servizio di laboratorio - Accademia di qualitologia

Transcript

Azienda Sanitaria Locale n.6 - Presidio
Ospedaliero di Livorno
Servizio di Patologia Clinica
Direttore: Dr. A. La Gioia
SERVIZIO DI LABORATORIO
GUIDA PER L’USO
“Principio 1 – Organizzazione orientata al cliente
Le organizzazioni dipendono dai propri clienti e dovrebbero pertanto capire le loro esigenze
presenti e future, ottemperare ai loro requisiti e mirare a superare le loro stesse aspettative.”
da ISO 9000:2000 – I Principi di Gestione per la Qualità
Servizio di laboratorio. Guida per l’uso
…perchè sei viva e mi passeggi dentro
a Maria
3
Patologia Clinica - ASL6 Livorno
INTRODUZIONE
Comunicare in medicina è lo strumento necessario
per costruire tra professionisti relazioni le cui componenti cognitive contribuiscono alla creazione di un
processo educativo per tutti gli attori coinvolti. Il
nostro servizio ha sviluppato sistemi di comunicazione tra professionisti specificamente finalizzati alla
promozione dell’appropriatezza. Superato l’iniziale
esasperato efficientismo prevalentemente economico,
l’aziendalizzazione del SSN si è attualmente proiettata
verso modelli gestionali capaci di orientare la pratica
clinica verso criteri di efficacia e di appropriatezza.
L’appropriatezza, dovere istituzionale dell’Azienda
Sanitaria e diritto per il cittadino, costituisce uno degli
strumenti del governo clinico.
Il nostro laboratorio ha da tempo individuato la
comunicazione come sistema efficace per la divulgazione di linee guida o raccomandazioni o, ancora,
algoritmi diagnostici.
Gli strumenti utilizzati sono essenzialmente:
1. la “personalizzazione del referto” con l’uso di
commenti, osservazioni o suggerimenti clinici;
2. il periodico trimestrale “LabNews”.
3. la “guida alla prescrizione degli esami di laboratorio”
LabNews lo conoscete tutti: è la nostra “rivista”
nata nel febbraio del 1998. Prodotta col contributo di
tutti i professionisti del laboratorio, è rivolta ai medici
di famiglia, ai pediatri di libera scelta della nostra
Azienda ed è inviata anche ai medici del presidio
ospedaliero. Nei suoi 5 anni di vita LabNews è stato
utilizzato per la proposizione o l’attivazione di algoritmi diagnostici (PSA, celiachia, autoimmunità, diagnostica tiroidea, altri), per la divulgazione di linee
guida o raccomandazioni (marcatori tumorali, diabete, marcatori cardiaci, altri) o, ancora, per divulgare
comunicazioni scientifiche riprese da riviste autorevoli. Tutti gli algoritmi e le linee guida proposti sono
attualmente operativi, contribuendo significativamente alla appropriatezza nel ricorso alle prestazioni di
laboratorio.
Questa è la seconda edizione della “guida”, ed è
molto cambiata, come pure è molto cambiato, in questi anni, il laboratorio; è cambiato negli aspetti strutturali, tecnologici ed organizzativi ma, soprattutto, il
laboratorio è cambiato “dentro”, nella sua maturazione di una Mission mutuata dai principi della Gestione
per la Qualità “Le organizzazioni dipendono dai propri clienti e dovrebbero pertanto capire le loro esigenze presenti e future, ottemperare ai loro requisiti e
superare le loro stesse aspettative”
Pur mantenendo la precedente impostazione delle
schede “il laboratorio nello studio di….”, la guida è
diventata un pò più…… presuntuosa, presentando
alcuni argomenti nella veste di “articolo” in cui, oltre
alla diagnostica di laboratorio, sono trattati anche
aspetti clinico-terapeutici. Alcune volte questa diversa
impostazione è statà stimolata anche dal coinvolgimento di autorevoli Colleghi di altre Unità Operative
che hanno risposto con entusiasmo e competenza alla
richiesta di trattare argomenti di particolare rilevanza.
A loro va il mio ringraziamento.
Ed il mio ringraziamento va soprattutto a tutti i
Colleghi e Collaboratori del laboratorio.
Livorno è città di pittori, alcuni eccellenti. Pochi
sanno, però, come Giancarlo Landi, riportare sulla tela
l’atmosfera dolce di una Livorno ancora suggestiva in
alcuni dei suoi angoli più belli, la Venezia, il porto e le
sue barche, i canali e le fortezze. Anche per questo, a
me, questa “guida” pare un po’ più bella.
Antonio La Gioia
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PRESENTAZIONE
La ricerca dell’eccellenza guida gli uomini praticamente da sempre : “Fatti
non foste a viver…..”.
A volte ne siamo coscienti anzi ci indirizziamo volutamente su quel cammino,
a volte no, ma Pascal direbbe “Vous êtes engagés,” siete (ossia siamo) incastrati,
non ne possiamo fare a meno.
L’attività laboratoristica è stata tra le prime ad essere sottoposta a certificazione della qualità nel sistema sanitario e quella della nostra Unità Operativa di
Livorno è stata la 1° in Toscana e tra le prime a livello nazionale.
Ma a cosa servirebbe una lanterna se la si nasconde sotto il moggio? Meglio
se può far luce ai più.
Così questa guida all’uso delle prescrizioni di laboratorio diventa un ulteriore
contributo che il nostro laboratorio offre a tutti coloro – medici di medicina generale, pediatri di libera scelta, medici ospedalieri – si trovano nella necessità di
prescrivere analisi laboratoristiche.
L’aspetto comunicativo, informativo e di condivisione del sapere, fa della
guida un elemento concreto, inserito nel percorso verso l’eccellenza che tutta
l’ASL 6 ha intrapreso da tempo. Percorso, che, come tutte le cose umane, incontra inciampi e ostacoli, comunque superabili da dirigenti di buon calibro.
Grazie quindi al Dr. La Gioia e ai suoi Collaboratori interni ed esterni.
Massimo Scura
Direttore Generale ASL 6
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INDICE
Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . pag.
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Presentazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
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La norma ISO 9001:2000 (Vision 2000) nel laboratorio di patologia clinica: un potente strumento
di gestione per la qualità (SGQ). Il laboratorio del terzo millennio proteso verso il cliente . . . . . . . . . . . . . . .»
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I “messaggi” del laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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Valori normali, variabilità e differenza critica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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Ambulatorio per il monitoraggio della terapia anticoagulante orale: standard di prodotto . . . . . . . . . . . . . .»
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Il laboratorio nella diagnosi dei difetti dell’emostasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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Il laboratorio nello screening delle trombofilie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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Uso clinico del D-dimero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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Diagnostica delle anemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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Le anemie infiammatorie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
39
Le talassemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
40
Il laboratorio nella diagnosi delle sindromi mielodisplastiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
41
Il laboratorio nella diagnosi delle leucemie acute . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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Leucemie acute mieloidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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Le malattie mieloproliferative croniche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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La citofluorimetria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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Cellule staminali ematopoietiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
56
Il laboratorio nello studio delle pseudopiastrinopenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
58
I nuovi marcatori biochimici per la diagnostica di danno miocardico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
63
Il laboratorio nello studio delle dislipidemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
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Insufficienza renale cronica ed insufficienza renale acuta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
72
Il laboratoro nella diagnosi delle proteinurie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
75
Il laboratorio nella diagnosi dell’ematuria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
77
Il laboratorio nello studio delle sieroproteine - 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
79
Il laboratorio nello studio delle sieroproteine - 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
82
Il laboratorio nella diagnosi delle malattie del pancreas esocrino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
84
Il laboratorio nello studio della malattia diabetica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
86
11
Turn over osseo e metabolismo fosfo-calcico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
91
Diagnostica dell’ipertensione arteriosa – il sistema renina/angiotensina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
95
Tiroide: uso razionale dei parametri di laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .»
97
Agoaspirato tiroideo – metodica, indicazioni e citologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 100
Test endocrinologici dinamici nella patologia ipofisaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 102
Uso clinico dei marcatori tumorali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 104
Il laboratorio nella diagnostica della patologia prostatica: l’antigene prostatico specifico (PSA) . . . . . . . . . .» 110
Il laboratorio nel monitoraggio terapeutico dei farmaci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 113
Aspetti farmacologici e problematiche di monitoraggio terapeutico dei farmaci immunosoppressori:
la ciclosporina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 116
Aspetti farmacologici e problematiche di monitoraggio terapeutico dei farmaci immunosoppressori:
il Tacrolimus (FK506) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 120
Ecstasy: nuova droga da discoteca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 121
Sindromi mononucleosiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 127
Epatite C: attualità di laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 129
Attualità di laboratorio in tema di AIDS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 132
Il laboratorio nella patologia da Helicobacter Pylori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 135
Il laboratorio nella diagnostica delle infezioni delle vie urinarie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 138
Le Clamidie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 140
Il laboratorio nel monitoraggio della gravidanza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 145
La diagnostica prenatale 1. Il laboratorio nello screening biochimico prenatale per i difetti del
Tubo Neurale e la Sindrome di Down . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 148
La diagnostica prenatale 2. Amniocentesi ed analisi citogenetica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 151
La diagnostica prenatale 3. Dosaggio dell’alfafetoproteina nel liquido amniotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 152
Le malattie autoimmuni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 153
Il laboratorio nella diagnosi della malattia celiaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 157
Sistema HLA e suscettibilità alle malattie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 159
Allergia: un problema diagnostico ancora aperto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 165
Il valore diagnostico dell’esame chimico-fisicio dei versamenti in cavità sierose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 167
Diagnostica citologica dei liquidi da versamento endocavitario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 169
Il laboratorio nell’esame del liquido seminale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 172
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LA NORMA ISO 9001 : 2000 (VISION 2000) NEL
LABORATORIO DI PATOLOGIA CLINICA: UN
POTENTE STRUMENTO DI GESTIONE PER LA QUALITA’
Il Laboratorio del terzo millennio proteso verso il Cliente
Analizzando l’evoluzione logico-temporale che ha
avuto la Legge di Riforma Sanitaria (502/517) e il
cambiamento dell’approccio della medicina di laboratorio nei confronti delle interfacce, è ormai evidente
come il tema della qualità e/o dell’accreditamento,
stiano diventando di grande attualità anche in Italia.
Il D.d.l. 4230 di Delega al Governo per la realizzazione del Servizi Sanitario Nazionale (SSN), collegato
alla finanziaria 1998, ha dato una svolta definitiva alla
politica sanitaria.
Dopo una partenza tutta orientata agli aspetti economici, e conseguente esasperazione dell’efficienza, si
è reso necessario un momento di riflessione; questo
perché ad una visione del Sistema Salute orientata ad
obiettivi e vincoli di funzionalità economica se ne contrappone una legata soprattutto all’aspetto medico
sanitario, in cui concetti di malati “produttivi” e
“improduttivi” o di esami più o meno “redditizi” stridono con il concetto di professionalità e possono portare ad una pericolosa spaccatura tra i Direttori, veri
manager, da una parte e i medici dall’altra.
Contemporaneamente, nell’ultimo decennio la
potenzialità e, di conseguenza, il ruolo del Laboratorio Analisi è profondamente cambiato: nuove tecnologie analitiche e informatiche hanno permesso di raggiungere traguardi impensabili fino a poco tempo fa.
Di conseguenza la Medicina di Laboratorio, interpretando il ruolo di primaria importanza, si è impegnata
a tutto campo per riaffermare il principio che il Laboratorio non deve chiudersi in sé stesso; non deve essere una semplice “fabbrica di numeri”; deve rappresentare l’interlocutore privilegiato dei clinici e che il personale Dirigente del Laboratorio deve fare il patologo
clinico.
Ma quali armi ha la nostra professione per riaffermare la centralità della Medicina di Laboratorio?
Sono armi culturali (specializzazione clinica e analitica) e armi gestionali (accreditamento e certificazione),
che si manifestano durante tutto l’iter diagnostico:
• nella fase pre-analitica: con lo studio della congruità della richiesta, dei percorsi diagnostici e della
variabilità biologica;
• nella fase analitica: con una congrua organizza-
zione del lavoro, con il Controllo di Qualità, con la
Verifica Esterna della Qualità;
• nella fase post-analitica: con l’interpretazione dei
risultati (refertazione), e verifica della qualità percepita
Bisogna tuttavia puntualizzare il concetto che un
profondo ed efficace cambiamento verso un SSN realmente a misura d’uomo, nei limiti però delle risorse
economiche, non può che nascere da un impegno
diverso e una mentalità nuova degli operatori. Mentalità che deve portare i professionisti di Laboratorio a
fare autocritica:
• devono essere soddisfatte sia le esigenze di efficacia (percorsi diagnostici, referto normalizzato) sia di
efficienza (economicità di gestione);
• devono tener conto che il paziente non è più un
semplice utente ma, insieme al proprio medico curante, sempre di più diventa cliente, con le sue aspettative, che, se non sono disattese, il cliente sarà soddisfatto; se sono superate il cliente sarà fidelizzato, con
tutto quello che di positivo comporta.
In questo contesto è di fondamentale importanza la
formazione manageriale che deve sviluppare:
• capacità organizzative e gestionali per coordinare
gli obiettivi del proprio Servizio a quelli aziendali e
con quelli di altri servizi di diagnosi e cura; questo
perché lo sviluppo “a macchia di leopardo” della qualità porta a risultati positivi molto limitati;
• capacità relazionali per comunicare efficacemente
con interlocutori interni (Direzione aziendale, colleghi, amministrativi, ecc.) ed esterni (fornitori, clienti);
• capacità di valutare le alternative organizzative e
di prendere le conseguenti decisioni gestionali;
• capacità di valutare la Qualità del Servizio e di
sviluppare programmi di Miglioramento continuo
della Qualità.
Per riuscire ad introdurre tutti i concetti fino ad ora
menzionati, il Laboratorio di Patologia Clinica deve
prontamente recepire la necessità di operare secondo
modelli organizzativi che, assicurando efficacia (fare
le cose giuste) ed efficienza (utilizzare correttamente
le risorse), siano finalizzati al miglioramento continuo
della qualità del servizio offerto.
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- Accreditamento di eccellenza (volontario)
- Accreditamento istituzionale (obbligatorio)
- Certificazione ISO (volontaria)
SONO GLI STRUMENTI A DISPOSIZIONE DEGLI OPERATORI
SANITARI PER GESTIRE UN SISTEMA ORIENTATO AL
MIGLIORAMENTO CONTINUO
Tale scelta di fondo (assicurare la qualità del servizio complessivamente offerto piuttosto che la qualità
del solo prodotto finale), si può concretizzare anche
attraverso l’implementazione in laboratorio di un
“Sistema di Gestione per la Qualità” conforme alla
norma ISO 9001:2000, che concepisce l’Organizzazione secondo una concezione sistemica.
Per capire il motivo della scelta, basta analizzare gli
otto principi di gestione della qualità che sono menzionati nella parte introduttiva della norma ISO
9000:2000 e i benefici della loro applicazione.
L’ottenimento del “bollino” però non deve essere
un punto di arrivo ma il punto di partenza per uno
sforzo proteso nel cammino finalizzato all’eccellenza
del servizio secondo i principi del Total Quality Management (TQM).
NOTA. LA CONCEZIONE SISEMICA
GUIDARE UN’ORGANIZZAZIONE SECONDO UNA CONCEZIONE SISTEMICA SIGNIFICA CONCEPIRLA COME UN’INSIEME DI
PROCESSI (MACROPROCESSI, PROCESSI, SOTTOPROCESSI, AZIONI, FASI, ECC.) FORTEMENTE LEGATI ED INTERCONNESSI, CHE
CONTRIBUISCONO ALLA QUALITÀ TOTALE.
IN QUESTO CONTESTO, OGNI SERVIZIO O REPARTO DIVENTA CONTEMPORANEAMENTE FORNITORE, PER L’ATTIVITÀ SUCCESSIVA E CLIENTE DI QUELLA CHE LO PRECEDE. Q UANDO L’AZIENDA RIESCE AD ORIENTARE TUTTI I PROCESSI ALLA SODDISFAZIONE ADEGUATA DELLE ESIGENZE DEI CLIENTI INTERNI (APPARTENENTI ALLA STRUTTURA) PER IL CLIENTI FINALI
(ESTERNI/PAZIENTI) SIGNIFICA CHE HA
IMPLEMENTATO UN SISTEMA DI GESTIONE FINALIZZATO ALLA QUALITÀ
LA RELAZIONE MATEMATICA CHE LEGALA QUALITÀ DEI SINGOLI PROCESSI ALLA QUALITÀ TOTALE, NON È LASOMMA MA
IL PRODOTTO:
QTOT = Q1 X Q2 X Q3 X Q4 X Qn.
QUINDI UN PROCESSO
DI BASA QUALITÀ INFLUISCE IN MODO DETERMINANTE SULLA QUALITÀ TOTALE....SE UN SOLO PRO-
(Q = 0), QUESTO ANNULLA LAQUALITÀ TOTALE DELL’INTERA ORGANIZZAZIONE!!!
UN ESEMPIO DI SISTEMA È IL CORPO UMANO, IN CUI I VARI ORGANI, SISTEMI, APPARATI SONO UNITÀ A SÈ STANTI CHE
PERÒ, ESSENDO STRETTAMENTE INTERCONNESSI FUNZIONALMENTE, CONTRIBUISCONO ALL’UNISONO AL BUONO STATO DI
SALUTE DELL’ INDIVIDUO.
CESSO NON È DI QUALITÀ
Figura 1 – Schema di um processo del
sistema di gestione per la qualità
Definizione tratta dalla Norma ISO
9000:2000 – “Un’attività, che utilizza
risorse e che è gestita per consentire la
trasformazione degli elementi in ingres so in elementi in uscita, può essere con siderata come un processo. Spesso l’ele mento in uscita da un processo costitui sce direttamente l’elemento in ingresso
per un processo successivo.”
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Principio 1 – Organizzazione orientata al cliente
Le organizzazioni dipendono dai propri clienti e dovreb bero pertanto capire le loro esigenze presenti e future,
ottemperare ai loro requisiti e mirare a superare le loro stes se aspettative.
Benefici principali: aumento del fatturato e delle
quote di mercato, attraverso una risposta flessibile e
rapida alle opportunità offerte dal mercato. Miglior
efficacia, nell’uso delle risorse di un’organizzazione,
nel perseguire la soddisfazione dei clienti. Maggior
fidelizzazione dei clienti, che porta continuità di affari
e stimola il passa parola.
Principio 2 – Leadership
I capi stabiliscono unità di intenti e di indirizzo dell’or ganizzazione. Essi dovrebbero creare e mantenere un
ambiente interno che coinvolga pienamente il personale nel
perseguimento degli obiettivi dell’organizzazione.
Benefici principali: il personale comprenderà e sarà
motivato nel perseguimento degli obiettivi e dei traguardi dell’organizzazione. Le attività verranno valutate, rese coerenti e messe in atto in modo unificato.
Saranno ridotti i disguidi di comunicazione tra i
diversi livelli dell’organizzazione.
Principio 3 - Coinvolgimento del personale
Le persone, a tutti i livelli, costituiscono l’essenza di
un’organizzazione ed il loro pieno coinvolgimento permette
di porre le loro capacità al servizio dell’organizzazione.
Benefici principali: motivazione, rispondenza e
coinvolgimento del personale nell’ambito dell’organizzazione. Innovazione e creatività nel raggiungimento degli obiettivi dell’organizzazione. Responsabilizzazione del personale per le proprie prestazioni.
Desiderio del personale di partecipare e contribuire al
miglioramento continuativo
Principio 4 - Approccio per processi
Un risultato desiderato si ottiene con maggior efficienza
quando le relative risorse ed attività sono gestite come un
processo.
Benefici principali: minori costi e cicli più brevi,
mediante un efficace uso delle risorse. Risultati
migliori, coerenti e prevedibili. Occasioni per la messa
a fuoco e la scelta delle priorità dei miglioramenti.
Principio 5 - Approccio sistemico alla gestione
Identificare, capire e gestire un sistema di processi inter connessi, mirati a determinati obiettivi, migliora l’efficacia
e l’efficienza dell’organizzazione.
Benefici principali: integrazione ed allineamento dei
processi per meglio favorire il raggiungimento dei
risultati desiderati. Capacità di mettere a fuoco i processi che più contano. Dar fiducia alle parti interessate
sulla solidità, efficacia ed efficienza dell’organizzazione
Principio 6 - Miglioramento continuo
Il miglioramento continuo dovrebbe essere un obiettivo
permanente dell’organizzazione
Principio 7 - Decisioni basate su dati di fatto
Le decisioni efficaci si basano sull’analisi di dati ed
informazioni.
Benefici principali: i principi 6 e 7 sono fortemente
15
correlati fra di loro; infatti non si può migliorare se
non si misura con indicatori adeguati. Inoltre una
miglior capacità di gestire gli indicatori permette di
esaminare, confrontare e modificare opinioni e decisioni e ha, come conseguenza, una maggiore flessibilità nel rispondere con prontezza alle opportunità e/o
alle problematiche che si presentano.
Principio 8 - Rapporti di reciproco beneficio con i
fornitori
Una organizzazione ed i suoi fornitori sono interdipen denti ed un rapporto di reciproco beneficio migliora, per
entrambi, la capacità di creare valore.
Benefici principali: maggior capacità di creare valore, per entrambe le parti. Flessibilità e prontezza nel
dare risposte congiunte al mutare del mercato o delle
esigenze e aspettative dei clienti. Ottimizzazione di
costi e risorse.
E’ ovvio che un’organizzazione che riesce a proiettarsi verso tutti questi obiettivi, ponendoseli come
vision, mette in moto un meccanismo che, attraverso
lo strumento dell’ottimizzazione organizzativa, tende
al Miglioramento Continuo della Qualità delle prestazioni offerte.
Secondo la filosofia della nuova Norma, Vision
2000, da organizzazioni proiettate verso la garanzia
dell’Assicurazione Qualità dei prodotti e dei servizi,
le Aziende dovranno gradualmente modificare le loro
strutture, in seguito alla sempre più crescente necessità di dimostrare la capacità di raggiungere la Customer Satisfaction, ovvero una maggiore soddisfazione
dei loro Clienti, stabilendo con essi una relazione puntuale e personalizzata.
Da un Sistema Qualità basato su singoli requisiti, si
passerà con le Vision 2000, ad un modello articolato
“per processi”, in cui il Cliente con le sue esigenze ed
aspettative diventerà il riferimento di tutte le decisioni
manageriali.
Ciò consentirà alle aziende di riporre una maggiore
attenzione agli elementi essenziali e sostanziali del
Sistema Gestionale (Management, Core Process, Servizi di Supporto, Processi di misurazione e miglioramento) ed alle relative opportunità e criticità, così
come ad una valutazione degli elementi di efficacia e
di efficienza del sistema aziendale. Le aziende sono
spinte all’autovalutazione e alla maggiore responsabilizzazione delle funzioni aziendali in una logica di
tipo interfunzionale orientata ai processi.
L’introduzione della Customer Satisfaction in un
sistema aziendale è in grado di apportare indubbi
benefici sul fatturato, profitto e quota di mercato.
La misura della soddisfazione sia del cliente (interno, esterno, fruitore finale, utilizzatore) che delle altre
parti interessanti (direzione aziendale, associazioni
dei consumatori, operatori sanitari ecc.) è utilizzata
per verificare e validare che i bisogni e le aspettative
del Cliente siano stati corrisposti.
Figura 2 – Organizzazione del sistema di gestione per la qualità.
Nella concezione sistemica della nuova norma ISOO 9001:2000, l’insieme dei processi che generano il
prodotto/servizio, partono dai clienti e da tutte le parti interessate (gli Steckeholders), le aspettative dei quali
sono trasformate in requisiti del prodotto/servizio e servono da input per il processo di realizzazione del pro dotto/servizio il cui ouput è un prodotto/sevizio che soddisfa, fidelizzandolo, il cliente. Da parte sua l’Alta Di rezione dell’organizzazione deve gestire il flusso d’informazioni che prevengono dall’esterno (analisi di mercato,
analisi di customer satisfaction, reclami, ecc.) per cercare di soddisfare, anzi anticipare le aspettative e l’output
dei processi gestionali che le competono serviranno da input per il processo di gestione delle risorse (umane, tec nologiche, ecc.) e per quello di realizzazione del prodotto/servizio. Infine, il flusso bidirezionale da e verso l’e sterno, gli indicatori d’efficacia e d’efficienza dei vari processi (gestionali, realizzativi e di supporto) entrano,
come input nel processo delle misurazioni, analisi e miglioramento e la loro elaborazione fornisce gli elementi
in ingresso per i processi gestionali dell’alta direzione che li trasforma, secondo una corretta gestione, in ele menti di miglioramento per tutti gli altri processi aziendali; il risultato finale E’ IL MIGLIORAMENTO CON TINUO DEL SISTEMA DI GESTIONE PER LA QUALITA’.
Ma l’ascolto del Cliente non è limitato esclusivamente alla misurazione della sua soddisfazione. A
monte dei processi che governano il meccanismo di
creazione del valore di un’impresa vi è la necessità di
identificare i bisogni e le aspettative dei Clienti allo
scopo di configurare un servizio o un prodotto che
meglio risponda al bisogno specifico. La Vision 2000
introduce esplicitamente la necessità di definire una
16
modalità di “ascolto a monte” delle esigenze del Cliente.
L’obiettivo primario della Vision 2000 è quindi il
raggiungimento della soddisfazione del Cliente attraverso l’applicazione del Sistema di “Gestione della
Qualità”, del Miglioramento Continuativo e della Prevenzione delle Non Conformità.
Figura 3 – I concetti relativi alla gestione.
Nella norma UNI EN ISO 9000.2000 “Sistemi di getione per la qualità - fondamenti e terminologia”, la figura
A.5 è di notevole aiuto per capire i termini relativi ai concetti di gestione e le loro interazioni.
I concetti da puntualizzare sono:
- La gestione per la Q. passa attraverso quattro fasi (pianificazione, controllo, assicurazione, miglioramento),
che sono gli strumenti fondamentali per perseguire il miglioramento continuo (inteso come attività costante e
ricorrente) ed obiettivi di efficacia ed efficienza;
- Il ruolo fondamentale dell’alta direzione che deve definire la politica per la Q. in modo formale e gli obiettivi
per la Q. cercando il coinvolgimento di tutto il personale con finalità condivise.
La Qualità in Sanità
E’ ormai appurato che in Sanità (quindi in un’Azienda che eroga servizi) la Qualità Erogata, da parte
di una struttura nel suo insieme, e la Qualità Percepita,
da parte dell’utente, si concretizzano e si fondono nel
momento in cui il servizio o la prestazione sono erogati. Quindi l’attenta analisi della Qualità Attesa, da
parte della struttura sanitaria, è un elemento strategico
per progettare il livello di qualità.
Analizziamo criticamente l’attività di una Struttura
Organizzativa sanitaria:
• essa si presenta come un pacchetto di componenti
che inglobano elementi sia materiali (tecnologia, luoghi d’accoglienza, sale d’attesa, il referto, ecc.), che
immateriali (sensibilità del personale di front-office,
17
assistenza all’utente, consulenza professionale, immagine, affidabilità, capacità di risposta, capacità di rassicurazione, empatia). La prevalenza d’elementi immateriali (intangibilità) ha come immediata conseguenza,
il fatto che la valutazione avviene essenzialmente in
termini percettivi;
• è difficile separare la fase di produzione da quella
di erogazione del servizio, per cui mentre un buon
apparecchio televisivo, con un’ottima risoluzione dell’immagine, un audio di qualità, che non richiede assistenza tecnica per anni, ti “può far dimenticare” di non
essere stato trattato bene al momento dell’acquisto; un
referto di ottima qualità, ottenuto con le tecnologie più
avanzate, con le tecniche più costose e sofisticate, con
CV% bassissimi e CQ eccellenti, non sarà apprezzato
dall’utente che è stato maltrattato al momento dell’accettazione, ha atteso due ore prima di fare il prelievo,
è tornato tre volte a ritirare il referto, perchè mancava
il risultato di un esame;
• conseguenza logica dei punti precedenti, è la
caratteristica dell’eterogeneità. Infatti le performances
del servizio sono dipendenti dall’azione del produttore e di quella dell’utilizzatore e dalle rispettive capacità d’interazione: è perciò difficile, tenendo conto del-
l’importanza del fattore umano, raggiungere un alto
livello di standardizzazione.
Tutto questo depone a favore dell’opportunità di
fornirsi di un appropriato sistema di gestione, che la
nuova Vision 2000 garantisce, al fine di evitare che
eventuali errori, difetti e non conformità dei processi,
si ripercuotano direttamente sul servizio sperimentato
dal cliente: quindi lo scopo di una gestione accurata e
completa del processo di erogazione di un servizio, è
che le varie fasi si svolgano in modo controllato
rispetto ai requisti (anche cogenti) prefissati, data l’impossibilità e l’inutilità di un controllo finale di tipo
ispettivo sul prodotto finito.
Nota. GLI ELEMENTI DEL SERVIZIO
Gli elementi percepiti da chi utilizza un servizio
sono:
ASPETTI TANGIBILI = strutture, apparecchiature, personale, strumenti di comunicazione, ecc.;
AFFIDABILITÀ = capacità di offrire il servizio promesso in modo affidabile e preciso;
CAPACITÀ DI RISPOSTA = unisce l’affidabilità alla
TEMPESTIVITÀ del servizio;
CAPACITÀ DI RASSICURAZIONE = competenza e cortesia dei dipendenti e loro capacità di ispirare fiducia
e sicurezza;
EMPATIA = assistenza premurosa ed individualizzata
Le figure che seguono esemplificano lo schema dei
processi che devono essere gestiti per ottemperare ai
requisiti della Norma e l’organizzazione documentale
del Sistema di Gestione per la Qualità
Conclusioni
Anzitutto voglio sottolineare che non deve essere
percepito il messaggio che l’introduzione di una
Norma, di Procedure, di Istruzioni Operative, di indicatori, ecc., siano una limitazione della liberta professionale.
Figura 4 - Sschema dei processi gestionali, realizzativi e di supporto.
18
Figura 5 – Organizzazione documentale del sistema di gestione per la qualità.
Rispetto alla documentazione richiesa dalla norma ISO 9001:94, l’ISO 9001:2000 semplifica notevolmente la
“montagna di carta” che deve essere gestita come aggiornamenti, revisioni, distribuzioni: l’organizzazione
documentale rispecchia l’organizzazione per processi, per cui siamo passati dalle 23 sezioni del manuale qua lità (MQ), versione:94 (di cui 20 sottosezioni della sezione 4), alle 8 attuali; e dalle 18 procedure documentate
obbligatorie del: 94, alle 6 (riducibili a 5), della versione:2000. Questo non vuol dire che non si devono scrivere
le procedure: se il processo da descrivere è particolarmente complesso e influisce in modo determinante sulla
qualità del prodotto può essere descritto da una procedura; ma se un ciclo produttivo o un processo ammini strativo è ormai una prassi consolidata è sufficiente un diagramma di flusso per descrivere l’intero processo. In
ogni caso l’importante è individuare gli indicatori che monitorizzano in continuo la qualità dei processi. La
nota 3 del § 4.2.1 specifica “la documentazione può avere qualsiasi forma o supporto”, per cui in presenza di
una efficiente informatica e di un sistema informativo che funziona da collante, la gestione documentale,
richiesa dal § 4.2.3, (la montagna di carta) può essere notevolmente razionalizzata e l’elaborazione di tutti gli
indicatori semplificata e più efficiente altro punto importante e innovativo è il § 4.1 sistema di gestione per la
qualità - requisiti generali, che richiede l’identificazione della catena dei p rocessi che guidano l’organizzazio ne, le loro relazioni/interazioni, le risorse e le informazioni necessarie per il loro corretto governo, gli indicatori
d’efficacia che ne permettano il monitoraggio e il miglioramento continuo.
