BCR probe mix: 70 ng/test
Amount of ABL probe mix: 50 ng/test
The probes are provided premixed and ready to use in hybridisation solution (Formamide; Dextran Sulphate; SSC).
Counterstain: 150 µl per vial (15 tests)
The counterstain is DAPI antifade (ES: 0.125 µg/ml DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole))
Instructions For Use
REF: LPH007
BCR/ABL Dual Fusion Probe
PROFESSIONAL USE ONLY
ENGLISH/FRANÇAIS/ITALIANO/DEUTSCH/ESPAÑOL
Further information available at www.cytocell.com
Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) is a technique that allows DNA sequences to be detected on metaphase
chromosomes or in interphase nuclei of fixed cultured or uncultured cytogenetic samples. The technique uses DNA
probes that hybridise to entire chromosomes or single unique sequences, and serves as a powerful adjunct to classic
cytogenetics. Target DNA, after fixation and denaturation is available for annealing to a similarly denatured,
fluorescently labelled DNA probe which has a complementary sequence. Following hybridisation, unbound and nonspecifically bound DNA probe is removed by a series of rapid formamide-free stringent washes and the DNA
counterstained for visualisation. Fluorescence microscopy then allows the visualisation of the hybridised probe on the
target material.
Probe Specification
BCR (22q11.23) Green
ABL (9q34) Red
The presence of the Philadelphia chromosome (Ph') has important diagnostic and prognostic implications in a number
of Haematological disorders. The abnormality is characteristic of Chronic Myeloid Leukaemia (CML), found in around
90% of cases but represents a significant abnormality in 30% of adult and 2 to 10% of childhood (Macdonald et al 2004)
Acute Lymphoblastic Leukaemia, (ALL) cases (Groffen et al., 1984; Shtivelman et al., 1985; Hermans et al., 1987). This
rearrangement is also seen in rare cases of acute myelogenous leukemia (AML) (Nishida et al 2006).
As a result of the Philadelphia translocation, t(9;22)(q34;q11), the 3' sequences of the ABL(Abelson) proto-oncogene at
9q34 are joined to the 5' sequences of the BCR (Breakpoint cluster region) gene at 22q 11, giving rise to the BCR/ABL hybrid or
‘fusion’ gene. Prakash and Yunis (1984) located the breakpoints in CML to subbands 22q11.21 and 9q34.1. Although the
position of the breakpoint in chromosome 9 is quite variable, almost all breaks are located within a 200 kb region
covering exons 1b to 1a. In BCR there are two breakpoint regions, m-BCR and M-BCR. In CML most translocations
involve the Major Breakpoint Cluster Region (M-BCR) located approximately between exons 12 to 16. In ALL
breaks mostly fall in the Minor Breakpoint Cluster Region (m-BCR) located between exons 1 and 2 though the
resulting translocation is Cytogenetically identical to that of CML. These alternative breakpoints join different exon sets
of BCR to a common subset of the exons of the ABL resulting in 2 alternative chimeric oncogene products, p210(BCRABL) and p185(BCR-ABL). Both of these fusion proteins possess enhanced tyrosine kinase activity, through the activation
of ABL tyrosine kinase activity by the direct physical binding of sequences within the first exon of BCR. It is thought that
this kinase activity is necessary for the oncogenic potential of the chimeric oncogene.
In ALL, the rearrangement is associated with an extremely poor outcome, with an event-free survival (EFS) of 15% or
less at 5 years in adult and childhood patients treated with chemotherapy alone (Fletcher et al 1992, Secker-Walker et al
1978). There are no reports of long-term survivors (Wetzler et al 1999). Allogeneic bone marrow transplantation is
the only curative therapy for these patients. Children wit h t h i s r e ar r a n g e me nt ar e tr e ate d on a hi gh - r i sk
pr ot oc ol a n d a d ul ts a r e recommended for immediate bone marrow transplantation. Philadelphia (Ph)
chromosome-positive acute myeloid leukaemia (AML) is characterized by its resistance to conventional standard
chemotherapy and poor prognosis. Accurate and rapid identification of this chromosomal abnormality is therefore
vital.
In a small number of cases of ALL, the translocation does not result in a cytogenetically visible Philadelphia chromosome.
In these cases, FISH is essential for highlighting the fusion gene. (Van Rhee et al 1995).
Cytocell’s Dual Fusion BCR/ABL product contains two probe mixes, one for BCR and one for ABL, which also
contains a probe for the ASS gene.
The BCR probe mix contains a probe 3’ of BCR covering a region extending 171 kb 3’, covering the genes GNAZ
and RAB36 and a second probe covering a region 262 kb 5’ of the gene extending 148 kb. Both are labelled in green
and are orientated such that breakpoints in either mBCR or MBCR will result in a fusion signal. For ABL a probe
contig. covers 349 kb from the middle of the FUB3 gene to a point 64 kb from the 5’ end of ABL and it is labelled in
red, whilst there is an additional red probe covering a region 212 kb 3’ of ABL, incorporating the ASS gene. This
additional probe is 193 kb long and spans the whole of the ASS gene.
Warnings and Precautions
1.
For in vitro diagnostic use. For professional use only.
2.
Wear gloves when handling DNA probes and DAPI counterstain.
3.
Probe mixtures contain formamide which is a teratogen; do not breathe fumes or allow skin contact. Wear gloves, a
lab coat, and handle in a fume hood. Upon disposal, flush with a large volume of water.
4.
DAPI is a potential carcinogen. Handle with care; wear gloves and a lab coat. Upon disposal, flush with a large
volume of water.
5.
All hazardous materials should be disposed of according to your institution’s guidelines for hazardous waste
disposal.
Storage and Handling
The Aquarius kit should be stored at -20°C until the expiry date indicated on the kit label. The probe and counterstain vials
must be stored in the dark.
Materials Necessary but not Supplied
Equipment
a)
Hotplate (with a solid plate and accurate temperature control up to 80°C)
b)
Variable volume micropipettes range 1 µl - 200 µl
c)
Water bath with accurate temperature control at 72°C
d)
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)
e)
Fluorescence microscope (Please see Fluorescence Microscope Recommendation section)
f)
Plastic or glass coplin jars
g)
Forceps
h)
Fluorescence grade microscope lens immersion oil
i)
Bench top centrifuge
Fluorescence Microscope Recommendation
For optimal visualisation of the probe we recommend a 100 watt mercury lamp and plan apochromat objectives x 63 or x
100. The Triple bandpass filter DAPI/FITC/Texas Red is optimal for viewing all three probe fluorophores and DAPI
simultaneously.
Sample Preparation
The kits are designed for use on cultured peripheral blood cells fixed in Carnoy’s fixative and should be prepared
according to the laboratory or institution guidelines.
Prepare blood metaphase spreads on microscope slides according to standard cytogenetic procedures.
FISH Protocol
Slide Preparation
Spot cell sample onto cleaned microscope slide.
1.
2.
Wash slide in 2 x SSC for 2 minutes at room temperature (RT).
3.
Dehydrate in an ethanol series (70%, 85% and 100%), each for 2 mins at RT. Allow to air dry.
Pre-Denaturation
4.
Remove probe from -20°C freezer and allow to warm to RT.
5.
Ensure probe solution is uniform by repeated pipette mixing.
6.
