la Tecnica del DNA fingerprinting

International pbi S.p.A. Milano
Copyright pbi 
MARZO 2003
Kit didattico Edvotek: la
Tecnica del DNA fingerprinting
‰ Introduzione
L’analisi del profilo di restrizione del DNA, detto anche DNA fingerprinting,
è un metodo sviluppato da pochi anni che permette l’identificazione del DNA
da campioni sconosciuti. Questo metodo è diventato realmente importante in
campo forense dove è utilizzato in caso di delitto e per la determinazione di
paternità. Al contrario di altri metodi convenzionali, il DNA fingreprinting
consente una identificazione con grande accuratezza.
Il DNA fingerprinting prevede la corsa elettroforetica di frammenti di DNA
generati da enzimi di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi,
sono capaci cioè di rompere il legame fosfato delle due catene di DNA. I
punti di taglio corrispondono a sequenze specifiche, chiamati “siti di taglio”
che sono lunghi da 4 a 8 paia di basi. La grandezza dei frammenti generati
dipende dalla distanza tra i siti di taglio. In generale, più è lunga la molecola
di DNA e più alta è la probabilità che ci sia un sito di restrizione. Un
cromosoma umano, lungo 100 milioni di paia di basi, se trattato con un
enzima che riconosce siti di 6 paia di basi, viene tagliato in circa 750.000
frammenti di lunghezza diversa che vanno a definire il fingerprinting
specifico.
Nessun individuo ha esattamente lo stesso pattern di restrizione di un altro:
queso è dovuto alla variabilità dei geni. Un gene è presente nella
popolazione in forme diverse dette alleli, e nella popolazione esiste un
grandissimo numero di alleli che variano la sequenza del genoma; questi
hanno sequenze diverse tra loro, quindi i siti di restrizione sono distribuiti
diversamente lungo la sequenza. Ne consegue che un enzima taglierà in
posizioni diverse da allele ad allele, dando frammenti di diversa lunghezza
che produrranno profili di fingerprinting diversi su gel di agarosio.
‰ Il kit “DNA fingerprinting” cod. n° 26549
Obiettivo di questo esperimento è sviluppare una conoscenza di base della
tecnica del DNA fingerprinting. Gli studenti analizzeranno le variazioni nei
pattern creati dagli enzimi di restrizione da diverse molecole di DNA, per
identificare il colpevole di un crimine usando la logica del DNA fingerprinting.
Il DNA di due sospetti è stato tagliato con due diversi enzimi di restrizione in
condizioni separate: l’obbiettivo è confrontare i pattern di frammentazione su
gel di elettroforesi e detreminare chi tra il sospetto 1 e 2 era sulla scena del
crimine.
Nota Applicativa n° 856
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‰ Come utilizzare il kit “DNA fingerprinting”
Il kit “DNA fingerprinting” cod. n° 26549 è composto da:
A campione di DNA dalla scena del delitto tagliato con l’enzima 1
A campione di DNA dalla scena del delitto tagliato con l’enzima 2
A campione di DNA dal sospetto 1 tagliato con l’enzima 1
A campione di DNA dal sospetto 1 tagliato con l’enzima 2
A campione di DNA dal sospetto 1 tagliato con l’enzima 1
A campione di DNA dal sospetto 1 tagliato con l’enzima 2
Gel loading solution di pratica
Polvere di Agaosio
Buffer per elettroforesi 50x
Pellicole DNA Blue InstaStain
Blu di Metilene concentrato
Pipetta da 1 ml
Cilindro da 100 ml (e confezione dei campioni)
Micropipette monouso
Guanti e occhiali protettivi dovrebbero essere indossati secondo buona prassi di laoratorio.
Preparazione del gel
Chiudere i lati aperti del vassoio porta-gel usando le pareti in gomma o con nastro adesivo.