19
Le indicazioni che si ricavano dalla lettura delle
Norme citate, piuttosto che quelle dell’Accreditamento
istituzionale, o la legislazione in merito alla Riforma
Sanitaria in atto, impongono ad ogni operatore coinvolto di garantire il trattamento migliore sia dal
punto di vista tecnico che dal punto di vista delle
necessità globali del paziente
Obiettivo, questo, che deve essere condiviso e
soprattutto supportato dalla struttura attraverso:
- la destinazione delle risorse
- il coinvolgimento
- l’informazione costante
- la comunicazione degli obiettivi
- la formazione
- il monitoraggio del miglioramento
Gli approcci metodologici che si possono intraprendere (integrati comunque sempre da requisiti di
20
legge o professionali) sono molteplici ma, qualunque
sia il percorso individuato, è la nuova ottica che bisogna assimilare.
Questa ci permetterà di visionare le problematiche
da una nuova prospettiva che porta in primo piano le
esigenze dei clienti esterni e interni e che permetterà
di avviare in modo efficace il cambiamento mentale e
culturale richiesto a tutte le figure professionali, prime
tra tutte quella del management che ha la responsabilità della scelta degli obiettivi da condividerePer quanto appena detto e per le caratteristiche strategiche
intrinseche alla ISO 9001:2000, integrate da quelle della
guida per il Miglioramento Continuo della ISO
9004:2000, queste Norme si rivelano un efficace strumento di gestione in quanto mettono a disposizione gli
strumenti necessari per un buon governo dell’Organizzazione.
Fabio Bonini
I “MESSAGGI” DEL LABORATORIO
Antonio La Gioia
I risultati delle indagini di laboratorio sono abitualmente forniti come dati numerici (quantitativi) o
descrittivi (qualitativi) il cui utilizzo a scopo clinico può
essere limitato o insufficiente se non si mettono in essere accorgimenti idonei a trasformare i “dati” in “informazione” e, più precisamente, in informazione diagnostica utile ai fini clinici. Una esemplificazione di tale
concetto è rappresentata dai c.d. valori normali (più
correttamente limiti di riferimento o ambito di variazione), in assenza dei quali il potere informativo dei dati
numerici o descrittivi di laboratorio è molto limitato.
Appare pertanto necessario che tra il laboratorio ed
il clinico siano consolidate tutte quelle procedure idonee alla trasformazione del dato in informazione; a
tale scopo assume grande rilevanza la esplicitazione,
da parte del medico richiedente, di un sospetto clinico
o la segnalazione della patologia che ha dettato la
richiesta di indagini di laboratorio. In questo caso la
richiesta del medico acquista valore ed indicazione di
“quesito diagnostico” e, conseguentemente, i dati di
laboratorio assumono valenza di “informazione diagnostica” e di “referto”.
Altri sistemi utilizzabili per il potenziamento del
potere informativo dei dati di laboratorio, sono rappresentati dal contatto telefonico e dalla utilizzazione
di messaggi collegati a determinati risultati.
Il contatto telefonico tra il laboratorio ed il medico
curante è attivato tutte le volte che alcuni risultati di
laboratorio orientano per una situazione clinica per la
quale sia ipotizzabile la necessità di un immediato
intervento terapeutico o il ricorso al ricovero ospedaliero urgente (iperglicemia, piastrinopenia gravi, profilo biochimico suggestivo per infarto in atto o recente, elementi orientativi o diagnostici di emopatia acuta
ecc.); altre volte l’attivazione avviene in senso curante
- laboratorio ed è relativa a quesiti diagnostici, o a
chiarimenti sul significato di alcuni particolari parametri.
Il ricorso a messaggi collegati a determinati risultati è invece una procedura routinaria nella gestione dei
risultati di laboratorio ed ha, generalmente, il compito
di complementare l’informazione fornita dai soli risultati. Alcuni di tali messaggi sono autoesplicativi (ad
esempio: gammapatia policlonale; presenza di piastrine giganti; anisocitosi eritrocitaria ecc.); più spesso il
messaggio sottintende un preciso percorso diagnostico o lo suggerisce o, comunque, introduce rilevanti
informazioni relative al risultato o all’intero referto.
Un significato più generale dei diversi messaggi e
quello di suggerire la possibilità di sfruttare tutte le
potenzialità diagnostiche offerte dal laboratorio al fine
di indirizzare il paziente ad eventuali approfondimenti “specialistici” sulla base di un sospetto diagnostico
consolidato o, meglio, di una diagnosi autonomamente posta o confermata.
Alcuni di tali messaggi ed il relativo significato
attribuito sono di seguito esemplificati:
• “presenza di emazie a goccia”: le anomalie di
forma dei globuli rossi (poichilocitosi) sono di frequente osservazione; la presenza di emazie a goccia (o
dacriociti) è frequentemente associata (ma non patognomonica) con un quadro di mielofibrosi. Tale messaggio, pertanto, assume il significato di suggerire
approfondimenti semeiologici (splenomegalia!) o strumentali o di laboratorio, specialmente se associato ad
altre segnalazioni (presenza alla osservazione microscopica del sangue periferico di elementi immaturi
della serie bianca [mielociti - metamielociti] o rossa
[eritroblasti]).
• “presenza di linfociti attivati”: i linfociti attivati
rappresentano il corrispettivo morfologico di uno
stato funzionale che i normali linfociti periferici (in
particolare i T-linfociti CD8 positivi) assumono in
seguito a stimolazione da parte di alcuni antigeni,
specie virali (virus di Epstein-Barr, Herpes virus, rosolia, morbillo, virus epatitici, citomegalovirus, ecc.). La
loro presenza nel sangue periferico in diverse percentuali, è informativa di infezione in atto o recente e
suggerisce l’opportunità di approfondimenti diagnostici specifici (transaminasi, reazione di Paul-BunnellDavidhson; ricerca di anticorpi della classe IgM anti
citomegalovirus o anti rosolia o anti EBV ecc.);. Il termine “linfociti attivati” sostituisce le vecchie dizioni
di “virocita" e "linfomonocita”.
• “presenza di linfociti atipici”: tale segnalazione
va tenuta distinta da quella di “attivazione” perché
suggerisce l’ipotesi di una probabile deviazione neoplastica di un clone linfocitario (linfoma non Hodgkin; malattia linfoproliferativa).
21
• “si consiglia la determinazione della fosfatasi
alcalina leucocitaria”: la presenza di percentuali
diverse di elementi immaturi della serie granulocitica
(promielociti, mielociti e metamielociti) nel sangue
periferico è osservazione frequente ed è generalmente
in relazione con una stimolazione del sistema granulopoietico di tipo reattivo (infezioni, traumatismi, processi necrotici, neoplasie, ecc.) o fisiologico (gravidanza) per le quali non è richiesto alcun tipo di approfondimento diagnostico specifico. In altri casi la presenza
di tali elementi si accompagna ad altri “segni” (anemia, piastrinosi, aumento dei granulociti basofili, poliglobulia, presenza di eritroblasti) che inducono il
sospetto di una malattia mieloproliferativa cronica; in
tale contesto la determinazione della fosfatasi alcalina
leucocitaria (FAL) diventa insostituibile ausilio nella
conferma o esclusione del sospetto diagnostico (valori
o assenti [o bassi] di FAL si ritrovano solamente nella
leucemia mieloide cronica; le altre sindromi mieloproliferative [mielofibrosi idiopatica cronica; policitemia
vera; trombocitemia essenziale] sono caratterizzate da
valori normali o elevati di FAL).
• “si consiglia la determinazione del lisozima urinario”: tale messaggio è da noi associato al rilievo di
monocitosi periferica superiore a 1000 monociti/ml. Il
significato e la interpretazione della segnalazione
sono legati a due elementi di valutazione che, tuttavia,
non sempre sono a conoscenza del laboratorio: la stabilità nel tempo della monocitosi stessa e la età del
paziente; infatti, le monocitosi (> 1000/mL) stabili dell’anziano sono segno di possibile leucemia mielomonocitica cronica e il rilievo di lisozima urinario elevato
costituisce elemento di consolidamento del sospetto
diagnostico.
• “conteggio confermato con l’osservazione microscopica”: i moderni contatori automatici eseguono
la formula leucocitaria con maggiore precisione ed
accuratezza di qualsivoglia operatore anche esperto e
pertanto la “validazione” dei dati quantitativi forniti
da tali strumenti non è in genere necessaria. Accade
tuttavia che specifiche alterazioni quantitative possano costituire la spia di anomalie qualitative per le
quali sia richiesta la osservazione microscopica. Tale è
il caso dell’aumento percentuale ed assoluto dei granulociti basofili che è segno suggestivo per malattia
mieloproliferativa cronica; in caso di basofilia, pertanto, il messaggio sottolinea l’importanza diagnostica
del conteggio ed invita ai necessari approfondimenti
diagnostici (vedi anche nota relativa al messaggio “si
consiglia la determinazione della FAL”).
Più in generale, il messaggio sottolinea che le
diverse anomalie quantitative eventualmente riscon-
trate su di un esame emocromocitometrico sono state
valutate mediante osservazione al microscopio ottico.
• “numerose (alcune) ombre di Gumprecht”: i
linfociti della leucemia linfatica cronica sono elementi
di particolare fragilità che ne determina la rottura
nelle fasi di allestimento e colorazione dei vetrini ematologici; i linfociti così danneggiati appaiono sul vetrino come “macchie di colore” che costituiscono appunto le ombre di Gumprecht. Il messaggio, se riferito ad
una linfocitosi stabile dell’anziano (conteggi ripetutamente superiori a 4000 linfociti/mL in un arco di
tempo di almeno 6 mesi), è orientativo per la diagnosi
di leucemia linfatica cronica (non è assolutamente
patognomonico).
• “campione emolizzato”: il messaggio sottolinea
la inattendibilità analitica di alcuni risultati (ad esempio bilirubina, potassio, LDH) in conseguenza della
rottura di quote significative di globuli rossi in fase di
prelievo. In tali casi è corretto non fornire i relativi
risultati.
• probabile pseudopiastrinopenia: contattare il
laboratorio per i test di conferma”: il messaggio serve
a sottolineare l’assoluta irrilevanza clinica del fenomeno di agglutinazione piastrinica che è alla base della
pseudopiastrinopenia: non sono in alcun modo necessarie ulteriori indagini diagnostiche o l’invio dei soggetti interessati presso centri specialistici. Vedi anche
scheda sulle pseudopiastrinopenie.
• “assenza di agglutinati: piastrinopenia vera”: la
diagnosi di piastrinopenia vera avviene a seguito di
specifiche indagini orientate ad escludere la presenza
di agglutinazione o aggregazione in vitro e suggerisce
di orientare l’ulteriore percorso diagnostico verso le
diverse forme di piastrinopenia centrale o periferica.
Vedi anche scheda sulle pseudopiastrinopenie.
• “notevole aumento della transferrina”: questo
messaggio e tutti gli altri relativi alla elettroforesi proteica sottolineano la necessità che la interpretazione di
un tracciato elettroforetico avvenga in termini di valutazione molecolare (variazioni [aumento o riduzione]
delle singole frazioni del tracciato elettroforetico
espresse come variazioni [aumento o riduzione] della
proteina specifica che costruisce il principale componente della frazione stessa). Vedi anche scheda “il
laboratorio nello studio delle sieroproteine - 1”.
• “si consiglia immunofissazione”: l’evidenza o il
sospetto di una banda monoclonale nel tracciato elettroforetico costituisce l’inizio di uno specifico iter diagnostico (tipizzazione della componente mediante
immunofissazione, ricerca della proteina di BJ, studio
della funzionalità renale, ecc.). Vedi scheda “il laboratorio nello studio delle sieroproteine - 2”.
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VALORI NORMALI, VARIABILITA’ E DIFFERENZA
CRITICA
Angela Matteucci
Le indagini di laboratorio possono essere praticate al fine di accrescere la possibilità di discriminare le
persone sane dalle ammalate (screening), di classificare queste ultime in modo corretto (diagnosi) e per
seguire e sorvegliare i trattamenti (monitoraggio).
Per trarre il maggior vantaggio dal dato di laboratorio è necessario avere ben presente il contenuto di
informazione di ogni singolo esame. Questo è legato
alle caratteristiche del test come la sensibilità, la specificità, la efficienza diagnostica e il valore predittivo,
ma anche alla posizione del risultato in rapporto ai
valori di una popolazione di riferimento o in rapporto
ai valori precedenti del soggetto stesso. In quest’ultimo caso parliamo di differenza critica.
cui una donna di 50 kg. può avere un valore di creatinina di 1.0 (ancora nella norma se consideriamo i
valori di riferimento), ma nel suo caso già indice di
una insufficienza renale.
Valore predittivo di un test
La sensibilità esprime la probabilità che un soggetto malato presenti un test positivo (positività nella
malattia) ed è data dal rapporto.
VP
—————— X 100
VP + FN
La specificità rappresenta la probabilità che un
soggetto sano presenti un test negativo (negatività
nello stato di salute) ed è uguale al rapporto:
Valori di riferimento
I valori o intervalli di riferimento sono rilevati su
di una popolazione detta appunto di riferimento;
quando possibile, questi intervalli vengono prodotti
direttamente dal laboratorio sulla popolazione locale e
il cosiddetto “range di normalità” comprende il 95 %
dei valori di una popolazione sana.
Ma non sempre il valore di riferimento coincide
con il valore normale. Per alcuni esami, come per il
colesterolo, vengono indicati i valori “desiderabili”
cioè i valori che risultano essere correlati con un
minor rischio di malattie cardio-vascolari, come viene
evidenziato da studi epidemiologici. Anche per i farmaci non si può parlare di valori “normali”, ma di
valori terapeutici, perché il riferimento qui non è
costituito da una popolazione sana, ma da una popolazione in terapia con livelli plasmatici ottimali.
Oltre al sesso, l’età e altre variabili specifiche
(giorno del ciclo per alcuni ormoni) di cui viene tenuto conto nella compilazione dei valori di riferimento,
altre variabili possono influenzare i valori degli esami,
come la massa muscolare nel caso della creatinina; per
Malati
Sani
Totali
VN
————— X 100
VN + FP
La prevalenza della malattia è il numero dei soggetti malati presenti, in un dato istante, nella popolazione.
Il teorema di Bayes, date queste tre grandezze
(sensibilità, specificità e prevalenza) consente di calcolare il valore predittivo di un test positivo.
p1q1
Valore predittivo positivo: = ——————
p1q1 + p2q2
p1 = prevalenza della malattia nella popolazione studiata
p2 = prevalenza di non malattia
q1 = sensibilità del test
q2 = 1 – specificità
Numero di soggetti con
risultato del test positivo
Numero di soggetti con
risultato del test negativo
Totali
VP
FP
VP+FP
FN
VN
FN+VN
VP+FN
FP+VN
VP+FN+FP+VN
VP= veri positivi
FP= falsi positivi
VN = veri negativi
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FN = falsi negativi
Un esempio pratico è il seguente. Si consideri un
test che rileva anticorpi anti-HIV. Si assume che abbia
una sensibilità del 100% (è quindi positivo nel 100%
degli ammalati) e una specificità del 99,7% (è negativo
nel 99,7% dei soggetti sani). La prevalenza della positività agli anticorpi anti-HIV nella popolazione è del 3
per mille. Se effettuiamo il test su 1000 soggetti presi a
caso, i risultati saranno i seguenti: 3 soggetti presentano
positività al test (in quanto la prevalenza è del 3 per
mille) e sono veri positivi, e altri 3 soggetti presenteranno una positività al test (la specificità è del 99.7%) e
questi sono falsi positivi. Essendo in totale 6 i soggetti
positivi e 3 i veri positivi, avremo quindi un valore
predittivo del test pari al 50%. Questo esempio, che tra
le altre cose costituisce la base razionale delle indicazioni che sconsigliano la effettuazione “a tappeto” del test
per l’HIV, fornisce anche un ottimo esempio di come
piccole variazioni della specificità di un test possano
influenzarne pesantemente il valore predittivo (in particolar modo in situazioni di bassa prevalenza).
Dcr = 2,77
2
+ CVi 2 )
Il valore di 2,77 corrisponde al livello di probabilità di 0,95,
altamente significativo (“indica chiaramente”).
Quando un paziente viene sottoposto allo stesso
tipo di analisi in tempi successivi (per controllare il
successo della terapia o per monitorare l’andamento
di una malattia) è necessario stabilire se le variazioni
riscontrate stiano ad indicare un reale mutamento
delle condizioni del paziente; in questo caso si calcola
la differenza critica.
Nella tabella successiva sono elencati alcuni parametri di laboratorio con i rispettivi CV analitici e biologici e la differenza critica calcolata. I CV analitici
sono quelli ottenuti nel nostro laboratorio, mentre i
CV biologici sono tratti dalla letteratura. Tutti questi
valori sono espressi in %.
Ad esempio, l’emoglobina di una persona in terapia aumenta da 10,5 a 11,8 e noi vogliamo sapere se la
differenza è significativa. Dalla tabella ricaviamo che la
Dcr dell’emoglobina è 6,9; per essere significativa l’aumento dell’emoglobina deve essere quindi del 6,9%;
possiamo dedurre che l’aumento da 10,5 a 11,8 (+12%)
è significativo. Mentre una riduzione del valore dell’acido urico da 7,0 a 5,6, dopo appropriata terapia, non è
sufficientemente probativo di riuscita della terapia; il
valore infatti dovrebbe ridursi di almeno il 23% (da 7,0
a 5,4) per essere statisticamente significativo.
L’efficienza del test indica la percentuale dei
pazienti correttamente classificati come malati (o
come sani) in base al test eseguito ed è calcolata dal
rapporto:
VP + VN
————————— X 100
VP + FP + FN + VN
Variabilità
Quando si esegue più volte su di uno stesso campione la determinazione di un analita, il risultato
quantitativo che si ottiene differisce ogni volta per un
certo ordine di grandezza; questo comportamento
viene definito variabilità analitica. Questa variabilità è
legata alla precisione del metodo analitico e viene
espressa come coefficiente di variazione (CV).
Viceversa la variabilità biologica è dovuta alla
diversità delle influenze fisiologiche sull’individuo; i
fattori più importanti sono i ritmi circadiani, le variazioni stagionali, il ciclo mestruale, il fumo di tabacco,
l’ingestione di cibo e la postura.
La somma di questi due tipi di variabilità viene
definita variabilità totale.
Analita
ALT
Amilasi
Aptoglobina
AST
Bilirubina
Calcio
CK
Cloruro
Colesterolo
Colesterolo- HDL
Creatinina
Emoglobina
Ferritina
Ferro
Fosfatasi alcalina
GGT
Glucosio
LDH
Lipasi
Potassio
Proteine totali
Sodio
Trigliceridi
Urato
Urea
Differenza critica
Questo parametro fornisce la minima differenza
statisticamente significativa (ad un livello di probabilità scelto dall’operatore) tra due successive misurazioni di uno stesso analita nello stesso paziente. Rappresenta quindi la soglia oltre la quale la variazione
della concentrazione dell’analita è significativa per
una decisione clinica. Esso viene calcolato sulla base
della variabilità biologica intraindividuale (CVi) e
della variabilità analitica (CVa).
La formula per il calcolo della differenza critica
(Dcr) è la seguente:
* (CVa
CVi
CVa
Dcr
16,9
9,0
23,8
11,9
19,0
2,3
23,4
1,3
6,1
7,4
5,4
1,5
12,7
20,3
8,1
12,6
10,6
9,8
12,8
4,5
2,8
0,6
8,1
8,1
11,0
4,0
3,0
3,0
4,0
6,0
2,0
3,0
5,0
2,0
5,0
3,0
2,0
6,0
5,0
5,2
5,0
3,0
2,5
5,0
2,5
2,0
2,0
3,5
2,0
3,5
48,1
26,3
66,4
34,8
55,2
8,4
65,3
14,3
17,8
24,7
17,1
6,9
38,9
57,9
26,7
37,5
30,5
28,0
38,1
14,3
9,5
5,8
24,4
23,1
32,0
Tabella 1. differenza critica di alcuni analiti per un
livello di probabilità di 0.95.
24
AMBULATORIO PER IL MONITORAGGIO DELLA
TERAPIA ANTICOAGULANTE ORALE:
STANDARD DI PRODOTTO
L’ambulatorio per il monitoraggio della terapia
anticoagulante orale (TAO) si pone come obiettivo
principale l’integrazione dei molteplici processi assistenziali coinvolti nella gestione del paziente anticoagulato e, laddove possibile, il miglioramento della
loro efficacia e appropriatezza.
Questo approccio poggia su solide evidenze scientifiche: è infatti ampiamente dimostrato che le cosiddette
anticoagulation clinic offrono ai pazienti un reale vantaggio, in termini di prevenzione degli eventi tromboembolici e di complicanze emorragiche (Cortellazzo et al.,
1993; Hamby et al., 2000; Chamberlain et al., 2001).
La sorveglianza dei pazienti in TAO costituisce
dunque un processo assistenziale in cui si integrano
attività laboratoristica, clinica ed educativo/informativa, svolta da figure professionali con competenze,
ruoli ed aree di formazione diversificate, che si pone
come outcome l’ottimizzazione di efficacia e sicurezza
della TAO. La gestione dell’ambulatorio è affidata ad
un pool di medici dell’Area Funzionale della Diagnostica di Laboratorio, afferenti ai Servizi di Patologia
Clinica e di Medicina Trasfusionale.
In un’ ottica di complementarietà e di collaborazione, l’accesso alle prestazioni fornite avviene solo su
specifica richiesta del Medico di Medicina Generale
(“8 controlli INR presso ambulatorio TAO”) e, limitamente alla prima visita, è necessario l’appuntamento.
L’ambulatorio ha sede presso il Poliambulatorio ed
è aperto dal Lunedì al Sabato con i seguenti orari:
• per i prelievi (tre fasce orarie):
m ore 08:00;
m ore 08:50;
m ore 11:00.
Per il successivo ritiro del referto ed il controllo clinico il paziente dovrà presentarsi presso il primo
piano del Poliambulatorio dalle ore 12 alle ore 14 dello
stesso giorno.
L’ambulatorio TAO offre dunque al paziente la possibilità di eseguire nell’ambito della stessa mattina:
• il prelievo e l’esecuzione di esami della coagulazione;
• l’esame clinico iniziale che si svolge nell’ambito
della prima visita;
• le prescrizioni di controlli sia laboratoristici che
clinici successivi;
• la prescrizione della terapia;
Nell’ambito della prima visita viene eseguita una
valutazione per chiarire e/o definire i seguenti aspetti:
• il motivo della terapia anticoagulante;
• la presenza di eventuali controindicazioni;
• il target terapeutico;
• la durata della terapia;
• l’educazione del paziente all’assunzione della
terapia e la sua informazione sulle interferenze legate
ai farmaci, alle abitudini di vita, ai fattori stagionali;
m i dati anamnestici collegati alla patologia;
m l’eventuale necessità di eseguire esami di
laboratorio come:
m test coagulativi di base (PT, aPTT, fibrinogeno) volti ad escludere una diatesi emorragica;
m esame emocromocitometrico, assetto marziale, transaminasi, γGT, bilirubina, colinesterasi, protidemia totale e frazionata, funzionalità renale;
m test di gravidanza in donne in età fertile.
Il Centro TAO, grazie ad un software gestionale
dedicato e mediante la connessione tramite local area
network al coagulometro del Laboratorio Analisi,
gestisce un archivio dati informatico, dove ogni
paziente viene inserito ed ha disposizione una cartella
clinica individuale in cui sono registrati:
• i dati anagrafici e sanitari;
• i dati anamnestici;
• le indicazioni alla TAO ed il target terapeutico;
• il tipo di farmaco usato;
• il risultato degli esami di laboratorio;
• la prescrizione giornaliera della terapia;
• gli appuntamenti per i controlli successivi.
Le potenzialità del software gestionale dedicato,
grazie ad algoritmi validati, consentono inoltre:
• l’esecuzione di periodici controlli qualità ed elaborazioni statistiche;
• la prescrizione automatica della posologia terapeutica;
• la previsione della dose di mantenimento.
La VEQ è garantita inoltre dalla partecipazione al
controllo di qualità esterno che, su base nazionale, è
stato reso obbligatorio per tutti i Centri che, analogamente a quello di Livorno, sono e desiderano rimanere federati alla Federazione dei Centri di Sorveglianza
Anticoagulati (FCSA).
25
Nell’ambito dell’ambulatorio TAO il paziente viene
inoltre educato/informato:
• all’uso corretto della terapia;
• alla durata della terapia (breve/a lungo termine/a vita);
• alla necessità di controlli periodici clinici e di
laboratorio;
• sulla possibilità di interferenze farmacologiche
(viene fornita, se necessario, una lista di farmaci sicuri);
• sulla necessità di fornire indicazioni sullo stato
salute generale del paziente che possono interferire
con il livello di anticoagulazione;
• a mantenere delle abitudini di vita costanti.
Viene inoltre gestito l’embricamento con la terapia
eparinica ed il successivo passaggio alla terapia con
anticoagulanti orali e, su specifica richiesta, è fornita
consulenza per le misure terapeutiche da adottare in
previsione di interventi chirurgici e/o manovre invasive. I pazienti che giungono al termine della terapia
non sono più sottoposti a controlli, ma la loro cartella
informatica viene archiviata.
Giancarlo Liumbruno
Servizio di Medicina Trasfusionale
26
IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSI DEI DIFETTI
DELL’EMOSTASI
Antonio La Gioia
L'emostasi è l'insieme dei fenomeni fisiologici che
portano all'arresto di un sanguinamento conseguente
a soluzione di continuo della parete vascolare. Si tratta di un processo che, schematicamente, è suddiviso
in tre fasi (vascolare, piastrinica e plasmatica o coagulativa p.d.), ciascuna delle quali può essere indagata
con opportuni test di laboratorio.
Le moderne conoscenze sulla fisiopatologia emocoagulativa impongono l'abbandono di tutti quei test
di laboratorio complessivamente conosciuti come
prove emogeniche (tempo di coagulazione, prova del
laccio, del pizzicotto, tempo di stillicidio dal lobo dell'orecchio, etc.) perché scarsamente correlati con l'emostasi in vivo, poco standardizzati e non riproducibili. E' generalmente accettato il criterio diagnostico di
una esplorazione del sistema emocoagulativo impostata in due tempi:
- test di primo livello, in grado di evidenziare la
maggior parte dei difetti dell’emostasi;
- test di secondo livello.
• Tempo di protrombina o PT o attività protrombinica o tempo di Quick: esplora la via estrinseca e
comune della fase plasmatica della coagulazione e,
pertanto, è sensibile a deficit isolati o multipli, congeniti o acquisiti o farmacologici dei fattori VII, X, V, II e
del fibrinogeno. Un aspetto importante è rappresentato dalla espressione del risultato soprattutto in relazione alla "confrontabilità" dei dati di laboratori
diversi o dello stesso laboratorio quando viene monitorizzata la terapia anticoagulante orale. Riportiamo
di seguito le diverse modalità di espressione del risultato con un "giudizio di confrontabilità".
m secondi: esprime il tempo necessario alla coagulazione di una miscela plasma-tromboplastina.
Confrontabilità pessima sia intra- che interlaboratorio: da non usare;
m % di attività: traduce il tempo in attività coagulativa rapportata ad una curva di calibrazione in
cui la "normalità" risulta pari al 100%.Confrontabilita
scarsa sia intra- che interlaboratorio; è la modalità di
espressione del PT ancor oggi più utilizzata;
m ratio: è il rapporto tra il tempo di coagulazione del plasma in esame e quello di un plasma normale:
I test di primo livello
I test di primo livello esplorano le diverse fasi del
processo emocoaugulativo fornendo informazioni su
ciascuna di esse o globali. La normalità di tali test, in
assenza di un quadro clinico suggestivo di difetti dell'emostasi, giustifica la non utilizzazione di ulteriori
indagini diagnostiche.
• Tempo di emorragia o di stillicidio o di sanguinamento indaga la fase vasculo-piastrinica e, se correttamente eseguito (standardizzazione della incisione,
bracciale a 40 mmHg), risulta affidabile e riproducibile. Allungamenti del tempo di emorragia, con conteggio piastrinico normale orientano per una piastrinopatia o per deficit dei fattori implicati nella fase vasculo
piastrinica (fatt. von Willebrand, fibrinogeno)
• Conteggio delle piastrine: attualmente sono eseguiti esclusivamente con metodi automatizzati, più
affidabili precisi e riproducibili dei vecchi metodi
manuali di conteggio al microscopio. I moderni contatori cellulari offrono generalmente altri indici correlati
(PDW, piastrinocrito); nessuno di tali parametri ha
importanza clinica consolidata e per questo motivo
sono stati eliminati dalla refertazione del nostro laboratorio.
PT paziente
Ratio = ——————
PT normale
Confrontabilità accettabile, specialmente intralaboratorio;
• INR (International Normalized Ratio = rappor to internazionale normalizzato): esprime la ratio precedentemente descritta dopo correzione per un indice
di sensibilità della tromboplastina utilizzata. In pratica ciascun lotto di reagente, prima di essere messo in
commercio, viene "tarato" su uno standard internazionale di riferimento; il risultato di questa taratura è
espresso come rapporto tra il tempo di coagulazione
ottenuto con una specifica tromboplastina e quello
ottenuto con la tromboplastina di riferimento. Tale
rapporto, utilizzato nel calcolo della INR, viene denominato ISI (International Sensitivity Index); il valore
di ISI, obbligatoriamente dichiarato da ciascuna ditta
produttrice per ciascun lotto, esprime, in un certo
29
senso, la qualità del reagente utilizzato: il valore 1.00
rappresenta la tromboplastina ideale con comportamento coagulativo identico allo standard internazionale di riferimento. Nel nostro laboratorio utilizziamo
tromboplastine con ISI pari a 1.05. Con l’introduzione
dell’ISI è stato raggiunto un buon livello di confrontabilità sia intra- che interlaboratorio.
• Tempo di trombina: sensibile ai difetti quantitativi e qualitativi del fibrinogeno; è allungato in corso di
terapia eparinica.
• Dosaggio dei fattori emocoagulativi: vengono
ricercati i deficit dei fattori V, VII, VIII, IX e X. Quando
la richiesta è determinata da un allungamento dell'
aPTT e/o del PT, la ricerca di deficit fattoriali viene
fatta precedere, generalmente, dai così detti mix test
che permettono di precisare se un difetto coagulativo
è determinato da carenza fattoriale o dalla presenza di
inibitori della coagulazione. I mix test si basano sulla
capacità di un plasma normale, aggiunto al plasma in
esame, di correggere (carenza fattoriale) o meno (presenza di inibitori) il difetto.
• Ricerca dell'anticoagulante tipo lupus (Lac), di
anticorpi antifosfolipidi (Apa): anomalie dei test coagulativi di base possono essere determinate dalla presenza di anticoagulanti acquisiti (inibitori, Lac, Apa).
Lo studio di tali anomalie coagulative si avvale dei mix
test (vedi sopra) e di specifiche indagini mirate (vedi
scheda sulla sindrome da anticorpi antifosfolipidi).
• Studio della proteine C (PC) ed S (PS): deficit
congeniti o acquisiti degli anticoagulanti fisiologici
non modificano, in genere, i test coagulativi di base.
Lo screening e l’eventuale approfondimento sono
quindi determinati su base clinico/anamnestico (vedi
scheda sulle trombofilie)
• Dosaggio del fibrinogeno.
• Ricerca del D-dimero: indice di attivazione in
vivo del processo emocoagulativo e pertanto positiva
nei casi di coagulazione intravascolare disseminata
(DIC), trombosi venose profonde, embolia polmonare;
può essere più propriamente considerato un test per
lo studio della fibrinolisi (vedi scheda D-Dimero).
Tromboplastina in uso
ISI = ——————————————
Tromboplastina. di riferimento
INR = RatioISI
• Tempo di tromboplastina parziale attivato o
aPTT: indaga la via intrinseca e comune della coagulazione ed è quindi sensibile ai difetti dei fattori XII,
XI, IX, VIII, X, V, II, fibrinogeno. Il risultato viene
espresso generalmente in secondi anche se appare più
corretto l'uso della "ratio", analogamente a quanto
detto per l'attività protrombinica.
I test di secondo livello
Si ricorre all'uso dei test di secondo livello quando
si documentino alterazioni dei test di primo livello o,
comunque, in presenza di un quadro clinico suggestivo, non chiarito dalle indagini preliminari.