Remove 10 µl of probe per test, place in a microcentrifuge tube.
7.
Place probe, sample slide and 24 x 24 mm glass coverslip to prewarm on a 37°C
(+/- 1ºC) hotplate for 10 mins.
8.
Spot 10 µl probe mixture onto the cell sample and carefully apply coverslip.
Seal with rubber solution glue and allow to dry completely.
Denaturation
9.
Denature sample and probe simultaneously by heating slide on a hotplate at 75°C
(+/- 1ºC) for 2 mins.
Hybridisation
10.
Place slide in humid, lightproof container at 37°C (+/- 1ºC) overnight.
Post-Hybridisation Washes
11.
Remove coverslip and all traces of glue carefully.
12.
Wash slide in 0.4 x SSC (pH 7.0) at 72°C (+/- 1ºC) for 2 mins.
13.
Drain slide and wash in 2 x SSC, 0.05% Tween-20 (pH 7.0) at RT for 30
seconds.
14.
Drain the slide and apply 10 µl of DAPI antifade.
15.
Cover with a coverslip and allow colour to develop in the dark for 10 mins.
16.
View with fluorescence microscope.
Stability of Finished Slides
FISHed slides remain analysable for up to 1 month if stored in the dark at or below room temperature.
Procedural Recommendations
1.
The use of a calibrated thermometer is strongly recommended for measuring temperatures of solutions, waterbaths,
and incubators, as these temperatures are critical for optimum product performance.
2.
The wash concentrations (stringency), pH and temperature are important, as low stringency can result in nonspecific binding of the probe and too high stringency can result in a lack of signal.
Expected Results
In the normal cell, these probes will appear as discrete red and green spots, one for each homologue (resulting in a
2G 2R conformation). In a t(9:22) patient, there should be two (yellow) fusion signals in addition to the red and
green signals of the normal chromosomes 9 and 22 respectively (1R 1G 2Y).
Customer Support
Please contact the Cytocell Sales and Marketing Department by telephone or e-mail. [email protected]
FRANÇAIS
L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une technique qui permet de détecter des séquences ADN sur les
chromosomes en métaphase ou sur les noyaux interphasiques d’échantillons cytogénétiques fixés cultivés ou non cultivés.
La technique utilise des sondes ADN qui s’hybrident aux chromosomes entiers ou à des séquences spécifiques, et sert de
test complémentaire à la cytogénétique classique. L’ADN cible, après fixation, est traité par la chaleur et à la formamide
pour dénaturer la double hélice, la rendant simple hélice. L’ADN cible est alors disponible pour hybridation avec une
sonde ADN complémentaire simple brin, dénaturée de la même manière et marquée avec un fluorochrome. Après
l’hybridation, l’ADN non hybridé et l’ADN non lié spécifiquement sont éliminés par une série de lavages stringents et
l’ADN est ensuite contre-coloré. Un microscope à fluorescence permet ensuite la visualisation de la sonde hybridée sur
l’ADN cible.
Caractéristiques de la sonde
BCR (22q11.23) – Fluorochrome vert
ABL (9q34) – Fluorochrome rouge
La présence du chromosome Philadelphie (Ph1) a des implications importantes en termes de diagnostic et de pronostic
dans le cadre de nombreux troubles hématologiques. L’anomalie est caractéristique de la leucémie myéloïde chronique
(LMC), retrouvée dans environ 90 % des cas ; elle représente une anomalie significative dans 30 % des cas de leucémies
aiguës lymphoblastiques (LAL) de l’adulte et dans 2 à 10 % des cas de LAL de l’enfant (Macdonald et al., 2004 ; Groffen
et al., 1984 ; Shtivelman et al., 1985 ; Hermans et al., 1987). Ce réarrangement est également observé dans de rares cas de
leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) (Nishida et al., 2006).
À la suite de la translocation Philadelphie, t(9;22)(q34;q11), les séquences en 3' du proto-oncogène ABL (Abelson) en
9q34 sont reliées aux séquences en 5' du gène BCR (Breakpoint Cluster Region) en 22q11, donnant naissance à l’hybride
ou gène de « fusion » BCR/ABL. Les points de cassure dans les LMC ont été localisés par Prakash et Yunis (1984) au
niveau des sous-bandes 22q11.21 et 9q34.1. Bien que la position du point de cassure au niveau du chromosome 9 soit
assez variable, presque toutes les cassures sont situées à l’intérieur d’une région de 200 kb couvrant les exons 1b à 1a. Il
existe deux régions de points de cassure dans le gène BCR, m-BCR et M-BCR. Dans les LMC, la plupart des
translocations impliquent le M-BCR (Major Breakpoint Cluster Region), qui se situe approximativement entre les exons
12 et 16. Dans les LAL, les cassures sont principalement regroupées dans le m-BCR (Minor Breakpoint Cluster Region),
qui se situe entre les exons 1 et 2, et cela bien que la translocation qui en résulte soit, d’un point de vue cytogénétique,
identique à celle observée dans les LMC. Ces autres points de cassure relient différents ensembles d’exons du gène BCR à
un sous-ensemble commun d’exons du gène ABL, se traduisant par 2 produits oncogènes chimères alternatifs, p210 (BCRABL) et p185 (BCR-ABL). Ces deux protéines de fusion possèdent une activité tyrosine kinase très augmentée, due à
l’activation de l’activité tyrosine kinase du gène ABL suite à la liaison directe de séquences à l’intérieur du premier exon
du gène BCR. On pense que cette activité kinase est nécessaire au pouvoir oncogène de l’oncogène chimérique.
Dans les LAL, le réarrangement est associé à une évolution extrêmement défavorable, avec une survie sans autre
évènement inférieure ou égale à 15 % à 5 ans chez les patients adultes et enfants traités uniquement par chimiothérapie
(Fletcher et al., 1992, Secker-Walker et al., 1978). Il n’existe aucun compte-rendu relatif à des survivants au long terme
(Wetzler et al., 1999). La greffe de moelle osseuse allogénique est l’unique traitement curatif pour ces patients. Les enfants
portant ce réarrangement sont traités sur la base d’un protocole à haut risque et les adultes sont orientés vers une greffe de
moelle osseuse immédiate. La leucémie aiguë myéloïde (LAM) positive pour le chromosome Philadelphie (Ph1) se
DS085/CE Vers004/2008-04-14
caractérise par sa résistance à la chimiothérapie standard conventionnelle et par un pronostic défavorable. L’identification
exacte et rapide de cette anomalie chromosomique est par conséquent vitale.
Dans un petit nombre de cas de LAL, la translocation n’entraîne pas la formation d’un chromosome Philadelphie visible
d’un point de vue cytogénétique. Dans ces cas, la FISH est essentielle pour mettre en évidence le gène de fusion (Van
Rhee et al., 1995).
Le produit Dual Fusion BCR/ABL de Cytocell contient deux mélanges de sondes, un pour BCR et un autre pour
ABL, ce dernier contenant également une sonde pour le gène ASS.
