Monoclonal Mouse Anti-Human Octamer-Binding

Monoclonal Mouse
Anti-Human
Octamer-Binding Transcription Factor 3/4
Clone N1NK
Codice M3649
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
Monoclonal Mouse Anti-Human Octamer-Binding Transcription Factor 3/4, Clone N1NK, è destinato all'utilizzo in
ambito immunoistochimico. Gli anticorpi diretti contro la proteina OCT3/4 (Octamer-binding Transcription Factor
3/4) possono essere utilizzati per l'identificazione di sottotipi specifici di tumori delle cellule germinali, tra i quali il
seminoma, il carcinoma embrionale e la neoplasia intratubulare a cellule germinali di tipo non classificato (IGCNU)
(1-4). L'interpretazione clinica di qualsiasi colorazione o della sua assenza deve essere completata da studi
morfologici usando controlli corretti e deve essere valutata nel contesto dell'anamnesi clinica del paziente e di altri
esami diagnostici eseguiti da un patologo qualificato.
Sinonimo
dell'antigene
Octamer binding protein-3 (OCT3), Octamer Transcription Factor-3 (OTF3), Octamer binding protein-4 (OCT4),
Octamer Transcription Factor-4 (OTF4), POU5F1 (1-3, 5, 6).
Cenni
introduttivi
Dal gene OCT4 umano localizzato sul cromosoma 6, vengono generate per splicing alternativo due varianti di
mRNA, originariamente denominate OCT3A e OCT3B (7), da cui il nome OCT3/4. Le isoforme OCT3A e OCT3B
sono rispettivamente di 360 e 265 aminoacidi, di questi, i 225 aminoacidi C-terminali sono identici. OCT3/4
appartiene alla famiglia dei fattori di trascrizione POU (Pit-Oct-Unc), i quali sono in grado di attivare i geni target
tramite il legame a un motivo con sequenza ottamerica della sequenza consensus AGTCAAAT (6). OCT3/4 è
espresso nelle cellule dell'embrione precoce e nelle cellule germinali (1) e ha un ruolo determinante nella
regolazione dei geni responsabili di auto-rinnovamento, pluripotenza e commitment nelle cellule staminali
embrionali e nelle cellule staminali pluripotenti indotte (5). L'espressione di OCT3/4 viene rilevata anche in specifici
sottotipi di tumori delle cellule germinali, quali seminomi, germinomi, disgerminomi, carcinoma embrionale,
componente a cellule germinali dei gonadoblastomi e IGCNU (1, 2, 4).
Fare riferimento al documento General Instructions for Immunohistochemical Staining (Istruzioni generali per la
colorazione immunoistochimica) di Dako o alle istruzioni sul sistema di rilevazione per le procedure IHC.
Reagente fornito
Anticorpo monoclonale murino fornito in forma liquida come sopranatante per colture cellulari in tampone Tris-HCl
0,05 mol/L, sodio azide 0,015 mol/L, pH 7,2. Contiene una proteina stabilizzante.
Clone: N1NK. Isotipo: IgG1.
Concentrazione di IgG murine in mg/L: vedere l'etichetta sul flacone.
La concentrazione della proteina tra i lotti potrebbe variare senza influenzare la diluizione ottimale. La titolazione di
ogni lotto viene confrontata e regolata in base ad un lotto di riferimento per garantire una colorazione
immunoistochimica coerente tra i lotti.
Immunogeno
Proteina ricombinante corrispondente a 147 aminoacidi N-terminali della proteina OCT3/4 umana.
Specificità
Nei lisati cellulari hES-TW1 analizzati tramite Western blotting, l'anti-OCT3/4, clone N1NK, riconosce una banda
principale di ~40 kDa, peso molecolare atteso per OCT3/4 (8).
Precauzioni
1.
Per uso professionale.
2.
Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura.
Sebbene alle concentrazioni del prodotto non sia classificata come pericolosa, la sodio azide può reagire con
il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento del
prodotto, far scorrere abbondante acqua nelle tubature per impedire la formazione di azidi metalliche.
3.
Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.
4.
Indossare dispositivi di protezione individuale appropriati per evitare il contatto con gli occhi e la cute.
5.
La soluzione non utilizzata deve essere smaltita in conformità alle normative locali e nazionali vigenti in
materia.
