Lezione15_Microscopi.. - Università Politecnica delle Marche

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Università Politecnica delle Marche, Facoltà di Agraria
C.d.L. Scienze e Tecnologie Agrarie, A.A. 2014/2015, Fisica
Microscopia – metodi, limiti, possibilità
Incrementando di un fattore 10 la potenza dell’occhio umano tramite
il suo telescopio, Galileo Galilei è riuscito a studiare la superficie della
Luna e scoprire i satelliti di Jupiter.
15.02.1564 –
08.01.1642
Primi
microscopi:
Microscopio moderno:
Microscopio a fluorescenza
Questo tipo di microscopio utilizza
radiazioni ultraviolette, per ottenere, nei
preparati in cui ciò è possibile, la
fluorescenza.
Però c’è un limite!
La visione distinta di oggetti sempre più piccoli non può essere ottenuta
solamente aumentando il potere di ingrandimento. La diffrazione pone un
limite inferiore alla distanza di separazione tra due punti in posizioni distinte.
Questa distanza minima è data da:
dmin = 1,2λ / 2n sinα (limite di Abbe)
dove λ è la lunghezza d'onda della luce che illumina l'oggetto, n l'indice di
rifrazione del mezzo interposto tra oggetto e obiettivo, α il semi-angolo del
cono di raggi utili che ha il vertice nel centro dell'obiettivo.
Luce nello spettro visibile: 380nm ≤ l ≤ 750nm; limite di Abbe ≈ 250nm
Il Microscopio Elettronico a
Scansione (SEM)
Il potere risolutivo cresce proporzionalmente al
decrescere della lunghezza d’onda della radiazione
impiegata, infatti la scoperta che gli elettroni hanno
una radiazione di bassissima lunghezza d’onda ha
suggerito la possibilità di usare fasci di elettroni per
ottenere poteri risolutivi assai elevati.
Cosa è la Microscopia Elettronica
Tecnica
che
permette
l’osservazione di campioni con
ingrandimenti e risoluzione fino a
1000 volte superiore alla
microscopia ottica ordinaria.
Alcuni cenni storici
• 1897: J. Thomson scopre l’elettrone
• 1924: L. de Broglie propone la teoria ondulatoria della materia
• 1926: H. Busch dimostra che i campi elettrici e magnetici a
simmetria assiale si comportano come lenti per gli elettroni
Nascita dell’ottica elettronica
• 1934: E. Ruska primo prototipo di TEM
• 1938: von Ardenne primo prototipo STEM
• 1942 Zworykin realizza il primo prottipo di SEM capace di
analizzare campioni massivi.
• 1960 Everhart e Thornley introducono il loro rivelatore per
elettroni secondari, basato su scintillatore e tubo
fotomoltiplicatore
• 1965: Cambridge Instruments produce e commercializza il
primo SEM
• 1986: Ruska vince il Nobel
IL SEM
• In linea di principio un microscopio elettronico opera come
un normale microscopio ottico qualora si usasse luce con
lunghezza d’onda bassissima.
•
Poiché però i normali dispositivi ottici non deviano gli
elettroni, si ricorre a lenti elettrostatiche o a lenti
magnetiche che, agendo sulla carica elettrica degli
elettroni, ne provocano la deviazione.
IL SEM
• Il Microscopio Elettronico a Scansione sfrutta la generazione di
un fascio elettronico ad alta energia nel vuoto.
• Il fascio viene focalizzato da un sistema di lenti e deflesso per
scandire una area del campione.
• L’interazione fascio-campione genera vari segnali che vengono
acquisiti da opportuni detectors e successivamente elaborati
fino a formare una immagine a livelli di grigio.
SEM moderno:
I pregi del SEM
Da indicazioni su:
• morfologia della superficie del campione
• composizione chimico fisica
• difettosità elettriche
• contaminazione delle superfici
• misura dei potenziali superficiali
•
•
•
•
Alta risoluzione (limite 1nm)
Alti ingrandimenti (fino a 100.000x)
Alta profondità di campo
Abbastanza facile preparazione del campione
La combinazione di alti ingrandimenti, alta risoluzione, larga
ampiezza del fuoco e facile preparazione e osservazione del
campione rende il SEM uno degli strumenti più affidabili e più
semplici da utilizzare per lo studio della morfologia di vari campioni.
Confronto tra microscopie
MO
SEM
TEM
1-1000
10-10000
1000-1000000
5mm
50nm
5nm
Per osservazioni accurate
0,2mm
5nm
0.5nm
Limite
0,1mm
1nm
0.1nm
0,1mm a 10x
10mm a 10x
limitata allo spessore del film
1mm a 100x
1mm a 100x
limitata allo spessore del film
versatile
richiede il vuoto (0,03Pa)
richiede il vuoto (0,03Pa)
Range di ingrandimento
Risoluzione
Ordinaria
Profondità di campo
Ambiente
Grano di pepe (Piper nigrum)
tarantola messicana
Foglia di menta
Foglia di canapa indiana
Pollini di Compositae al microscopio elettronico a scansione
Creste delle cellule vegetali
Coccolithophore (alga) Emiliania huxleyi
Peli sul fusto di una pianta di tabacco
Tricomi sulla pianta Juglandales Juglandaceae
Tricoma sulla foglia di Arabidopsis thaliana
Fusto di bamboo
Microscopio
elettronico a
trasmissione
(TEM)
Caratteristiche del TEM
• Potere risolutivo altissimo (0,2 nm), dell’ordine delle
molecole.
• Fino a 1.000.000 X.
• Richiede sezioni sottilissime, colorate solitamente
con metalli e mantenute sotto vuoto: artefatti
inevitabili.
• Non si possono osservare strutture viventi, né in 3D.
TEM
vs
SEM
Microscopio ottico
Microscopio a raggi X
Microscopi elettronici e ionici
- Microscopio elettronico a scansione (SEM)
- Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
- Microscopio elettronico a diffrazione
- Microscopio elettronico ad emissione di campo
- Microscopio ionico
Microscopi a scansione di sonda (SPM)
- Microscopio a scansione per effetto tunnel (STM)
- Microscopio ottico a scansione in campo prossimo (SNOM)
- Microscopio a forza atomica (AFM)
Altre tipologie di microscopio
- Microscopio acustico
- Microscopio confocale + forza atomica + riflessione interna totale in fluorescenza
SEM – UNIVPM (Dipartimento SIMAU):
SEM
PHILIPS
XL20 con
EDS
Microscopio a forza atomica –
Dipartimento Di.S.C.O.
Erythrocytes, contact mode
scan field 40 µm * 40 µm
z-range 0 – 2.1 µm
Superficie della castagna, tapping mode
scan field 30 µm * 30 µm
z-range 0 – 6 µm
Microtomografia computerizzata a raggi X o radiazione di
sincrotrone:
Strumento desktop Skyscan: risoluzione tipica nell’ordine dei micron.
European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, France
www.esrf.
fr
Schematic set up of microCT
system installed at ID19 in
ESRF
Visualizzare la struttura interna del legno utilizzando
microtomografia computerizzata
ricostruzione 3D del legno
Radiografia neutronica:
Differenza tra una radiografia
neutronica e una a raggi X: i
liquidi vengono visualizzati
molto
neutroni.
bene
utilizzando
Tomografia neutronica:
L’assorbimento dell’acqua nelle piante
l’assorbimento di D2O in 5 min

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