Tra quelli in uso presso il nostro laboratorio ricordiamo:
• Test di aggregazione piastrinica: indaga la funzionalità piastrinica e la risposta ad eventuali terapie
antiaggreganti. Ancor oggi rappresenta il test di elezione per la individuazione e l'inquadramento di
difetti funzionali, congeniti o acquisiti, delle piastrine.
30
IL LABORATORIO NELLO SCREENING DELLE
TROMBOFILIE
Angela Matteucci
La trombosi è un fenomeno multifattoriale dalla
patogenesi complessa e dipende, secondo un concetto
espresso già nel XIX° secolo da Virchow, dalla triade
di alterazioni del sistema vascolare (danno vasale), del
flusso ematico (rallentamento o stasi) e della coagulazione (ipercoagulabilità). Il trombo venoso è prevalentemente fibrinico e alla sua formazione concorre maggiormente la coagulazione, mentre nella formazione
del trombo arterioso giocano un ruolo più importante
le piastrine e la parete vasale.
Definiamo come stati trombofilici alcune particolari condizioni caratterizzate dalla presenza di fattori
causali ben definiti, unici e altamente specifici per la
trombosi, e quindi da un rischio elevato di eventi
trombotici (trombofilia ereditaria o acquisita). In
molte circostanze gli eventi trombotici sono scatenati
o favoriti da condizioni acquisite (permanenti o transitori) favorenti la trombosi quali l’immobilizzazione,
i traumi, gli interventi chirurgici, la assunzione di
estroprogestinici e la gravidanza.
Queste condizioni “protrombotiche“ sono la prova
del carattere multifattoriale del fenomeno trombotico.
trombosi spontaneamente. La restante parte in concomitanza di fattori scatenanti quali gravidanza, traumi,
interventi chirurgici, contraccettivi orali. La diagnosi
di carenza congenita può essere posta con ragionevole
certezza se l’attività è ridotta a livello di circa il 50%
della norma e siano escluse tutte le cause di carenza
acquisita quali epatopatie, coagulazione intravascolare disseminata (CID), sindrome nefrosica e trattamento eparinico.
La carenza congenita di PC è responsabile del 5-8%
delle trombosi venose idiopatiche giovanili. I soggetti
con carenza congenita, anche a livelli del 50% della
norma, possono sviluppare tromboembolie venose e
talvolta anche arteriose. Anche qui è necessario escludere le cause di carenza secondaria a malattie epatiche, la CID e l’assunzione di anticoagulanti orali.
La prevalenza del difetto della PS nei pazienti con
tromboembolismo in età giovanile è simile a quella
della PC. La PS è presente in circolo in due forme:
circa il 40% libera (forma attiva) ed il restante 60 %
legata ad una proteina regolatrice del complemento, la
C4bBP che è anche una proteina della fase acuta. Conseguentemente, nel corso di malattie acute, così come
in gravidanza e durante l’assunzione di estroprogestinici l’aumento della C4bBP determina una diminuzione di PS libera. Carenza acquisita di PS si ha inoltre
nella CID, nelle epatopatie e nei pazienti in trattamento con anticoagulanti orali.
I valori soglia ritenuti necessari per un minimo
bilancio emostatico sono il 5%. Nella porpora fulminante neonatale (omozigosi per il deficit PC o PS) i
valori sono solitamente inferiori a questo limite.
Resistenza alla proteina C attivata: quando al plasma umano normale si aggiunge PC attivata si assiste
ad un prolungamento del tempo di coagulazione
come conseguenza della inattivazione dei fattori V e
VIII attivati, da parte della PC attivata. Esistono soggetti il cui tempo di coagulazione, dopo l’aggiunta in
vitro di PC attivata, non si prolunga in maniera adeguata. Responsabile di tale anomalia, denominata
resistenza alla PC attivata, è, nella stragrande maggioranza dei casi, una mutazione del gene del fattore V
(fattore V Leiden). Questa condizione costituisce la
più frequente alterazione trombofilica congenita: ha
una prevalenza nella popolazione trombofilica del 20
Trombofilie ereditarie
Le trombofilie ereditarie sono un gruppo di affezioni caratterizzate da episodi trombotici prevalentemente venosi, che avvengono in età giovanile, spesso
ricorrenti, e nelle quali è possibile mettere in evidenza
una familiarità.
Le principali sono:
• Carenza o alterata funzione degli inibitori della
coagulazione:
m Antitrombina (AT)
m Proteina C (PC)
m Proteina S (PS)
• Resistenza alla proteina C attivata
• Aumento ereditario del fattore II
Il difetto congenito di AT è responsabile del 2-4%
degli episodi trombotici in età giovanile. A causa della
incompleta penetranza non tutti gli individui carenti
sviluppano la trombosi. La comparsa dei sintomi è
correlata con l’età: bassa al di sotto di 20 anni, elevata
al di sopra dei 50. Circa la metà dei soggetti sviluppa
31
– 60% ed è presente nel 3-5% della popolazione normale. Si trasmette per via ereditaria con tratto autosomico dominante e, vista l’alta prevalenza, si associa
con una certa frequenza ad altre carenze congenite
(AT, PC, PS) o a difetti acquisiti (anticorpi antifosfolipidi, iperomocisteinemia, ecc.), aumentando così il
rischio di trombosi nei soggetti portatori. Questo test
può essere reso specifico per la mutazione del V
aggiungendo plasma carente di V durante l’esecuzione del test. Comunque la resistenza alla proteina C
attivata costituisce di per sé un fattore di rischio per
tromboembolismo venoso, indipendentemente dalla
presenza di fattore V Leiden. All’identificazione di un
soggetto resistente con metodo coagulativo è sempre
buona norma far seguire la conferma con il test genetico per la mutazione del fattore V.
Recentemente è stata individuata una variante
genetica della protrombina (20210A) che risulta essere
associata ad elevati livelli plasmatici del fattore II
(protrombina) e ad un aumentato rischio di eventi
trombotici. Questa mutazione è presente in circa il 2%
della popolazione sana, e nel 6-7 % dei trombofilici; il
rischio relativo in soggetti eterozigoti è piuttosto
modesto (3 volte), ma l’associazione con altri difetti
potrebbe incrementarlo.
A causa della mancanza di un valore discriminante
fra portatore e non portatore, la misura dei livelli plasmatici del fattore II non è idonea ad identificare i soggetti portatori della mutazione. Attualmente, il metodo usato per l’identificazione dei soggetti. è l’analisi
del DNA.
diagnostica del test.
Accanto a queste ci sono forme acquisite, per lo più
secondarie a deficit di folati, vitamina B12 e vitamina
B6; sono particolarmente frequenti negli anziani. La
prevalenza del difetto nella popolazione trombofilica
è del 20%. Molti degli eventi trombotici sono associati
a fattori predisponenti come contraccettivi orali, chirurgia e gravidanza.
Trombofilie acquisite
• Anticorpi antifosfolipidi (APA) e anticoagulante
tipo Lupus (LAC). La presenza di LAC e/o APA si
può associare a manifestazioni cliniche di trombosi
ricorrenti venose e arteriose, abortività ricorrente e
piastrinopenia. Il LAC è presente nel 10% dei pazienti
con lupus eritematoides: che risultano quindi a più
elevato rischio trombogeno. LAC e/o APA possono
ritrovarsi anche associati a malattie autoimmuni, a
malattie mielo- e linfoproliferative, neoplasie, infezioni virali, epatite cronica attiva o all’uso di alcuni farmaci (idralazina, clorpromazina).
• Deficienza acquisita della fibrinolisi. Un elevato
livello di PAI 1 o, assai più raramente, una deficienza
di produzione di tPA sono stati riscontrati con notevole frequenza associati a trombosi venose ricorrenti. Ma
l’estrema variabilità del parametro PAI, la sua reattività come proteina della fase acuta e quindi la difficoltà di distinguere se un suo aumento sia primitivo o
secondario rispetto alla trombosi, impediscono di conferire a questa alterazione il valore di uno stato trombofilico vero e proprio.
• Fattori della coagulazione. Recenti studi indicano un aumentato rischio per tromboembolismo venoso (TEV) in presenza di elevati livelli di alcuni fattori
della coagulazione (VIII, IX e XI); allo stato attuale
solo per il fattore VIII è emersa una evidenza certa;
valori aumentati si sono dimostrati infatti come fattore di rischio indipendente per TEV.
• Altre cause. Fra le altre cause acquisite di trombofilia hanno un ruolo importante l’età avanzata, il
puerperio, l’infarto miocardio acuto, il cancro, le sindromi mieloproliferative, la sindrome nefrosica e le
infezioni.
Altre anomalie ereditarie descritte in associazione
con rischio di trombosi sono:
• Carenze o anomalie ereditarie di fattori o meccanismi della fibrinolisi
m disfibrinogenemia
m riduzione del plasminogeno
• Iperomocisteinemia
• Aumento della lipoproteina (a)
La disfibrinogenemia è caratterizzata dalla presenza nel plasma di un fibrinogeno abnorme, la cui conversione in fibrina è ritardata o alterata strutturalmente. E’ causa di trombosi venose recidivanti ed è spesso
associata alla comparsa di fenomeni trombotici arteriosi. Costituisce una condizione non frequente.
Per le alterazioni del plasminogeno la penetranza
clinica è bassa.
Un aumento, anche modesto di omocisteina nel
sangue rappresenta un fattore di rischio per malattie
cardiovascolari. Numerose sono le condizioni congenite che portano all’accumulo nel plasma di omocisteina. La diagnosi non comporta particolari problemi
nei soggetti omozigoti, mentre negli eterozigoti la
misura dei livelli del metabolita quattro ore dopo un
carico orale di metionina può migliorare la capacità
Trombosi arteriose
Le piastrine giocano un ruolo importante nella formazione del trombo arterioso, ma il valore predittivo
del test di aggregazione piastrinica in vitro nella trombosi arteriosa è inesistente ed è quindi inutile eseguire
questo test ai fini diagnostici per trombofilia.
Vari studi hanno messo in evidenza una chiara
associazione fra aumento di fibrinogeno e trombosi
arteriosa.
Alcune ricerche epidemiologiche avevano messo in
evidenza un’associazione fra aumentati livelli di fattore VII e trombosi arteriosa, ma studi successivi non
hanno confermato il dato.
32
Chi sottoporre allo screening trombofilico?
I soggetti per i quali è indicato eseguire uno screening per trombofilia sono elencati nella tabella 1.
Rimane tuttora dibattuto il tema dello screening di
pazienti candidate all’uso di contraccettivi orali o di
terapia postmenopausale sostitutiva.
1. l’indagine di laboratorio si esegue solo sui soggetti che hanno avuto almeno un episodio di trombosi, con o senza familiarità
2. l’età dei soggetti da avviare allo screening è generalmente inferiore a 50 anni
3. prima dello screening bisogna escludere eventuali cause che possano spiegare la trombosi (neoplasie)
4. i riscontri diagnostici positivi debbono essere
confermati in una occasione successiva e dopo aver
escluso eventuali cause acquisite di carenza (ad es.
epatopatie)
5. estendere l’indagine ai familiari del probando
anche se ancora asintomatici
6. i portatori del difetto devono essere adeguatamente informati circa i rischi che la loro condizione
comporta in occasione di esposizione ad eventi scatenanti
Quando eseguire lo screening?
Il risultato di alcuni test può essere considerevolmente influenzato dall’episodio acuto e dalla relativa
terapia; nelle tromboembolie venose va eseguito a
distanza di almeno tre mesi dall’evento acuto e dopo
la sospensione (da almeno 15-20 giorni) di qualsiasi
trattamento anticoagulante. Anche negli eventi arteriosi è necessario attendere almeno tre mesi dall’evento acuto, ma l’indagine può essere eseguita in corso di
terapia antiaggregante.
Inoltre lo screening non va eseguito durante malattie intercorrenti acute (le proteine del complemento
sequestrano la PS), durante il trattamento estro-progestinico o terapia ormonale sostitutiva, in caso di epatopatie e durante la gravidanza.
I test genetici per il fattore V Leiden e la protrombina variante non risentono dei suddetti fattori.
E quali di questi test vengono eseguiti presso il
laboratorio di Livorno?
Tutti gli esami elencati nella tabella 2 vengono eseguiti presso il nostro laboratorio. Inoltre, fra gli esami
nominati in questa breve rassegna, vengono eseguiti
l’aggregazione piastrinica, il dosaggio della vitamina
B12 e dei folati, il dosaggio dei fattori della coagulazione (V, X, VII,VIII, IX e XI) ed i test coagulativi di
base (PT e aPTT).
• Storia familiare positiva per embolie venose
• Trombosi idiopatica
Trombofilia venosa
• Trombosi dopo stimoli di entità trascurabile, specie
se ricorrenti
Antitrombina
• Età giovanile di comparsa dell’evento
Proteina C
• Trombosi in sedi non usuali
Proteina S
Resistenza alla proteina C attivata
• Associazione di patologia trombotica venosa e arteriosa
Omocisteina
• Associazione di trombosi e perdita fetale
Fattore VIII
• Necrosi cutanea indotta da anticoagulante
Anticorpi antifosfolipidi (LAC e APA)
• Porpora fulminante neonatale
Analisi del DNAper l’identificazione
della protrombina (20210A)
Tabella 1. Soggetti per i quali è indicato eseguire uno
screening per trombofilia.
Trombofilia arteriosa
Quali test?
I test di screening per i quali esiste oggi provata
validità clinica e sufficiente accordo fra gli esperti
sono elencati nella tabella 2.
Fibrinogeno
Omocisteina
Anticorpi antifosfolipidi (LAC e APA)
Raccomandazioni
Per lo screening del paziente trombofilico valgono
le seguenti raccomandazioni:
Tabella 2. Screening emostatico per il paziente trom bofilico.
33
USO CLINICO DEL D-DIMERO
Antonio La Gioia
Il tromboembolismo venoso (TEV) è una malattia
potenzialmente fatale che si manifesta nelle forme cliniche più frequenti della trombosi venosa profonda
(TVP) e dell’embolia polmonare (EP).
L’EP deriva nella maggior parte dei casi (90%) da
TVP degli arti inferiori; inoltre, nel 70% dei pazienti
con EP è possibile riscontrare una TVP residua, mentre nel 50% delle TVP distali è possibile accertare una
EP clinicamente silente.
medaglia con aspetti comuni non solo per quanto
riguarda i fattori di rischio e la terapia, ma anche per
gli strumenti diagnostici.
Recentemente Wells ha introdotto nella valutazione
diagnostica della TVP e dell’EP il concetto di probabilità pre-test: la stratificazione del rischio individuale
di TEV, infatti, condiziona (in positivo) il valore predittivo di qualsiasi test diagnostico strumentale. In
tabella 1 e 2 sono riportati i modelli clinici per predire
la probabilità pre test per TVP e, rispettivamente, per
EP.
- Punteggio totale ≥ 7: probabilità elevata
- Punteggio totale ≥ 3: probabilità elevata
- Punteggio totale 1 o 2: probabilità moderata
- Punteggio totale ≤ 0: probabilità bassa
TVP ed EP, quindi, sono due facce della stessa
Caratteristiche cliniche
- Punteggio totale 2-6:
- Punteggio totale 0-1:
I modelli clinici di Wells presentano limitazioni evidenti (soggettività nella identificazione delle diagnosi
alternative, per esempio) ma hanno il grande merito
di rendere possibile la graduazione dell’impiego delle
Punteggio
Cancro attivo (terapia in corso
o nei 6 mesi precedenti o palliativa)
1
Paralisi o paresi o recente ingessatura
degli arti inferiori
1
probabilità moderata
probabilità bassa
Caratteristiche cliniche
Punteggio
Precedente EP o TVP
1.5
Tachicardia (>100b/min)
1.5
Recente intervento chirurgico
o immobilizzazione
1.5
Segni clinici di TVP
3.0
Recente allettamento > 3 giorni o
chirurgia maggiore entro 4 settimane
1
Dolorabilità localizzata lungo la
distribuzione del sistema venoso profondo
1
Edema di un intero arto inferiore
1
Edema del polpaccio > 3 cm rispetto
all’arto inferiore asintomatico
1
Diagnosi alternativa meno
probabile di EP
3.0
Presenza di vene collaterali
superficiali (non varicose)
1
Emottisi
1.0
Diagnosi alternativa ugualmente
o più probabile di TVP
Cancro
1.0
-2
Tabella 1. Modello clinico per predire la probabilità
pretest per TVP. (Wells PS, et Al. A simple clinical
model for the diagnosis of deep-vein thrombosis com bined with impedance plethismography: potential for
an improvement in the diagnostic process. J Intern
Med 1998 Jan;243(1):15-23).
34
Tabella 2. Modello clinico per predire la probabilità
pretest per EP.
(Wells PS, et Al. Derivation of s simple clinical
model to categorize patients probability of pulmo nary embolism: increasing the models utilty with de
simplired D-dimer. Thromb Haemost 2000 Mar;83
(3):416-20).
metodiche diagnostiche e di incrementare fortemente
la significatività clinica dei test strumentali utilizzati.
Il miglior strumento diagnostico che il laboratorio
può offrire per la diagnosi di TVP ed EPè il D-dimero.
Il D-dimero plasmatico si genera quando il sistema
fibrinolitico degrada la fibrina ed è quindi specifico
della fibrina stabilizzata e, conseguentemente, miglior
marcatore della formazione di fibrina in vivo.
Tale marcatore s’innalza quindi con l’evento trombotico per abbassarsi poi a circa 1/4 del valore iniziale
in 1-2 settimane.
Tutti i metodi di determinazione del D-dimero
attualmente in uso, prevedono l’impiego di anticorpi
monoclonali e sono quindi dotati di elevata specificità
analitica (misurano solo il D-dimero e non altri prodotti di degradazione della fibrina) e buona sensibilità
(misurano bassi valori di D-dimero) e buon valore
predittivo negativo (VPN: probabilità di assenza della
malattia con test negativo).
Esistono, invece, discrete differenze per quanto
attiene alla specificità e sensibilità cliniche; questi i criteri interpretativi di maggiore rilevanza:
• il D-dimero è raramente elevato nei soggetti sani
ma è poco specifico per TEV poiché aumenta in molte
altre condizioni in cui si forma e degrada la fibrina
(infezioni, tumori, traumi, interventi chirurgici, insufficienza renale, infarto, ecc.) = bassa specificità clinica;
• un risultato negativo rende improbabile la presenza di un episodio acuto di TEV, specie quando si
utilizzano metodi di buona sensibilità analitica ed elevato VPN.
Altre indagini strumentali sono correntemente utilizzate nella diagnostica di TVP ed EP. L’invasività di
alcune di queste (flebografia, angiografia), tuttavia,
enfatizza la necessità precedentemente richiamata di
valutare le probabilità pre-test per TEV acuto e quindi
la necessità del ricorso a tali metodiche..
Esistono metodiche strumentali non invasive
(ultrasonografia con compressione [CUS] per le TVP e
scintigrafia polmonare perfusoria/ventilatoria per EP)
la cui sensibilità, tuttavia, è significativamente più
bassa delle manovre invasive.
Parecchi studi, pertanto, hanno valutato la sicurezza e l’efficacia diagnostica di utilizzare algoritmi decisionali che associassero il dosaggio del D-dimero con i
test strumentali non invasivi (Kraaijenhagen RA et Al
Simplification of the diagnostic management of
suspected deep vein thrombosis. Arch Intern Med.
2002 Apr 22;162(8):907-11.
I diversi risultati di tali studi portano alle seguenti
conclusioni:
1. Il TEV può essere escluso con sicurezza utilizzando strategie diagnostiche non invasive che prevedano anche l’utilizzo del D-dimero;
2. i risultati di tali studi si riferiscono all’uso combinato del D-dimero e dei modelli clinici per la valutazione della probabilità pre test;
3. in alcuni casi l’esclusione del TEV può essere
ottenuta con sicurezza sulla base di un D-dimero
negativo. Condizione irrinunciabile per tale condotta
è rappresentata dall’uso di un D-dimero di sensibilità
100% (e VPN 100%): ogni 2% di riduzione della sensibilità, infatti, comporta 1 morte per ogni 1000 pazienti
valutati per EP;
4. Anche utilizzando metodiche con sensibilità pari
al 100%, rarissimi casi di TEV possono essere D-dimero negativi. In tale evenienza devono essere valutati:
• Intervallo tra sintomi e dosaggio del D-dimero:
un intervallo > 7 giorni rende non conclusivo il risultato negativo;
• I livelli di D-dimero si abbassano significativamente in corso di terapia con anticoagulanti orali;
• Possibili difetti del sistema fibrinolitico.
35
DIAGNOSTICA DELLE ANEMIE
Gerardina Russo
Si definisce anemia la riduzione del patrimonio eritrocitario ed emoglobinico. Un primo approccio alla
diagnosi etiopatogenetica delle anemie è possibile con
il semplice esame emocromocitometrico, che consente
la suddivisione in base al contenuto emoglobinco
medio globulare (MCH) in anemie ipocromiche, normocromiche e ipercromiche ed in base al volume dei
globuli rossi (GR) in anemie microcitiche, normocitiche e macrocitiche. Secondo un criterio patogenetico
vengono distinte:
• anemie sideropeniche da carenza di ferro (Fe);
• anemie megaloblastiche da carenza di alcuni fattori che regolano l’eritropoiesi;
• anemie mielopatiche da alterazione intrinseca
della matrice eritropoietica;
• anemie emolitiche da ridotta sopravvivenza dei
globuli rossi.
II caratteri di un’anemia sideropenica sono i
seguenti:
• riduzione del patrimonio emoglobinico maggiore
di quella del patrimonio eritrocitario;
• riduzione del diametro e del volume globulare
medio;
• presenza sugli strisci di GR scolorati (anulociti);
• iperplasia eritroblastica midollare, con rapporto
leuco-eritrogenetico <1, con rallentamento della
maturazione;
• spiccata riduzione dei sideroblasti midollari e
assenza di Fe nel citoplasma dei macrofagi midollari;
• riduzione della ferritina, iposideremia e ipertransferrinemia insatura;
• reticolociti non sempre diminuiti, spesso normali,
talora modicamente aumentati; crisi reticolocitaria a
distanza di 48-72 ore dall’inizio della terapia sostitutiva con Fe;
• resistenza globulare osmotica (RGO) spesso
modicamente aumentata;
• sopravvivenza dei GR praticamente normale.
Le anemie sideropeniche sono dovute ad un’alterazione dell’emoglobinopoiesi per carenza di Fe.
Tutte le anemie sideropeniche sono ipocromiche
(anemie ipocromiche sideropeniche), ma un’anemia
ipocromica può essere dovuta a difettosa utilizzazione
del Fe (anemie ipocromiche ipersideremiche) o a difettosa sintesi di globina (talassemie, anche queste ipocromiche e ipersideremiche).
Un’anemia funzionalmente iposideremica può
essere dovuta, oltre che a carenza di Fe, al suo sequestro nel sistema reticolo endoteliale (SRE) (anemie
infettive, anemia dell’artrite reumatoide, anemie in
corso di neoplasie); in tal caso l’anemia è normocromica o modicamente ipocromica e si accompagna a
deposizione tessutale di Fe.
Le cause di una carenza di Fe sono fondamentalmente:
• mancato apporto (allattamento prolungato al
seno);
• mancato assorbimento (acloridria, gastroresezione, accelerato transito intestinale, fistole gastro-digiuno-coliche, sindromi da malassorbimento);
• aumentata richiesta (accrescimento, gravidanza,
allattamento);
• perdita abnorme (emorragie croniche, emoglobinuria parossistica notturna).
Le anemie megaloblastiche conseguono a un’alterata maturazione degli eritroblasti per difettosa sintesi
di DNA, dovuta prevalentemente a carenza di vitamina B12 o di acido folico. Poiché le riserve di acido folico nell’organismo sono relativamente scarse e ogni
stato che comporti un’esaltazione del lavoro eritropoietico midollare comporta un aumentato fabbisogno
di acido folico, alcune anemie mielopatiche (refrattarie) ed emolitiche croniche si accompagnano a una
tendenza alla megaloblastosi. Le cause di una carenza
di fattori anti-megaloblastici sono:
a. per la vit. B12:
• mancato apporto (lattanti,vegetariani);
• mancato assorbimento (deficit di fattore intrinseco nell’anemia perniciosa e in altre affezioni gastriche,
sindromi da malassorbimento);
• aumentata richiesta (gravidanza);
b. per l’acido folico:
• mancato apporto (malnutrizione);
• mancato assorbimento (sindromi da malassorbimento;
• aumentata richiesta (gravidanza);
• antagonismo farmacologico (antifolici, anticon-
36
vulsivanti, raramente contraccettivi e associazioni
cicloserina e isoniazide);
- fattori multipli e complessi (epatopatie, alcoolismo).
Nelle sindromi da malassorbimento e nelle gravidanza il deficit di acido folico prevale su quello di vit.
B12. Una megaloblastosi non legata a carenza di queste
due vitamine si può avere nella oroticoaciduria oppure dopo uso di farmaci che inibiscono la sintesi di
DNAquali il 5-fluorouracile o la 6-mercaptopurina.
I caratteri comuni delle anemie aplastiche, indipendentemente dall’interessamento delle altre linee
midollari, sono:
• midollo estremamente povero di eritroblasti;
• reticolociti estremamente ridotti;
• globuli rossi di solito, ma non necessariamente,
normocitici e normocromici con sopravvivenza normale;
• ipersideremia e ipotransferrinemia;
• rinnovamento del Fe59 plasmatico ridotto come
tasso e ritmo e sua incorporazione nei globuli rossi
circolanti ridotta.
I caratteri di una anemia megaloblastica sono:
• riduzione del patrimonio eritrocitario maggiore
di quella del patrimonio emoglobinico: valore globulare aumentato, contenuto emoglobinico aumentato,
concentrazione emoglobinica normale;
• macro-megalocitosi con aumento del diametro e
del volume globulare medio;
• alterazione morfologica degli eritroblasti, che
assumono carattere macro-megaloblastico;
• prevalenza degli eritroblasti con inversione del
rapporto leuco-eritrogenetico, ma curva di maturazione degli eritroblasti rallentata, con prevalenza delle
forme basofile (midollo blu);
• reticolociti diminuiti;
• rinnovamento del Fe59 plasmatico aumentato
come tasso, ma non come ritmo e sua incorporazione
nei GR ridotta (eritropoiesi inefficace);
• sopravvivenza dei GR spesso ridotta, con i caratteri dell’iperemolisi da difetto intraglobulare;
• iperbilirubinemia indiretta ed aumento dell’escrezione bilinica, anche in assenza di iperemolisi
(iperbilirubinemia da “shunt”);
• aumento della LDH e di altre attività enzimatiche
sieriche, conseguente alla distruzione intramidollare
di eritroblasti;
• aumento delle dimensioni dei granuloblasti e dei
megacarioblasti, talora piastrinopenia, ipersegmentazione dei granulociti neutrofili.
L’identificazione del fattore carente è sospettabile
in base ad un criterio clinico (possibile presenza di
manifestazioni neurologiche nel deficit di vit. B12), ad
un criterio eziologico (il fattore causale, se identificato,
orienta per il deficit dell’uno o dell’altro fattore), a due
criteri di laboratorio (aspetto macroblastico più che
megaloblastico e minore compromissione della serie
bianca e piastrinica nel deficit di acido folico).
I caratteri comuni delle anemie diseritropoietiche sono :
• midollo ricco, con linea eritroblastica ben rappresentata, ma con un blocco maturativo e prevalenza
degli elementi basofili (midollo blu);
• reticolociti estremamente ridotti;
• globuli rossi di diametro e volume variabile e
sopravvivenza di fatto spesso ridotta;
rinnovamento del Fe59 plasmatico aumentato
come tasso, anche se ridotto come ritmo, e sua incorporazione nei GR circolanti ridotta.
Le anemie emolitiche sono tutte le anemie dovute
a ridotta sopravvivenza dei GR. Un’iperemolisi si
accompagna ad anemia se la riduzione della sopravvivenza supera la capacità di compensazione del midollo (che può aumentare fino a 7 volte la produzione di
GR) o se vi è insufficienza midollare relativa, e/o ad
ittero (ittero emolitico), se la produzione di bilirubina
è aumentata in valore assoluto e supera la capacità del
fegato a coniugarla ed eliminarla. L’iperemolisi può
avere luogo in sede extravascolare o intravascolare.
Le anemie emolitiche si dividono in :
1. anemie emolitiche eritropatiche, in cui la causa
dell’iperemolisi è una ridotta vitalità dei GR;
2. anemie emolitiche extracorpuscolari, in cui la
causa dell’iperemolisi è la presenza di agenti o fattori
emolitici nel torrente circolatorio.
I caratteri comuni a tutte le anemie emolitiche, a
parte la riduzione della sopravvivenza dei GR, comprendono due gruppi di reperti:
A. Segni di un’aumentata distruzione di GR:
• iperbilirubinemia indiretta;
• riduzione dell’aptoglobina;
• ipersideremia.
Nell’iperemolisi intravascolare sono presenti anche
altri segni: metemalbuminemia, plasma laccato, emoglobinemia, aumento della LDH sierica, iperpotassiemia (se l’emolisi è massiva).
B. Segni di un’aumentata attività eritropoietica:
• iperplasia eritroblastica midollare;
• reticolocitosi.
La distinzione tra anemie emolitiche eritropatiche
Le anemie mielopatiche sono dovute a insufficienza dell’eritropoiesi non legata a fattori carenziali,
come nel caso delle anemie sideropeniche e megaloblastiche, ma a difetto delle cellule staminali o a blocco maturativo. In base alla densità cellulare del midollo queste anemie si distinguono in:
1. anemie mielopatiche a midollo “povero” o anemie aplastiche;
2. anemie mielopatiche a midollo “ricco” o anemie
diseritropoietiche.
37
ed extracorpuscolari si basa sul comportamento della
sopravvivenza dei GR.
tropatia acquisita. La diagnosi, di solito chiara in base
al contesto clinico, si documenta con i seguenti reperti:
autoemolisi per incubazione dei GR in siero normale,
acidificato a pH 6,7 (test di Ham), autoemolisi in soluzione ipotonica di saccarosio.
Anemie emolitiche eritropatiche:
• sferocitosi ereditaria (ittero emolitico tipo
Minkowski-Chauffard), legata a un ridotto contenuto
in lipidi della membrana globulare. La diagnosi, a parte
i criteri clinici (familiarità, splenomegalia, turricefalia),
si basa sui seguenti reperti: sferocitosi (GR di diametro
ridotto e volume normale), riduzione della RGO, legata alla sferocitosi; aumento della autoemolisi “in vitro”
(10-50%) corretta dall’aggiunta preliminare di glucosio
o ATP (tipo I). L’ iperemolisi è di tipo extravascolare,
ma l’aptoglobina è abitualmente ridotta.
• ellissocitosi ereditaria: può manifestarsi in forma
latente (senza iperemolisi), in forma compensata (con
iperemolisi, ma senza anemia), in forma conclamata
(con iperemolisi e anemia). La diagnosi si basa sui
seguenti reperti: GR di forma ovoidale in percentuale
del 50-90%, RGO normale, aumento dell’autoemolisi
in “vitro” corretta dall’aggiunta di glucosio o ATP.
• deficit di glucosio-6-fosfato deidrogenasi: è la
più nota delle eritropatie enzimopeniche emolitiche,
particolarmente frequente in alcune aree geografiche
(Sardegna) e nelle popolazioni di colore. Può determinare un’anemia emolitica cronica congenita o anemie
emolitiche acquisite da ipersensibilità a farmaci (primachina e altri antimalarici, sulfamidici, aspirina,
dinitrofurantoina, ecc.) o alle fave (favismo itteroemoglobinurico). La diagnosi si basa sul dosaggio dell’enzima, la formazione di corpi di Heinz, il test dell’autoemolisi “in vitro”.
