Matrici per cromatografia

STUDIO DELLE PROTEINE
Purificazione delle proteine
ª
ª
ª
ª
1.
2.
3.
4.
cromatografia
determinazioni quantitative concentrazione
elettroforesi
determinazione della massa
STUDIO DELLE PROTEINE
Purificazione delle proteine
ª 1.
Cromatografia:
ª Gel filtrazione
ª Scambio ionico
ª Interazioni idrofobiche
ª Affinità
Principi della separazione
cromatografica
• La separazione delle macromolecole e in
particolare delle proteine in cromatografia si
basa sull’ equilibrio di ripartizione tra:
– una FASE MOBILE,
MOBILE costituita dal solvente nel quale
è presente la miscela di proteine e contaminanti
– una FASE STAZIONARIA (associata ad un
supporto o MATRICE),
MATRICE che può avere
caratteristiche differenti (carica, idrofobicità,
presenza di liganti specifici, porosità…), in modo
tale da consentire l’interazione selettiva e
preferenziale di alcune macromolecole o proteine
rispetto ai contaminanti e consentirne così la
purificazione.
• Coefficiente di ripartizione
R=CS / CM dove CS corrisponde alla
concentrazione della proteina di interesse
nella fase stazionaria e CM nella fase mobile
Quale tecnica cromatografica? Criteri di
scelta
Schema del processo
H
A: tampone di eluizione
B: miscelatore o formatore di gradiente
C: sistema di pompaggio
D: colonna cromatografica
E: rivelatore
F: plotter per cromatogramma
G: raccoglitore di frazioni
H: rubinetto a tre vie o loop di
iniezione
Matrici per CROMATOGRAFIA
La matrice è il substrato solido
della fase stazionaria.
La matrice può essere modificata
tramite reazioni chimiche per
coniugare gruppi con differente
funzionalità:
Es. – gruppi carichi positivamente o
negativamente
- metalli (zinco, rame, nichel)
- molecole idrofobiche (C4-C18)
-ligandi specifici (coenzimi,
anticorpi)
Uno stesso gruppo funzionale può
essere coniugato a differenti
matrici, che conferiscono
diverse caratteristiche
chimico-fisiche.
Cellulosa:
Cellulosa
Dettaglio matrici cromatografia
E’ un polisaccaride lineare, formato da
MONOMERI di GLUCOSIO con legame β
1-4. [figura 1].
La presenza di 3 GRUPPI IDROSSILICI
per monomero rende la matrice MOLTO
IDROFILA e facile da derivatizzare.
Fig.1: Cellulosa: Struttura chimica
Fig.2: Trattamento della cellulosa asciutta (a) con
NaOH: effetti (b)
Agarosio:
Agarosio
E’ un polisaccaride ottenuto dall’agar
(estratto da alghe).
E’ composto da catene del disaccarise
AGAROBIOSO
(D-GALATTOSO
e
3,6-ANIDRO-1
GALATTOSO). [figura 3]
Struttura:
gel IDROFILO MOLTO POROSO ottenuto
per raffreddamento di soluzioni 2% w/v.
[figura 4].
Fig.3: Agarosio: Struttura chimica
Fig.4: Struttura del gel
Dettaglio matrici
Destrano
E’
un
POLISACCARIDE
EXTRACELLULARE prodotto dal batterio
Leuconostoc mesenteroides.
E’ formato da catene di GLUCOSIO con
legame α 1-6.
E’ meno stabile della cellulosa all’idrolisi
acida ma regge il trattamento con 0.1 M
di HCl fino a 2 ore.
Stabile a pH 2-12.
Cross-linking: EPICLORIDRINA
Poliacrilamide
Si ottiene per polimerizzazione
dell’ ACRILAMIDE.
L’agente che permette il cross-linking è la N,N’
METILEN-BISACRILAMIDE.
La matrice che si ottiene è adatta soprattutto
alla gel-permeation.