Le mélange de sondes BCR se compose d’une sonde en 3’ de BCR couvrant une région s’étendant sur 171 kb en 3’
et incluant les gènes GNAZ et RAB36, ainsi que d’une seconde sonde couvrant une région s’étendant sur 148 kb
située à 262 kb en 5’ du gène. Les deux sondes sont marquées en vert et sont orientées de telle façon que les points
de cassure dans le mBCR ou le MBCR engendreront un signal de fusion. Pour ABL, un contig de sondes couvre 349
kb depuis le centre du gène FUB3 jusqu’à un point situé à 64 kb de l’extrémité 5’ du gène ABL. Ce contig est
marqué en rouge. Une sonde rouge supplémentaire couvrant une région située à 212 kb en 3’ du gène ABL et
incorporant le gène ASS se trouve également dans ce second mélange de sondes. Cette sonde supplémentaire a une
longueur de 193 kb et englobe l’intégralité du gène ASS.
Conditionnement
Sonde : 100 µl par tube (10 tests)
Concentration de sonde BCR : 70 ng/test
Concentration de sonde ABL : 50 ng/test
La sonde est fournie prête-à-l’emploi dans le tampon d’hybridation (formamide, sulphate de dextran, SSC.
Contre-colorant: 150 µl par tube (15 tests)
Le contre-colorant est le DAPI antifading (ES : 0.125µg/ml DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)).
Avertissements et précautions
1.
Pour utilisation en diagnostic in vitro. Pour usage professionnel uniquement.
2.
Porter des gants lors de la manipulation des sondes ADN et du contre-colorant DAPI.
3.
La sonde contient de la formamide qui est un tératogène. Ne pas respirer les vapeurs. Ne pas mettre en contact
avec la peau. Porter des gants, une blouse de laboratoire et manipuler sous une hotte. Après élimination, rincer
abondamment avec de l’eau.
4.
Le DAPI est un carcinogène potentiel. Manipuler avec précaution. Porter des gants et une blouse de laboratoire.
Après élimination, rincer abondamment avec de l’eau.
5.
Toutes matières dangereuses doivent être éliminées selon les réglementations en vigueur dans votre institution
pour l’élimination des déchets dangereux.
Conservation et manipulation
Le kit Aquarius doit être conservé à -20°C jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit. La sonde et le contre-colorant
doivent être conservés à l’abri de la lumière.
Equipement nécessaire non fourni
a)
Plaque chauffante (avec bloc et contrôle de la température jusqu’à 80°C)
b)
Micropipettes 1µl - 200µl
c)
Bain-marie avec contrôle de la température à 72°C
d)
Tubes à microcentrifugation (0,5 ml)
e)
Microscope à fluorescence (Voir la section Microscope et filtres)
f)
Jarres en plastique ou en verre
g)
Forceps
h)
Huile à immersion pour microscope à fluorescence
i)
Centrifugeuse de paillasse
Microscope et filtres
Pour une visualisation optimale de la sonde, nous recommandons l’utilisation d’une lampe à mercure de 100 watts et
d’objectifs plan apochromatiques x63 or x100. Le filtre triple bande DAPI/FITC/Texas Red est optimal pour la
visualisation des 3 fluorochromes simultanément.
Préparation des échantillons
Le kit a été développé pour utilisation sur des cellules de sang périphérique ou de moelle osseuse cultivées et fixées avec
du fixateur Carnoy et doivent être préparées selon les protocoles en vigueur dans le laboratoire ou institution.
Préparer les étalements métaphasiques sur des lames à microscope selon les techniques standards de cytogénétique.
Protocole FISH
Préparation de la lame échantillon
1.
Déposer l’échantillon cellulaire sur une lame propre. Laisser sécher.
2.
Plonger la lame dans du 2 x SSC, pH 7.0 pendant 2 minutes à température ambiante.
3.
Déshydrater dans une série de bains éthanol (70%, 85% et 100%), 2 minutes dans chaque bain à température
ambiante. Laisser sécher.
Pré-dénaturation
4.
Retirer la sonde du congélateur à -20°C et la laisser préchauffer à température ambiante.
5.
Bien homogénéiser la sonde en pipetant plusieurs fois.
6.
Prélever 10 µl de sonde par test et placer dans un tube à microcentrifugation.
7.
Mettre la sonde, la lame échantillon et une lamelle 24 mm x 24 mm à préchauffer sur une plaque chauffante à 37°C
(+/1ºC) pendant 10 minutes.
8.
Déposer 10 µl de sonde sur l’échantillon et couvrir avec une lamelle. Sceller avec du rubber cément et laisser
sécher.
Dénaturation
9.
Dénaturer simultanément la sonde et l’échantillon en plaçant la lame sur une plaque chauffante à 75°C (+/- 1ºC)
pendant 2 minutes.
Hybridation
10.
Incuber la lame pendant une nuit à 37°C (+/1ºC) à l’abri de la lumière et dans une chambre humide.
Lavages post-hybridation
11.
Retirer la lamelle et éliminer toutes traces de rubber cément.
°
12.
Laver la lame dans du tampon 0,4 x SSC (pH 7.0) à 72 C (+/- 1ºC) pendant 2 minutes.
13.
Egoutter la lame et laver dans du tampon 2 x SSC, 0,05% Tween-20 (pH 7.0) à température ambiante pendant 30
secondes.
14.
Egoutter la lame et déposer 10 µl de DAPI antifading.
15.
Couvrir avec une lamelle et laisser la coloration se développer dans l’obscurité pendant 10 minutes.
16.
Visualiser avec un microscope à fluorescence.
Stabilité des lames
Les lames FISH sont analysables pendant un mois si elles sont conservées à l’obscurité et à/ou au-dessous de la
température ambiante.
Recommandations
1.
L’utilisation d’un thermomètre calibré est fortement recommandé pour mesurer les températures des solutions,
bains-marie et incubateurs. Ces températures sont essentielles pour une efficacité optimale du produit.
2.
Les concentrations des lavages (stringence), pH et température sont importants. Une faible stringence peut
résulter en une liaison non-spécifique de la sonde et une trop forte stringence peut résulter en une perte de signal.
Interprétation des résultats
Dans une cellule normale, ces sondes apparaîtront comme des points rouges et verts individuels, un pour chaque
chromosome homologue (conduisant à une conformation 2V 2R). Chez un patient présentant une translocation t(9;22), on
doit observer deux signaux de fusion (jaune) en plus des signaux rouges et verts des chromosomes normaux 9 et 22
respectivement (1R 1V 2J).
Support Client
Veuillez contacter Cytocell, Département Ventes/Marketing ou votre agent local.
ITALIANO
L'ibridazione in situ in fluorescenza (Fluorescence In Situ Hybridisation - FISH) è una tecnica che permette di rilevare
sequenze di DNA su cromosomi in metafase o in nuclei in interfase di campioni citogenetici fissati, o in coltura dopo
prelievo. La tecnica prevede l'utilizzo di sonde di DNA in grado di ibridare con l'intero cromosoma o con singole
sequenze. La FISH costituisce quindi un potente strumento in aggiunta alle tecniche citogenetiche classiche. Il DNA
bersaglio, dopo la fissazione, è sottoposto a denaturazione al calore in presenza di formamide. Il DNA bersaglio è così
disponibile per l’annealing con una sonda di DNA a singola elica a sequenza complemetare, marcata con una sostanza
fluorescente. Terminata l’ibridazione, la sonda di DNA non legata o legata in modo non specifico, è rimossa per mezzo
di lavaggi stringenti ed il DNA è in seguito colorato con un colorante di contrasto. L’ibridazione della sonda viene infine
analizzata con un microscopio a fluorescenza.