• emoglobinuria parossistica notturna: è una eri-
Anemie emolitiche extraglobulari:
• anemie emolitiche autoimmuni, dovute a un processo di auto-immunizzazione, per il quale compaiono nel siero anticorpi rivolti contro i propri GR. Da un
punto di vista sierologico gli autoanticorpi si possono
distinguere in base all’attività: agglutinine (emolisi
indiretta, extravascolare) ed emolisine (emolisi diretta,
intravascolare); in base al carattere: completo (capacità
di agglutinare i GR sospesi in soluzione fisiologica) e
incompleto (capacità di agglutinare i GR solo se
sospesi in soluzione macromolecolare); in base alla
sede: adesi alla superficie dei GR (svelabili mediante
il test di Coombs diretto) o liberi nel siero (svelabili
mediante il test di Coombs indiretto); in base all’optimum termico: freddi (massima attività a + 4 °C), caldi
(massima attività a + 37 °C); in base alla classe: anticorpi IgM e anticorpi IgG; in base alla specificità nei
confronti degli antigeni eritrocitari.
• anemie emolitiche isoimmuni, dovute alla presenza nel siero di anticorpi naturali o immuni, rivolti
contro GR di individui della stessa specie appartenenti a un diverso gruppo sanguigno.
• anemie emolitiche da agenti infettivi: si verificano in corso di sepsi
• anemie emolitiche da agenti chimici e da cause
fisiche o meccaniche.
38
LE ANEMIE INFIAMMATORIE
Antonio La Gioia
La definizione di “anemia da disordine cronico” o
“anemia infiammatoria” comprende una serie di
situazioni anemiche caratterizzate dalla associazione
dell’anemia con stati infettivi (tubercolosi, infezioni
polmonari croniche, endocardite subacuta, epatite cronica), degenerativi (artrite reumatoide, lupus) o proliferativi (neoplasie).
La fisiopatologia dell’anemia cronica secondaria (a.
infiammatoria) è complessa ma riconducibile essenzialmente a tre principali meccanismi variamente
associati nelle diverse situazioni: un’anomalia del
metabolismo del ferro e della transferrina; un’insufficienza della produzione eritropoietica ed una iperemolisi extracorpuscolare. Tra questi, maggiore importanza rivestono quelli relativi al metabolismo del ferro
il cui risultato ultimo è rappresentato da uno spostamento di tale metallo dal pool circolante a quello di
deposito. Un ruolo fondamentale in tale meccanismo
è rappresentato dalle numerose citochine rilasciate nel
corso degli stati flogistici dal sistema reticolo istiocitario e linfocitario e dalla lattoferrina rilasciata dai granulociti neutrofili che, competendo con la transferrina
per il ferro circolante, rende quest’ultimo indisponibile per la normale eritropoiesi.
Le diverse citochine prodotte e, in particolare, l’interferon gamma, l’interleuchina 1 ed il tumor necrosis
factor sono inoltre responsabili di una ridotta risposta
del sistema eritropoietico all’azione dell’eritropoietina.
Diagnosi di laboratorio. L’anemia è generalmente
di tipo iporigenerativo (ridotta produzione di reticolociti), normocromica e normocitica o, più raramente
ipocromica e/o microcitica. La sideremia, generalmente ridotta, è associata ad una notevole riduzione
della transferrina. La ferritina è aumentata. In effetti,
l’associazione tra aumento del ferro di deposito (ferritina) e riduzione della transferrina costituisce un quadro di laboratorio praticamente esclusivo delle anemie
da disordine cronico e rappresenta il maggior criterio
di diagnosi differenziale con le anemie sideropeniche
nelle quali la ridotta sideremia è associata ad aumento
della transferrina e riduzione della ferritina.
La “tipicità” dei dati di laboratorio rende superfluo,
nella maggior parte dei casi, l’esame dell’aspirato
midollare la cui osservazione può fornire dati di conferma (aumento del ferro reticolare; assenza di sideroblasti) e di supporto (non iperplasia eritroide; assenza
di rilevanti anomalie qualitative).
Particolari problemi diagnostici possono presentarsi
nel caso della concomitanza (non infrequente) tra anemia da disordine cronico ed anemia sideropenica. Aiutano in tali casi la valutazione del grado di ipocromia
(MCHC eritrocitario; percentuale di emazie ipocromiche), più accentuata nelle situazioni ferrocarenziali e la
determinazione del recettore solubile della transferrina, precocemente aumentato nelle anemie sideropeniche, normale nelle anemie da disordine cronico.
39
LE TALASSEMIE
Gerardina Russo
Le talassemie sono emoglobinopatie trasmesse
geneticamente e caratterizzate dalla depressione della
sintesi di una delle catene polipeptidiche che costituiscono la globina.
Sono note:
• una beta-talassemia, largamente diffusa in molte
regioni italiane e in tutta l’area mediterranea, che interessa la sintesi delle catene beta (presenti nell’HbA1);
• una alfa-talassemia, osservata solo sporadicamente in Italia, che interessa la sintesi delle catene alfa
(presenti in tutte le emoglobine);
• una gamma-talassemia e una theta-talassemia,
ancora poco note, che interessano rispettivamente la
sintesi delle catene gamma (presenti nell’HbF) e theta
(presenti nell’HbA2).
La sintesi delle catene beta è regolata da una coppia
di geni alleli, per cui esistono una forma omozigote
(beta-talassemia maior o morbo di Cooley) e una
forma eterozigote, che può essere sintomatica (betatalassemia minor o anemia di Rietti-Greppi-Micheli) o
asintomatica (beta-talassemia minima).
La diagnosi di microcitemia, una condizione estremamente diffusa in Italia, si basa sui seguenti reperti:
• globuli rossi (GR) in numero normale o lievemente aumentato, con netta ipocromia (ma la concentrazione emoglobinica è meno ridotta del contenuto
emoglobinico);
• spiccata aniso-poichilocitosi, con microciti, leptociti, cellule a bersaglio, riduzione del volume globulare medio;
• resistenza globulare osmotica (RGO) aumentata;
• aumento della quota di HbA2 (>3%);
• segni di iperemolisi minimi o assenti (sideremia
normale, modica iperplasia eritroblastica del midollo,
reticolociti normali o poco aumentati).
La diagnosi di morbo di Cooley, a parte i criteri clinici (facies microcitemica, splenomegalia) e radiologici (cranio a spazzola), presenta l’associazione di reperti indicativi di eritropatia talassemica, grave anemizzazione, iperemolisi ed eritropoiesi inefficace:
• grave anemia ipocromica;
• imponente aniso-poichilocitosi, presenza di GR
con granulazioni basofile o corpi di Jolly e di eritroblasti in prevalenza ortocromatici e policromatofili;
• aumento della RGO;
• iperbilirubinemia;
• ipersideremia, ipotransferrinemia, presenza di
siderociti in circolo e di sideroblasti nel midollo;
• midollo con spiccata iperplasia eritroblastica e
arresto di maturazione (midollo blu);
• reticolociti aumentati;
• aumento considerevole dell’HbF (15-90%) e dell’HbA2 (4-6%), con riduzione estrema fino alla scomparsa dell’HbA1;
• leucocitosi neutrofila.
Nell’ambito delle sindromi talassemiche sono da
prendere inoltre in considerazione altri quadri:
• la F-talassemia (beta-theta talassemia), nella
quale si verifica una difettosa sintesi non solo delle
catene beta, ma anche di quelle teta, per cui l’HbF rappresenta il 10-20% dell’Hb nella forma eterozigote e la
quasi totalità nella forma omozigote, mentre l’HbA2
non è aumentata o è diminuita;
• la persistenza ereditaria di HbF: condizione del
tutto asintomatica, caratterizzata dalla mancata
repressione della sintesi di catene gamma, che avviene
normalmente nei primi mesi di vita. Nello stato eterozigote l’HbF è il 15-20% dell’Hb e la quota di HbA2 è
diminuita, nello stato omozigote il 100% dell’Hb è
rappresentato da HbF;
• la microdrepanocitosi: non rara nelle regioni italiane talassemiche e sempre associata a un’anemia
emolitica di media gravità, è dovuta a una doppia eterozigosi per la beta-talassemia e per la drepanocitosi,
per cui si associano tutte le caratteristiche ematologiche della talassemia minor e la deformazione a falce
dei GR dopo incubazione “in vitro” con sodio bisolfito; l’Hb è rappresentata per il 60-80% da HbS e per il
40-20% da HbA1e HbF.
40
IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSI DELLE
SINDROMI MIELODISPLASTICHE
Antonio La Gioia
La denominazione di sindrome mielodisplastica
(SMD) comprende un gruppo eterogeneo di patologie
ematologiche determinate da difetti della maturazione
cellulare.
Le SMD sono caratterizzate da citopenia periferica,
mono o plurilineare, associata ad iperplasia midollare
delle corrispondenti linee maturative.
La dissociazione: citopenia periferica / iperplasia
centrale, trova giustificazione in un difetto maturativo
midollare (accumulo di precursori immaturi; iperplasia) e nella conseguente mancata immissione di elementi maturi nel sangue periferico (citopenia).
La base fisiopatologia delle SMD è rappresentata da
disordini clonali acquisiti della cellula staminale pluripotente; tali disordini possono essere primitivi (SMD
primitive o idiopatiche) o secondari all’esposizione a
fattori mielotossici (citostatici, solventi organici, piombo, radiazioni ionizzanti, etc.: SMD secondarie).
Le SMD primitive sono malattie prevalenti (ma non
esclusive) dell’età avanzata (dopo i 60 anni, prevalenza di 1/600).
Le SMD secondarie, al contrario, non mostrano evidenti correlazioni con l’età, essendo prevalentemente
in relazione con la frequenza e durata dell’esposizione
ai fattori causali.
La frequenza con cui alcune mielodisplasie evolvono verso forme di leucemia acuta, particolarmente di
tipo mieloide, induce a considerare le SMD come
situazioni “preleucemiche”.
L’aspetto caratterizzante delle SMD è rappresentato
dalla displasia, vale a dire dal corrispettivo morfologico (periferico e centrale) delle anomalie maturative
midollari. Gli aspetti displastici possono interessare
tutte le differenti linee cellulari emopoietiche nei diversi stadi maturativi. In effetti, l’osservazione di citopenia periferica associata ad anomalie morfologiche dei
leucociti, degli eritrociti e delle piastrine (variamente
combinate) è fortemente evocativa per SMD ed è motivo sufficiente per un immediato approfondimento diagnostico. La valutazione degli aspetti diseritropoietici,
disgranulopioetici e dismegacariocitopoietici (anomalie morfologiche rispettivamente della serie eritroide, granulocitica e piastrinica) e la percentuale di blasti
midollari sono tra i criteri utilizzati dal gruppo coope-
rativo FAB per l’ultima (1985) proposta di classificazione delle SMD primitive.
Anemia refrattaria (AR). E’ caratterizzata essenzialmente da anemia, iperplasia midollare eritroide e
diseritropoiesi. I blasti midollari sono inferiori al 5%.
Evoluzione leucemica: a bassa frequenza (15%).
Anemia sideroblastica idiopatica acquisita
(ASIA). Sostanzialmente sovrapponibile all’AR per
gli aspetti clinici, ematologici ed evolutivi, si differenzia da questa per la presenza di un’elevata percentuale (> 15% delle cellule midollari) di sideroblasti ad
anello. I sideroblasti ad anello sono precursori dei globuli rossi (eritroblasti) contenenti abbondanti granuli
siderotici disposti ad anello intorno al nucleo. Evoluzione leucemica: a bassa frequenza (15%).
Anemia refrattaria con eccesso di blasti (AREB).
Rispetto alle forme precedenti, possono essere maggiormente evidenti, accanto agli aspetti diseritropoietici,
quelli disgranulo-dismegacariocitopoietici. Può rappresentare il quadro d’esordio di una SMD o rappresentare
l’evoluzione di una precedente AR o ASIA. La percentuale di blasti midollari è compresa tra il 5% ed il 20%.
Evoluzione leucemica: ad elevata frequenza (30%).
Anemia refrattaria con eccesso di blasti in trasformazione (AREB-t). Come l’AREB ma con blasti
midollari compresa tra il 20% ed il 30%. Evoluzione
leucemica costante (100%).
Leucemia mielomonocitica cronica (LMMoC). E
caratterizzata da un interessamento delle tre linee cellulari midollari, da una monocitosi periferica superiore a 1000 elementi/µL, da un aumento del lisozima
urinario e, accessoriamente, da un aumento dei monociti e promonociti midollari. Il numero di blasti midollari è compreso tra il 5% ed il 20%. Evoluzione leucemica, prevalentemente verso la forma M4, ad elevata
frequenza (40%).
Nota. Nel 1998 l’organizzazione mondiale della
Sanità (WHO) ha proposto una nuova classificazione
delle leucemie acute mieloidi (vedi scheda). Sulla base
di tale classificazione il criterio quantitativo del numero di blasti midollari necessario per la diagnosi di
LAM è ridotto al 20%, questo perché numerose evidenze cliniche dimostrano la non esistenza di diffe-
41
renze evolutive e prognostiche tra soggetti con più
del 30% di blasti rispetto a quelli con blasti compresi
tra il 20% ed il 30%. Conseguentemente la forma di
SMD AREB-t dovrebbe essere eliminata.
Parallelamente dovrebbe essere risolta l’ambiguità
classificativa della leucemia mielomonocitica cronica,
inquadrata dal gruppo FAB (1994) tra le leucemie mie-
loidi croniche (vedi scheda malattie mieloproliferative
croniche) ma ancora mantenuta nel gruppo delle
SMD. Gli aspetti clinici, ematologici e prognosticoevolutivi di tale forma sembrano, in effetti, giustificare
la collocazione della LMMC tra le malattie mieloproliferative croniche.
42
IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSI DELLE LEUCEMIE
ACUTE
Antonio La Gioia
Le leucemie acute sono proliferazioni neoplastiche
clonali di cellule emopoietiche, caratterizzate dai
segni periferici di insufficienza midollare (anemia,
piastrinopenia, neutropenia) ed, eventualmente, dal
passaggio in circolo di blasti leucemici.
La “scoperta" di leucemia acuta è posta il più delle
volte in maniera occasionale in corrispondenza di
controlli ematochimici routinari, o richiesti per la presenza di segni clinici sfumati e scarsamente indicativi
(astenia, ecchimosi, petecchie, febbre). Tuttavia, indipendentemente dalle circostanze che ne hanno determinato la diagnosi iniziale, la leucemia acuta necessita
di un preciso percorso di tipizzazione morfologica,
citochimica, immunologica e citogenetica, indispensabile per definire l'iter terapeutico e gli aspetti prognostico-evolutivi:
In tale percorso il contributo del laboratorio risulta
indispensabile e si avvale in particolare di:
• Esame morfologico: su sangue, periferico o
midollare e su biopsia osteomidollare. E' essenziale
per definire il tipo di proliferazione leucemica ed il
grado di infiltrazione degli organi ematopoietici. L'elemento caratterizzante la proliferazione leucemica è
il blasto leucemico, i cui caratteri morfologici (blasto
“mieloide” di tipo I, II e III; blasto “linfoide” L1, L2
ed L3) concorrono al corretto inquadramento della
leucemia. In effetti, lo studio morfologico del sangue
periferico e midollare rimane ancor oggi. la modalità
diagnostica più importante e significativa.
• Esami citochimici: si tratta di particolari tecniche
di colorazione che utilizzano la presenza all'interno
della cellula di enzimi o di altri composti chimici (glicogeno, sostanze lipidiche). Tali colorazione permettono di definire l'orientamento maturativo della cellula
leucemica in senso mieloide (granulocitico, monocitico, megacariocitico ed eritroide) o linfoide. Le tecniche
più frequentemente utilizzate sono: perossidasi e/o
Sudan Nero (positive negli elementi della serie granulocitica), naftil butirrato esterasi (serie monocitaria),
PAS (positivo con differenti patterns nella leucemia
acuta di derivazione eritroide e in alcune leucemie
linfoidi). Altre reazioni utilizzate meno correntemente
o per quesiti diagnostici specifici sono la fosfatasi
acida e le esterasi (alfa naftil acetato e cloracetato).
• Determinazione dell'immunofenotipo: la scoperta che le diverse cellule posseggono un assetto
antigenico specifico per tipo cellulare è relativamente
recente; tali antigeni, quando univocamente riconosciuti da uno specifico organismo internazionale, sono
identificati dalla sigla CD (Cluster of Differentation)
seguita da un numero, ad esempio CD3, CD4, CD10,
CD34, ecc. Gli antigeni CD sono riconosciuti da corrispondenti anticorpi monoclonali (anti CD3, anti CD4,
anti CD10, ecc). Utilizzando i diversi anticorpi monoclonali antiCD è stato visto che patterns di differenti
antigeni CD caratterizzano specifici tipi cellulari o differenti stadi funzionali o maturativi. La determinazione dell'immunofenotipo (pattern cellulare di antigeni
CD) degli elementi leucemici concorre quindi al corretto inquadramento di una leucemia acuta, specialmente se di tipo linfoide. La tecnica maggiormente
utilizzata per la determinazione dell'immunofenotipo
e rappresentata dalla citometria a flusso; tecniche
alternative sono l’immunofluorescenza e l’immunocitochimica.
• Citogenetica e diagnostica molecolare. Le leucemie acute sono caratterizzate da modificazioni dell'assetto cromosomico. Alcune di tali alterazioni ricorrono
con maggiore frequenza in alcune forme di, leucemia;
meno frequentemente, specifiche alterazioni cromosomiche sono associate ad una specifica forma di leucemia, come nel caso della traslocazione 15;17 della leucemia promielocitica o della traslocazione 8;21 la cui
presenza in alcune forme di leucemia mieloide ne
definisce la prognosi favorevole. Per numerose delle
alterazioni cromosomiche le nuove tecniche di biologia molecolare (PCR; Southern blotting) hanno permesso l’analisi delle mutazioni puntiformi e quindi
anche la definizione dei prodotti di alcuni geni di
fusione risultanti dal processo di traslocazione cromosomica che, spesso sono marcatori molecolari specifici
di alcune forme leucemiche. L’analisi molecolare è
pertanto utilizzata sia a scopo diagnostico sia nella
valutazione di remissione terapeutica e di malattia
minima residua.
Classificazione delle leucemie acute (Cenni. Per
aggiornamenti e classificazione WHO, vedi scheda
Leucemie acute mieloidi)
43
La classificazione delle leucemie acute attualmente
più utilizzata è quella morfologica, elaborata da un
gruppo di ematologi conosciuto come gruppo cooperativo FAB dalle iniziali dei paesi di origine. La classificazione FAB, nella formulazione attualmente in uso
elaborata nel 1985 e rivista nel 1991, divide le leucemie acute linfoidi (LAL) dalle leucemie acute non
linfoidi LANL, denominate anche leucemie mieloidi
(LAM). All’interno di ciascun gruppo sono individuati
diversi tipi citologici (tabelle 1 e 2).
scio di sangue periferico. L’eventuale osservazione di
blasti o altre modificazioni qualitative conducano al
successivo studio morfologico e citochimico su agoaspirato midollare che permettono, il più delle volte,
un corretto inquadramento della leucemia negli schemi classificativi sopra riportati.
Ulteriori informazioni sono date dallo studio dell’architettura midollare su agobiopsia con la quale
può essere documentato più accuratamente il grado e
tipo di infiltrazione leucemica.
CLASSIFICAZIONE
DESCRIZIONE
L1
Prevalenza di blasti di piccole dimensioni con elevato rapporto N/C,
nucleo regolare con nucleoli scarsamente evidenti
L2
Prevalenza di blasti di dimensioni maggiori rispetto a L1, minore rapporto N/C (citoplasma più abbondante), nuclei con incisore del contorno e nucleoli evidenti
L3
Prevalenza di blasti con caratteristica tintorialità e vacuolizzazione citoplasmatica.
Tabella 1. leucemie acute linfoidi (LAL).
Denominazione
Descrizione
Caratteristiche
M0
M1
LAM a differenziazione minima
LAM scarsamente differenziata
Blasti “linfoidi” non granulati, senza corpi di Auer
Blasti midollari > 90%; blasti perossidasi positivi ≥3%;
ipogranulati, rari corpi di Auer
M2
LAM con differenziazione
Blasti >30%, < 90%; blasti perossidasi positivi ≥3%;
frequenti corpi di Auer.
M3
LAM a promielociti
Promielociti atipici con numerosi corpi di Auer;
frequente CID
M3 variante microgranulare LAM a promielociti ipogranulati
Promielociti atipici ipogranulati e con rari corpi di Auer;
frequente CID.
M4
LAM mielomonocitica
Blasti ≥30% (morfologia tipo M2 o monocitoide);
monocitosi periferica; aumento del lisozima urinario.
M4 con eosinofilia
LAM mielomonocitica con eosinofilia Come M4 + eosinofili midollari >5%
M5a
LAM monocitica senza differenziazione Blasti ≥30%; monoblasti ≥80% della serie monocitica.
M5b
LAM monocitica con differenziazione Blasti >30%; monoblasti <80% della serie monocitica.
M6
Eritroleucemia
Blasti >30% della cellularità non eritroide; anomalie
morfologiche; eritroblasti PAS positivi
M7
Leucemia a megacariociti
Blasti >30% con morfologia variabile, perossidasi
negativi; perossidasi piastrinica nei blasti presente
(in microscopia elettronica)
Tabella 2. leucemie acute non linfoidi (LANL; LAM). Note e legenda: quando non specificato, la percentuale di bla sti è calcolata sul totale delle cellule midollari; corpi di Auer: formazioni bastoncellari intracellulari, uniche o
multiple, patognomoniche della leucemia acuta mieloide; CID: coagulazione intravascolare disseminata; lisozima:
enzima prodotto da cellule del sistema monocitico-macrofagico, litico per la parete batterica. PAS: reazione cito chimica Acido Perioidico-base di Schiff.
La determinazione dell’imunofenotipo sia su sangue periferico sia su sangue midollare rappresenta un
utile complemento nelle leucemie non linfoidi e permette un’accurata tipizzazione delle leucemie linfoidi, utile soprattutto nella valutazione prognosticoevolutiva.
Diagnosi di laboratorio
L’osservazione di anomalie quantitative dell’esame
emocromo (leucocitosi/leucopenia gravi; anemia; piastrinopenia) isolate o variamente associate o lo studio
dei citogrammi forniti dai moderni contaglobuli sono
in genere sufficienti a determinare uno studio microscopico della morfologia leucocitaria condotto su striPatologia Clinica - ASL6 Livorno
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LEUCEMIE ACUTE MIELOIDI
Marcello Fiorini
Le leucemie acute mieloidi rappresentano un gruppo di patologie maligne ad eziologia multifattoriale,
che originano dal coinvolgimento della cellula staminale emopoietica, caratterizzate da un’alterata proliferazione e differenziazione della stessa e delle linee cellulari derivanti (granulocitaria, monocitaria, eritroide e
megacariocitaria).
Le leucemie acute mieloidi sono etichettate come
leucemie acute de novo quando insorgono come prima
malattia in pazienti senza importanti precedenti anamnestici, o leucemie acute “secondarie” quando insorgono in pazienti con pregressa esposizione a sostanze
chimiche (pesticidi), farmaci (alchilanti, inibitori delle
topoisomerasi II) o radiazioni e/o con precedenti emopatie in particolare sindromi mieloproliferative croniche, mielodisplasie, malattia di Hodgkin o linfomi
maligni non Hodgkin trattati con chemio- e/o radioterapia. Più raramente si sviluppano in pazienti con altre
pregresse malattie linfoproliferative croniche come il
mieloma multiplo.
La leucemia può originare da un’alterazione genetica (anomalie cromosomiche, mutazioni puntiformi)
che interviene in una singola cellula del midollo osseo,
la quale talvolta assume le caratteristiche di una vera e
propria predisposizione.
Numerose anomalie cromosomiche sono state e
continuano ad essere identificate. La caratterizzazione
molecolare delle anomalie cariotipiche ha consentito di
identificare markers specifici di diversi citotipi con
implicazioni diagnostiche e prognostiche.
Abitualmente la LAM viene classificata in otto
varianti (M0-M7) secondo uno schema FAB (FrenchAmerican-British group)1-2-3 che utilizzava principalmente criteri morfologici, citochimici e immunofenotipici. Nella classificazione FAB il numero di blasti
midollari necessario per la diagnosi di leucemia mieloide acuta è rappresentato dal 30 %.
Le varianti sono le seguenti:
volte essere messa in evidenza con l’impiego di anticorpi antimieloperossidasi (anti-MPO) o con la microscopia elettronica
Per la diagnosi è necessario rilevare la positività per
markers mieloidi mediante l’impiego di anticorpi
monoclonali anti CD13 e CD33 in almeno il 20% dei
blasti leucemici.
Le alterazioni citogenetiche, anche quando presenti,
non sono comunque specifiche.
Leucemia acuta M1: i blasti mieloidi non presentano
segni di maturazione; non vi sono granuli citoplasmatici, la cromatina nucleare è fine, e sono ben evidenti
uno o più nucleoli.
Per la diagnosi di LAM1 è necessario rilevare la
positività per la mieloperossidasi e il Sudan nero in
almeno il 3% dei blasti. La componente granulocitaria
con maturazione o monocitaria deve essere uguale o
inferiore al 10%. Gli eosinofili possono presentare alterazioni morfologiche particolari (granuli eosinofili più
piccoli di quelli di un eosinofilo normale) o granuli
irregolari (dark blue granules).
Le alterazioni citogenetiche riscontrabili sono varie,
più frequentemente rappresentate dalla t(9;22).
Leucemia acuta M2: i blasti mieloidi con segni di
maturazione presenti in una quota oscillante tra il 30 e
l’89%, spesso presentano nel citoplasma granuli azzurrofili e/o corpi di Auer. I nucleoli sono ben evidenti.
La componente granulocitaria, in tutti gli stadi di
differenziazione, è presente in una quota superiore al
10%. Spesso i polimorfonucleati presentano anomalie
citoplasmatiche (agranularità) con deficit parziale o
totale della positività per la mieloperossidasi. La componente monocitaria, quando è presente, deve essere
inferiore al 20%.
Gli eosinofili possono presentare alterazioni morfologiche particolari come nel caso della M1.
Le alterazioni citogenetiche, quando presenti, sono
Leucemia acuta MO: morfologia indefinita con bla - estremamente variabili e non specificamente associate,
sti di varie dimensioni, privi di granuli citoplasmatici e solo le forme con eosinofilia si accompagnano a una
di corpi di Auer, in genere con nucleoli ben definiti.
t(8;21) con il coinvolgimento di geni AML1/ETO.
Le reazioni citochimiche per la mieloperossidasi
(MPO) e il Sudan nero risultano negative in microscoLeucemia acuta M2 Baso: è una variante della leupia ottica; una positività per la mieloperossidasi può a cemia acuta M2 con presenza di precursori basofili che
45
indicano una tendenza alla differenziazione basofila di
una parte delle cellule leucocitarie ben dimostrabile
con indagini di microscopia elettronica, ma anche con
la microscopia ottica.
Un’alterazione citogenetica t(6;9)(p23;q33) viene frequentemente riscontrata.
Leucemia acuta M3: leucemia acuta a promielociti.
La quasi totalità delle cellule leucemiche è costituita da
promielociti atipici con un citoplasma stipato di granulazioni azzurrofile (forma ipergranulare). In molte cellule possono essere presenti corpi di Auer raggruppati in
fasci. Il nucleo, di dimensioni variabili, può essere interamente coperto dai granuli. Talora sono visibili, in
numero decisamente limitato, alcuni promielociti tipicamente ipogranulari.
Le reazioni citochimiche per la mieloperossidasi e la
cloroacetato-esterasi sono intensamente positive.
Le alterazioni citogenetiche associate con altissima frequenza sono t(15;17)(q22;q21) con la formazione del
gene PML/RARα, responsabile dell’alterata utilizzazione dell’acido retinoico.
Leucemia acuta M3v: variante della leucemia acuta
a promielociti (forma ipogranulare). Caratterizzata da
cellule con nucleo reniforme, bilobato, multilobato o
convoluto e con un citoplasma che sembra privo di
granuli o con qualche raro granulo alla microscopia
ottica, ma dimostrabili con la microscopia elettronica.
Mieloperossidasi e cloroacetato-esterasi risultano positive come nella forma ipergranulare.
Le cellule della M3V frequentemente mostrano una
positività per il CD2.
L’alterazione citogenetica è simile a quella evidenziabile nella forma M3 classica.
Leucemia acuta M4: leucemia acuta mielomonocitica. Oltre ad una quota di blasti superiore al 30%,
deve essere presente una componente granulocitaria
nei vari stadi di maturazione superiore al 20%, così
come è necessario il contemporaneo riscontro di una
componente monocitaria (dal monoblasto al monocito)
non inferiore al 20% delle cellule leucemiche.
Una positività per la mieloperossidasi e la cloroacetatoesterasi viene riscontrata nella componente granulocitaria, e una netta positività delle esterasi non specifiche
(naftol-ASD-acetato-esterasi o a-naftil-acetato-esterasi)
nelle cellule monocitarie, a volte nei monociti è osservabile una positività per la perossidasi.
Le alterazioni citogenetiche, quando presenti, sono
varie; più frequentemente sono riscontrabili una
t(11;19) e una trisomia del 22.
Leucemia acuta M4 Eo: leucemia acuta mielomonocitica con componente eosinofila. Gli eosinofili sono
abnormi. Il nucleo può essere ipolobulato oppure estremamente lungo e convoluto. Nel citoplasma degli elementi eosinofili, accanto ai granuli specifici, sono presenti granuli basofili particolarmente prominenti. Ciò è
46
apprezzabile particolarmente nei mielociti eosinofili.
La reazione per la mieloperossidasi è intensamente
positiva. I granuli eosinofili possono abnormemente
essere positivi per la cloroacetato-esterasi e per il PAS.
Le alterazioni citogenetiche frequentemente individuate sono rappresentate dalla delezione del braccio
lungo del cromosoma 16 (16q-).
Leucemia acuta M5: Nella leucemia acuta monocitica pura l’80% o più delle cellule non eritroidi midollari
sono monoblasti, promonociti o monociti.
• Citotipo a): o leucemia acuta monocitica scarsamente differenziata. Nel midollo e nel sangue periferico sono presenti blasti per lo più di grandi dimensioni,
a volte con pseudopodi ed espansioni citoplasmatiche
(monoblasti) che devono costituire almeno l’80% della
componente monolitica. Può essere presente una piccola quota di promonociti e monociti inferiore al 20%
della popolazione blastica. La componente granulocitaria, quando presente, deve essere inferiore al 20%
delle cellule leucemiche.
Le reazioni per le esterasi non specifiche (a-naftilacetato-esterasi e naftol-ASD-acetatoesterasi) sono abitualmente positive.
• Citotipo b): o leucemia acuta monocitica con dif ferenziazione. La popolazione cellulare è formata da
monoblasti, promonociti e monociti. Per porre diagnosi di M5b è necessario che i monoblasti siano presenti
nella componente monocitaria in una percentuale infe riore all’80%. La quota di monociti può essere rappresentata nel sangue periferico in percentuale superiore
rispetto al midollo osseo. Il nucleo spesso è caratteristicamente reniforme con nucleoli in genere meno visibili
che nella forma a.
Le cellule delle leucemie monocitiche spesso producono quantità più o meno rilevanti di lisozima con conseguente incremento dei livelli sierici e urinari dell’enzima, che possono essere utilizzati a fini diagnostici.
Sarebbero state configurate due forme di leucemia
acuta mono-blastica in base alla positività del lisozima
e all’espressione del CD68. Le forme monoblastiche
più mature mostrerebbero lisozima a positività diffusa
e fenotipo CD68+, quelle più immature avrebbero lisozima a disposizione focale e CD68-.
Le alterazioni citogenetiche possono essere varie con
una certa frequenza può essere riscontrata una t(9;11) o
una del(11).
Leucemia acuta M6: eritroleucemia, è una leucemia
acuta caratterizzata dalla coesistenza di blasti mieloidi ed
eritroblasti abnormi presenti nel midollo osseo e nel sangue periferico. I precursori eritroidi mostrano un’evidente asincronia di maturazione nucleo-citoplasmatica
con morfologia bizzarra. Gli aspetti megaloblastici o le
forme giganti delle cellule eritroidi sono comuni. Nel
citoplasma dei blasti mieloidi possono essere presenti
granuli azzurrofili e/o corpi di Auer.