E’ autoclavabile e ha buona stabilità chimica
tuttavia il monomero dell’acrilamide (tossico) può
essere lentamente rilasciato.
Unità ripetitiva
della poliacrilamide
STUDIO DELLE PROTEINE
Separazione in base alla
dimensione/taglia
molecolare:
CROMATOGRAFIA DI GEL
FILTRAZIONE O
ESCLUSIONE
MOLECOLARE
Cromatografia di gel filtrazione
(o esclusione molecolare)
Teoria: ripartizione e costante
di avanzamento (Kav)
Ciascuna molecola presenta in cromatografia di gel
filtrazione un comportamento caratteristico dettato dalla
sua taglia molecolare e descritto da un coefficiente di
distribuzione (Kd) tra fase mobile e fase stazionaria.
Kd rappresenta la frazione della fase stazionaria
disponibile per la diffusione di una determinata
molecola
Operativamente tuttavia si preferisce definire una
COSTANTE DI AVANZAMENTO Kav che è facilmente
determinabile e come Kd descrive il comportamento della
molecola durante la separazione
Teoria: ripartizione e costante
di avanzamento (Kav)
Kav = (Ve –Vo) / (Vt – Vo)
Ve
Vo
Vt
=
=
=
volume
volume
volume
di eluizione
vuoto
totale
Rispetto alla Kd si effettua una semplificazione
considerando (Vt-Vo) invece di Vi=Vt-Vo-Vmatrice
(volume dei pori dentro la matrice disponibile per la
diffusione libera di piccole molecole)
Vo
Vt-Vo
Vt
L’efficienza di una colonna si valuta in base al numero di
piatti teorici per metro:
N=5.56x(Ve)2/ Vh x 100/L
dove:
Ve: volume di eluizione
Vh: volume a ½ altezza del picco
L: lunghezza della colonna in cm
Separazione 1% acetone
STUDIO DELLE PROTEINE
Separazione in base alla
carica superficiale:
CROMATOGRAFIA A
SCAMBIO IONICO
(scambio cationico per
proteine basiche o anionico
per proteine acide)
Cromatografia di scambio ionico (IEXC)
Sito carico sulla matrice della resina
Proteina o molecola carica da separare
Ione del sale che compete con il legame
La Ion EXchange Chromatography:
ªsepara in base a differenze di carica superficiale
Schema IEXC (scambio anionico)
A: colonna equilibrata con
bassa concentrazione di
NaCl
B: le macromolecole
cariche interagiscono con
la matrice spostando i
controioni associati (Cl - )
C: aumentando la
concentrazione di sali le
macro-molecole meno
acide vengono eluite
D: ad elevata
concentrazioni di sali
vengono eluite anche le
molecole molto acide
MATRICI FUNZIONALIZZATE
SCAMBIO ANIONICO
SCAMBIO CATIONICO
Per le proteine i gruppi principali coinvolti sono:
+
-
Lys (pKa= 10.5), Arg (pKa= 12.5), His (pKa= 6),
N-terminale (pKa= 9-11)
Glu, Asp (pKa= 2-5), Cys (pKa= 8.3), Tyr (pKa= 10)
pI: pH al quale la carica netta della proteina è nulla
pH < pI< pH
+
-
Visto il tipo di interazione è necessario che la proteina sia carica e
quindi la separazione si effettua ad un pH che sia almeno 1 unità
maggiore o minore del pI.
NB: interessa la carica SUPERFICIALE e LOCALE anche se pH=pI
La cromatografia a scambio ionico prende il nome di:
SCAMBIO ANIONICO
+
SCAMBIO CATIONICO
in base alla carica del CONTROIONE che può associarsi e
dissociarsi dalla fase stazionaria carica.
Effetto del pH
Carica proteina
+
-
pH acido
pH basico
Eluizione
L’eluizione può essere:
ª ISOCRATICA: la composizione dell’eluente
non cambia
tempo
ª CON
Conc.
eluente
GRADIENTE
A
SCALINI:
la
composizione viene cambiata in modo
discontinuo almeno una volta, per eluire
selettivamente.