Specifiche della sonda
BCR (22q11.23) Verde
ABL (9q34) Rosso
La presenza del cromosoma Filadelfia (Ph') ha importanti implicazioni in ambito diagnostico e prognostico in numerosi
disturbi a livello ematologico. L'aberrazione è caratteristica della leucemia mieloide cronica (CML), trovata in circa
il 90% dei casi, ma diventa rilevante nel 30% degli adulti e nel 2-10% dei bambini (Macdonald et al 2004) affetti da
leucemia linfoblastica acuta – (casi ALL) (Groffen et al., 1984; Shtivelman et al., 1985; Hermans et al., 1987). Questo
riarrangiamento è osservato anche nei rari casi di leucemia mieloide acuta (AML) (Nishida et al 2006).
Come risultato della traslocazione del cromosoma Filadelfia, t(9;22)(q34;q11), le sequenze 3' del proto-oncogene ABL
(Abelson) nel 9q34 sono unite alle sequenze 5' del gene BCR (regione del gruppo di breakpoint) nel 22q 11, originando l'ibrido
BCR/ABL o il gene di "fusione". Prakash e Yunis (1984) hanno individuato i breakpoint nella leucemia mieloide cronica in
corrispondenza delle sottobande 22q11.21 e 9q34.1. Sebbene la posizione del breakpoint nel cromosoma 9 sia abbastanza
variabile, quasi tutti i break si trovano nella regione 200 kb che copre gli esoni 1b-1a. Nel BCR esistono due regioni di
breakpoint: la m-BCR e la M-BCR. Nella leucemia mieloide cronica la maggior parte delle traslocazioni coinvolge la
M-BCR (Major Breakpoint Cluster Region) che si trova circa tra gli esoni 12 e 16. Nei casi di ALL i break finiscono
prevalentemente nella m-BCR (Minor Breakpoint Cluster Region) che si trova tra gli esoni 1 e 2 sebbene la
traslocazione risultante sia citogeneticamente identica a quella della leucemia mieloide cronica. Questi breakpoint
alternativi uniscono serie differenti di esoni di BCR ad una sottoserie comune degli esoni dell'ABL dando vita a due (2)
prodotti oncogeni alternativi, la p210 (BCR-ABL) e la p185 (BCR-ABL). Entrambe queste proteine di fusione possiedono
un'attività potenziata della tirosina cinasi, tramite l'attivazione dell'attività della tirosina cinasi dell'ABL con il legame
fisico diretto delle sequenze nel primo esone di BCR. Si ritiene che questa attività della cinasi sia necessaria per il
potenziale oncogenico dell'oncogene chimerico.
Nei casi ALL, il riarrangiamento è associato ad un risultato particolarmente scarso, con una sopravvivenza event-free
(EFS) del 15% o meno dopo 5 anni nei pazienti adulti e bambini trattati solo con chemioterapia (Fletcher et al 1992,
Secker-Walker et al 1978). Non esistono referti di sopravvissuti a lungo termine (Wetzler et al 1999). Il trapianto di
midollo osseo allogenico è l'unica terapia curativa per questi pazienti. I bambini con questo riarrangiamento sono
trattati secondo un protocollo a d a l t o r i sc h i o e a gl i ad u lt i vi e n e c on si gl i a t o u n i mme d ia t o t r a pia n t o
de l m i d ol l o os se o . La leucemia mieloide acuta (AML) positiva al cromosoma Filadelfia (Ph) è caratterizzata dalla sua
resistenza alla tradizionale chemioterapia convenzionale e da una prognosi infausta. L'identificazione accurata e rapida
di questa aberrazione cromosomica è quindi essenziale.
In un numero limitato di casi di ALL, la traslocazione non comporta una cromosoma Filadelfia geneticamente visibile. In
questi casi, il metodo FISH è indispensabile per evidenziare il gene di fusione (Van Rhee et al 1995).
Il prodotto Dual Fusion BCR/ABL della Cytocell contiene due miscele per sonda, una per il BCR e una per l'ABL,
che contiene anche una sonda per il gene ASS.
La miscela della sonda BCR contiene una sonda costituita dalla regione 3' del gene BCR (di 171 Kb) e che ibridizza
con i geni GNAZ e RAB36 e una seconda sonda (di 148 Kb) che ibridizza con una regione di 262kb all’estremità 5'
del gene che raggiunge 148kb. Entrambe sono marcate in verde e sono orientate in modo tale che i breakpoint nella
mBCR o nella MBCR generino un segnale di fusione. Per l'ABL la sonda di contiguità copre 349kb dalla metà del
gene FUB3 fino al punto 64kb dall'estremità 5' dell'ABL ed è marcata in rosso, mentre è presente una sonda rossa
aggiuntiva che copre la regione 212kb 3' dell'ABL, incorporando il gene ASS. Questa sonda aggiuntiva è lunga
193kb e ricopre il gene ASS per intero.
Materiali forniti
Sonda: 100µl per provetta (10 test)
Quantità di BCR probe: 70 ng/test
Quantità di ABL probe: 50 ng/test
La sonda è fornita già miscelata e pronta per l'uso nella soluzione di ibridazione (Formamide; Destrano solfato; SSC).
Colorante di contrasto: 150µl per provetta (15 test)
Il colorante di contrasto è il DAPI antifade (ES: 0,125µg/ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole))
Avvertenze e misure precauzionali
1.
Per uso diagnostico in vitro. Per uso professionale.
2.
Quando si manipolano le sonde ed il colorante di contrasto DAPI è necessario indossare i guanti.
3.
Le miscele di sonda contengono formamide, una sostanza teratogena. Non respirare i fumi ed evitare
il contatto con la pelle. Indossare guanti, camice da laboratorio e maneggiare in una cappa aspirante.
Per lo smaltimento, lavare con grandi quantità di acqua.
4.
Il DAPI è un potenziale cancerogeno. Maneggiare con cura, indossare guanti ed un camice da
laboratorio. Per lo smaltimento, lavare con grandi quantità di acqua.
5.
Eseguire lo smaltimento dei materiali pericolosi nel rispetto delle normative interne dell'istituzione
relative allo smaltimento dei residui tossici.
Conservazione e utilizzo
Conservare il kit Aquarius a –20°C fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. I flaconcini della sonda e del colorante
di contrasto devono essere conservati al buio.
Apparecchiature necessari non forniti
a)
Piastra riscaldante (con - un controllo accurato della temperatura fino ad 80°C).
b)
Micropipette a volume variabile compreso tra 1µl e 200µl.
c)
Bagno termostatato con controllo accurato della temperatura a 72°C.
d)
Provette da microcentrifuga (0,5 ml)
e)
Microscopio a fluorescenza (riferirsi alla sezione Configurazione ottimale del microscopio e dei filtri)
f)
Contenitori di Coplin in plastica o vetro.
g)
Pinzette.
h)
Olio per lenti ad immersione del microscopio a fluorescenza.
i)
Centrifuga da banco.
Configurazione ottimale del microscopio e dei filtri
Per una visualizzazione ottimale della sonda si raccomanda di utilizzare una lampada a mercurio da 100 watt ed obiettivi
plan apochromat 63x e 100x. Il filtro triplo DAPI/FITC/Texas Red è ottimale per visualizzare tutti e tre i fluorofori
contemporaneamente.