Spesso gli eritroblasti sono positivi alla reazione
dell’acido periodico di Schiff (PAS+), mentre i blasti mie-
loidi possono mostrare una positività per la perossidasi.
A volte può essere associata una piccola quota di cellule megacariocitarie a carattere displastico.
Le alterazioni citogenetiche sono estremamente variabili. Queste in genere possono interessare il cromosoma 3 con inv(3) o con t(3;3) o t(3;5).
Leucemia acuta M7: leucemia acuta megacariocitaria. La morfologia dei blasti è polimorfa: possono apparire come mieloblasti o linfoblasti talvolta con protrusioni citoplasmatiche che consentono di sospettare la
natura megacariocitaria delle cellule.
Per la diagnosi è necessario procedere alla caratterizzazione dell’immunofenotipo con l’impiego di anticorpi monoclonali contro gli antigeni piastrinici GpIb,
GpIIb/IIIa e GpIIIa (CD42b, CD41 e CD61). Inoltre la
natura megacariocitaria della leucemia può essere evidenziata con la microscopia elettronica mediante la
dimostrazione della perossidasi piastrinica (PPO) delle
cellule. Recentemente la specificità di tale reperto è
stata posta in discussione.
Le alterazioni citogenetiche, se presenti, possono essere varie: più frequentemente viene riportata la t(l;22).
Applicando la classificazione FAB la concordanza
diagnostica tra diversi osservatori si aggira intorno al
70%. A tal proposito è bene sottolineare che per l’attuazione di protocolli diagnostico-terapeutici pluricentrici
vengono istituite apposite commissioni di revisione
citologica.
Nel 1998 l’Organizzazione Mondiale della Sanità
(WHO)4, nel tentativo di integrare le nuove acquisizioni, sulla base delle caratteristiche citogenetiche e molecolari, della presenza di displasia morfologiche e della
storia di precedente mielodisplasia, ha proposto uno
schema classificativo delle leucemie acute mieloidi in 4
gruppi, andando ad identificare alcuni sottotipi citologici particolari non specificatamente proposti nella
classificazione FAB. Molte specifiche alterazioni citogenetiche presenti nelle leucemie acute mieloidi sono
associate con caratteristiche morfologiche e con quadri
clinici peculiari. Con l’eccezione della leucemia promielocitica/M3 con t(15;17), le forme caratterizzate da
alterazioni citogenetiche non presentavano un inquadramento organico nella classificazione FAB, con la
classificazione WHO queste vengono collocate in specifiche categorie. Inoltre i casi che presentano queste
alterazioni citogenetiche pur esprimendo una bassa
quota di blasti, che in passato sarebbero state diagnosticate come sindromi mielodisplastiche adesso vengono inserite nella leucemie acute mieloidi.
Altra novità è rappresentata dall’inserimento delle
forme leucemiche mieloidi acute associate a mielodisplasia (primitive o secondarie), a quadri di displasia
multilineare, a sindrome mielodisplastica e a trattamenti chemioterapici. E’ stato suggerito che tutte queste forme riflettano un danno genetico simile sia su
base ambientale che iatrogena e che riflettano una
comune patogenesi.
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Classificazione delle LAM secondo WHO
1. Leucemie mieloidi acute con traslocazione citogenetiche
ricorrenti
• LMAcon t(8;21) (q22;q22), AML1 (CBFa)/ETO
• Leucemia promielocitica acuta [LMAcon
t(15;17)(q22;q11-12) e varianti PML/RARa]
• LMAcon ipereosinofilia midollare [inv(16)(p13;q22) o
t(16;16)(p13;q11),CBFß/MYH11X]
• LMAcon anomalie 11q23 (MLL)
2. Leucemia mieloide acuta con displasia multilineare
• Secondaria a sindrome mielodisplastica
• De novo
3. Leucemia mieloide acuta e sindromi mielodisplastiche
secondarie a chemioterapia
• Secondaria ad agenti alchilanti
• Secondaria a epipodofilotossine
• Altri tipi
4. Leucemia mieloide acuta non altrimenti classificata
• LMAcon differenziazione minima
• LMAsenza maturazione
• LMAcon maturazione
• Leucemia mielomonocitica acuta
• Leucemia monocitica acuta
• Eritroleucemia acuta
Come corollario alla classificazione un nuovo
importante assunto viene applicato all’interno della
classificazione. Nella classificazione FAB il numero di
blasti midollari necessario per la diagnosi di leucemia
mieloide acuta era rappresentato dal 30%. Recenti
studi invece hanno dimostrato che pazienti con una
quota di blasti midollari compresa tra il 20% ed il 30%
classificati secondo FAB come sindrome mielodisplastica (Anemia Refrattaria con Eccesso di Blasti in Trasformazione AREB-T) hanno una prognosi simile a
quella dei pazienti che invece presentano il 30% di blasti midollari. Da tutto ciò deriva che la quota di blasti
necessaria per definire la Leucemia Mieloide Acuta è
definita dal 20% ed inoltre che la categoria AREB-T
debba essere soppressa.
Bibliografia
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Galton DAG, Gralnick HR, Sultan C. Proposals for
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study group. Ann Intern Med; 103:620-5; 1985.
3. Liso V. Specchia G. Leucemie acute mieloidi Il Patologo Clinico nr.3-4:100-111 2002.
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hematological malignancies report of the Clinical
Advisory Committee Meeting, Airlie House, Virginia, November 1997.Mod Pathol. 13(2):193-207 2000.
LE MALATTIE MIELOPROLIFERATIVE CRONICHE
Marcello Fiorini
Le malattie mieloproliferative croniche (MMPC)
sono malattie che originano dalla trasformazione neoplastica delle cellule staminali totipotenti o delle cellule staminali multipotenti e sono caratterizzate dalla
proliferazione clonale di uno o più progenitori emopoietici nel midollo osseo e in sedi extramidollari.
Le caratteristiche biologiche, i quadri clinici e la storia naturale possono essere diversi tra le diverse forme
le quali possono trasformarsi da una sindrome all’altra
durante il decorso della malattia.
Vengono distinte principalmente quattro entità cliniche:
1. leucemia mieloide cronica
2. policitemia vera
3. trombocitemia essenziale
4. mielofibrosi idiopatica.
Le MMPC sono accomunate da alcuni aspetti:
• derivano dalle cellule ematopoietiche staminali
totipotenti e multipotenti, tuttavia, in ognuno di questi
disordini domina la proliferazione di un particolare
linea cellulare: quella mieloide nella leucemia mieloide
cronica; quella eritroide nella policitemia vera; e quella
megacariocitica nella trombocitemia essenziale e nella
mielofibrosi idiopatica;
• i fibroblasti del midollo osseo, che non partecipano al processo maligno, tendono a proliferare determinando una fibrosi midollare, la cui severità è variabile
a seconda del tipo di sindrome mieloproliferativa;
• possono degenerare nello sviluppo di una leucemia acuta mieloblastica.
Recentemente è stata proposta dalla World Health
Organization (WHO) una nuova classificazione delle
patologie tumorali ematologiche, che ha proposto
alcune novità nella classificazione delle malattie mieloproliferative croniche, in particolare per quanto riguarda appunto il gruppo delle leucemie mieloidi croniche.
In buona sostanza le novità sono rappresentate
dalla classificazione di alcune forme di malattie mieloproliferative croniche, che pur essendo riconosciute nei
precedenti tentativi di classificazione, non vi trovavano inquadramento univoco e venivano come presentazioni atipiche della leucemia mieloide cronica.
In particolare viene individuato un gruppo di patologie caratterizzate dalla contemporanea presenza di
48
1. Malattie mieloproliferative croniche(MMPC)
• Leucemia mieloide cronica, cromosoma Philadelphia
(Phi) [t(9;22)(q34;q11), Bcr-Abl]+
• Leucemia neutrofilica cronica
• Leucemia eosinofila cronica/sindrome ipereosinofila
• Policitemia Vera
• Trombocitemia Essenziale
• Malattia mieloproliferativa non classificabile
2. Malattie mielodisplastiche/mieloproliferative
• Leucemia mielomonocitica cronica LMMC
• Leucemia mieloide cronica atipica LMCa
• Leucemia mielomonocitica giovanile LMMJ
Tabella 1. Classificazione WHO delle malattie mielo proliferative croniche.
aspetti proliferativi e displastici che raccoglie la leucemia mielomonocitica cronica, la leucemia mieloide cronica atipica e la leucemia mielomonocitica giovanile,
che acquisisce la dignità di una categoria separata.
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA
La leucemia mieloide cronica (LMC) è il disordine
mieloproliferativo più studiato derivato dalla trasformazione neoplastica della cellula staminale totipotente
e caratterizzato da una prevalente iperplasia della
linea granulocitaria.
La LMC, più frequente nel sesso maschile, ha un’incidenza che va da 1 a 2 casi per 100.000 persone per
anno e rappresenta il 15% delle leucemie negli adulti.
L’età media è compresa fra i 45 e i 55 anni. Rari i casi
descritti nel bambino.
E’ una malattia contrassegnata, nella quasi totalità
dei casi, da un’ alterazione citogenetica e molecolare
(cromosoma Philadelphia - gene di fusione Bcr-Abl) e da un
decorso caratterizzato, in una fase iniziale (fase cronica), da una elevata granulocitosi periferica e da un’espansione del compartimento mieloide con un midollo
ipercellulare ricco di elementi differenziati, la cui evoluzione successiva è caratterizzata da un deterioramento clinico ed ematologico subacuto (fase accelerata) o acuto (crisi blastica).
Nella fase terminale (crisi blastica) l'incremento
marcato dei blasti è associato a manifestazioni cliniche ed ematologiche simili a quelle delle leucemie
acute. Nel 95% dei casi di LMC è stata dimostrata la
presenza del cromosoma Philadelphia derivato dalla
traslocazione reciproca tra braccio lungo del cromosoma 9 e il braccio lungo del cromosoma 22 t(9;22)
(q34;q11): Tale traslocazione porta alla formazione di
un cromosoma 22 di dimensioni ridotte, denominato
Philadelphia (città dove fu descritto per la prima volta
nel 1961) e, a livello molecolare sullo stesso cromosoma 22 di un gene di fusione denominato Bcr-Abl.
L’esposizione a radiazioni ionizzanti è un chiaro
fattore di rischio.
Per la diagnosi di LMC sono quindi indispensabili
lo studio citogenetico e la valutazione molecolare.
Il cromosoma Phi è evidenziabile mediante l’analisi
citogenetica classica, mentre, attraverso l’utilizzo della
metodologia RT-PCR (Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction), è possibile evidenziare nel 99% dei
Sangue periferico
• Leucocitosi (>20 x 109/L) con neutrofilia e presenza di
granulociti immaturi in tutte le fasi maturative
• Blasti <5%, promielociti <10%; picchi di maggiore frequenza nei mielociti e nei neutrofili maturi
• Morfologia dei neutrofili maturi regolare (segmentazione nucleare conservata, granulazioni citoplasmatiche tipiche)
• Riduzione della fosfatasi alcalina dei neutrofili
• Basofilia assoluta (> 300 x 109/L), talora con dismorfismo e riduzione numerica dei granuli
• Frequente eosinofilia assoluta, con morfologia normale
• Possibile presenza di promielociti, mielociti e metamielociti cosinofili e basofili nel sangue periferico
• Globuli rossi normali per morfologia e dimensioni
• Rari eritroblasti circolanti (<2 ogni 100 leucociti), ortocromatici o policromatofili, senza atipie
• Piastrine con dimensioni eterogenee, possibile gigantismo e riduzione dei granuli, talora piccoli ammassi
• Nuclei nudi di megacariociti, non micromegacariociti
casi il gene chimerico che si forma sul cromosoma Phi;
Altre tecniche di indagine, utili soprattutto nel fallow
up della malattia, sono rappresentate dalla FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) e dalla Southern blot.
La malattia viene generalmente diagnosticata
casualmente in fase cronica in soggetti assolutamente
asintomatici.
Gli aspetti caratteristici della fase cronica osservabile a livello del sangue periferico e midollare sono esposti in tabella 2
E’ generalmente presente anemia normocitica normocromica di entità molto variabile (abitualmente tra
8 e 12 g/dL). La conta dei reticolociti è normale, talvolta lievemente aumentata o diminuita.
Altri reperti di laboratorio, non indispensabili per
la diagnosi, ma utili per definire la malattia, sono rappresentati dai livelli, in genere elevati, di uricemia, di
LDH sierica, di vitamina B12, di istaminemia. In particolare i livelli sierici di vitamina B12 e della proteina
con capacità legante la vitamina B12 sono elevati per
Sangue periferico
• Aumento dei blasti indifferenziati
• Aumento dei promielociti con anomalie delle granulazioni
• Aumento dei basofili, con accentuazione degli aspetti
displastici
• Riduzione dei neutrofili maturi, con aumento della
fosfatasi alcalina e comparsa di aspetti displastici:
m
iposegmentazione nucleare tipo pseudo-Pelger
m
riduzione delle granulazioni citoplasmatiche
m
negatività parziale per la mieloperossidasi
• Aumento degli eritroblasti circolanti, con aspetti di
diseritropoiesi
• Macrocitosi eritrocitaria, anisopoichilocitosi, corpi di
Jolly, punteggiatura basofila
• Piastrine giganti e di forma bizzarra
• Aumento dei nuclei di megacariociti in circolo
Midollo osseo
Midollo osseo
• Iperplasia dei granulociti neutrofili con normale
sequenza maturativa
• Blasti <5%. promielociti <15%
• Rapporto leuco/critrogenetico superiore a 10
• Aumento costante di basofili maturi e immaturi;
aumento frequente di eosinofili maturi e immaturi
• Eritropoiesi quantitativamente ridotta, ma normale per
morfologia
• Megacariociti spesso numerosi, di dimensioni ridotte,
spesso raccolti in piccoli gruppi, non displastici
• Istiociti blu-mare o pseudo-Gaucher
• Studio istologico: megacariociti, topografia della granulopoiesi, valutazione della fibrosi
• Deviazione a sinistra della curva maturativa della serie
granulocitica
• Aumento dei blasti (>5%)
• Aumento dei basofili
• Comparsa di displasia trilineare
m
disgranulopoiesi
m
diseritropoiesi
m
dismegacariocitopoiesi
• Studio istologico: ammassi di blasti a distribuzione
focale, aumento della fibrosi, disorganizzazione dell’architettura emopoietica
Tabella 2. Caratteristiche della LMC in fase cronica.
Tabella 3. Criteri di progressione della malattia.
49
l’aumentato turnover dei granulociti. L’aumento dell’istaminemia è quasi sempre secondario all’incrementato numero di basofili.
La fase accelerata rappresenta l’evoluzione subacuta della LMC.
Per definire la fase accelerata sono stati proposti
recentemente i seguenti criteri: blasti > 5%; e promielo citi > 15% nel midollo. A tali reperti si associa spesso
una fibrosi midollare di grado variabile. In circa il 70%
dei casi di LMC la fase accelerata evolve naturalmente
nella crisi blastica.
In alcuni casi la fase accelerata può passare inosservata per cui dalla fase cronica sembra evolvere direttamente nella crisi blastica, definita anche fase terminale
o fase aggressiva, la quale viene rivelata dalla comparsa di una percentuale di blasti superiore al 15-20% o di
una quota di blasti più promielociti maggiore del 30%
nel sangue periferico o del 50% nel midollo osseo.
Una mielofibrosi di grado notevole può osservarsi
nella fase terminale della LMC.
Il fenotipo della crisi blastica può essere mieloide
(CD13 e CD33); nel 15-20% dei casi linfoide, in genere
di tipo B comune (CD10, CD19, CD20), raramente T
immaturo. In una percentuale inferiore al 5% può essere di tipo mielomonocitico (CV14,CD11c), eritroide
(CD71, glicoforina A), megacariocitico (CD41, CD42,
CD61) e multilineare o bifenotipico.
Le modificazioni morfologiche che possono indicare la transizione verso la fase accelerata o la crisi blasti ca sono descritte nella tabella 3.
La durata della crisi blastica è breve, in genere di
mesi (circa 6 ) e si conclude nel 90% dei casi con l’exitus del paziente.
Esistono delle varianti a questa forma classica di
LMC. Il gruppo FAB (French-American-British Cooperative Leukaemia Group) ha individuato un gruppo
Leucocitosi
Granulociti immaturi
(sangue periferico)
Monociti (sangue periferico)
Basofili (sangue periferico)
Blasti (sangue periferico)
Displasia dei neutrofili
(sangue e midollo)
Percentuale di eritroblasti (midollo)
Cromosoma Phi
Riarrangiamento Bcr-Abl
Fosfatasi alcalina leucocitaria
(sangue periferico)
POLICITEMIA VERA
La policitemia vera (PV) fu descritta per la prima
volta da Vaquez nel 1892 come eritrocitosi primitiva.
Nella PV la lesione della cellula staminale multipotente causa un’eccessiva proliferazione trilineare che si
concretizza principalmente a livello eritropoietico con
un aumento della produzione di eritrociti morfologicamente normali in media intorno a 7 x 1012/L.
Poiché i meccanismi di regolazione della produzione di eritropoietina sembrano inalterati, è probabile
che il difetto alla base della PV risieda in un’alterata
LGC
LMCa
LMMC
Molto spiccata
(media: 141 x 109/L)
Numerosi
(>20%)
Rari
(<3%)
Sempre aumentati
(>2% o >350 x 109/L)
Rari
(<2%)
Assente
Variabile, meno spiccata
(media: 97 x 109 /L)
Meno numerosi
(10-20%)
Moderatamente aumentati
(5-15%)
Non aumentati
(<2%)
Presenti
(>2%)
Marcata
Moderata
(media: 31 x 109/L)
Pochi
(<10%)
Molto aumentati
(>15%)
Non aumentati
(<2%)
Rari
(<2%)
Lieve o moderata
<10%
Presente (90%)
Sempre dimostrabile
Diminuita
<10%
Assente
Assente
Variabile
>10%
Assente
Assente
Variabile
Tabella 4.
definito delle leucemie mieloidi croniche che comprende
oltre altra forma classica Phi+ Bcr-Abl+, anche una
forma atipica (Leucemia mieloide cronica atipica
LMCa), la leucemia mieloide cronica giovanile, la leucemia mielomonocitica cronica LMMC che, peraltro,
sempre secondo lo stesso gruppo FAB, rientra nel
novero delle sindromi mielodisplastiche, mantenendo
quindi una certa ambiguità classificativa. Tutte forme
queste sono caratterizzate dalla costante assenza tanto
del cromosoma Phi quanto della corrispondente alterazione genetica.
Gli elementi differenziativi tra le tre forme sono
evidenziati nella tabella 4.
Per quanto riguarda la leucemia mieloide cronica
giovanile per la quale alcuni autori ritengono più
appropriata la denominazione di leucemia mielomonocitica cronica giovanile, essa è caratterizzata ovviamente dalla distribuzione peculiare della popolazione
colpendo soprattutto bambini di età inferiore ai quattro/cinque anni, più frequentemente maschi. Il quadro
ematologico è caratterizzato da neutrofilia, con spiccata monocitosi e presenza in circolo di precursori sia
granulocitari che eritroidi. La fosfatasi alcalina leucocitaria è generalmente aumentata
50
risposta del clone neoplastico ai fattori di regolazione
dell’eritropoiesi
Una modesta leucocitosi, una piastrinosi, una condizione di metaplasia mieloide e/o mielofibrosi, una
modesta splenomegalia possono essere associate in
maniera varia all’incremento della massa eritrocitaria
fino dall’esordio della malattia, deponendo anche per
un coinvolgimento della linea mieloide.
L’esame microscopico del midollo osseo rivela un’ipercellularità midollare con predominanza degli elementi cellulari eritroidi e megacariocitari con riduzione della componente adiposa; la biopsia osteomidollare può rilevare fibrosi midollare
La PV colpisce soggetti di età media di circa 60 anni
(con un ampio range di età compreso tra i 1 e i 90 anni;
rari casi sono stati descritti nei bambini), predilige il
sesso maschile con un rapporto M/F di 2:l.
I criteri diagnostici sono stati individuati dal
Polycythemia Vera Study Group:
Criteri Maggiori
• A1 incremento della massa eritrocitaria (uomo ≥
36 mL/kg, donna ≥ 32 mL/kg)
• A2 normale saturazione di O2 del sangue arterioso ≥ 92%
• A3 splenomegalia
Criteri Minori
• B1 trombocitosi (> 400.000/mL)
• B2 leucocitosi (>12000/mL) in assenza di febbre o
infezione
• B3 fosfatasi alcalina leucocitaria elevata (score
100) in assenza di febbre o infezione
• B4 aumento della vitamina B 12 sierica (>900
pg/mL) e della capacità legante la vitamina B12 libera
(> 2200 pg/mL)
La diagnosi risulta confermata se sono presenti le
combinazioni A1 + A2 + A3 o A1 + A2 + due criteri
minori
Recentemente Pearson (1996) ha proposto la
seguente revisione dei criteri:
Criteri Maggiori
• A1 incremento della massa eritrocitaria
• A2 esclusione di cause di policitemia secondaria
• A3 splenomegalia palpabile
- A4 marker di clonalità (es. cariotipo midollare
anormale)
Criteri Minori
• B1 trombocitosi (> 400.000/mL)
• B2 neutrofilia (> 10 x 109/L)
• B3 splenomegalia documentata con ecografia o
TAC
• B4 eritropoietina sierica diminuita e macrocolonie
eritroidi (BFU-E) iperresponsive all’eritropoietina.
51
La diagnosi risulta confermata nel caso in cui siano
presenti tre criteri del gruppo A o due criteri del gruppo A e due del gruppo B (A1, A2, con B1, B2 o B3 e/o
B4).
TROMBOCITEMIA ESSENZIALE
La trombocitemia essenziale (TE) è una neoplasia
delle cellule staminali totipotenti del midollo osseo,
che si manifesta con una proliferazione dei megacariociti midollari e un aumento della conta piastrinica nel
sangue periferico (>600.000/mL) con valori che possono oscillare tra i 700.000/mL ed i 1.500.000/mL o ancor
più elevati, anisocitosi piastrinica e presenza di aggregati piastrinici.
La diagnosi deve essere sospettata in tutti i pazienti
con piastrine aumentate, quando non vi sono cause di
trombocitosi reattiva, come per esempio l’anemia ferrocarenziale, stati infiammatorie neoplasie.
I criteri stabiliti dal Policythemia Vera Study Group
per effettuare diagnosi di TE sono i seguenti:
• conta piastrinica costante ≥ 600.000/mL;
• midollo ipercellulare con iperplasia megacariocitaria;
• fosfatasi alcalina leucocitaria normale o aumentata;
• assenza del cromosoma Philadelphia;
• massa eritrocitaria normale;
• fibrosi midollare di modesta entità.
A livello midollare si osserva un’ipercellularità in
cui si segnalano numerosi megacariociti, a volte cosi
numerosi e vicini da formare clusters. La biopsia
osteomidollare rivela, oltre all’iperplasia megacariocitaria, anche quella granulocitaria ed eritroide, frequentemente con incremento delle fibre reticolari. Nella
maggior parte dei pazienti con TE è presente una leucocitosi neutrofila con valori generalmente compresi
tra 12.000/mLe 20.000/mL; raramente sono osservabili
nel sangue periferico elementi immaturi, quali mielociti e metamielociti. Più frequente è il riscontro di lieve
basofilia ed eosinofilia. Gli indici di fosfatasi alcalina
leucocitaria possono essere lievemente aumentati o
normali.
I livelli di vitamina B12 e della capacità legante la
vitamina B12 sono elevati in un terzo dei pazienti.
L’anemia, quando presente, è frequentemente di
tipo ipocromico microcitico e generalmente secondaria
alle possibili emorragie, principalmente gastrointestinali dovute alle anomalie dell’aggregazione piastrinica
e dell’adesività piastrinica.
Il decorso è generalmente cronico con sopravvivenza mediana di più di 10 anni. Al pari delle altre sindromi mieloproliferative croniche, anche nella TE è possibile osservare l’evoluzione in leucemia acuta sia di tipo
linfoide che mieloide.
Un problema spesso di non facile soluzione è la
diagnosi differenziale tra trombocitemia essenziale e
trombocitosi secondarie (TS).
Le più frequenti cause di piastrinosi secondaria
possono essere rappresentate da:
• splenectomia o agenesia splenica,
• neoplasie (polmonari, in particolare),
• interventi chirurgici,
• malattie renali croniche,
• osteoporosi,
• fase postemorragica,
• sideropenia.
La caratteristica comune di queste piastrinosi
secondarie è costituita dalla transitorietà della piastrinosi stessa.
All’osservazione microscopica dello striscio periferico, nessuna anomalia della morfologia piastrinica è
specifica della TE.
Per quanto riguarda la morfologia midollare, sia
nelle TS che nella TE risulta aumentato il numero dei
megacariociti; nella TE vi è tendenza al clustering, talora presenza di gigantismo megacariocitario, con nuclei di dimensioni maggiori del normale; assenza di fibrosi.
L’analisi della distribuzione della ploidia dei megacariociti usando la citometria di flusso è un metodo
che può essere utile al clinico per suffragare una diagnosi nei pazienti affetti da TS o TE.
Anche con l’analisi citogenetica applicando il metodo "FISH" (Fluorescence In Situ Hybridization) alle cellule di sangue periferico (citogenetica in interfase),
sono state rinvenute alterazioni cromosomiche in
pazienti affetti da TE, in particolare nel 55% dei
pazienti affetti, sia pure in una minoranza di cellule,
venivano riscontrate trisomie 8 o 9.
La formazione di colonie spontanee da progenitori
megacariocitici del midollo osseo potrebbe essere utilizzata quale strumento definitivo e affidabile per la
discriminazione fra TE e TS, in quanto espressa dal
100% dei pazienti affetti da TE e da nessun paziente
affetto da TS.
L’analisi di clonalità nelle piastrine può essere utile
per differenziare TE da TS, dato che la maggioranza
dei pazienti affetti da TE ha piastrinopoiesi monoclonale (74%), riscontrabile almeno nelle piastrine, mentre
tutti i pazienti affetti da Trombocitosi benigna reattiva
hanno una piastrinopoiesi policlonale.
La PCR è stata indicata come pratico e semplice
strumento nella diagnostica differenziale delle trombocitemie: elevati livelli di PCR sono stati trovati nei casi
di TS, ma non in quelli di TE.
MIELOFIBROSI IDIOPATICA CRONICA
Bibliografia
La Mielofibrosi idiopatica cronica (MI) è una sindrome mieloproliferativa caratterizzata da un’estesa fibrosi del midollo osseo e dalla formazione di ematopoiesi extramidollare, soprattutto nella milza e nel fegato.
La fibrosi midollare risulta da una reazione pro-
liferativa dei fibroblasti del midollo osseo, come conseguenza della produzione locale di fattori di crescita
quali il PDGF o il TGF-beta, secreti dai megacariociti.
Incidenza annuale: 0.5/100.000. Alcuni casi hanno
una base ereditaria. La sopravvivenza mediana è di
circa 5 anni; alcuni pazienti sviluppano una leucemia
acuta. Le cause di morte più frequenti sono le emorragie e le complicazioni trombotiche.
L’anemia può essere di tipo normocromico normocitico o più raramente ipocromico microcitico ed è
riscontrabile in circa due terzi dei pazienti con un’eritropoiesi inefficace con una ridotta sopravvivenza
media delle emazie.
La trombocitopenia è evidente in circa un terzo dei
pazienti, mentre una trombocitosi con livelli di piastrine superiori a 600.000/mL è rilevabile nel 10-20% dei
casi. In circa il 15% dei pazienti si osserva leucopenia.
Dall’esame degli strisci di sangue periferico si
riscontra la presenza di elementi immaturi della serie
granulocitaria (mielociti e metamielociti) ed eritroblastica; quasi costantemente è presente una marcata anisocitosi o anisopoichilocitosi che tende a ridursi o
scomparire dopo splenectomia. Caratteristica è la presenza di emazie a goccia o dacriociti, espressione diretta dell’emopoiesi extramidollare splenica, come lo
sono anche il reperto di emazie con punteggiatura
basofila o di emazie pigmentate (entrambi corrispondenti a reticolociti immaturi, peraltro la conta reticolocitaria risulta essere aumentata), le emazie con corpi di
Jolly (piccoli residui nucleari sferici) e le emazie con
anelli di Cabot (residui di fuso mitotico indissoluti).
Da segnalare anche la presenza di anisocitosi piastrinica. La fosfatasi alcalina leucocitaria è quasi sempre elevata. Possono essere presenti alterazioni dell’emostasi secondarie a difetti di aggregazione piastrinica
(al collagene e/o all’adrenalina), a volte si rileva associata alla trombocitopenia, a bassi livelli di fattori V e
VIII, ipofibrinogenemia e incremento dei prodotti di
degradazione del fibrinogeno.
Il midollo può essere ipocellulare, normocellulare o
ipercellulare. Frequentemente sono evidenti una
disgranulopoiesi e una dismegacariocitopoiesi e costante è l’incremento delle fibre reticolari midollari.
Assai frequente l’impossibilità di prelevare materiale
midollare mediante l’agoaspirazione (punctio sicca) a
causa della fibrosi
Le anomalie cromosomiche più frequentemente
riscontrate sono a carico del cromosoma 8 (trisomia,
monosomia), del cromosoma 9 (trisomia) e del 7
(monosomia). Non esiste però un marker cromosomico
specifico della mielofibrosi.
52
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1997 Verduci Editore Roma.
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53
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Myeloproliferative Disorders American Society of
Hematology http://www.hematology.org/education/hema98/schafer.pd
LA CITOFLUORIMETRIA
Ivo Chiapponi
La citometria di flusso è una metodica di analisi
cellulare basata sulla valutazione delle caratteristiche
fisiche ed immunologiche degli elementi figurati del
sangue o di altra provenienza.
Tali caratteristiche sono rilevate da un sistema ottico collimato con una camera a flusso attraverso la
quale le cellule passano allineate una per una (focalizzazione idrodinamica).
Quando per la definizione di parametri cellulari ci
si avvale dell’uso d’anticorpi marcati con sostanze
fluorescenti, possiamo senz’altro parlare di citofluorimetria (CFM).
Le origini di questa metodologia sono strettamente
connesse con la microscopia classica. Un citofluorimetro (CF) non è altro che un microscopio a fluorescenza
specializzato, dotato cioè di un automatismo di trasporto delle cellule e di un sofisticato sistema di misura della luce.
Tuttavia ciò che caratterizza in modo molto preciso
la CFM è che si tratta di una tecnica di misura e non di
sola osservazione. Il CF, a differenza dell’occhio
umano, è in grado di misurare simultaneamente diver se caratteristiche e parametri cellulari (analisi multiparametrica): dimensioni, granularità relativa e complessità interna, quantità di fluorescenza.
L’utilizzo di sostanze fluorescenti garantisce un’elevata sensibilità di misura, essendo possibile quantificare fino a poche centinaia di molecole per cellula.
L’impiego d’anticorpi monoclonali (Mab), oltre a
garantire un’ottima specificità, ha consentito le più
svariate applicazioni della citofluorimetria nell’ambito
delle scienze biomediche.
Alla base dunque di ogni misura in CFM stanno
due fenomeni fisici: la diffusione della luce (light scattering) e la fluorescenza.
Per capire come si generano e come sono misurati,
bisogna guardare all’interno della macchina. Qui un
raggio di luce laser è proiettato in un punto preciso del
sistema. Quando una particella lo attraversa, una parte
della luce è diffusa. La quantità ed intensità di questa
sono proporzionali alle caratteristiche da misurare:
• la luce “diffusa in avanti”, cioè a piccolo angolo
rispetto alla direzione del raggio incidente (Forward
Scatter FSC), è proporzionale alle dimensioni della
particella.
54
• la luce “diffusa a 90°” è proporzionale alla complessità della particella (Side Scatter SSC)
Contestualmente il raggio di luce ecciterà le molecole le molecole fluorescenti eventualmente presenti, che
emetteranno fluorescenza verde, rossa, arancione, etc..