Conservazione
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Conservare a 2-8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sul flacone. Nel caso in cui i reagenti
vengano conservati diversamente da quanto specificato, le condizioni dovranno essere verificate dall'utente. Non
è possibile indicare segni evidenti di instabilità del prodotto. Pertanto, è necessario analizzare gli opportuni
controlli positivi e negativi contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Se si osserva una colorazione inattesa
non imputabile a variazioni delle procedure di laboratorio e si sospetta un problema associato all'anticorpo,
contattare l'Assistenza tecnica Dako.
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Guida rapida*
Fase
Fissazione
Pretrattamento
Commenti
Formalina
EnVision FLEX™, High pH (codice K8004)
N/A
HIER 20 min, 3-in-1 con PT Link e PT
Link Rinse Station
Diluizione
1:50
Incubazione 20 min
Tampone di
diluizione
Controllo negativo
Dako Antibody Diluent (codice S0809)
Diluire immediatamente prima dell'uso
Negative Control, Mouse IgG1 (codice X0931)
Incubazione 20 min
Visualizzazione
EnVision™ FLEX+, High pH (codice
K8002/K8012)
20 min totali di incubazione, 15 min per
il Mouse (LINKER), 2x5 min per DAB+
Colorazione di
contrasto
Tessuto di
controllo
EnVision™ FLEX Hematoxylin (codice
K8008/K8018)
Seminoma
5 min di incubazione
Vetrini
FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020)
Consigliati per applicazioni in cui è
richiesta una maggiore aderenza delle
sezioni di tessuto ai vetrini.
Montaggio
È richiesto il montaggio permanente e non
acquoso
Una volta completata la procedura di
colorazione, le sezioni devono essere
disidratate, diafanizzate e montate
utilizzando un mezzo di montaggio
permanente.
Strumentazione
Autostainer Link 48 e Autostainer Plus
Utilizzare fiale specifiche per lo
strumento (codici SK200-SK203 e
S3425)
Colorazione nucleare. Una colorazione
citoplasmatica, in presenza di una forte
colorazione nucleare, è considerata
accettabile.
*Si raccomanda all'utente di leggere sempre il foglietto informativo contenuto nella confezione per istruzioni dettagliate sulla
procedura di colorazione e la manipolazione del prodotto.
Preparazione dei
campioni
Sezioni in paraffina: è possibile utilizzare l'anticorpo per la marcatura delle sezioni di tessuto incluse in paraffina e
fissate in formalina. I campioni di tessuto devono essere tagliati in sezioni di approssimativamente 4 µm.
Pretrattamento: è necessario il pretrattamento di sezioni di tessuto incluse in paraffina e fissate in formalina con la
tecnica dello smascheramento antigenico termoindotto (HIER). Per risultati ottimali, eseguire il pretrattamento dei
tessuti con HIER utilizzando la soluzione diluita EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (codice
K8004). La deparaffinazione, la reidratazione e lo smascheramento dell'epitopo possono essere eseguiti in Dako
PT Link (codice PT100/PT101). Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link. Per PT Link, attenersi a seguenti
parametri: temperatura di preriscaldamento: 65 °C; temperatura e tempo per smascheramento antig enico: 97 °C
per 20 (±1) minuti; raffreddamento fino a 65 °C. Ri muovere il rack dei vetrini dal serbatoio PT e immergere
immediatamente i vetrini in un'apposita vaschetta/serbatoio (ad es. PT Link Rinse Station, codice PT109)
contenente il tampone di lavaggio diluito EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) (codice K8007) a temperatura
ambiente. Lasciare i vetrini nel Wash Buffer per 1-5 minuti.
Le sezioni di tessuto non devono essiccarsi durante il trattamento o durante la successiva procedura di
colorazione immunoistochimica. Affinché le sezioni di tessuto aderiscano perfettamente ai vetrini, si consiglia di
utilizzare FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020). Una volta completata la procedura di colorazione, le
sezioni devono essere disidratate, diafanizzate e montate utilizzando un mezzo di montaggio permanente.