Preparazione del campione
Il kit è stato progettato per l'utilizzo con cellule del sangue periferico o cellule di midollo osseo coltivate, fissate nel
fissativo di Carnoy e preparate secondo le linee guida del laboratorio o dell'istituzione.
Preparare sospensioni dense di cellule ematiche o cellule del midollo osseo in metafase sui vetrini campione seguendo le
procedure standard di citogenetica.
Protocollo
Preparazione del vetrino
1. Caricare il campione cellulare su un vetrino da microscopia. Lasciare asciugare il vetrino.
2. Lavare il vetrino in SSC 2x per 2 minuti a temperatura ambiente (TA).
3. Disidratare in una serie di diluizioni di etanolo (70%, 85% e 100%), ognuna per 2 minuti a TA. Lasciare asciugare il
vetrino.
Pre-denaturazione
4. Rimuovere la sonda dal congelatore a -20°C e lasciarla riscaldare a TA
5. Accertarsi che la soluzione della sonda sia uniforme pipettando ripetutamente con delicatezza
6. Pipettare10µl di sonda per test ed inserirli in una provetta da microcentrifuga
7. Pre-riscaldare la sonda, il vetrino ed il coprioggetto da 24 x 24mm su una piastra riscaldante a 37°C (+/- 1ºC) per 10
minuti
8. Caricare 10µl di miscela della sonda sul campione cellulare e coprire delicatamente con il coprioggetto. Sigillare con
soluzione collante gommosa e far asciugare completamente
Denaturazione
9. Denaturare simultaneamente il campione e la sonda riscaldando il vetrino su una piastra riscaldante a 75°C (+/- 1ºC) per
2 minuti
Ibridazione
10. Disporre il vetrino in una camera umida, non permeabile alla luce, a 37°C (+/- 1ºC) per tutta la notte
Lavaggi post-ibridazione
11. Rimuovere accuratamente il vetrino coprioggetto e tutte le tracce di colla
12. Lavare il vetrino in SSC 0,4x (pH 7,0) a 72°C (+/- 1ºC) per 2 minuti
13. Scolare il vetrino e lavare in SSC 2x, Tween-20 0,05% (pH 7,0) a TA per 30 secondi
14. Scolare il vetrino e applicare 10µl di DAPI antifade
15. Coprire con un vetrino coprioggetto e far sviluppare il colore al buio per 10 minuti
16. Analizzare con il microscopio a fluorescenza
Stabilità del vetrino finito
I vetrini FISH restano analizzabili per circa 1 mese se conservati al buio a temperatura ambiente o inferiore.
Raccomandazioni per l'uso
1.
Si raccomanda fortemente l'utilizzo di un termometro calibrato per misurare la temperatura delle soluzioni, dei
bagni termostati e degli incubatori in quanto critiche per il funzionamento ottimale del prodotto.
2.
Le concentrazioni del lavaggio (stringenza), il pH e la temperatura sono importanti in quanto condizioni di
stringenza blande possono favorire un legame non specifico della sonda e condizioni di stringenza troppo alte
possono portare alla perdita del segnale.
Risultati attesi
Nelle cellule normali, queste sonde appariranno come punti discreti rossi e verdi, uno per ogni omologo (determinando una
conformazione 2G 2R). Nella t(9:22) di un paziente, dovrebbero essere presenti due segnali di fusione (gialli) in aggiunta
ai rispettivi segnali rosso e verde dei normali cromosomi 9 e 22 (1R 1G 2Y).
Assistenza clienti
Contattare l'Ufficio Commerciale e Vendita della Cytocell.
DEUTSCH
Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, mit der DNA-Sequenzen auf Metaphase-Chromosomen
oder Interphase-Kernen bei fixierten Kulturen oder nicht in Kultur gezüchteten zytogenetischen Proben nachgewiesen
werden können. Die Technik verwendet DNA-Sonden, die an gesamte Chromosomen oder an einzelne, einmalige
Sequenzen hybridisieren und dient als leistungsstarke Ergänzung zur klassischen Zytogenetik. Die Ziel-DNA wird zum
Denaturieren der doppelsträngigen DNA nach dem Fixieren mit Hitze und Formamid behandelt, wodurch sie
einzelsträngig wird. So kann sich die Ziel-DNA an eine ebenso denaturierte, einzelsträngige fluoreszenzmarkierte DNA-
DS085/CE Vers004/2008-04-14
Sonde mit komplementärer Sequenz anlagern. Nach der Hybridisierung werden nichtgebundene und nicht spezifisch
gebundene DNA-Sonden durch eine Reihe von Waschvorgängen unter stringenten Bedingungen entfernt und die DNA
zum Sichtbarmachen gegengefärbt. Unter dem Fluoreszenzmikroskop wird dann die hybridisierte Sonde am Zielmaterial
erkennbar.
Sondenspezifikation
BCR (22q11.23) Grün
ABL (9q34) Rot
Das Vorhandensein des Philadelphia-Chromosoms (Ph’) hat wichtige Implikationen für Diagnose und Prognose bei einer
Reihe von hämatologischen Störungen. Die Abnormität ist kennzeichnend für chronische myeloische Leukämie (CML)
und wird bei etwa 90% der Fälle gefunden, stellt aber nur bei 30% der Erwachsenen und bei 2 bis 10% von Kindern
(Macdonald et al 2004) mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL) eine signifikante Abnormität dar (Groffen et al., 1984;
Shtivelman et al., 1985; Hermans et al., 1987). Dieses Rearrangement findet man auch in seltenen Fällen bei akuter
myelogener Leukämie (AML). (Nishida et al 2006)
Als Ergebnis der Philadelphia-Translokation t(9;22)(q34;q11) gesellen sich die 3’ – Sequenzen des ABL(Abelson)-ProtoOnkogens auf 9q34 zu den 5’-Sequenzen des BCR-Gens (Messpunkt-Clusterregion) auf 22q 11, wodurch das BCR/ABL Hybrid- bzw.
„Fusions“-Gen entsteht. Prakash und Yunis (1984) haben die Messpunkte bei CML auf den Unterbändern 22q11.21 und
9q34.1 lokalisiert. Obwohl die Lage des Messpunkts auf Chromosom 0 ziemlich variiert, sitzen fast alle Messpunkte in
einem Gebiet von 200 Kb, das die Exone 1b bis 1a abdeckt. Bei BCR gibt es zwei Messpunktgebiete, nämlich m-BCR und
M-BCR. Bei CML betreffen die meisten Translokationen die größere Messpunkt-Clusterregion (M-BCR) die sich ungefähr
zwischen den Exonen 12 bis 16 befindet. Bei ALL fallen die Messpunkte meist in die kleinere Messpunkt-Clusterregion
(m-BCR), die zwischen den Exonen 1 und 2 liegt, obwohl die sich daraus ergebende Translokation zytogenetisch mit der
von CML identisch ist. Diese alternativen Messpunkte fügen verschiedene Sets von Exonen von BCR zu einem
gemeinsamen Unterset der Exonen des ABL, wodurch sich 2 alternative chimäre onkogene Produkte entstehen, nämlich
p210(BCR-ABL) und p185(BCR-ABL). Diese Fusionsproteine besitzen wegen der Aktivierung der ABL-TyrosinKinaseaktivität durch die direkte physische Bindung von Sequenzen im ersten Exon von BCR beide eine vermehrte
Tyrosin-Kinaseaktivität. Es wird angenommen, dass diese Kinaseaktivität für das onkogenetische Potential des chimären
Onkogens notwendig ist.