Se si analizza sangue intero dopo lisi dei globuli
rossi, l’uso combinato dei due parametri fisici FSC e
SSC, combinati in un citogramma bidimensionale, può
consentire la suddivisione delle tre principali popolazioni di leucociti.
La rapida ed ampia diffusione della CFM è da attribuire da un lato allo sviluppo di sostanze fluorescenti,
dall’altro alla disponibilità di un larghissimo spettro di
Mab, cui i fluorocromi possono essere legati. La marcatura “luminosa” degli anticorpi fornisce il segnale dell’avvenuto legame con l’antigene ricercato, mettendone in “luce” la presenza sulla membrana od all’interno
della cellula.
Gli anticorpi monoclonali sono immunoglobuline
prodotte da cellule animali con la classica tecnica degli
ibridomi.
Ognuno è in grado di riconoscere una parte (epitopo) di un antigene complesso, cui si lega con vario
grado di affinità ed elevatissima specificità. Esistono in
commercio numerosissimi Mab; quelli capaci di riconoscere una stessa molecola, pur con grado diverso di
affinità ed avidità, sono riuniti da Commissioni di
esperti internazionali, in raggruppamenti definiti Cluster di Differenziazione, da cui l’acronimo CD. Così ad
esempio con CD3 si indicano tutti i Mab capaci di
riconoscere una glicoproteina presente solo sulla membrana dei linfociti T, dunque tutti e solo i linfociti T
sono CD3 positivi. Riprendendo l’esempio dell’analisi
di sangue intero dopo lisi delle emazie, è possibile isolare, con l’ausilio dei parametri fisici e/o immunologici, i soli linfociti, escludendo “elettronicamente” le
altre popolazioni (tecnica di “gate”) e solo su questi
determinare la presenza di CD3, quantificando in tal
modo i soli linfociti T.
I CD, in quanto sonde specifiche, permettono di
differenziare cellule morfologicamente simili o identiche come i linfociti, in sottopopolazioni diverse: linfociti B, T e Natural Killer (NK) possono essere distinti
solo utilizzando CD specifici legati a fluorocromi.
Da quanto detto si evince facilmente come l’emato-
logia rappresenti una delle aree più importanti nella
quale la CFM è idealmente adattabile allo studio di
leucociti, globuli rossi e piastrine. Il sangue è una
sospensione “naturale” di cellule monodisperse e c’è
un numero sempre più crescente di aspetti clinicamente rilevanti della fisiopatologia di queste cellule, che
possono essere esplorati con questa tecnica:
• analisi del fenotipo linfocitario in pazienti HIV
positivi;
• immunofenotipizzazione delle malattie oncoematologiche;
• analisi e conteggio dei progenitori emopoietici
CD34 positivi (cellule staminali);
• ricerca di anticorpi adesi alle piastrine;
• analisi del DNA;
Questi rappresentano solo alcune delle applicazioni
della citofluorimetria.
Analisi del fenotipo linfocitario nei soggetti HIV
positivi
La determinazione del fenotipo linfocitario consiste
nella caratterizzazione della componente linfocitaria
del sangue periferico mediante l’uso di Mab coniugati
con fluorocromi e diretti contro markers di membrana
e mediante l’analisi in CFM dei linfociti marcati.
I linfociti sono costituiti dalle sottopopolazioni T, B
ed NK definite dai seguenti specifici marcatori (il
segno + e – indica rispettivamente presenza ed assenza
del marker antigenico):
• linfociti T (65-79% del totale) CD3+, a loro volta
suddivisi in CD4+ e CD8+ (helper/inducer e suppressor/citotossici);
• linfociti B (6-15% del totale) CD19+;
• linfociti NK (5-19%) del totale CD16+, CD56+;
La patogenesi della sindrome da immunodeficienza
acquisita (AIDS) è largamente da attribuire ad una
deplezione dei linfociti CD4+, mediata da un’azione
diretta del virus e da meccanismi indiretti. Nel soggetto
HIV positivo la linfopenia CD4 è associata ad un aumento relativo dei linfociti CD8+ che si verifica nei primi
mesi dell’infezione e persiste anche nella fase acuta.
Nei soggetti normali si hanno valori ematici di CD4
compresi tra 600-1200/mL. I pazienti sieropositivi possono presentare valori molto inferiori a 600 CD4/mL.
Il valore assoluto di linfociti CD4+, dunque, è utile per
stabilire l’inizio di una profilassi per patogeni polmonari, per la terapia antivirale e per il monitoraggio del
trattamento.
Per la quantificazione dei CD4 sono attualmente
usati processi di conteggio assoluto, seguendo le linee
guida del controllo di qualità. Si impiega una tripla
marcatura CD3 FITC*/ CD4 PE**/ CD45 perCP*** ed
una CD3 FITC/ CD8 PE/ CD45 perCP. Con la prima si
contano i linfociti CD4+ che sono anche CD3+, mentre
con la seconda si contano i linfociti CD8+, che sono
anche CD3+. Il CD45, (che individua un antigene panleucocitario) è adoperato per la separazione “elettronica dei linfociti (“gate”).
55
L’immunofenotipo nelle neoplasie ematologiche
La determinazione dell’immunofenotipo (IFT) è
oggi un metodo oggettivo e riproducibile per la diagnosi ed il controllo della terapia nelle neoplasie ematologiche, in quanto capace di identificare e definire
immunologicamente i precursori cellulari abnormi clonalmente espansi.
Lo scopo può essere raggiunto attraverso quattro
steps differenti:
• assegnazione della filiera di appartenenza delle
cellule maligne (antigeni di differenziazione);
• dimostrazione della clonalità, usualmente in associazione con analisi molecolari e citogenetiche;
• analisi dello stadio maturativo e della eterogeneità all’interno della popolazione maligna (antigeni di
maturazione);
• applicazione di queste osservazioni nel monitoraggio della terapia e nella valutazione della malattia
minima residua.
Il valore diagnostico della CFM è ben stabilito nelle
seguenti neoplasie ematologiche:
• leucemie acute (prevalentemente linfoidi);
• crisi blastiche;
• disordini linfoproliferativi cronici.
Analisi del fenotipo linfocitario
Un incremento del numero assoluto dei linfociti nel
sangue periferico (>4000/mL negli adulti e 7500/mL
nei bambini) può essere osservato in numerose patologie sia virali sia batteriche.
In alcuni casi è utile uno studio immunofenotipico in
grado di dimostrare la natura clonale della proliferazione.
Anche senza incremento assoluto, lo studio immunofenotipico dei linfociti può risultare utile in molte
patologie del sistema immunitario comprese le malattie autoimmuni.
Per la generica analisi dell’IFT linfocitario si utilizza comunemente una metodica in doppia fluorescenza, con tecnica di colorazione seguita da lisi di sangue
periferico raccolto in eparina o EDTA.
Il pannello di Mab può essere il seguente:
1. CD45 FITC/CD14 PE per definire un “gate”
immunologico che consenta l’isolamento citografico
dei linfociti, i quali appaiono intensamente fluorescenti
per CD45 e negativi per CD14;
2. Controllo negativo isotipico;
3. CD3 FITC/CD19 PE: sono rispettivamente
misurati i T ed i B;
4. CD3 FITC/CD4 PE: si misurano solo i T CD4+
(si elimina l’inquinamento dei monociti CD4+);
5. CD3 FITC/CD8 PE: si misurano i T CD8+ (si
elimina l’interferenza degli NK);
6. CD3 FITC/CD16+56PE: si misurano gli NK.
Un pannello così concepito consente la definizione
della somma totale dei linfociti e garantisce una buona
precisione attraverso un controllo di ripetibilità.
*FITC : Isotiocianato di fluoresceina
** PE : Ficoeritrina
***perCP: peridinin clorophylla protein
CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE
Ivo Chiapponi
La cellula staminale ematopoietica (HSC) è una cellula del midollo osseo, poco numerosa ma prolifica, in
grado d’autorinnovarsi e nel contempo di generare
una progenie di tutte le linee cellulari del sangue.
In campo oncologico ed oncoematologico è da alcuni anni entrata in uso la tecnica del trapianto di progenitori emopoietici circolanti, identificabili dalla presenza sulla loro membrana di una glicoproteina CD34 e
perciò comunemente indicate come CD34+.
Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche consiste nel trasferimento di cellule staminali autologhe o
allogeniche con lo scopo di ristabilire una normale
emopoiesi e supportare cicli di chemioterapia ad alte
dosi. Le HSC possono avere origine midollare, placentare (cordone ombelicale) o circolanti nel sangue periferico. Storicamente il midollo osseo ha rappresentato
la più importante sorgente di HSC.
L’efficacia del trapianto di midollo deriva in gran
parte dal numero di cellule staminali presenti che sono
in genere non più di 1/10.000 cellule nucleate; pertanto, qualsiasi utilizzazione terapeutica del midollo,
implica quantità “sufficienti” di tessuto midollare.
In corso di ripristino delle popolazioni cellulari del
sangue in pazienti sottoposti a terapia mieloablativa, la
quantità per un ricevente di 70 Kg implicherebbe un
prelievo di circa 100 punture midollari. Per evitare una
simile procedura si può ricorrere, per tutti i trapianti
autologhi e per alcuni di quelli allogenici, alla utilizzazione di cellule staminali provenienti da sedi diverse
come il sangue periferico.
Le cellule staminali che sono normalmente presenti
in bassissima concentrazione nel sangue periferico,
possono aumentare significativamente dopo “mobilizzazione” con chemioterapia o mediante stimolazione
con fattori di crescita. I più usati sono il G-CSF ed il
GM-CSF rispettivamente fattore stimolante i granulociti e fattore stimolante i granulociti-monociti e l’IL-3.
Queste cellule si collocano nella frazione mononucleata del sangue periferico e possono essere raccolte con
sedute di aferesi. Nei pazienti o donatori il sangue
viene prelevato e centrifugato per isolare i leucociti. I
globuli rossi vengono immediatamente reinfusi, mentre i globuli bianchi vengono accumulati.
Il numero di aferesi necessario per ottenere una
56
quantità di CD34+ adeguata a garantire l’attecchimento è di 3-4.
Nella ricerca di fonti alternative di cellule staminali
emopoietiche utilizzabili per trapianti allogenici, di
peculiare interesse pediatrico è il trapianto di cellule
cordonali. Il sangue placentare, infatti, contiene una
quota rilevante di progenitori emopoietici immaturi,
più elevata rispetto al midollo osseo e la loro capacità
clonogenica sembra essere superiore a quella delle corrispettive cellule midollari.
Tutte le cellule staminali raccolte possono essere crioconservate in azoto liquido a temperature bassissime.
E’ certamente vero che le sorgenti di progenitori
emopoietici si sono estese, ma non tutti i tipi di trapianto possono dare una possibilità di guarigione in
tutte le patologie. Il trapianto autologo, ad esempio,
consente terapie ad alte dosi, ma manca dell’effetto
antineoplastico dato dalla GVH (reazione verso l’ospite), mentre il trapianto allogenico con progenitori emopoietici circolanti ha un effetto antineoplastico della
GVH ma un rischio maggiore di GVHD cronica (reazione di trapianto contro l’ospite).
Per il prelievo, la manipolazione ed il trapianto di
progenitori emopoietici esistono procedure standardizzate che richiedono una organizzazione dipartimentale con specifiche competenze ematologiche e di
laboratorio.
Identificazione dei precursori emopoietici CD34+
Una delle applicazioni di maggiore impiego della
citofluorimetria è senz’altro rappresentata dal conteggio di cellule CD34+ in campioni di sangue periferico
o in prodotti leucoaferetici di pazienti da sottoporre a
trapianto di cellule staminali periferiche (PBSC).
Il vantaggio della tecnica citofluorimetrica rispetto
alla valutazione dell’attività clonogenetica risiede nella
rapidità del test. Il conteggio delle cellule CD34+ offre
la possibilità di ottenere risposte precise ed immediate,
capaci di predire con ragionevole sicurezza la velocità
di attecchimento delle PBSC. In base a questo il clinico
può selezionare i pazienti che in seguito a somministrazione di fattori di crescita e/o chemioterapia mobilizzano un numero sufficiente di cellule staminali tali
da richiedere la leucoaferesi ed il numero di procedure
leucoaferetiche necessarie per raggiungere un livello di
cellule CD34+ (2-6x10E6/Kg) da permettere l’effettuazione di un trapianto PBSC.
La comparsa degli elementi CD34+ in circolo è
caratteristicamente poco prevedibile, come tempi, in
rapporto alle numerose variabili cliniche e terapeutiche. Il criterio di una analisi seriata di CD34 a partire
dal periodo di iniziale ripresa dei globuli bianchi è
quindi sempre raccomandabile.
Dunque la peculiarità dell’ambito clinico in cui è
richiesto questo conteggio, la particolare biologia degli
elementi mobilizzati e delle altre cellule ematiche di
accompagnamento hanno fin dall’inizio posto complessi problemi tecnici al conteggio citometrico.
Anche il sangue cordonale, come già accennato, è
57
ricco di elementi staminali ed attualmente oggetto di
grande interesse per la sua possibilità di essere impiegato in procedure allotrapianto sia in ambito pediatrico che nell’adulto. Le sacche contenenti il sangue di
cordone vengono congelate e stoccate, previa tipizzazione HLA del donatore e valutazione dei CD34+ assoluti presenti. Le procedure di conteggio applicabili su
sangue cordonale sono essenzialmente le stesse di
quelle del sangue periferico.
Attualmente il Laboratorio di Analisi, nell’ottica
dell’organizzazione dipartimentale per l’utilizzazione
dei precursori emopoietici, è in grado di utilizzare una
tecnica, accurata ed affidabile per il conteggio assoluto
per unità di volume dei CD34+ in citometria a flusso.
IL LABORATORIO NELLO STUDIO DELLE
PIASTRINOPENIE
Antonio La Gioia
La pseudopiastrinopenia o pesudotrombocitopenia
(PTCP) è una condizione nella quale, in soggetti con
valori normali di piastrinemia, si verifica, esclusivamen te in vitro, una riduzione del conteggio piastrinico.
La pseudopiastrinopenia rappresenta un importante problema in quanto è spesso causa di manovre diagnostiche e terapeutiche non giustificate; inoltre, se
non correttamente interpretato, il fenomeno diventa
fonte di ansia per il soggetto, spesso avviato verso
approfondimenti "specialistici" inutili e costosi.
Inquadramento
La PTCP venne descritta originariamente nel 1969
da Gowland che evidenziò la dipendenza del fenomeno da “fattori sierici” in presenza di EDTA.
Successivamente furono descritte PTCP da aggluti nine fredde (Wakins, 1970), da satellitismo (Kjeldsberg,
1970), da indaginosità del prelievo o da ridotta concen trazione di anticoagulante (Payne, 1984).
Tali segnalazioni e i successivi approfondimenti
fisiopatologici hanno consentito l’inquadramento delle
PTCP in:
1. EDTA DIPENDENTI
a. da agglutinine fredde
b. da agglutinine ad ampio spettro termico
c. da satellitismo
2. EDTA INDIPENDENTI
a. da agglutinine fredde
b. da agglutinine ad ampio spettro termico
3. DA INDAGINOSITA’ DEL PRELIEVO
Basi fisiopatologiche
La maggior parte delle pseudopiastrinopenie è causata dalla presenza di anticorpi anti piastrine. In condizioni normali (in vivo) questi anticorpi non causano
agglutinazione perché i relativi antigeni piastrinici
restano "nascosti" all'interno della struttura piastrinica.
Il contatto delle piastrine con gli anticoagulanti presenti nella provetta di prelievo, causa una modificazione
della struttura piastrinica con conseguente "scopertura" degli antigeni nascosti che si rendono disponibili
per il legame con l'anticorpo: l'agglutinazione piastrinica che così si realizza sottrae piastrine al conteggio
determinando la pseudopiastrinopenia.
Per le PTCP EDTA dipendenti l’agglutinazione “in
58
vitro” si verifica esclusivamente quando il prelievo
viene effettuato in EDTA, essendo completamente inibita, invece, da altri anticoagulanti quali il citrato di
sodio, il CTAD o l’ossalato d’ammonio.
Le PTCP EDTA indipendenti, viceversa, si presentano sia con l’EDTA sia con altri anticoagulanti e, in
particolare, non sono inibite dal prelievo in Na citrato.
Le PTCP da indaginosità.del prelievo costituiscono
la forma di più frequente osservazione; riconoscono
come momento fisiopatologico l’attivazione diretta
delle piastrine, innescata dalle manovre di ricerca del
vaso e dal danno endoteliale conseguente. Differiscono dalle PTCP “vere” per i seguenti aspetti: sono transitorie, non si ripresentano, quindi, nello stesso soggetto quando il prelievo è eseguito in maniera corretta;
non sono determinate da una agglutinazione anticorpo
dipendente bensì da una aggregazione da atticazione
diretta delle piastrine
Studio e tipizzazione delle pseudopiastrinopenie
La pseudopiastrinopenia:
• non ha effetti sull’emostasi;
• non è un sintomo;
• non è una situazione patologica;
• non necessita di interventi terapeutici;
• non necessita di approfondimenti diagnostici;
• non necessita di controlli nel tempo.
Per tali motivi la diagnosi e la tipizzazione di una
PTCP sono finalizzate esclusivamente a:
• stabilire se un conteggio piastrinico ridotto è conseguente ad una piastrinopenia vera o ad una pseudopiastrinopenia;
• determinare modalità di conteggio che permettano di conoscere il valore vero della piastrinemia
• fornire al "paziente" un’informazione utile ad evitare indagini supplementari inutili quando, ad esempio, deve essere seguito un intervento chirurgico.
Quando sospettare una pseudopiastrinopenia
Tutti i conteggi piastrinici ridotti possono essere
potenzialmente determinati da agglutinazione in vitro.
In laboratorio tutti i campioni con conteggi inferiori a
120.000 piastrine/mL sono controllati al microscopio e
segnalati come "piastrinopenia vera" o "pseudopiastri-
nopenia" se sono assenti o, rispettivamente, presenti
agglutinati piastrinici. Un'altra possibilità di evidenziazione è data dalla presenza di differenze rilevanti
tra conteggi ripetuti in giorni successivi: questo fatto
rispecchia la progressività dell’agglutinazione che
determina conteggi piastrinici sempre più ridotti man
mano che il ci si allontana dal momento del prelievo.
Diagnosi di pseudopiastrinopenia.
L'abbassamento significativo dei valori di piastrine-
59
mia su conteggi eseguiti a distanza di due ore l'uno
dall'altro e l’evidenza al microscopio di agglutinati
piastrinici sono sufficienti alla diagnosi. Prelievi eseguiti con differenti anticoagulanti (EDTA e citrato di
sodio) permettono poi di differenziare le pseudopiastrinopenie in forme EDTA dipendenti (corrette dal
sodio citrato) e forme EDTA indipendenti (non corrette
dal citrato) e, cosa importante dal punto di vista pratico, definiscono le modalità di prelievo e conteggio da
utilizzare sempre per quello specifico soggetto.
I NUOVI MARCATORI BIOCHIMICI PER LA
DIAGNOSTICA DI DANNO MIOCARDICO
Alberto Genovesi Ebert, Michele Galli, Antonio La Gioia*
Divisione di Cardiologia ed UTIC; Servizio di Patologia Clinica*
Nel processo investigativo, la cosa più importante è il saper
distinguere, da un cumulo di fatti, quelli che sono accidentali e quelli che sono essenziali. In caso contrario la nostra
energia e la nostra attenzione vanno sprecate.
(Sir Arthur Conan Doyle: le memorie di Shelock Holmes.
L’enigma di Reigate)
________________________________________________
• specificità per il tessuto miocardico, per una diagnosi certa in presenza di danno muscolare non cardiaco;
• adeguata persistenza nel torrente ematico, per
una diagnosi a distanza dall’episodio, ma allo stesso
tempo, rapida clearance per consentire la valutazione
della riperfusione miocardica dopo ricanalizzazione
meccanica o farmacologica del vaso di necrosi, e la diaLa valutazione del paziente con dolore toracico nel gnosi di eventuale recidiva precoce di infarto miocardipartimento d'Emergenza comporta notevoli implica- dico.
zioni organizzative, economiche e legali e costituisce
Negli ultimi anni i marcatori tradizionali di danno
una delle problematiche cliniche più difficili a cui far miocardico (CK, CK-MB activity, AST ed LDH), sono
fronte quotidianamente. Se, da un lato, tra i pazienti stati oramai largamente sostituiti da nuovi marcatori
con dolore toracico ospedalizzati con diagnosi di possi - (mioglobina, CK-MB massa, troponina T e troponina I)
bile sindrome coronarica acuta (angina instabile o in grado di svelare la presenza di tessuto miocardico
infarto miocardico acuto), solo 1/4 ne è davvero affet- necrotico già meno di 3 ore dalla insorgenza del doloto, dall’altro una strategia di dimissione precoce com- re. I nuovi marcatori forniscono inoltre informazioni
porta la mancata ospedalizzazione di una piccola (2- utili sull’efficacia della terapia riperfusiva e, nel caso
8%) ma non trascurabile percentuale di pazienti con delle sindromi coronariche acute senza sopraslivellainfarto miocardico in corso, con ovvie possibili cata- mento del tratto ST, sono largamente utilizzati ai fini
strofiche conseguenze (1-3). Di contro, l’indicazione al della immediata stratificazione prognostica e della
ricovero ospedaliero del paziente clinicamente stabile scelta terapeutica più o meno invasiva.
non può essere indiscriminata stante la limitazione delle
risorse. L’indicazione è inoltre condizionata da un
Caratteristiche biochimiche dei marcatori
eventuale orientamento terapeutico più aggressivo,
Mioglobina: proteina strutturale a basso peso moleriservando le strategie di rivascolarizzazione coronarica a colare tanto del muscolo scheletrico che del miocardio,
pazienti con diagnosi certa di sindrome coronarica acuta è rilasciata direttamente nel sistema vascolare in seguionde incidere significativamente sulla evoluzione della to alla lesione della miocellula. La sua concentrazione
malattia.
ematica aumenta rapidamente dopo danno miocardico
Il protocollo valutativo utilizzato più comunemen- ed il suo dosaggio comporta una sensibilità diagnostite in questi pazienti prevede un tradizionale triage cli- ca assai elevata per IMA a fronte di una bassa specifinico basato sulla anamnesi, l’obiettività ed il quadro cità; è il marcatore più precoce, risultando positivo già
elettrocardiografico di presentazione, abbinato ad uno dopo 2-3 ore dalla insorgenza del dolore. La finestra
screening bioumorale mirato alla ricerca dell’eventuale diagnostica (periodo in cui variazioni del dosaggio
danno miocardico in corso. Lo screening bioumorale hanno significatività ed utilizzo clinico) è compresa tra
attuale deve comunque essere semplice ma contempo- 2.5 e 20 ore. (4)
raneamente sensibile e specifico al fine di contenere
CK-MB massa: subunità della creatinchinasi-isoenquanto più possibile il numero dei soggetti “falsi posi- zima (CK) presente all’interno della cellule miocarditivi” (altrimenti inappropriatamente ospedalizzati) e che, il cui dosaggio prevede una determinazione
dei pazienti “falsi negativi” (ed erroneamente misco- immunologica (anticorpi monoclonali anti sub-unità M
nosciuti al triage).
e sub-unità B) che ne permette una stima quantitativa
Il marcatore ideale di necrosi miocardica dovrebbe (ng/mL), a differenza della determinazione della attiavere le seguenti caratteristiche:
vità enzimatica espressa come percentuale della atti• rapido incremento ematico, al fine di consentire vità totale CPK. Rispetto al CK-MB “activity”, la
una diagnosi precoce;
determinazione del CK-MB massa ha maggiore specifi-
63
cità e sensibilità. La CK-MB massa è un marcatore precoce (positivo dopo la 3a ora), e la finestra diagnostica è
compresa tra 3 e 24 ore dall’esordio della sintomatologia.
Troponine: mioproteine della struttura contrattile
muscolare. La troponina p.d. è un complesso formato
dalle sottofrazioni C (TnC), T (TnT), ed I (TnI); di queste, la TnT e la TnI sono utilizzate nella diagnostica
cardiologica utilizzando anticorpi monoclonali rivolti
verso le isoforme specifiche miocardiche. Per tali motivi la determinazione delle troponine TnT e TnI ha
valori elevatissimi tanto di specificità che sensibilità. In
caso di danno miocardico l’elevazione del marcatore
può essere rilevabile già a 3 ore. La clearance plasmatica è estremamente lenta, e si possono riscontare valori
elevati di troponinemia a distanza di 4 (TnI) e 5 giorni
(TnT) dall’evento acuto (5).
Uso clinico dei marcatori cardiaci.
In virtù della loro elevata sensibilità e specificità, i
nuovi marcatori biochimici, in particolare CK-MB
massa e la Troponina, hanno imposto alla comunità
scientifica internazionale la revisione dei tradizionali
criteri diagnostici di infarto miocardico OMS. La commissione congiunta ESC/ACC European Society of
Cardiology/American College of Cardiology ha convenuto di definire come infarto miocardico ogni incremento di qualunque entità degli indici di citonecrosi
miocardica più specifici (CM-MB massa e, preferibilmente, troponina) in presenza di dolore toracico e/o
modificazioni ECG (tabella 1) (7,8). Quindi, non sembra più sostenibile l’ipotesi di una soglia al di sotto
della quale il danno miocardico non abbia significato
clinico, stante le recenti ed innovative raccomandazioni internazionali. Il dosaggio dei marcatori di citonecrosi miocardica assume diverso rilievo in differenti
situazioni cliniche.
Uno dei due seguenti criteri soddisfa la diagnosi di infarto
miocardico acuto (in evoluzione o subacuto):
1) Tipico incremento e graduale diminuzione (troponina) o
più rapido incremento e diminuzione (CK-MB) dei marcatori biochimici di necrosi miocardica, associati ad almeno
una delle seguenti condizioni:
a) sintomi ischemici;
b) sviluppo di onde Q patologiche all’ECG;
c) modificazioni ECG indicative di ischemia (innalzamento o depressione del tratto ST);
d) intervento coronarico (ad esempio, angioplastica coronarica).
Angina instabile ed infarto miocardico senza ST
sopraslivellato (NoSTEMI). In questo contesto i marcatori di danno miocardico giocano un ruolo preminente nella stratificazione prognostica e nella scelta del
2) Reperti anatomo-patologici di infarto miocardico acuto.
Tabella 1. Definizione di infarto miocardico.
Infarto miocardico con tratto ST sopraslivellato
(STEMI). La diagnosi resta fondamentalmente basata
sul sintomo ed il quadro ECG, e la rapidità dell’intervento rappresenta un fattore decisivo per il successo
della terapia. La riperfusione miocardica con farmaci o
angioplastica, infatti, è efficace nel ridurre la mortalità
acuta e a distanza solo se è avviata entro 6-12 ore dall’inizio dei sintomi. Il rapido incremento plasmatico
di CK-MB massa e mioglobina seguiti da un precoce
declino (“lavaggio”) predicono, assieme al decremento
del sopraslivellamento Ecgrafico di ST, il successo
della terapia fibrinolitica; in mancanza di questi criteri
strumentali può essere indicata l’angioplastica di salvataggio. De Lemos et al. hanno identificato, in modo
prospettico, tre criteri indicativi di riperfusione inefficace: a) risoluzione del segmento ST <50% a 90 min; b)
dolore toracico persistente a 90 min; c) rapporto fra
livello sierico di mioglobina a 60 min e di base <4. In
presenza di tutti e tre i criteri, la probabilità di avere
occluso il vaso di necrosi è elevata (>75%) (31).
Dal paragone di sensibilità e specificità attese e
osservate dei vari marcatori di danno miocardico e
degli indici derivati dal loro dosaggio seriato, la mioglobina risulta il marcatore di scelta per la valutazione
della riperfusione, in particolare la sua variazione tra
valore basale e a 90’ (9). La curva della Troponina I,
marcatore di incremento più tardivo poco aggiunge
alle informazioni già ottenute. Rimane di ausilio tuttavia qualora sia necessario discernere tra altre patologie
che possano provocare innalzamento degli indici di
citonecrosi muscolare.
La quantità di CK e CK-MB dismessa durante l’infarto, già dagli anni 70, è stata dimostrata correlare con
l’estensione dell’area infartuata e con la prognosi (1013). Più recentemente la stretta correlazione tra la
quantità di CK-MB massa, funzione ventricolare residua e prognosi è stata osservata anche in pazienti sottoposti a fibrinolisi sistemica (14). Anche i nuovi marcatori di danno cardiaco hanno dimostrato di aggiungere informazioni prognostiche indipendenti nei
pazienti con STEMI (33). Il rischio più elevato dei
pazienti con livelli anormali di troponina all’ingresso
potrebbe essere correlato con un arrivo “oggettivamente” più tardivo in ospedale. Nello studio GUSTO-III, il
9% di >12000 pazienti trattabili con trattamento fibrinolitico al momento della randomizzazione presentavano valori abnormi di troponinemia T; in questi
pazienti si è dimostrata una stretta correlazione fra la
durata dei sintomi prima del test e la percentuale di
positività ad esso (32). La mortalità è risultata significativamente più elevata (15.5% vs 6.4%, p =0.001) nei
pazienti con positività troponinica. Recentemente tale
dato prognostico negativo è stato confermato anche
per la troponina I, quando rilevata all’ammissione.
64
più idoneo iter terapeutico. La positività della Troponina I o T identifica infatti un sottogruppo di pazienti
NoSTEMI a decorso sfavorevole (incidenza combinata
di re-infarto, morte o necessità di rivascolarizzazione a
30 giorni attorno al 15% (15, 33). In questi pazienti è
vantaggioso, se possibile, un trattamento anti-trombotico aggressivo ricorrendo inoltre a valutazione coronarografica e rivascolarizzazione miocardica <72 ore
(16, 17). D’altra parte, la negatività della Troponina
permette di identificare un sottogruppo che potrà non
essere ricoverato in Unità Coronarica, e che potrà essere dimesso rapidamente ed eventualmente rivalutato
con stress test (18).
Infarto o reinfarto miocardico periprocedurale. Il
significato prognostico negativo della necrosi durante
una procedura di rivascolarizzazione coronarica percutanea (PTCA) è condiviso da vari autori (19, 20). Per
valutarne la comparsa, la CK-MB è stata di recente
indicata come il marcatore di scelta, effettuando sistematicamente almeno 3 determinazioni dopo PTCA
(basale, 2-4 ore, 6-9 ed eventualmente 12-24 ore) (21,
22). Il dosaggio seriato di GOT e LDH è da abbandonare, per la bassa accuratezza predittiva (21). Il dosaggio
routinario della Troponina non è indicato ma può esse re d’aiuto nel caso di pazienti senza chiara evidenza di
danno miocardico pre-procedurale e/o qualora non si
sia eseguita un adeguato campionamento di CK-MB
subito dopo la procedura. Un aumento della troponina
già abnorme prima della PTCA è stato recentemente
riportato avere un significato prognostico particolarmente sfavorevole (23). Nel paziente che affronta una
PTCA con un infarto in evoluzione, la difficoltà di valutare la presenza del danno post-PTCA è maggiore per
la presenza di abnormi valori di marcatori già prima
della procedura. E’ ragionevole tuttavia considerare
espressione di danno post-PTCA l’ulteriore incremento
del marcatore ematico >50% rispetto ai valori “basali”,
e rilevato in almeno 2 determinazioni (20).
Utilizzo dei marcatori di danno miocardico nel
triage del paziente con dolore toracico in Pronto Soccorso. Sono stati proposti numerosi protocolli per un
uso integrato dei marcatori ai fini di una corretta e
rapida diagnosi di danno miocardico. Sebbene nessuno appaia ancora ben consolidato per l’utilizzo e quindi univocamente accettato, esiste un notevole accordo
sul fatto che:
1. è consigliabile la ripetizione seriata delle determinazioni ad intervallo di tempo prefissato (generalmente al momento della presentazione e a 6 ore dall’esordio dei sintomi).
2. il marcatore da preferirsi per la diagnosi di infarto miocardico è la troponina.