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Procedura di
colorazione
Diluizione: la diluizione consigliata di Monoclonal Mouse Anti-Human Octamer-Binding Transcription Factor 3/4,
Clone N1NK, codice M3649, è 1:50. Diluire l'anticorpo in Dako Antibody Diluent (codice S0809). Incubare le
sezioni di tessuto pretrattate per 20 minuti a temperatura ambiente. Queste informazioni sono fornite
esclusivamente come linee guida. Le condizioni ottimali possono variare a seconda del tipo di campione e del
metodo di preparazione adottato, pertanto dovranno essere convalidate autonomamente da ogni laboratorio.
Controllo negativo: il reagente di controllo negativo consigliato è Dako Negative Control, Mouse IgG1 (codice
X0931), diluito alla stessa concentrazione di Ig dell'anticorpo primario. A meno che la stabilità dell'anticorpo e del
controllo negativo diluiti non sia stata determinata nella procedura effettiva di colorazione, diluire tali reagenti
immediatamente prima dell'uso. I controlli positivi e negativi devono essere analizzati insieme ai campioni dei
pazienti.
Visualizzazione: il sistema di visualizzazione consigliato è EnVision FLEX+, High pH (codice K8002/K8012) in
combinazione con EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (codice K8021/K8022) in incubazione di 20 minuti a
temperatura ambiente. Per EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (codice K8021/K8022) è richiesto un periodo di
incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente. Attenersi alla procedura prevista per il(i) sistema(i) di
visualizzazione prescelto(i).
Automazione: l'anticorpo è idoneo per le procedure di colorazione immunoistochimica su piattaforme
automatizzate come, ad esempio Dako Autostainer, Autostainer Plus, Autostainer Link e PT Link per il
pretrattamento.
Colorazione di contrasto: la controcolorazione consigliata è EnVision FLEX Hematoxylin (codice K8008/K8018).
Per risultati ottimali, si consiglia di utilizzare un mezzo di montaggio permanente non acquoso.
Controlli: i tessuti di controllo positivo e negativo devono essere analizzati contemporaneamente utilizzando lo
stesso protocollo dei campioni dei pazienti. Il tessuto di controllo positivo deve consistere di tessuto di seminoma o
di carcinoma embrionale e le cellule/strutture devono mostrare i pattern di reazione descritti per il tessuto in
questione nella sezione "Caratteristiche di prestazione".
Interpretazione dei
risultati della
colorazione
Il pattern di colorazione cellulare è di tipo nucleare. Una colorazione diffusa citoplasmatica, in presenza di una
forte colorazione nucleare, è considerata accettabile.
Caratteristiche di
prestazione
Tessuti normali:
Anti-OCT3/4 non ha mostrato alcuna reattività nei nuclei cellulari di tutti i tipi di tessuto normale analizzati (9).
Tipo di tessuto
(q.tà testata)
Surrene (3)
Midollo osseo (3)
Mammella (3)
Elementi del tessuto
positivo
0/3
0/3
0/3
Tipo di tessuto
(q.tà testata)
Pancreas (3)
Paratiroide (3)
Ipofisi (3)
Elementi del tessuto
positivo
0/3
0/3
0/3
Cervelletto (3)
0/3
Prostata (3)
0/3
Cerebrum (3)
0/3
0/3
Cervice (3)
0/3
Ghiandola salivare
(3)
Muscolo scheletrico
Colon (3)
0/3
Cute (3)
0/3
Esofago (3)
0/3
Intestino tenue (3)
0/3
Cuore (3)
0/3
Milza (3)
0/3
Rene (3)
0/3
Stomaco (3)
0/3
Fegato (3)
0/3
Testicolo (3)
0/3
Polmone (3)
0/3
Timo (3)
0/3
Cellule mesoteliali (3)
0/3
Tiroide (3)
0/3
Nervo, periferico (3)
0/3
Tonsilla (3)
0/3
Ovaio (3)
0/3
Utero (3)
0/3
0/3
Nota: nel citoplasma delle cellule epiteliali di tre diversi tipi di tessuto normale è stata osservata una
immunocolorazione debolmente positiva. Gli elementi reattivi comprendono epiteli di testicolo (2/3), stomaco (1/3)
e intestino tenue (2/3). La debole colorazione positiva è stata riscontrata in una percentuale di cellule epiteliali di
testicolo (10-20%), stomaco (50%) e intestino tenue (20%).
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Bibliografia
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Edizione 08/13
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