1. usando le pareti in gomma:
posizionare una parete in gomma per ogni lato del pozzetto
Assicurarsi che le pareti in gomma siano bene in contatto con i bordi del vassoio
2. usando il nastro adesivo
distendere il nastro adesivo sul bordo mancante del vassoio, facendolo aderire
alle pareti laterali ed a quella inferiore
Premere sui punti di contatto per assicurare una buona aderenza
Posizionare il pettine nelle scanalature più vicine al bordo del pozzetto. Assicurarsi che il
pettine sia ben posizionato.
L’esperimento richiede un gel allo 0.8% di agarosio
Tabella A : quantità richieste per un gel allo 0.8% di agarosio
Misura
gel
7x7
7x15
10.5x14
del Q.tà di agarosio Q.tà di
(50x)
0.24g
0.6ml
0.48g
1.2ml
0.8g
2.0ml
buffer Q.tà di
distillata
29.4ml
58.8ml
98.0ml
acqua Volume
totale
30ml
60ml
10ml
Usare una beuta da 250 ml per preparare il tampone: con una pipetta da 1 ml, misurare il
buffer 50x e aggiungere acqua distillata come indicato nella Tabella A.
Aggiungere la quantità richiesta di agarosio, mescolare.
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Nota Applicativa n° 856
Indicare
con
un
pennarello il livello di
volume sull’esterno della
beuta.
Scaldare la sospensione
a circa 55°C fino a
dissolvere la polvere di
agarosio. La soluzione
dovrà essere trasparente
e priva di particelle
solide.
1. con forno a microonde
Coprire
l’imboccatura
della beuta per ridurre
l’evaporazione
Scaldare la sospensione
per 1 minuto circa
Agitare la sospensione e
riscaldare con intervalli
di 25 secondi fino alla
totale
dissoluzione
dell’agarosio
2. con piastra riscaldante
Coprire
l’imboccatura
della beuta per ridurre
l’evaporazione
Scaldare la sospensione
fino
all’ebollizione,
agitando di tanto in
tanto. Scaldare finchè
l’agarosio
è
completamente dissolto
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CoPreparazione
me preparare del
il gel
Gel
di di
elettroforesi
Elettroforesi
Versare l’agarosio
nel vassoio
Rimuovere i blocchi alle
estremità ed immergere il gel
nella vaschetta elettroforetica
Campioni di gel pronti
Caricare i campioni in
pozzetti consecutivi
Chiudere il coperchio,
connettere le prese
all’alimentatore ed iniziare
la corsa
Decolorare e
visualizzare i
risultati su gel
Rimuovere il gel e
colorare con la
pellicola InstaStain
Raffreddare la soluzione
di agarosio sino a 55°C,
agitando dolcemente per dissipare il calore. Se c’è stata una evaporazione consistente,
aggiungere acqua distillata per riportare la soluzione al volume originale, quello marcato
con pennarello prima del riscaldamento.
Posizionare il vassoio su una superficie piana
Assicurarsi che i lati del vassoio siano chiusi ermeticamente (con il nastro adesivo o con le
pareti in gomma)
Versare la soluzione di agarosio nel vassoio.
Lasciare solidificare completamente il gel per 20 minuti
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Quando il gel è completamente solidificato, rimuovere con attenzione il nastro adesivo o le
pareti in gomma.
Rimuovere il pettine estraendolo delicatamentre verso l’alto.
Mettere il vassoio col gel nella camera elettroforetica orientato in maniera corretta, con i
pozzetti in prossimità del polo negativo (cavo nero).
Riempire la camera elettroforetica con il volume necessario di buffer diluito. Assicurarsi che
il gel sia completamente coperto dal gel. Il gel di agarosio è comunemente chiamato
submarine gel perché sommerso dal tampone per il caricamento dei campioni e la corsa.
Caricamento dei campioni e corsa elettroforetica
Scaldare a 65°C un beaker pieno d’acqua per riscaldare le
microprovette contenenti frammenti di DNA. A questa temperatura i
frammenti generati dagli enzimi di restrizione sono completamente
separati, quindi questo passaggio è indispensabile per una buona
separazione delle bande nel gel.