Bei ALL ist das Rearrangement mit einem äußerst schlechten Endergebnis verbunden. Man findet bei Erwachsenen und
Patienten im Kindesalter, die nur mit Chemotherapie behandelt wurden, ein schubfreies Überleben (EFS) von 15% oder
weniger nach 5 Jahren (Fletcher et al 1992, Secker-Walker et al 1978). Es gibt keine Berichte über Langzeit-Überlebende
(Wetzler et al 1999). Für diese Patienten ist eine allogene Knochenmarktransplantation die einzige heilkräftige Therapie.
Kinder mit diesem Rearrangement werden mit einem Hochrisiko-Protokoll behandelt und bei Erwachsenen wird eine
sofortige Knochenmarktransplantation empfohlen. Akute myeloische Leukämie (AML) mit positivem Philadelphie (Ph)Chromosom ist dadurch gekennzeichnet, dass sie auf die konventionelle Standardchemotherapie nicht anspricht und eine
schlechte Prognose hat. Die genaue und rasche Feststellung dieser Chromosomenabnormität ist daher lebenswichtig.
Bei einer kleinen Anzahl von ALL-Fällen führt die Translokation aufgrund nicht zu einem zytogenetisch sichtbaren
Philadelphia-Chromosom. In diesen Fällen ist FISH wesentlich wichtig, um das Fusionsgen hervorheben zu können. (Van
Rhee et al 1995).
Das Produkt Dual Fusion BCR/ABL von Cytocell enthält zwei Sondenmischungen, eine für BCR und eine für ABL.
Letztere enthält auch eine Sonde für das ASS-Gen.
Die BCR-Sondenmischung enthält eine Sonde 3’ von BCR, welche eine Region abdeckt, die sich über 171Kb 3’
erstreckt. Diese deckt die Gene GANZ und RAB36 ab. Eine zweite Sonde deckt eine Region von 262Kb 5’ für das
Gen ab das sich über 148Kb erstreckt. Beide sind grün markiert und so ausgerichtet, dass Messpunkte sowohl in
mBCR, als auch in MBCR ein Fusionssignal ergeben. Bei ABL deckt ein Sondenkontingent 349Kb von der Mitte
des FUB3-Gens bis zu einem Punkt 64Kb vom Ende 5’ des ABL ab. Dieses ist rot markiert, es gibt aber eine weitere
rote Sonde, die eine Region von 212Kb 3’ von ABL abdeckt und das ASS-Gen mit einbezieht. Diese zusätzliche
Sonde ist 193Kb lang und umspannt das ASS-Gen zur Gänze.
Kitkomponenten
Sonde: 100µl pro Röhrchen (10 Tests)
Menge an BCR: 70 ng/Test
Menge an ABL: 50 ng/Test
Die Sonden wird vorgemischt und gebrauchsfertig in Hybridisierungslösung geliefert (Formamid, Dextransulfat, SSC).
Gegenfärbung: 150µl pro Röhrchen (15 Tests)
Die Gegenfärbung besteht aus DAPI antifade (ES: 0.125µg/ml DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindol)).
2.
Die Konzentrationen der Waschlösungen (Stringenz), pH und Temperatur sind wichtig, da niedrig stringente
Bedingungen zu nicht-spezifischer Bindung der Sonde führen kann und zu hohe Stringenz zum Verlust des
Signals.
Erwartete Ergebnisse
Bei der normalen Zelle werden diese Sonden als getrennte rote und grüne Flecken erscheinen, von denen jeder für ein
Homolog steht (was eine Anordnung 2G 2R ergibt). Bei einem Patienten mit t(9:22) sollte es zusätzlich zu den roten und
grünen Signalen der normalen Chromosome 9 und 22 zwei (gelbe) Fusionssignale geben (1R 1G 2Y).
Kundendienst
Bitte wenden Sie sich an die Verkaufs- und Marketingabteilung von Cytocell.
ESPAÑOL
La hibridación in situ fluorescente (FISH) es una técnica que permite detectar secuencias de ADN en cromosomas
metafásicos o núcleos interfásicos en muestras citogenéticas cultivadas o no cultivadas y fijadas. En la técnica se utiliza
una sonda de ADN que hibridiza los cromosomas completos o las secuencias únicas simples y es un complemento útil
para la citogenética clásica. Después de la fijación, el ADN diana se trata con calor y formamida para desnaturalizar el
ADN bicatenario haciendo que resulte monocatenario. El ADN diana queda entonces disponible para hibridarlo con una
sonda de ADN igualmente desnaturalizado, monocatenario marcado con fluorescencia que tiene una secuencia
complementaria. Después de la hibridación la sonda de ADN no específicamente hibridada y no hibridada se elimina tras
varios lavados y se aplica un contraste al ADN para su visualización. El uso de un microscopio de fluorescencia permite
la visualización de la sonda hibridada en el material utilizado.
Especificaciones de la sonda
BCR (22q11.23) verde
ABL (9q34) rojo
La presencia del cromosoma Filadelfia (Ph') tiene una importante repercusión diagnóstica y pronóstica en una serie de
enfermedades hematológicas. Esta anomalía es característica de la leucemia mieloide crónica (LMC), apareciendo en el
90% de los casos, pero representa una anomalía significativa, en el 30% de los casos de leucemia linfoblástica aguda
(LLA) (Groffen y cols., 1984; Shtivelman y cols., 1985; Hermans y cols.., 1987) en adultos, y entre el 2% y el 10% de los
niños (Macdonald y cols. 2004). Este reordenamiento también se observa en casos raros de leucemia mielógena aguda
(LMA) (Nishida y cols. 2006)
Como resultado de la translocación Filadelfia, t(9;22)(q34;q11), las secuencias 3' del protooncogén ABL(Abelson) en 9q34
se unen a las secuencias 5' del gen BCR (Breakpoint cluster region) en 22q 11, dando lugar al gen híbrido o de ‘fusión’
BCR/ABL. Prakash y Yunis (1984) localizaron los puntos de rotura en la LMC en las subbandas 22q11.21 y 9q34.1.
Aunque la posición del punto de rotura en el cromosoma 9 es muy variable, casi todas las roturas se sitúan en una región
de 200 kb que cubre los exones 1b a 1a. En BCR existen dos regiones de escisión, m-BCR y M-BCR. En la LMC la
mayoría de translocaciones afectan a la región de clúster de rotura mayor (Major Breakpoint Cluster Region, M-BCR),
situada aproximadamente entre los exones 12 y 16. En la LLA, las escisiones aparecen principalmente en la región de
clúster de rotura menor (Minor Breakpoint Cluster Region, m-BCR), situada entre los exones 1 y 2, aunque la
translocación resultante es citogenéticamente idéntica a la de la LMC. Estos puntos de rotura alternativos unen diferentes
conjuntos de exones de BCR en un subconjunto común de los exones de ABL, dando lugar a dos productos oncogénicos
quiméricos alternativos p210(BCR-ABL) y p185(BCR-ABL). Ambas proteínas de fusión poseen una actividad tirosina
quinasa aumentada, a través de la activación de la actividad de la tirosina quinasa ABL por la unión física directa de
secuencias en el primer exón de la BCR. Se cree que esta actividad quinasa es necesaria para el potencial oncogénico del
oncogén quimérico.