3. L’utilizzo combinato del duplice marcatore mioglobina + troponina si caratterizza per la rapida ed elevata accuratezza diagnostica (6).
4. L’incremento di troponina e/o di CK-MB massa,
se non accompagnato da un contesto ischemico, non è
65
criterio sufficiente per la diagnosi di infarto miocardico acuto.
Sulla base di queste premesse, i Dipartimenti d’Emergenza, le Divisioni di Cardiologia ed i Laboratori
Clinici dovrebbero collaborare allo sviluppo di un protocollo diagnostico nella valutazione dei pazienti con
sospetta sindrome coronarica acuta (2, 6, 24). Da tali
esperienze scientifiche dovranno scaturire Linee Guida
che permettano di ottimizzare l’uso delle risorse e di
ridurre la variabilità di comportamento tra Centri
diversi e addirittura tra operatori dello stesso Centro.
In pazienti con sospetto infarto miocardico acuto, le
Linee Guida sui marcatori di lesione miocardica del
Gruppo di Studio interdisciplinare ANMCO-SIMEL
Associazione Nazionale Medici Cardiologi Ospedalieri
e Società Italiana Medicina di Laboratorio (30), in relazione alla cinetica di incremento dei diversi marcatori
(figura 1), propone lo schema di campionamento dei
prelievi riportato nella tabella 2.
Alcuni Caveat nell’uso dei marcatori di danno
miocardico.
Livelli decisionali. La misurazione degli incrementi della
troponina permette di individuare necrosi miocardiche di
entità di tessuto <1 g. Questa estrema sensibilità comporta,
nell’utilizzo pratico, la necessità di porre precisi limiti decisionali “minimi”. Il documento ESC/ACC (7,8) prevede che i
Produttori dei kit diagnostici specifichino sempre per ogni
metodo analitico i valori di concentrazione della troponina
50
B
cTn I o T
20
10
5
CK-MB
C
2
A
1
AMI decision limit
Upper reference limit
D
0
0
Mioglobina o CK-MB
1
2
3
4
5
6
7
8
Giorni dall’esordio dell’IMA
Troponina I o T nell’angina instabile
Figura 1. Andamento temporale degli incrementi dei
marcatori di necrosi dopo infarto miocardico acuto.
Marcatore precoce
(CK-MB massa o Mioglobina) Troponina
Ammissione
SI
SI
+4h
SI
SI
+8h
SI/NO
SI
NO
SI
+ 12-14 h o mattino
Successivo
Tabella 2. Frequenza di prelievo consigliata, per la
determinazione dei marcatori biochimici di lesione
miocardica.
corrispondenti al 99° percentile della distribuzione normale. I
limiti decisionali riportati nei vari kit si riferiscono spesso al
97.5 percentile o non forniscono esaustivi chiarimenti. E’
auspicabile che tale intervallo di normalità sia desunto da una
casistica di soggetti normali periodicamente testati nel singolo
Laboratorio periferico. E’ inoltre indispensabile che sia
specificato il livello di imprecisione analitica (espresso
come coefficiente di variazione del valore corrispondente al limite di riferimento o SD della mediana, che
non dovrebbe essere >10%. Qualora i sistemi usati non
siano in grado di fornire un coefficiente di variazione
<10% ai valori corrispondenti al 99° percentile, le
Società internazionali di Patologia Clinica raccomandano che a fini diagnostici vengano utilizzati soglie
più elevate, pari alle concentrazioni minime per le
quali il coefficiente di variazione è comunque <10%
(tabella 3). Sebbene in tal modo si diminuisca la sensibilità clinica complessiva del sistema di analisi, si evitano gran parte dei riscontri occasionali di abnormi
valori di troponinemia (“troponinismi”), di difficile
inquadramento clinico (25).
Valori locali e trasferibilità del dato. La necessità di
avere valori di riferimento diversi in relazione ai vari
metodi e kit utilizzati con variabile accuratezza diagnostica, comporta oltretutto difficoltà nella trasmissione e
quindi nella interpretazione dei dati provenienti da
altri Centri. Per uniformare in modo semplice questa
informazione e migliorarne la trasferibilità, è stato proposto di esprimere l’incremento del marcatore non utilizzando valori assoluti (ad esempio, CK-MB = 42 U/l;
v.n. del Laboratorio = 0-14 U/l) ma valori normalizzati
del marcatore rispetto ai limiti superiori di normalità di
quel Laboratorio (nel caso dell’esempio precedente:
CK-MB index = 3, in quanto 42/14).
Metodo/strumento
Abbott AxSYM
Bayer ACS 180
Bayer ACS Centaur
Beckman Access IIa gen.
DiaSorin Byk Liaison
Dade Dimension RxL IIa gen.
Dade Status CS
DPC Immulite
Ortho Vitros
Roche Elecsys IIIa gen.
Organospecificità: oltre ai problemi intrinseci alle
metodiche di dosaggio sopra riportate, esistono condizioni in cui un incremento della troponina, pur essendo espressione di danno miocardico, non indica la presenza di una “necrosi miocardica” e quindi di una sindrome coronarica acuta. La grande sensibilità dei
metodi chimico-clinici di recente introduzione all’incremento anche minimo dei marcatori, in particolare
della troponina, implica che si osservino sempre più
frequentemente incrementi della troponina in contesti
clinici disparati. Tale incremento sebbene organo-specifico, non è “patologia-specifico”: quindi tali riscontri,
sebbene non francamente da intendersi “falsi positivi”
non devono necessariamente comportare una genesi
ischemica dell’incremento del marcatore e, quindi, una
diagnosi errata di coronaropatia. La pericardite e la
miocardite, ad esempio, comportano una necrosi cellulare, cui segue un incremento dei marcatori di necrosi non espressione di coronaropatia (26, 27). Analogamente traumatismi cardiaci, tossicità miocardica da
chemioterapici e rigetto di trapianto cardiaco possono
provocare incrementi dei marcatori di necrosi miocardica (28). Lo scompenso ventricolare sinistro, compreso l’edema polmonare acuto, può essere un’altra causa
non coronarica di incremento degli indici di citonecrosi. Nell’edema polmonare acuto sono stati osservati, in
circa la metà dei casi, incrementi della troponina che
identifica pazienti con peggior prognosi (29). L’embolia
polmonare, specie se significativa dal punto di vista
emodinamico, provoca un sovraccarico acuto del ventricolo destro con aumento dello stress subendocardico
con conseguente necrosi cellulare, anch’essa non necessariamente espressione di coronaropatia. Di recente è
stata segnalata una correlazione tra prognosi negativa
99°percentile**
Concentrazione associata a CV <10%***
0,30 µg/L
0,07l µg/L
0,15 µg/L
0,04 µg/L
0,036 µg/L
0,07 µg/L
0,03 µg/L
0,40 µg/L
0, 10 µg/L
0,01 µg/L
0,84 µg/L(2,8 x 99° percentile)
0,30 uµg/L(4,3 x 99° percentile)
0, 15 µg/L (2,1 x 99° percentile)
0,06 µg/L(2 x 99° percentile)
1,20 µg/L(3 x 99° percentile)
0,03 µg/L (3 x 99° percentile)
CV = coefficiente di variazione analitica totale.
*la presente tabella rappresenta un aggiornamento di quella che compare sul documento FIC/SIBioC/SIMeL in pubblicazione su Italian Heart Journal è
disponibile sul sito web delle rispettive società.
** Livello decisionale per la diagnosi di IMAsuggerito dal Comitato Congiunto European Society of Cardiology/American College of Cardiology.
***livello decisionale per la diagnosi di IMAsuggerito dal Comitato per la Standardizzazione dei Marcatori di Lesione Miocardica dell'International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine.
Tabella 3. Esempi della possibile influenza dell'imprecisione analitica in alcuni metodi di determinazione della
troponina sulla diagnosi di infarto miocardico acuto*.
66
ed entità dell’incremento della troponina nell’embolia
polmonare. Meccanismi simili possono essere chiamati
in causa per spiegare gli incrementi di troponina in
corso di polmonite e nelle crisi asmatiche severe.
Altre condizioni in cui è stato riportato incremento
della troponina, sono l’ipertensione arteriosa severa,
l’ipotensione, specie se accompagnata da aritmie, l’ipotiroidismo, le situazioni di grave compromissione
generale specie in presenza di diabete mellito, l’insufficienza renale cronica e le sepsi (30).
Anticorpi eterofili. Pazienti trattati con farmaci
costituiti da frazioni anticorpali (ad es. l’abciximab,
potente farmaco bloccante i recettori piastrinici GP
IIb/IIIa e comunemente usato in pazienti con sindromi
coronariche e nel corso di procedure invasive coronariche) possono produrre anticorpi detti eterofili (cioè
diretti contro le frazioni anticorpali del farmaco), che
possono dare reazioni crociate con i reagenti utilizzati
nel dosaggio della troponina. Le Case produttrici dei
kit riferiscono di aver risolto il problema, ma la cosa è
da verificare. Il problema non è da poco, visto il crescente utilizzo clinico di farmaci anticorpali.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Conclusioni finali
A fronte dei numerosi problemi legati alla diagnosi,
monitoraggio clinico e terapeutico della sindrome
coronarica acuta, i nuovi marcatori di danno miocardico sono di grande aiuto nel:
• riconoscere/confermare precocemente la presenza di danno miocardico acuto;
• fornire informazioni affidabili circa il successo
della terapia trombolitica, l’estensione della necrosi e
la prognosi;
• escludere l’infarto entro 16/24 ore nei soggetti con
sintomatologia dubbia ed ECG dubbio/non interpretabile;
• individuare tra i pazienti senza sopraslivellamento del tratto ST coloro che possono trarre giovamento
da un trattamento aggressivo;
• evidenziare il danno miocardico periprocedurale.
I nuovi marcatori di citonecrosi miocardica sono
dotati di grande sensibilità e specificità; pertanto
hanno contribuito a modificare la definizione e quindi
l’epidemiologia dell’infarto miocardico e le strategie
terapeutiche delle sindromi coronariche acute.
II significato clinico degli incrementi di questi marcatori (“necrosi miocardica acuta”) è certo per i pazienti:
a) con elevata probabilità di malattia coronarica;
b) contesto clinico ischemico;
c) per standard di laboratorio conformi alle disposizioni della Comunità Scientifica.
Il significato clinico di incrementi osservati in
modo diverso o in contesti clinici diversi deve essere
oggetto di ulteriori studi.
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IL LABORATORIO NELLO STUDIO DELLE DISLIPIDEMIE
Antonella Leoni
La prevenzione della coronaropatia da aterosclerosi
presuppone la possibilità di ridurre l’incidenza dell’evento coronarico a seguito della riduzione dei livelli
lipidici e della modificazione di stili di vita non idonei.
Gli studi nell’uomo hanno indicato che la progressione
della placca ateromatosica può essere rallentata ed
inoltre, secondo il Lipid Research Clinic Program, il
calo del 25% della Colesterolemia totale o del 35% del
Colesterolo LDL comporta una riduzione del 50% dell'incidenza di coronaropatia nei pazienti con ipercolesterolemia.
Pertanto le maggiori associazioni nazionali del settore, tra cui la Società Italiana Biochimica Clinica, l’Associazione Italiana Patologici Clinici, la Società Italiana
Medicina di Laboratorio, il Gruppo di Studio delle
Malattie Dismetaboliche e dell’Aterosclerosi e l’Associazione per lo studio dei farmaci antitrombotici hanno
formato un Comitato tecnico di esperti con il compito
di indicare:
• gli accertamenti più idonei e con il migliore rapporto potere diagnostico/costo da effettuare nella diagnostica laboratoristica.
• quali metodi di Laboratorio utilizzare al fine di
ottenere risultati più attendibili.
• i valori “desiderabili” delle analisi ematochimiche
stabilite da riportare sulla modulistica.
Alla accuratezza di un risultato di laboratorio concorrono, oltre ai fattori dipendenti dal metodo e dall’affidabilità del laboratorio, anche la variabilità preanalitica, influenzata dallo stato basale del paziente,
dalla modalità del prelievo e dalla conservazione del
campione.
Quello che viene qui proposto è appunto il risultato
del consenso raggiunto su questi temi.
Colesterolo Totale
E’ ormai documentato attraverso una vasta serie di
dati sperimentali clinici ed epidemiologici, la stretta
correlazione tra elevati livelli di colesterolo nel plasma
e la patologia aterosclerotica.
La determinazione del colesterolo ha quindi un
valore predittivo nella valutazione del rischio dell’infarto del miocardio e delle vasculopatie cerebrali e
periferiche.
Variabilità preanalitica: il colesterolo totale presenta una variabilità intraindividuale compresa in un
range tra il 6-7%. E’ importante quindi eseguire la
determinazione in almeno due sedute diverse e standardizzare accuratamente le fasi preanalitiche. Il gruppo di studio prevede pertanto che il prelievo venga
effettuato dopo che il soggetto ha attuato misure igienico-dietetiche (dieta a basso contenuto lipidico in particolare grassi saturi e colesterolo) per almeno 3 mesi e
dopo aver escluso le forme secondarie. Deve inoltre
sospendere circa 20 giorni prima del prelievo (quando
ciò è possibile) farmaci che possono modificare la
determinazione (diuretici, beta-bloccanti, estroprogestinici, anabolizzanti steroidi). La determinazione del
colesterolo non deve essere eseguito in gravidanza o in
caso di patologia flogistica non completamente risolta
o prima che siano trascorsi 3 mesi da un infarto miocardico (la flogosi provoca una diminuzione del colesterolo totale e LDL proporzionale alla concentrazione
basale del colesterolo).
Valori desiderabili: il valore desiderabile della
concentrazione di colesterolo inteso come quello oltre
al quale può essere necessario un intervento terapeutico dietetico o, per valori più elevati, anche farmacologico (valore decisionale), è stato stabilito essere per l’adulto <190 mg/dL e, per i soggetti con meno di 20
anni, <180 mg/dL.
Colesterolo HDL
Numerosi studi epidemiologici hanno visto come il
colesterolo HDL rappresenta un fattore protettivo nei
confronti della malattia coronarica (CHD), mentre la
diminuzione di concentrazione, soprattutto se associata ad un aumento dei trigliceridi, può comportare un
aumento del rischio di malattia cardiovascolare. Le
HDL sono lipoproteine ad alta densità adibite al trasporto del colesterolo dalle cellule periferiche al fegato,
dove esso viene trasformato in acidi biliari che vengono escreti nell’intestino attraverso le vie biliari. Le
HDL, inoltre, possono limitare l’assunzione di LDL da
parte delle cellule periferiche.
“Variabilità preanalitica”: valgono le stesse considerazioni citate per il Colesterolo totale.
“Valori desiderabili”: il valore decisionale è di 38
69
mg/dL per i maschi e 42 mg/dL per le femmine.
mg/dL possono essere espressivi di iperlipemie familiari.
Colesterolo LDL
Le lipoproteine a bassa densità (LDL) occupano un
ruolo fondamentale nel determinismo e nello sviluppo
dell’ateroma, pertanto se presenti nel sangue in quantità elevata sono in grado di dare avvio alla lesione ate romatosica e condizionarne la progressione.
“Variabilità preanalitica”: volgono le stesse considerazioni espresse per il colesterolo totale ed HDL.
“Metodo di misura”: Attualmente la maggioranza
dei laboratori dosa direttamente il colesterolo LDL. La
“formula di Friedewald”:
CLDL (mg/dL) = CTOT - (TG/5 + CHDL)
ancor oggi utilizzata correla molto bene con i metodi
diretti nel caso di soggetti normo o moderatamente
ipertrigliceridemici; il valore calcolato, viceversa, può
discordare anche significativamente in sieri con TG
molto alti.
“Valori desiderabili”: <115 mg/dL; valori >175
mg/dL sono espressione di malattia genetica del meta bolismo lipidico.
Trigliceridi
I vari studi tesi a verificare l’esistenza di un’associazione tra i livelli plasmatici di trigliceridi (TG) e sviluppo di malattia coronarica (CHD) hanno fornito
risultati in parte discordanti.
Sebbene i livelli di TG siano associati con l’incidenza di CHD, non sempre risultano predittivi per nuovi
episodi cardiovascolari rispetto ad altri fattori di
rischio come l’ipertensione, il fumo, l’ipertensione, l’ipercolesterolemia, i bassi valori di colesterolo HDL.
Resta comunque il ruolo chiave del dosaggio dei TG
nella diagnosi e monitoraggio della iperlipoproteinemia familiare combinata.
“Variabilità preanalitica”: i TG presentano una
variabilità biologica intraindividuale molto elevata,
maggiore rispetto a tutti gli altri costituenti lipidici.
Per il controllo di tale variabilità valgono le stesse considerazioni del colesterolo totale. Raccomandazioni
particolari riguardano l'astensione dal fumo e dall’esercizio fisico nelle ore precedenti il prelievo, in quanto
tali fattori possono modificare in modo significativo e
in breve tempo i livelli dei TG. L’uso di bevande alcoliche può portare ad un innalzamento dei TG; pertanto è
indispensabile sospenderne l’assunzione nei giorni
precedenti il prelievo soprattutto quando si deve verificare la presenza di una ipertrigliceridemia primitiva.
Poiché la concentrazione dei TG varia in maniera considerevole durante il giorno, il prelievo dovrebbe essere effettuato nelle prime ore del mattino dopo un
digiuno di 12 ore. I farmaci che possono modificare
significativamente la loro concentrazione sono i diuretici, i beta-bloccanti e gli estrogeni, che ne provocano
un aumento; l’eparina e gli eparinoidi determinano
invece una diminuzione.
“Valori desiderabili”: <180 mg/dL; valori >250
70
Apoproteina AI e Apoproteina B
L’Apo AI è una proteina presente in massima parte
nelle HDL: L’Apo B è la proteina strutturale dei chilomicroni, delle VLDL e delle HDL ed è correlata con l’a terogenesi.
Il dosaggio di tali proteine trova un impiego razionale solo per l’individuazione di soggetti ad alto
rischio; pertanto il Comitato costituito in seno alla Fon dazione Italiana per il cuore identifica le condizioni
nelle quali si ritiene utile richiedere tali esami:
• Apo AI:
• soggetti con bassi livelli di col.HDL (<25
mg/dL) per gli uomini, (<30 mg/dL) per le donne.
• soggetti con patologie cardiovascolari precoci
o familiarità per malattie cardiovascolari.
• Apo B:
• soggetti normolipemici o ipertrigliceridemici
con familiarità per patologie coronariche e cardiovascolari.
“Valori desiderabili”: i valori di attenzione sono
Apo AI <1,20 g/L; Apo B >1,20 gr/dL
Lipoproteina (a) o Lp (a)
E’ stato visto che elevate concentrazioni plasmatiche di lipoproteina(a) rappresentano un fattore di
rischio per lo sviluppo della patologia aterosclerotica.
L’Lp(a) risulta costituita da una molecola lipidica
“LDL – simile” in cui l’ApoB 100 è legata all’Apo(a).
La variabilità del peso molecolare dell’Apo(a) è determinata geneticamente, isoforme ad alto p.m. si associano a bassi livelli plasmatici di Lp(a) e viceversa.
Numerosi studi hanno dimostrato che esiste una bassa
variabilità intraindividuale e che gli abituali provvedimenti terapeutici (dietetici e farmacologici) sono inefficaci nel ridurre i livelli plasmatici; pertanto in relazione ai problemi analitici e all’incertezza sul significato
fisiopatologico dell’Lp(a) viene suggerito di non
impiegare la determinazione nello screening e di valutare con cautela i valori ottenuti.
Fibrinogeno
Studi recenti sembrano indicare il fibrinogeno
quale fattore di fischio per CHD; si è visto, infatti, che
alti valori di fibrinogeno sono correlati con la prevalenza di infarto del miocardio. Poiché allo stato attuale
non vi è omogeneità dei metodi utilizzati per la misura
di tale parametro si preferisce non utilizzarlo nel profilo di rischio cardiovascolare.
Conclusioni
Sulla base di quanto riportato il Comitato tecnico di
esperti consiglia di eseguire come profilo lipidico di
base i seguenti esami:
• colesterolo totale,
• trigliceridi,
• colesterolo HDL,
• colesterolo LDL.
In casi particolari può essere opportuno effettuare il
dosaggio di Apo A-I, Apo B e Lp(a). Poiché tali dosaggi devono rispecchiare il reale stato del metabolismo
lipoproteico del paziente è necessario standardizzare
accuratamente sia i metodi di analisi ma soprattutto le
possibili fonti di variabilità preanalitica e pertanto:
71
• eseguire il prelievo dopo un digiuno di 12 ore e
dopo che per 3 mesi il paziente ha osservato una dieta
a basso tenore lipidico;
• sospendere almeno 20 giorni prima del prelievo
l’assunzione di farmaci che possono interferire;
• effettuare il prelievo preferibilmente a livello
ambulatoriale in quanto la dieta ospedaliera tende a
modificare i livelli dei lipidi plasmatici;
• è opportuno effettuare il dosaggio in 2 diverse
occasioni con un intervallo di circa 2 mesi.
INSUFFICIENZA RENALE CRONICA ED INSUFFICIENZA
RENALE ACUTA
Roberto Bigazzi
U.O. di Nefrologia e Dialisi
La nozione d’insufficienza renale cronica (IRC)
implica che il filtrato glomerulare sia ridotto in maniera irreversibile. Questa definizione è usata in maniera
estensiva includendo anche una compromissione lieve
del filtrato glomerulare.
L’evidenza della cronicità della sindrome è fornita
da misure cliniche multiple del filtrato glomerulare
(clearance della creatinina misurata o calcolata con il
metodo di Cockroft) che ne documentano la riduzione
stabile (in un arco temporale di 3-6 mesi) o un declino
più o meno graduale negli anni.
La nozione d’insufficienza renale acuta (IRA) implica un declino rapido della funzione renale che si sia
stabilito in un arco di tempo variabile da poche ore a
settimane, potenzialmente reversibile. In genere la
distinzione con l’insufficienza renale cronica è ovvia
ma talora può essere difficile.
Elementi di distinzione fondamentali tra IRA e
IRC (che suggeriscono un’IRA):
• Diretta osservazione di un declino del filtrato glomerulare (creatininemia e urea plasmatica) nell’arco di
pochi giorni o settimane.
• Oliguria, anuria
• Documentazione che la funzione renale era normale non molto tempo prima.
• Dimensioni renali normali
Elementi di distinzione utili
• Assenza d’anemia e di altre complicazioni tipiche
dell’IRC
ITER DIAGNOSTICO
RENALE ACUTA
NELL’INSUFFICIENZA
Esclusione delle principali cause di declino rapido e
potenzialmente reversibile della funzione renale quali:
• Uropatia ostruttiva
• Malattia renovascolare
• Shock
• Disidratazione
• Insufficienza cardiaca
• Insufficienza epatica
72
Una volta che siano state escluse le “principali
cause” elencate sopra ed in aggiunta si riscontrino:
- Concentrazione urinaria del sodio (NaU) >20
mMol/L;
- Concentrazione frazionata del sodio urinario
(FENaU) >1%;
- Rapporto tra creatinina urinaria e creatinina plasmatica (Cr U/P) <20,
si delinea il quadro clinico di una probabile Necrosi
Tubulare Acuta (condizionata da situazioni cliniche
precedenti e/o concomitanti quali: sepsi generalizzata,
shock prolungato, interventi chirurgici maggiori).
Nel caso in cui la successiva evoluzione non sia compatibile con un quadro di necrosi tubulare acuta, vi è
indicazione all’esecuzione di una biopsia renale che,
tuttavia, in presenza di elementi clinico-anamnestici
suggestivi di glomerulonefrite acuta, nefrite interstiziale o vasculite, può essere effettuata in una fase più
precoce.
Esami di laboratorio utili per la definizione dell’insufficienza renale acuta
Per una diagnosi differenziale è utile effettuare
determinazioni seriate della creatinina sIerica o della
clearance della creatinina misurata o calcolata secondo
Cockcroft e Gault (Ccr = (140 - età) x peso corporeo/ (P
Cr x 72 se uomo o 85 se donna), elettroliti (Na, K, Cl)
plasmatici e urinari, bicarbonati plasmatici o CO2 totale, uricemia, emocromo, calcemia, fosforemia ed esame
chimico fisico delle urine e del sedimento urinario.
Con alcune di queste misurazioni è possibile calcolare gli “indici d’insufficienza renale“ sotto riportati,
utili per un corretto orientamento diagnostico.
Notevole importanza acquistano le alterazioni di
alcuni parametri di laboratorio che sono propri di specifiche patologie alla base della IRA quali ad esempio
l’aumento del CPK unitamente alla iperkaliemia,
iperfosforemia, ipocalcemia suggestivo di rabdomiolisi; oppure ipercalcemia grave isolata, oppure l’anemia
marcata senza emorragia (sindrome uremica emolitica,
DIC, LES, sclerodermia, ecc.) ed altre ancora per le
quali rimandiamo ai rispettivi capitoli nelle rispettive
sezioni delle complicanze renali.
Esame urine
Nella diagnosi dell’IRA la determinazione del volume urinario non è di grande aiuto: l’anuria completa
indica ostruzione delle vie urinarie ma può anche presentarsi nei casi di IRA prerenale o intrinseca (per es.
ostruzione dell’arteria renale, alcune forme di glomerulonefrite nella necrosi corticale bilaterale). Ampie
fluttuazioni del volume urinario indicano ostruzione
intermittente mentre i pazienti con ostruzione parziale
possono presentare poliuria a causa della disfunzione
secondaria del meccanismo di concentrazione urinaria.
sono dovuti a fibrosi interstiziale e dilatazione dei
tubuli;
• Presenza di granulociti eosinofili nel sedimento
(da 1 a 50% dei leucociti urinari). E’ comune (90%)
nella nefrite interstiziale allergica indotta da farmaci se
viene eseguita la colorazione di Hansel mentre la sensibilità scende al 20% con la colorazione comune di
Wright.
Proteinuria
1. se inferiore a 1 g/die = IRA ischemica o nefrotossica
2. se superiore a 1 g/die = indice di danno glomeruEsame del sedimento
lare oppure di escrezione di catene leggere nel mielo1. IRA prerenale : il sedimento, cosiddetto “benigno” ma.
o “inattivo” è privo di cellule; può contenere cilindri
Se lo stick urinario segnala positività marcata all’eialini (si formano in urine concentrate per l’aggrega- moglobina in assenza o in presenza di pochi GR al
zione di sostanze normalmente presenti nell’urina, sedimento deve essere sospettata emoglobinuria o
principalmente la proteina di Tamm-Horsfall che è mioglobinuria.
secreta in condizioni normali dalle cellule epiteliali
E’ di solito possibile distinguere l’emolisi dalla rabdell’ansa di Henle);
domiolisi osservando il plasma centrifugato: rosa nel
2. IRA post renale : anche in questo caso si può aver e primo caso, incolore (solitamente) nel secondo poiché
una sedimento inattivo, simile al precedente; piuria ed l’emoglobina libera, che ha un PM più elevato della
ematuria sono, tuttavia, comuni nei casi di ostruzione mioglobina, si lega alle proteine e viene filtrata più lenendoluminale e di malattia prostatica;
tamente dal rene.
3. IRA da malattia parenchimale renale ; di seguito
Nella successiva tabella sono evidenziati gli indici di
sono descritte le più comuni osservazioni:
insufficienza renale acuta maggiormente consolidati.
- Presenza di cilindri granulosi pigmentati e di
cilindri contenenti cellule epiteliali tubulari. Sono
caratteristici della Necrosi tubulare ed orientano verso
ITER DIAGNOSTICO NELL’INSUFFICIENZA
la diagnosi di IRA ischemica o nefrotossica spesso RENALE CRONICA
associati a microematuria e lieve proteinuria (<
1g/die);
L’approccio diagnostico iniziale dell’insufficienza
INDICE DIAGNOSTICO
IPERAZOTEMIA PRERENALE
IPERAZOTEMIA RENALE
INTRINSECA
FENaU* (NaU x CrP/NaP x CrU x 100)
Creatinina U/P
NaU
Azoto ureico U/P
Peso specifico urinario
Osmolarità urinaria
Azoto ureico/Creatinina plasmatica
Sedimento urinario
<1
>40
<10
>8
>1.018
>500
>20
Cilindri ialini
>1
<20
>20
<3
<1.012
<250
<10 -15
Cilindri granulosi color marrone opaco
* Indice più sensibile
• Presenza di cilindri eritrocitari, indice di danno
glomerulare acuto. La presenza di eritrociti dismorfici
è un reperto frequente nei casi di glomerulonefrite
(meno specifico dei cilindri eritrocitari);
• Presenza di cilindri leucocitari e cilindri granulosi non pigmentati. Suggeriscono una nefrite interstiziale;
• Presenza di cilindri granulosi di grosse dimensioni. Sono caratteristici della malattia renale cronica;
73
renale cronica coincide con quello dell’insufficienza
renale acuta. La necrosi tubulare acuta, per quanto
possibile, è una complicazione comunque rara dell’insufficienza renale cronica. La definizione implica che il
danno renale è irreversibile (anche parzialmente) per
cui solo eccezionalmente sono indicate ulteriori indagini. Quando l’insufficienza renale è scoperta in fase non
molto avanzata e la sua causa rimane incerta o sconosciuta possono essere indicate la biopsia renale o altre
indagini al fine di istituire un eventuale trattamento
che possa stabilizzare o ritardare la progressione della
malattia o prevederne la recidiva post-trapianto.
Principali alterazioni di parametri di Laboratorio in
corso di insufficienza renale cronica.
Sodio e volume dello spazio extracellulare
La maggior parte dei pazienti presenta un modesto
aumento del sodio e del liquido dello spazio extracellulare.
Alterazione del metabolismo dei grassi:
I livelli di colesterolo serico sono generalmente normali ad eccezione della sindrome nefrosica; vi può
essere ipertrigliceridemia dovuta sia all’aumentata sin tesi epatica sia alla diminuita rimozione tissutale
secondaria ad un deficit dell’enzima lipoproteinlipasi
deficitario. Possibile interferenza con gli elevati valori
di insulinemia.
Iperuricemia
Omeostasi del potassio
• Con filtrato glomerulare (GFR) superiore a 5
mL/min si ha un aumento del bilancio del potassio,
generalmente compensato e comunque raramente in
grado da determinare disturbi clinici (con l’eccezione
di un concomitante carico esogeno o endogeno acuto);
• Con GFR inferiore a 5 mL/min aumenta significativamente il rischio d’iperkaliemia sintomatica;
• Ipokaliemia: rara nell’IRC, può esser legata all’eccessiva perdita urinaria di potassio (patologie renali
croniche con specifica alterazione al riassorbimento
tubulare del K) oppure ad una restrizione alimentare
unita ad un uso quotidiano di diuretici e/o eccessiva
perdita intestinale.
Acidosi Metabolica
• Da riduzione dell’escrezione di NH3 urinaria;
• Riduzione della quota di acidità titolabile;
• Diminuito riassorbimento di bicarbonati urinari.
Metabolismo calcio-fosforo ed iperparatiroidismo:
In corso di IRC si determina:
• ipocalcemia dovuta alla diminuita sintesi di Vitamina D attiva;
• aumentata produzione di PTH stimolata dall’ipocalcemia;
• iperfosfatemia, quando il GFR è <25% circa del
normale;
• ulteriore ipocalcemia determinata a sua volta dall’iperfosfatemia e quindi nuovo stimolo alla produzione di PTH
• alterazioni istologiche dell’osso (osteite fibrosa),
determinate dall’iperparatiroidismo
Magnesio
Il livello serico del magnesio è elevato in corso di
IRC. Tuttavia raramente ciò causa sintomi significativi.
Il concomitante uso di lassativi contenenti magnesio
può creare depressione dello SNC.
Alterazioni metabolismo del glucosio:
• Intolleranza al glucosio (corretta dall’emodialisi);
• resistenza periferica insulina con elevati livelli di
insulinemia.
74
Alterazioni endocrine
Vi può essere una riduzione dei livelli di T3, peraltro
in un contesto di eutiroidismo; ridotti valori di FSH,
LH e testosterone possono essere in relazione con una
diminuzione della libido e della potenza del paziente
uremico.