Conc.
eluente
Dopo l’applicazione del campione le colonne (ad eccezione dei quelle per
gel-filtrazione) vengono solitamente lavate con un volume dello stesso
tampone utilizzato per equilibrarle; questo per rimuovere i
contaminanti non legati.
tempo
varia in modo continuo, incrementando
gradualmente le condizioni favorevoli alla
dissociazione delle molecole di interesse dalla
colonna
Conc.
eluente
ª CON GRADIENTE CONTINUO: il gradiente
tempo
Esempi di effetto del gradiente
Pendenza del gradiente:
Un gradiente RIPIDO (“STEEP”)
permette di ottenere picchi più stretti
(la coda del picco è eluita ad una
velocità leggermente
maggiore del
fronte perché sottoposta all’effetto di
una
maggiore
concentrazione
dell’eluente).
Tuttavia la risoluzione può essere
diminuita perché la selettività (=
distanza tra i picchi) è minore.
Diminuendo la pendenza del gradiente
(“SHALLOW” gradient) di ha un
maggior effetto di allargamento delle
bande e i picchi sono più larghi e
spesso scodati ma si possono risolvere
meglio.
In alcuni casi, se si ha a disposizione un
formatore di gradiente automatico, si
possono
programmare
in
modo
alternato segmenti di gradiente lineare
a diversa pendenza.
STUDIO DELLE PROTEINE
Separazione in base alla
idrofobicità superficiale:
CROMATOGRAFIA DI
INTERAZIONE
IDROFOBICA
Cromatografia di interazione idrofobica
(HIC): teoria
Si basa sull’interazione idrofobica tra la superficie della resina (che porta
gruppi octile o fenile) e quella della proteina (o macromolecola) da separare.
La proteina possiede sulla superficie un film di molecole d’acqua in struttura
ordinata in corrispondenza delle regioni idrofobiche. L’ interazione di queste
regioni con altre della stessa natura è favorita da un ∆S > 0: la rimozione di
queste molecole d’acqua ordinate aumenta l’entropia del sistema. Il ∆G = ∆H -T
∆S risulta negativo e la reazione è perciò spontanea (∆H è piccolo).
STUDIO DELLE PROTEINE
Separazione in base a
caratteristiche di funzione:
CROMATOGRAFIA DI
AFFINITA’
Cromatografia di affinità:
Utilizzata per purificare biomolecole che si assorbono in modo
SPECIFICO e REVERSIBILE ad un ligando immobilizzato sulla matrice.
P+L
PL
KL= [P] [L]
[PL]
[L] = [PL]
KL [P]
Se
1: condizione ideale, il ligando e la biomolecola non vengono alterati
2: si promuove un cambiamento di conformazione di P e L
3: competizione con molecola simile a P, L rimane bloccato
4: competizione con molecola simile a L, P rimane bloccato
[PL]=95
[P] 5
allora KL deve
essere 1/100
della [L] (es.
[L] = 1mM
allora KL deve
essere 10 –5 M
Range utile:
KL=10 –4 10 –8M
Cromatografia di affinità: tabella ligandi
utilizzati
Riconoscimento di “TAG” e “FLAG” in proteine
ricombinanti
Le proteine ricombinanti vengono spesso espresse come proteine
di fusione in vettori specifici.
Il vettore possiede un sito di inserzione della sequenza codificante
“in FRAME” con la traduzione sequenza che codifica per una
proteina o un frammento di proteina all’N o al C terminale della
proteina da purificare.
Questo TAG o FLAG è una “etichetta” o “bandierina” di
riconoscimento che può essere selettivamente legata ad anticorpi,
ligandi o recettori specifici per cromatografia di affinità.
Il frammento FLAG viene poi rimosso per azione di una proteasi
specifica, il cui sito di riconoscimento viene anch’esso progettato
sul vettore in modo da risultare nella posizione adatta ad ottenere
la proteina di interesse nella forma integra e nativa.