En la LLA, la reordenación se asocia con un resultado pésimo, con una supervivencia sin acontecimientos (SSA) del 15%
o menos a cinco años en pacientes adultos e infantiles tratados solo con quimioterapia (Fletcher y cols. 1992, SeckerWalker y cols. 1978). No se ha referido ningún caso de supervivencia a largo plazo (Wetzler y cols. 1999). El transplante
alogénico de médula ósea es el único tratamiento curativo para estos pacientes. Los niños con esta reordenación son
tratados bajo un protocolo de alto riesgo y a los adultos se les recomienda para un transplante de médula ósea inmediato.
La leucemia mieloide aguda (LMA) con cromosoma Filadelfia (Ph) positivo se caracteriza por su resistencia a la
quimioterapia estándar convencional y por su mal pronóstico. Por tanto, es esencial realizar una identificación exacta y
rápida de esta anomalía cromosómica.
En un pequeño número de casos de LLA, las translocaciones no causan un cromosoma Filadelfia citogenéticamente
visible. En estos casos, el FISH es esencial para destacar el gen de fusión (Van Rhee y cols. 1995).
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1.
Zur Verwendung in der in vitro Diagnostik. Nur für die professionelle Verwendung
2.
Beim Umgang mit DNA-Sonden und der DAPI-Gegenfärbung Handschuhe tragen.
Sondenmischungen enthalten Formamid, das teratogen ist. Keine Dämpfe einatmen und nicht mit der Haut in
3.
Berührung bringen. Handschuhe und Labormantel tragen und unter einer Abzugshaube arbeiten. Bei der
Entsorgung mit viel Wasser nachspülen.
4.
DAPI ist ein potentielles Karzinogen. Vorsichtig damit umgehen , Handschuhe und Labormantel tragen. Bei der
Entsorgung mit viel Wasser nachspülen.
5.
Alle Gefahrstoffe sollten gemäß den Richtlinien Ihrer Einrichtung zur Gefahrstoffentsorgung entsorgt werden.
El producto de fusión dual BCR/ABL de Cytocell contiene dos mezclas de sondas, una para el BCR y otra para el
ABL, que también incluye la sonda para el gen ASS.
La sonda mixta BCR contiene una sonda 3’ de BCR que cubre una región que se extiende 171 kb 3’, que abarca los
genes GNAZ y RAB36, y una segunda sonda que cubre una región de 262 kb 5’ del gen que se extiende 148 kb.
Ambas están marcadas en verde, y están orientadas de tal forma que los puntos de corte de mBCR o MBCR
producirán una señal de fusión. Para el ABL una sonda contig. cubre 349 kb a partir del medio del gen FUB3 hasta
un punto a 64 kb del extremo 5' del ABL, que se marca en rojo, mientras que existe otra sonda roja adicional que
cubre una región de 212 kb 3’ de ABL y que incluye el gen ASS. Esta sonda adicional tiene una longitud de 193 kb y
abarca todo el gen ASS.
Lagerung und Behandlung
Das Aquarius-Kit sollte bis zum Ablaufdatum, das auf dem Kitetikett angegeben ist, bei –20°C gelagert werden. Die
Röhrchen mit den Sonden und der Gegenfärbung müssen im Dunkeln aufbewahrt werden.
Material proporcionado
Sonda: 100µl por vial (10 reacciones)
Sonda de la región de BCR: 70 ng/reacción
Sonda de la región de ABL: 50 ng/reacción
La sonda se proporciona mezclada previamente y lista para utilizar en la solución de hibridación (Formamida; sulfato de
dextrano; SSC).
Contraste: 150µl por vial (15 reacciones)
DAPI Antifade (ES: 0.125µg/ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol)).
Benötigte, aber nicht mitgelieferte Laborgeräte
a)
Heizplatte (mit stabiler Heizplatte und genauer Temperaturregelung bis 80°C)
b)
Mikropipetten mit variablem Volumen von 1 µµl -– 200 µµl
c)
Wasserbad mit genauer Temperaturkontrolle bei 72°C.
d)
Mikro-Zentrifugenröhrchen (0,5 ml).
e)
Fluoreszenzmikroskop (siehe auch “Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop”).
f)
Coplin-Färbetrog aus Kunststoff oder Glas.
g)
Pinzette.
h)
Für Fluoreszenzobjektive geeignetes Immersionsöl.
i)
Tischzentrifuge.
Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop
Zur bestmöglichen Beobachtung der Probe empfehlen wir die Verwendung einer 100 Watt Quecksilberdampflampe und
von Plan Achromat Objektiven mit 63-facher oder 100-facher Vergrößerung. Das Dreifach-Bandpasssfilter
DAPI/FITC/Texasrot ist für die simultane Beobachtung aller drei Fluorophore optimal geeignet.
Probenvorbereitung
Das Kit ist für Verwendung an kultivierten, peripheren Blutzellen, die in Carnoy’s Fixativ fixiert sind, ausgelegt und sollte
nach den Richtlinien des Labors oder der Einrichtung vorbereitet werden.
Präparieren Sie mit zytogenetischen Standardmethoden Metaphasen-Spreitungspräparate. Für verbesserte FISHErgebnisse und bessere Morphologie der Chromosomen wird empfohlen, die präparierten Objektträger über Nacht bei
Zimmertemperatur altern zu lassen.
FISH-Protokoll
Vorbereitung des Objektträgers
1.Zellprobe auf gereinigten Mikroskop-Objektträger auftropfen Trocknen lassen.
2.Objektträger für 2 Minuten in 2 x SSC bei Zimmertemperatur waschen (RT)
3.Entwässern in Alkoholreihe (70%, 85% und 100%), jeweils für 2 Min. bei RT. Trocknen lassen.
Vordenaturierung
4.Nehmen Sie die Sonde aus dem –20°C Gefrierschrank und lassen Sie diese sich auf Zimmertemperatur aufwärmen.
5. Durch wiederholtes, sanftes Mischen in der Pipette sicherstellen, dass die Sondenlösung homogen gemischt ist.
6. Pro Test 10µl Sonde entnehmen und in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben.
o
7. Sonde, Probenobjektträger und 24x24 Glasdeckplättchen zum Vorwärmen 10 Minuten auf eine Heizplatte mit 37 C (+/1ºC) geben.
8. 10µl Sondenmischung auf die Zellprobe auftropfen und Deckplättchen sorgfältig auflegen. Mit Gummikleber-Lösung
versiegeln und vollständig trocknen lassen.
Denaturierung
9. Denaturieren sie Probe und Sonde gleichzeitig durch zweiminütiges Erwärmen des Objektträgers auf einer Heizplatte
o
mit 75 C (+/- 1ºC).