Aspettare che i campioni si raffreddino leggermente e caricare i
campioni A-F consecutivamente nel gel. La quantità di campione da
caricare è circa 35-38 ul.
Caricamento del gel
Dopo aver caricato i campioni, mettere delicatamente il coperchio sulla
vaschetta, collegando gli elettrodi in posizione corretta. Inserire lo spinotto rosso della
camera nella presa rossa dell’alimentatore e lo spinotto nero nella presa nera
dell’alimentatore.
Settare l’alimentatore al voltaggio richiesto (70 Volts) e far partire l’elettroforesi per il tempo
indicato nella tabella B. Non muovere la vaschetta dopo il caricamento dei campioni o
durante la corsa.
Tabella A : voltaggi e tempi di corsa
Volts
50
70
125
Tempo min. richiesto
60 min
40 min
30 min
Tempo di corsa ottimale
2.0 h
4.5 h
45 min
Controllare che l’alimentatore raggiunga il voltaggio voluto e verificare la formazione di bolle
sugli elettrodi della camera. Lasciar correre il colorante blu per almeno 4 cm dal pozzetto
per avere una separazione adeguata delle bande di DNA.
Al completamento dell’elettroforesi, spegnere l’alimentatore, togliere le spine del gel e
rimuovere il coperchio della camera.
Rimuovere il vassoio contenente il gel, mettendo le mani su entrambe le estremità e
facendo attenzione che il gel non esca dal vassoio. Togliere il gel dal vassoio e procedere
con la colorazione.
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Per un corretto utilizzo della vaschetta da elettroforesi:
– La temperatura della soluzione di agarosio versata nel vassoio non deve mai superare i
55°C: una soluzione più calda può deteriorare irrimediabilmente il vassoio.
– Non toccare mai gli elettrodi di platino.
– La corrente elettrica deve sempre essere spenta, e le spine disconnesse dall’alimentatore
quando il coperchio è staccato dall’apparato.
Colorazione del gel
Quando l’elettroforesi è completata, porre il gel su una
superficie piana. Inumidire il gel con alcune goccie del tampone
di corsa. Dopo aver indossato i guanti, mettere il lato blu della
pellicola DNA Blue Instatain sul gel inumidito.
Con fermezza, muovere più volte le dita lungo la superficie del
foglio InstaStain.
Mettere il gel con la pellicola InstaStain su un foglio di plastica,
quindi mettervi sopra il vassoio portagel ed un beaker vuoto al
centro. Questo consentirà alla pellicola InstaStain di mantenere
un buon contatto con la superficie del gel.
Lasciare InstaStain a contatto col gel per 15 minuti.
Dopo 15 minuti rimuovere la pellicola InstaStain e trasferire il
gel in una larga vaschetta di plastica. Effettuare decolorazione
con acqua distillata alla temperatura di 37°C.
La decolorazione va effettuata per tre volte con acqua distillata
a 37°C, cambiando acqua ogni 10 minuti, ed agitando di tanto
in tanto la vaschetta.
Dopo la prima decolorazione, le bande più grosse di DNA
saranno visibili in blu scuro in contrasto con l’azzurro del gel.
Quando il gel è completamente decolorato, la banda blu scuro
diverrà più visibile, mentre lo sfondo si colorerà di un azzurro
chiaro ed uniforme.
Rimuovere con cautela il gel per esaminarlo. Se il gel non è
visibile e le bande sono difficili da esaminare, ripetere la
procedura di decolorazione.
Colorazione del gel
Un gel colorato con DNA Blu Instastain può essere conservato
in frigorifero per alcune settimane in una busta di plastica con
alcune goccie di tampone decolorante. NON CONGELARE I GEL DI AGAROSIO. I gel
possono essere gettati come rifiuto solido.
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