Resina coniugata all’avidina per proteine
ricombinanti Biotin-TAG
Maltose-binding-protein
Proteine di fusione con
Glutatione-S-transferasi
(GST)-TAG
: CATECOLO 1,2 DIOSSIGENASI
OH
6
5
1
4
Cat1,2DO
OH
OH
O2
OH
OH
2
3
Catecolo
OH
COOH
COOH
Acido cis-cis muconico
Proteine di fusione con
Glutatione-S-transferasi
(GST)-TAG:
FASE 1: caricamento del campione
FASE 2: lavaggio per rimuovere i contaminanti
proteine contaminanti di E.coli
FASE 3: eluizione specifica della proteina
di fusione con glutatione libero
PRINCIPIO: Il glutatione libero in
eccesso compete con il glutatione coniugato
alla matrice e pertanto spiazza la proteina
legata che si ritrova nella fase mobile e viene
raccolta nell’eluato
Cromatogramma
3
2,9
2,8
2,7
Numero frazioni
ASSORBANZA 280 nm
2,6
1
2,5
2
2,4
2,3
3
2,2
4
2,1
5
2
1,9
7
1,8
8
1,7
9
10
11
12
Abs 280 nm
6
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
frazione
9
10
11
12
13
14
15
16
STUDIO DELLE PROTEINE
Purificazione delle proteine
Determinazione quantitativa
della concentrazione
ª 2.
Determinazione della concentrazione di
proteine totali
METODI
Indiretti
Metodo di Kjeldahl (determinazione dell’azoto totale)
Diretti
Spettrofotometria UV (280 nm e lontano UV)
Metodo del Biureto
Metodo di Lowry
Metodo di Markwell (o Lowry modificato)
Metodo di Bradford (o del legame con coloranti)
Metodo dell’acido bicinconinico (BCA)
Metodo Silver-binding
Metodi spettrofotometrici
Premessa:
Premessa tutti i metodi diretti di dosaggio delle proteine
si basano sulla rilevazione spettrofotometrica e quindi
sull’analisi quantitativa dello spettro UV/visibile.
I0
I
I0 = intensità luce incidente
I = intensità luce trasmessa
Trasmittanza: T = I/I0 (I0=100)
Assorbanza. A = = log 1/T
A=Log I0/I
T varia tra 0-100
A varia tra 0-∞ (max. 2-4)
∆x
∆I
−∆I= ∆x I K
-dI=I K dx
-dI/I=Kdx
∫I dI/I =-K∫x dx
I0
∆x
0
ln I0/I =Kx
Legge di Lambert-Beer
Se ln (I0/I) ∝ A risulta che
A=Log I0/I = Kx/2.303= K’ x
con K’= ε c
A=ε c x
ε = A/cx in M-1 cm-1
Spettrofotometria UV
La maggior parte delle proteine presenta un massimo di assorbimento a
280 nm, dovuto al gruppo fenolico della tirosina e al gruppo indolico
del triptofano.
Il coefficiente di estinzione molare ε può essere espresso come ε280 1%
o ε280 1 mg/ml e varia in modo significativo da proteina a proteina, a
seconda della composizione aminoacidica e della struttura. Il range
è 0.4-1.5 con estremi a 0 (parvalbumina e proteine leganti il calcio
correlate) e 2,65 (lisozima).
Il metodo è quindi poco accurato e viene utilizzato solo quando l’ ε è
noto e la calibrazione è stata effettuata contro uno standard della
stessa proteine, possibilmente pesata (peso secco).
La sensibilità è relativamente bassa e richiede 0.05-2 mg di
proteina/ml.