Hybridisierung
10. Den Objektträger 1 Stunde lang, oder über Nacht bei 37°C (+/- 1ºC) in eine feuchte, lichtdichte Kammer geben.
Waschen nach der Hybridisierung
11. Deckgläschen und alle Kleberspuren vorsichtig entfernen.
°
12. Objektträger 2 Minuten in 0,4 x SSC (pH 7,0) bei 72 C (+/- 1ºC) waschen.
13. Objektträger abtropfen lassen und 30 Sekunden in 2 x SSC, 0,05% Tween -20 bei RT, (pH 7,0), waschen.
14. Objektträger abtropfen lassen und 10µl DAPI antifade auftragen.
15. Mit Deckgläschen abdecken und zur Farbentwicklung 10 Minuten im Dunklen lagern.
16. Unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachten.
Stabilität der fertigen Objektträger
Objektträger mit FISH-Proben können bis zu einem Monat lang analysiert werden, wenn sie im Dunkeln bei oder unter
Raumtemperatur gelagert werden.
Empfehlungen zur Durchführung
1.
Es wird dringend empfohlen, zur Temperaturmessung von Lösungen, Wasserbädern und Inkubatoren ein
geeichtes Thermometer zu verwenden, da diese Temperaturen für die optimale Leistung des Produkts
ausschlaggebend sind.
Avisos y precauciones
1.
Para diagnóstico in vitro. Sólo para uso profesional.
2.
Utilizar guantes al manipular las sondas de ADN y la contratinción DAPI.
La solución de hibridación contiene formamida, que es teratógena; no respire los vapores y evite el contacto con la
piel. Manipular con cuidado; utilizar guantes y bata de laboratorio. Al eliminarla, rociar con gran cantidad de agua.
3.
El DAPI y PI puede producir cáncer. Manipular con cuidado; utilizar guantes y bata de laboratorio. Al eliminarla,
rociar con gran cantidad de agua.
4.
Las sustancias peligrosas deben eliminarse de acuerdo con las instrucciones de su institución en relación con la
eliminación de sustancias peligrosas.
Almacenamiento y manejo
El kit Aquarius debe almacenarse a -20°C hasta la fecha de caducidad que se indica en la etiqueta del kit. Los viales de
contraste y de sonda deben almacenarse en un lugar oscuro.
Equipo necesarios pero no proporcionados
a)
Placa caliente (con una placa sólida y un control de temperatura preciso hasta 80°C).
b)
Micropipetas de volumen variable (rango 1µl -200µl)
c)
Baño de agua con control preciso de temperatura a 72°C
d)
Tubos de microcentrifugado (0,5 ml)
e)
Microscopio de fluorescencia (lea la sección Recomendaciones para el microscopio de fluorescencia)
f)
Recipientes de cristal y de plástico
g)
Pinzas
h)
Microscopio de fluorescencia con objetivo de inmersión en aceite
i)
Centrífuga de banco
Recomendaciones para el microscopio de fluorescencia
Para una visualización óptima de la sonda, se recomienda utilizar una lámpara de mercurio de 100 vatios y objetivos x63 o
x100 Plan-Apochromat. El filtro de triple banda DAPI/FITC/Texas Red es óptimo para ver simultáneamente los tres
fluorocromos.
Preparación de la muestra
El kit está diseñado para su uso en células sanguíneas periféricas cultivadas y fijadas o en células de médula ósea
cultivadas y fijadas en fijador de Carnoy, y deben prepararse de acuerdo con las instrucciones del laboratorio o la
institución.
Preparar las extensiones de sangre cultivada o médula ósea metafásica en los portaobjetos del microscopio según los
procedimientos citogenéticos estándar.
Protocolo FISH
Preparación del portaobjetos
1. Extender la muestra en un portaobjetos. Dejarlo secar
2. Lave el porta en 2 x SSC durante 2 minutos a temperatura ambiente (TA)
3. Deshidrate en una serie de etanol (70%, 85% y 100%), 2 minutos en cada una a TA. Dejarlo secar
Antes de la desnaturalización
4. Saque la sonda del congelador a -20°C y deje que se caliente a TA
5. Asegúrese de que la solución de la sonda es uniforme mezclando varias veces con la pipeta
6. Extraiga 10 µl de la sonda por prueba, poner en un tubo de microcentrífuga
7. Precaliente el portaobjetos y el cubreobjetos de cristal de 24 x 24 mm con la sonda y la muestra en una placa caliente a
37oC (+/- 1ºC) durante 10 minutos
8. Ponga 10µl de sonda sobre el portaobjetos y aplique cuidadosamente el cubreobjetos. Selle con solución de goma y
deje secar completamente
Desnaturalización
o
9. Desnaturalice la muestra y la sonda simultáneamente calentando el porta en la placa caliente a 75 C (+/- 1ºC) durante
2 min.
DS085/CE Vers004/2008-04-14
Hibridación
10. Ponga el porta en un contenedor húmedo a prueba de luz a 37oC (+/- 1ºC) toda la noche
Baños posthibridación
11. Quite el cubreobjetos y los restos de goma cuidadosamente
o
12. Lave el portaobjetos en 0,4 x SSC (pH 7,0) a 72 C (+/- 1ºC) durante 2 minutos
13. Seque el portaobjetos y lávelo en 2 x SSC, 0,05% Tween-20 (pH 7,0) a TA durante 30 segundos
14. Seque el portaobjetos y aplique 10µl del DAPI Antifade
15. Cubra con el cubreobjetos y deje que la preparación en la oscuridad durante 10 minutos para estabilizar el DAPI
16. Obsérvelo con el microscopio de fluorescencia
Estabilidad de los portaobjetos terminados
Los portaobjetos de FISH permanecen analizables durante 1 mes si se han almacenado en la oscuridad y por debajo de la
temperatura ambiente.
Recomendaciones de procedimiento
1.
Se recomienda encarecidamente el uso de un termómetro calibrado para medir la temperatura de las soluciones,
baños de agua e incubadores ya que estas temperaturas son cruciales para el rendimiento óptimo del producto.
2.
Las concentraciones de lavado, el pH y la temperatura son importantes puesto que un rigor escaso en el lavado
puede resultar en una fijación no específica de la sonda mientras que demasiada puede dar como resultado la falta
de señal.
Resultados esperados
En la célula normal, estas sondas aparecerán en forma de marcas rojas y verdes discretas, una para cada homólogo (que
producen una conformación 2G 2R). En un paciente de t(09:22:00), debería haber dos señales de fusión (amarillas) además
de la roja y la verde de los cromosomas normales 9 y 22, respectivamente (1R 1G 2Y).
Ayuda al cliente
Póngase en contacto con el departamento de marketing y ventas de Cytocell.
Patents and Trademarks
Aquarius and Cytocell are registered trademarks of Cytocell Ltd.
Any cyanine dyes used in this Product are manufactured on behalf of Amersham Pharmacia Biotech Inc. under an
exclusive license from Carnegie Mellon University and are covered by US Patent Number 5 268 486 and other patents
pending. The Compound in this Product is manufactured by NEN Life Science Products, Inc. under US Patent Numbers 5
047 519 and 5 151 507. Use of the Product for commercial purposes is strictly forbidden without written permission from
Amersham Pharmacia Biotech Inc. and NEN Life Science Products, Inc.
Cytocell Ltd.
4 Technopark
Newmarket Road
Cambridge, CB5 8PB, UK.
T: +44(0)1223 294048
F: +44(0)1223 294986
E: [email protected]
W: www.cytocell.com
004/2008-04-14
DS#085/CE
DS085/CE Vers004/2008-04-14

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