Inoltre è sensibile alle interferenze di altri composti che assorbono
nella stessa regione dello spettro UV, in particolare acidi nucleici
(260 nm). In questo caso si può applicare la formula di correzione:
PROTEINA (mg/ml) = 1.55 A280 – 0.76 A260
Si utilizzano cuvette in quarzo
Il metodo è rapido e NON DISTRUTTIVO
Metodo di Bradford
Questo metodo si basa
sull’interazione con il colorante
Coomassie Brilliant Blue G250. Il
legame con le proteine causa uno
shift della assorbanza massima da
465 a 595 nm.
Molto sensibile: 0.2-1.4 mg prot./
ml (5-100 µg /ml microassay)
E’ molto dipendente dalla composizione in aminoacidi: SI LEGA AGLI
AMINOACIDI BASICI (soprattutto arginina) e AROMATICI (interazioni
idrofobiche).
Assorbanza 595 nm
2
1,9
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
5
10
15
Concentrazione (µ g/ml)
20
25
Volume
totale
(ml)
EG
C1,2DO
Concentrazion
e proteine
(mg/ml)
Protein
e totali
(mg)
Attività per
50 µl di
campione
(∆Abs/min)
Attivit
à
totale
(∆Abs/
min)
Attività
specifica
(∆Abs/min/
mg proteina)
Attività
specifica
(∆conc M
/min/mg
proteina)
Fattore
di
purifica
zione
1
Resa
%
100
STUDIO DELLE PROTEINE
Purificazione delle proteine
ª3.
Elettroforesi:
ª elettroforesi su gel di poliacrilamide
ª SDS-PAGE
Elettroforesi
In generale, si tratta di un processo mediante cui molecole cariche si
separano, in presenza di un campo elettrico, in base alla loro
diversa mobilità.
La mobilità o velocità di migrazione v dipende da:
E: intensità del campo elettrico
z: carica netta superficiale della particella
f: coefficiente di forza contraria alla migrazione
La relazione è la seguente:
v =
E
z
f
anche se si preferisce definire non le velocità di migrazione assoluta
(v = distanza / tempo) ma la mobilità relativa (Rf = distanza
percorsa dalla particella d’interesse / distanza percorsa da un
colorante - traccia anionico ad elevato rapporto carica:massa):
zE
Rf =
f
Mobilità elettroforetica
• viene definita come:
µ = v/E = z/f
• NB: Il coefficiente frizionale f dipende
dalle dimensioni, dalla forma e dallo stato
di solvatazione della molecola carica che
migra nel campo elettrico
• IN PRATICA LA MOBILITA’ DIPENDE
DAL RAPPORTO CARICA/MASSA
Elettroforesi su gel poliacrilammide
(PAGE e SDS-PAGE)
OSO3
Na+
sodio dodecil solfato
Proteina
L’SDS conferisce un eccesso di carica negativa alla proteina e ne
promuove lo srotolamento
SDS-PAGE: sistema discontinuo
pH=8.2
pH=6.8
Acrilamide 4%
pH=8.8
Acrilamide 12%
In questo sistema il
campione caricato nel
pozzetto viene
concentrato
all’interfaccia tra
stacking e running gel e
la separazione effettiva
avviene nel running gel
con migliore risoluzione
STUDIO DELLE PROTEINE
Purificazione delle proteine
ª4. determinazione della massa
ª tramite SDS-PAGE
ª tramite cromatografia di esclusione
molecolare
In SDS-PAGE esiste una
relazione lineare tra Rf
e log MW
Rf=
Distanza migrazione del campione
Distanza migrazione del fronte
Lf: Distanza migrazione del fronte (colorante)
Lc: Distanza migrazione del campione (proteina)
97
66
45
31
21
14
kDa
Lc
Lf
CROMATOGRAFIA DI GEL FILTRAZIONE:
Esiste una relazione lineare tra la Kav e il
logaritmo della taglia molecolare
Separazione di campioni proteici a massa molecolare nota
Log MW
(variabile x)
Log MW
di
campioni
standard
noti
Kav
(variabile y)
Kav
determi
nata per
campioni
standard
noti
Per un campione di
MW ignota si
misura la Kav e si
risale al MW
Kav = f(log MW)
0<Kav<1