Alterazioni ematologiche:
• anemia normocromica normocitica, effetto della
ridotta sintesi midollare come risultato della inibizione
da parte di tossine uremiche e/o ridotta produzione di
eritropoietina da parte del rene malato
• alterazione dell’emostasi:
m allungamento del tempo di sanguinamento
(non corretto dalla dialisi)
m alterazione del fattore III piastrinico (corretta
dalla dialisi)
m alterata aggregazione piastrinica
m diminuito consumo di protrombina
• alterazioni della serie bianca:
m linfocitopenia
m diminuzione della chemiotassi
PRINCIPALI FONTI BIBLIOGRAFICHE
1) Coe FL. Laboratory and Clinical assessment of the
patient with renal disease. In Brenner & Rector. The
Kidney (II edition). Saunders, Philadelphia. 1981;
pgg 1135-1180.
2) Rainford DJ, Stevens PE. The investigative approach
to patient with acute renal failure. In Cameron S,
Davision AM, Grunfeld JP, Kerr D, Ritz E. Oxford
textbook of clinical nephrology. Oxford Medical
Publications, Oxford. 1992 pp 969-982.
2) Cassidy MJD, Kerr DNS. The assessment of the
patient with acute renal insufficiency. In Cameron S,
Davision AM, Grunfeld JP, Kerr D, Ritz E. Oxford
textbook of clinical nephrology. Oxford Medical
Publications, Oxford. 1992 pp 1149-1173.
IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSI DELLE PROTEINURIE
Antonella Leoni
Con la diagnostica urinaria è possibile rilevare lo
stato di salute dei reni e delle basse vie urinarie. Il controllo di questo apparato è particolarmente importante
in quanto numerose patologie, specie renali, solo tardivamente presentano una evidente sintomatologia ed il
conseguente ritardo diagnostico è spesso causa di esiti
invalidanti.
Tra le diverse determinazioni richieste al laboratorio, il cosiddetto esame dell’urine riveste un ruolo rilevante in quanto i numerosi parametri indagati da tale
metodologia sono in grado, generalmente, di offrire
una valutazione sintetica dello stato di funzionalità ed
integrità dell’apparato urinario.
L’esame chimico-fisico delle urine utilizza metodiche in “chimica secca” (il cosiddetto stick) che forniscono, per i diversi parametri, informazioni qualitative, semiquantitative e quantitative; in particolare la
determinazione della proteinuria è basata sul principio
dell’errore proteico dell’indicatore di pH.
Tale metodo, in realtà, è in grado di rilevare quasi
esclusivamente l’albumina e non altre componenti proteiche, quali la proteina di Bence-Jones o altre proteine
“tubulari”.
La sensibilità analitica, inoltre, è notevolmente bassa
e, quindi, non idonea ad evidenziare la presenza di
albumina in quantità inferiori a 200 mg/24h, ossia la
“microalbuminuria”.
Pertanto, se per la diagnosi delle proteinurie ci si
basasse esclusivamente sull’utilizzo delle strisce test si
evidenzierebbero solo patologie renali avanzate.
Considerando che in base ai dati del Registro Italiano di Dialisi e Trapianti (RIDT), aggiornato al 1995, la
prevalenza dei pazienti con insufficienza renale cronica terminale in trattamento dialitico o con trapianto
renale è pari a 700/milione di abitanti, è importante
che il Laboratorio possa fornire al Medico di base dei
mezzi diagnostici che permettono di riconoscere in
tempo eventuali danni renali.
Grazie all’utilizzo delle tecniche immunochimiche
per il dosaggio delle proteine urinarie si spera che in
futuro tali patologie siano riconosciute e curate precocemente.
Oltre alle patologie ereditarie e non, che colpiscono
direttamente il rene, esistono anche delle malattie che
75
coinvolgono secondariamente tale organo; tra queste le
forme metaboliche (gotta e diabete) le malattie autoimmuni e l’amiloidosi. Il rene è inoltre un organo-bersaglio di una serie di agenti tossici sia chimici che fisici
(farmaci, sostanze tossiche) in grado di provocare
tubulopatie.
La ridotta funzionalità renale si manifesta quasi
sempre con la eliminazione di proteine plasmatiche
nelle urine; pertanto la “proteinuria” è il sintomo principale della maggior parte delle patologie renali.
Cause di proteinuria
La proteinuria renale può essere di origine glomerulare o tubulare.
La proteinuria di tipo glomerulare è costituita da
albumina e proteine plasmatiche di p.m. >70.000 daltons (immunoglobuline, transferrina) ed è dovuta ad
un‘alterata permeabilità dei capillari glomerulari. Le
cause più frequenti sono le glomerulonefriti primitive
o secondarie; tuttavia una proteinuria glomerulare può
caratterizzare una condizione parafisiologica come la
proteinuria ortostatica (usualmente benigna) che si
manifesta soprattutto nei giovani. Se in clinostatismo
la proteinuria scende a valori inferiori a 150 mg/die si
può tranquillamente porre diagnosi di “proteinuria
ortostatica”.
La proteinuria tubulare è composta invece da proteine di p.m. <50.000 daltons (alfa-1 microglobulina,
beta-2 microglobulina, proteina legante il retinolo, lisozima). Può essere dovuta ad un’inadeguato riassorbimento da parte dei tubuli prossimali (tubulopatie primitive, nefropatie tubulo-interstiziali) o ad una iperproduzione di microproteine con filtrazione massiva e
superamento delle capacità di riassorbimento da parte
dei tubuli: proteina di B.J. nel mieloma, lisozima nella
leucemia mielomonocitica. (tubulopatie da sovraccarico).
Altre proteinurie riconoscono cause pre e post-renali. Nei casi di proteinuria post-renale si possono ritrovare in vescica, insieme alle urine, proteine plasmatiche giunte in forma di essudato o trasudato dall’epitelio urinario. Tale proteinuria può essere confusa in
questo caso con una proteinuria di tipo glomerulare.
Per la diagnosi differenziale è utile dosare l’alfa-2
macroglobulina (proteina di grosse dimensioni che
non riesce a superare la membrana basale del glomerulo, anche in presenza di gravi alterazioni patologiche).
Determinazione delle proteinurie
Ai fini di una corretta diagnosi non è sufficiente la
determinazione quantitativa delle proteine escrete
(ricerca della proteinuria nelle urine delle 24 ore). Di
fondamentale importanza è il riconoscimento della
composizione proteica, per poter localizzare il processo patologico. A tale proposito si può disporre per
un‘analisi qualitativa di 2 procedimenti alternativi: la
tecnica elettroforetica che si basa sulla separazione
delle proteine in base al loro peso molecolare (SDSPAGE) o la comune elettroforesi zonale (attualmente
utilizzata nel nostro Laboratorio). Per l’elettroforesi
zonale purtroppo il problema maggiore è quello di
riconoscere la presenza delle microglobuline oltre che
per la loro bassa concentrazione anche perché, spesso
la loro migrazione si sovrappone a quella delle proteine a peso molecolare maggiore nella proteinuria mista.
Per avere ulteriori conferme si possono associare a
tali tecniche la determinazione immunologica di “proteine marker” per ogni tipo di lesione.
Queste proteine sono rappresentate da:
• “albumina”: proteina di media dimensione presente nell’urine quando si verificano disturbi della
funzione di filtro del glomerulo (proteinuria glomerulare selettiva).
• “IgG”: proteina ad alto peso molecolare (150kDa),
la sua presenza indica disturbi severi del glomerulo
(proteinuria glomerulare non selettiva).
• “alfa-1 microglobulina”, “Catene leggere libere”:
proteine a basso peso molecolare presenti nelle tubulopatie.
Modalità di raccolta
L’urina delle 24 ore è da preferirsi se la raccolta è
stata fatta in modo corretto; per la determinazione
delle singole proteine l’urina non deve contenere additivi stabilizzanti.
Per la ricerca della proteina di Bence Jones è invece
necessario avere un campione di urine fresche (2°
urina della mattina) per ridurre l’inquinamento batterico, possibile causa di una diminuzione della concentrazione della proteina.
Se non è possibile un’analisi immediata l’urina deve
essere tenuta a temperatura di 4-6°C; in tali condizioni
le IgG, l’albumina, l’alfa-1 microglobulina sono stabili
7 giorni.
Microalbuminuria: è utile ricordare che l’aumentata escrezione di albumina viene valutata come marker
molto precoce di un’alterazione della membrana basale glomerulare. Dato che, negli stadi iniziali le percentuali di eliminazione sono inferiori al limite di sensibilità delle strisce-test è stato coniato il termine di “microalbuminuria” per indicare l’escrezione urinaria di quantità minime di albumina. Tale marker si è rilevato di estrema importanza nella nefropatia diabetica, in quanto un riconoscimento precoce e una terapia preventiva efficace possono impedire l’evolversi di tale patologia verso forme irreversibili di insufficienza renale.
76
IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSI DELL’EMATURIA
Antonella Leoni
Il riscontro occasionale di ematuria va affrontato
considerando che una certa percentuale di persone (1025% in relazione al sesso ed all’età) presenta una
“microematuria” costante o variabile, senza alcuna
causa apparente (questa eliminazione fisiologica corrisponde in media a meno di 10-20 eritrociti/µL). Tuttavia si può presumere che la maggior parte delle patologie che si manifestano con ematuria franca siano
state precedute da un periodo di microematuria asintomatica, durante il quale la malattia poteva essere
trattata con maggior successo. Poiché non esiste un
netto spartiacque tra l’ematuria fisiologica e quella
patologica, utili possono risultare alcuni criteri per
definire una ematuria che necessita di ulteriori
approfondimenti diagnostici:
- rilievo di 20–40 eritrociti/µL per campo microscopico in almeno due campioni di urine su tre, prelevati
in assenza di febbre e con corrette modalità di raccolta
(getto intermedio della prima urina del mattino in
assenza nelle 12/48 ore precedenti di sforzi fisici o sessuali e di manovre diagnostiche strumentali traumatiche)
- osservazione anche di un solo episodio di marcata
microematuria ( >160 eritrociti/µL)
- episodio di ematuria macroscopica.
Prima di porre diagnosi di ematuria è necessario
escludere una pigmenturia dovuta ad emoglobina, a
porfiria, a mioglobina, oppure a farmaci (es. Rifampicina, Primachina, etc.) o alimenti (rabarbaro, barbabietole, etc.) ed escludere una contaminazione proveniente
dalla vagina o ulcere del meato.
L’età del paziente è un criterio importante per indirizzare il clinico nelle ulteriori indagini. Si potrebbero
pertanto suddividere i pazienti con ematuria in 3 fasce
di età:
Pazienti sopra i anni 40
L’ematuria microscopica che compare nei soggetti
più anziani deve essere trattata con lo stesso impegno
di un’ematuria franca. I primi accertamenti dovrebbero comprendere l’urinocoltura, l’esame citologico, la
cistoscopia.
Il 20% circa dei casi è affetto da patologie importanti
e la metà almeno di esse sono neoplasie maligne. I
pazienti a cui non viene posta diagnosi vanno tenuti
77
sotto controllo; circa il 2% svilupperà lesioni significative entro 3 anni.
Il carcinoma a cellule di transizione dell’urotelio, il
carcinoma del parenchima renale, il cancro della prostata sono le neoplasie di maggior riscontro. Nella storia di queste malattie l’ematuria franca rappresenta
quasi sempre un evento tardivo.
Altra frequente causa di microematuria è rappresentata dal trattamento con anticoagulanti specialmente in
soggetti con anomalie urologiche precedentemente
non riconosciute.
E‘ stato costatato inoltre che l’ematuria microscopica
è significativamente più frequente nei forti fumatori.
Pazienti al di sotto dei 40 anni
Per tali soggetti è utile un esame clinico completo
che comprenda anche la misurazione della pressione
arteriosa, ed eventuali accertamenti che possano escludere: una cistite batterica, (più frequente nella donna)
una prostatite cronica (specialmente se l’ematuria è
ricorrente) una glomerulonefrite, una calcolosi.
In assenza di cause riconosciute e quadro clinico l’ematuria si definisce “essenziale o benigna”.
In questo gruppo solo il 2% dei pazienti presenta
una patologia neoplastica.
Una ulteriore causa di ematuria è rappresentata
dallo sforzo prolungato (atleti fondisti per esempio). In
questi casi l’ematuria scompare dopo adeguato periodo di riposo (48 ore circa).
Spesso dopo un trauma si può avere ematuria e talvolta l’intensità è sproporzionata rispetto alla lesione o
può persistere più a lungo di quanto ci si possa aspettare; in tal caso può provenire da una lesione non riconosciuta delle vie urinarie.
Bambini
Molto di rado l’ematuria è legata ad una patologia
di interesse chirurgico, pertanto l’indagine dovrebbe
essere diretta verso il parenchima renale. La causa più
frequente è costituita da una glomerulonefrite. In questo caso è importante valutare dall’esame del sedimen to la morfologia dei globuli rossi: quelli di origine
“non-glomerulare” sono tipicamente conformati a
disco con l’emoglobina uniformemente distribuita;
quelli di provenienza glomerulare sono frammentati,
piccoli, distorti per le alterazioni morfologiche legate
al passaggio attraverso la membrana basale del glomerulo; inoltre spesso nel sedimento si osservano dei
cilindri. Raramente nel bambino l’infezione delle vie
Errori di
analisi chimica
FALSI POSITIVI
FALSI NEGATIVI
PSEUDOEMATURIE
• Attività perossidasica
di contaminanti
batterici (ritardo nella
esecuzione dell’esame)
• Urine ad elevato peso specifico
• Acido Ascorbico urinario
>0.28mmol/L
• Mestruazioni
• Lesioni del prepuzio e
del meato
• Contaminazione con
agenti ossidanti
(ipoclorito es.)
• Urine molto alcaline
• Emoglobinuria
• Cistinuria
• Mioglobinuria
Interferenza
urine misura in realtà l’emoglobina ed è leggermente
più sensibile all’emoglobina libera rispetto a quella
presente nei globuli rossi. Il test si basa sull’attività
perossidasi-simile dell’emoglobina che catalizza la rea-
• Esplorazione
recente
rettale
• Coloranti azoici colorano
la striscia di blu
Tabella 1 - Cause di falsi positivi e falsi negativi nella ricerca di sangue con strisce reattive.
urinarie si limita a causare ematuria microscopica di
solito vi è anche un certo grado di piuria.
Nei bambini affetti da drepanocitosi spesso si può
avere micro o macroematuria.
Come nell’adulto, spesso l’ematuria può essere di
tipo benigno.
Il nefroblastoma, tumore tipico dell’infanzia (rappresenta il 13% delle neoplasie maligne non leucemiche) è accompagnato quasi sempre da un sanguinamento macroscopico.
Quindi di fronte ad un soggetto che non lamenta
sintomi chiari, ma che presenta una microematuria
persistente è necessario porre attenzione ad alcuni
aspetti, quale intensità e momento di comparsa dell’ematuria; natura di eventuali sintomi, anche se sfumati;
familiarità e abitudini di vita; patologie e terapie concomitanti:
Metodiche Diagnostiche
Test con strisce reattive: la striscia reattiva che viene
comunemente usata per la ricerca del sangue nelle
78
zione tra il diisopropil-benzene diidroperossido e la
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina. Il colore che si sviluppa
va dall’arancio al verde fino al blu per quantità elevate
di sangue. Il metodo si dimostra molto accurato tuttavia in alcuni casi si possono avere risultati falsamente
positivi o negativi come riportato in tabella 1.
Negli ultimi anni l’industria biomedica ha messo a
disposizione dei laboratori, analizzatori citofluorimetrici in grado di eseguire la “lettura” automatizzata del
“sedimento urinario”. In realtà tale dizione è, ovviamente, impropria in quanto l’analisi interessa il conteggio e la caratterizzazione degli elementi cellulari in
sospensione e non necessità quindi di centrifugazione
preliminare. La quantificazione citofluorimetrica delle
ematurie, pertanto, non risente delle interferenze
riportate in tabella. Le emazie, e gli altri elementi cellulari segnalati dallo strumento sono soggetti a controllo e valutazione microscopica utile, altresì, alla precisazione della morfologia e della conservazione delle
emazie. I risultati sono espressi in elementi/µL.
SIEROPROTEINE - 1
Antonio La Gioia
L’elettroforesi sieroproteica (EPR) rappresenta il
metodo più comunemente utilizzato per lo studio a
scopo diagnostico delle proteine.
Negli ultimi anni l’utilizzazione clinica della elettroforesi sieroproteica ha subito profonde revisioni critiche, alcune delle quali sono di seguito analizzate:
• l’EPR è una indagine globale qualitativa o semi quantitativa;
• come conseguenza del punto precedente il risultato di una EPR deve essere espresso in termini descrittivi delle variazioni qualitative (es. presenza/assenza di
componente monoclonale; gammapatia policlonale
simmetrica/asimmetrica; sdoppiamento della banda
a1; assenza di anomalie qualitative; ecc.) e con valutazioni semiquantitative delle singole componenti molecolari che individuano le diverse bande ( es.: aumento/riduzione dell’α1- antitripsina o dell’ aptoglobina o
della transferrina ecc.);
• non sono più utilizzabili i c.d. “quadri tipici ( ad
es. quadro epatico; quadro nefrosico; ecc.):
• la valutazione quantitativa delle singole sieroproteine deve essere affidata al dosaggio immunochimico
(es. dosaggio IgG/A/M; transferrina; aptoglobina);
• la valutazione di un tracciato elettroforetico
dovrebbe essere completata con una interpretazione
clinica che, per la sua complessità, non può prescindere dalla acquisizione di adeguate notizie cliniche.
Caratteristiche e significato clinico di alcune plasmaproteine
L’osservazione di un tracciato elettroforetico può
suggerire la necessità di valutazioni quantitative di singole proteine plasmatiche; riportiamo di seguito il significato di alcune tra quelle di uso clinico consolidato.
• RBP - Proteina legante il retinolo: proteina a
basso peso molecolare di sintesi epatica; il suo livello
sierico è correlato con quello della creatinina. La sua
presenza nel tracciato elettroforetico delle proteine urinarie è indice di proteinuria tubulare; il dosaggio urinario è utilizzato per conferma e quantificazione del
danno tubulare.
• Albumina: proteina a basso peso molecolare con
specifiche funzioni di trasporto e principale responsa-
79
bile della pressione oncotica plasmatica.
La concentrazione sierica dell’albumina è in relazione all’equilibrio tra sintesi, catabolismo e distribuzione. Nella pratica clinica può essere utile la quantificazione di una ipoalbuminemia da perdita esogena (sindrome nefrosica; ustioni; enteropatie protidodisperdenti) o da ridotta sintesi (denutrizione) ovvero da
aumentato catabolismo (ipertiroidismo; s. di Cushing).
• α1-antitripsina: proteina rientrante nel gruppo
degli inibitori delle proteasi. La sua concentrazione
nel siero aumenta negli stati infiammatori o di necrosi.
La riduzione dei livelli plasmatici di tale proteina è
geneticamente determinata ed associata ad aumentata
incidenza di cirrosi epatica infantile o, nell’adulto, a
maggiore facilità di sviluppo di enfisema polmonare.
• α1-glicoproteina acida: proteina a basso peso
molecolare che, a causa dell’elevato contenuto in glicidi, risulta non colorabile con i coloranti proteici e quindi non evidente alla elettroforesi. E’ una proteina della
fase acuta e, pertanto, aumenta negli stati infiammatori, neoplastici e di necrosi. Il suo comportamento è,
tipicamente, “lento”: ha un tempo di risposta di circa
24 ore, un aumento ed un ritorno alla norma di tipo
progressivo.
• Proteina C reattiva (CRP): così denominata perchè è in grado di reagire con il polisaccaride C del
pneumococco. Anch’essa è una proteina della fase
acuta, con comportamento tipicamente “rapido”:
tempo di risposta di circa 6 ore, aumento rapido, ritorno alla norma in tempi corrispondenti alla risoluzione
del processo infiammatorio. Per tali motivi la CRP
viene considerato come il marcatore ideale delle fasi
acute a rapida evoluzione (decorso post operatorio,
infezioni acute, infarto. ecc,) ma meno efficace nei processi subacuti o cronici nei quali il monitoraggio risulta
più conveniente con l’uso della VES o del fibrinogeno.
Da segnalare che, in caso di aumenti notevoli la CRP si
rende evidente anche sul tracciato elettroforetico come
banda inserita tra le “gamma lente”, simulando, se non
correttamente interpretata, la presenza di una componente monoclonale.
• Aptoglobina: glicoproteina a basso peso molecolare, caratterizzata dalla capacità di legare in forma
irreversibile l’emoglobina libera circolante. E’, come le
precedenti, una proteina della fase acuta ed è responsabile principale dell’aumento della frazione elettroforetica α-2 che si evidenzia nella sindrome nefrosica,
nella colestasi, nei processi neoplastici. Il principale
utilizzo clinico della aptoglobina è, tuttavia, legato alla
sua diminuzione (da consumo) che si verifica in tutti
gli stati di emolisi acuta e, soprattutto, cronica.
• Ceruloplasmina: proteina di trasporto del rame; è
una proteina della fase acuta a bassa reattività. Trova la
sua principale indicazione diagnostica nel morbo di
Wilson, in cui risulta fortemente ridotta. Assolutamente da sconsigliare il dosaggio della ceruloplasmina
quale indicatore del bilancio del rame.
• Transferrina: proteina a basso peso molecolare
deputata al trasporto del ferro. La sua sintesi è inibita
dalla entità dei depositi di ferro intracellulare e, pertanto, presenta una correlazione inversa con la ferritina. Trova, in associazione con il dosaggio della ferritina e della sideremia, importanti indicazioni diagnostiche nello studio del bilancio del ferro. Risulta ridotta in
tutti gli stati di sovraccarico di ferro (infiammazione
cronica, neoplasie) ed aumentata nella sideropenia ed
in gravidanza (effetto combinato degli estrogeni e
della eventuale sideropenia). Ulteriori informazioni
diagnostiche sono fornite dal calcolo dell’indice di
saturazione della transferrina.
• Frazioni C3 e C4 del complemento: il complemento rappresenta il principale sistema effettore dell’
immunità umorale. Le frazioni C3 e C4 sono solo alcune componenti di un complesso sistema “a cascata” in
cui ogni componente è attivato dal prodotto di reazione del componente a monte. Il sistema comprende una
“via classica” ed una “via alternativa” di attivazione,
oltre ad un “sistema litico” comune alle due vie. Nella
pratica clinica il dosaggio dei fattori del complemento
trova indicazione nel monitoraggio della fase acuta
(C3 e C4 aumentati) e nello studio della immunità
umorale in cui bassi livelli di C3 depongono per una
attivazione della via classica o della alternativa e bassi
livelli di C4 indicano attivazione della sola via classica.
• Immunoglobuline: IgG, IgA, IgM: il termine
immunoglobuline comprende proteine ad attività anticorpale, effettrici del sistema immunitario umorale.
Significato clinico delle alterazioni quantitative
delle Ig: le riduzioni.
Possono essere congenite (agammaglobulinemia;
ipogammaglobulinemia; deficit selettivi [di IgA; o
IgG; o IgM]) o acquisite (per difetto di sintesi [denutri-
80
zione; senescenza; trattamenti immuno- soppressivi o
radianti; presenza di gammapatia monoclonale] o per
perdita [nefrosi; enteropatie; ustioni]).
Significato clinico delle alterazioni quantitative:
delle Ig gli aumenti
.
Sono determinati da una espansione della massa
plasmacellulare di tipo monoclonale (gammapatie
monoclonali: vedi scheda e laboratorio nello studio
della sieroproteina-2) o policlonale (gammapatie policlonali).
Il significato clinico delle gammapatie policlonali
può essere interpretato solo in connessione con i dati
clinici. In genere la gammapatia policlonale è determinata da un aumento prevalente di una delle classi di Ig
o da tutte e tre.
Le alterazioni di tipo qualitativo: sono il risultato
della espansione di uno (gammapatia monoclonale vedi scheda relativa) o pochi (risposta oligoclonale)
cloni cellulari. Le risposte oligoclonali si possono verificare transitoriamente in corso di infezioni acute (specie virali) o, permanentemente, in alcune epatopatie
croniche o collagenopatie o neoplasie.
Nella tabella della pagina seguente (Aguzzi; Merlini 1993) è riportata una schematizzazione interpretativa del tracciato elettroforetico che può rappresentare
una guida nella richiesta di approfondimento diagnostico basato sul dosaggio delle diverse sieroproteine.
Tale tabella è stata modificata, tenendo conto dell’adozione nel nostro laboratorio della elettroforesi capillare. Con tale tecnica, la rappresentazione densitometrica risulta lievemente modificata rispetto alla elettroforesi in gel d’agarosio. In particolare in alfa-2 l’aptoglobina e l’alfa 2-macro risultano “invertite” mentre, in
zona gamma, l’eventuale CRP si evidenzia in posizione più vicina alle beta-2.
Nota tecnica: immunofissazione. Accade frequentemente che un tracciato elettroforetico sia accompagnato dalla annotazione “si consiglia immunofissazione”, determinata dalla osservazione di una anomalia
del tracciato che induce il sospetto della presenza di
una componente monoclonale.
L’immunofissazione è una tecnica di ummunoprecipitazione che permette di confermare la presenza di
una componente monoclonale e, nello stesso di tipizzarla (ad esempio IgG [o IgA o IgM] k; IgG [o IgA o
IgM) lambda; k libere; lamba libere, etc]).
Generalmente una componente monoclonale subisce nel tempo delle variazioni quantitative (aumenta o
diminuisce o, nel caso di quelle transitorie, scompare)
ma non qualitative e, conseguentemente, non necessita
di ulteriori immunofissazioni.
Zona elettroforesi
Proteina
Variazione
Fisiopatologia
Associazione clinica
ALBUMINA
Albumina
Riduzione
Ridotta sintesi
Epatopatie; neoplasie
Albumina
Riduzione
Perdita
Infiammazione
nefropatie; enteropatie
Albumina
Riduzione
Diluizione
Aumento volemia
Alfa 1-antitripsina
Aumento
Effetto estrogeni
Gravidanza; “pillola”
Alfa 1-antitripsina
Aumento
Sintesi
Infiammazione
Alfa 1-antitripsina
Riduzione
Genetica
Enfisema giovanile
Alfa 1-antitripsina
Doppia banda
Genetica
Enfisema; aumento incidenza
ALFA 1
(eterozigosi)
Alfa-fetoproteina
epatocarcinoma
Doppia banda(alfa-
Sintesi
Epatocarcinoma
Sintesi
Gammapatia monoclonale
1AT/ AFP)
Catene K/L
Doppia banda(alfa-1AT/catene L)
ALFA2
BETA1
BETA2
GAMMA
Aptglobina
Aumento
Proteina fase acuta
Infiammazione; necrosi; neoplasie
Aptglobina
Riduzione
Difetto di sintesi
Epatopatie
Aptglobina
Riduzione
Iperconsumo
Emolisi intravascolare
Alfa 2-Macroglobulina
Aumento
Fisiologico
Infanzia
Aumento
Ritenzione
Nefrosi
Aumento
Sconosciuta
Diabete; epatopatie
Riduzione
Iperconsumo
Iperfibrinolisi
Transferrina
Aumento
Riduzione Fe di deposito
Gravidanza; sideropenia
Transferrina
Riduzione
Perdita
Nefrosi
Transferrina
Riduzione
Ridotta sintesi
Infezioni croniche; epatopatie
C3
Aumento
Proteina fase acuta
Infiammazione; neoplasie
C3
Riduzione
Difetto di sintesi
Epatopatie; immunodeficienza
C3
Riduzione
Consumo
Fibrinolisi; pancreopatia
Propeina C Reattiva
Aumento
Proteina della fase acuta
Infiammazione
Immunoglobuline
Aumento simmetrico
Sintesi
Epatopatie cronica; neoplasie
Immunoglobuline
Aumento asimmetrico
Sintesi
Cirrosi; alcolismo cronico
Sintesi
Gammapatia monoclonale
e fusione Beta/Gamma
Immunoglobuline
Aumento omogeneo
(talvolta in alfa o in beta)
81
SIEROPROTEINE - 2
Antonio La Gioia, Antonella Leoni
L’introduzione in laboratorio di tecniche più sensibili come l’elettroforesi ad alta risoluzione (gel d’agarosio e, più recentemente, elettroforesi capillare) e l’immunofissazione ha aumentato notevolmente la prevalenza della componente monoclonale (C.M.) di riscontro occasionale, fino ad arrivare al 7-8% nelle persone
di età superiore ai 50 anni e all’11% in quelle al di
sopra dei 75 anni.
Queste C.M. sono per l’80% di modestissime dimensioni ed inquadrabili nella maggior parte dei casi come
“gammapatia monoclonale benigna. ”Per queste situazioni non appare opportuno seguire in ogni modo un
iter diagnostico costoso e di notevole impatto psicologico; e pertanto si suggerisce l’applicazione di un protocollo recentemente proposto (Waldenstrom, Kyle,
Axelsson, Radl, Merlini).
Le C.M. possono essere classificate clinicamente in:
• Forme progressive, nelle quali l’evoluzione verso
forme clinicamente manifeste è determinata dalla proliferazione neoplastica di un clone B linfocitario (mieloma nelle sue diverse forme; macroglobulinemia di
Waldenstrom; malattie da catene pesanti; alcune forme
di linfoma NH; leucemia linfatica cronica); rientrano in
questo gruppo le forme le cui manifestazioni cliniche
sono determinate direttamente dalla presenza della
C.M. (crioglobulinemie, amiloidosi, malattia da deposizione di catene leggere, anemia autoimmune da
crioagglutinine).
• Forme non progressive che comprendono essenzialmente le gammapatie monoclonali Benigne (GMB)
Attualmente non è disponibile un test di laboratorio che permetta di distinguere precocemente le
forme progressive (maligne) da quelle non progressive (non maligne). L’evoluzione clinica rimane il solo
criterio diagnostico valido.
All’esordio tutte le C.M. sono da inquadrare come
forme “di incerto significato”, dopo un periodo di follow-up è possibile discriminare le forme progressive
da quelle stazionarie.
Cosa fare quando viene segnalata da parte del
Laboratorio una C.M.?
Alla prima osservazione si deve valutare:
• Anamnesi focalizzata sulle possibili implicazioni
cliniche (dolori ossei, infezioni ricorrenti, parestesie,
astenia, turbe del ritmo, disturbi della diuresi e dell’alvo)
82
• Es. obiettivo
• Parametri ematochimici: emocromo, tipizzazione
(mediante immunofissazione) della C.M. e ricerca
della proteina di Bence Jones (urine), calcemia, creatininemia.
Se il paziente è asintomatico, con obiettività negativa, esami nella norma e la C.M. di piccole dimensioni
(IgG <2gr/dL, IgA e IgM < 1gr/dL) basterà seguire il
paziente dal punto di vista sintomatologico, ripetendo
gli accertamenti ematochimici ogni 4 mesi per 2 anni.
Nel caso in cui il quadro clinico ed ematochimico risulti stazionario sarà necessario un controllo annuale
indefininitivamente. Si sottolinea che, nelle condizioni
sopra specificate la valutazione morfologica dell’aspirato midollare non fornisce alcuna informazione
aggiuntiva e non è ritenuta criterio di valutazione
diagnostica o prognostica.
Se il paziente è sintomatico e/o presenta riscontri
obiettivi riferibili alla C.M. o alterazioni ematochimiche, le indagini devono essere estese, definendo il
“quadro midollare” (puntato sternale) e “scheletrico”
(Rx scheletro). Un infiltrato midollare (plasmacellule >
al 20%) e/o la presenza di lesioni osteolitiche sono in
accordo con criteri diagnostici per Mieloma Multiplo.
Un infiltrato linfoplasmacellulare > al 40% caratterizza
la Macroglobulinemia di Waldenstrom.
Se un soggetto con C.M. rimane asintomatico e con
un quadro bioumorale stazionario per 4 anni la sua
condizione può essere considerata benigna, poiché il
rischio che possa trasformarsi nei successivi 20-30 anni
è molto basso (1-3%). In questo caso è sufficiente una
valutazione clinica annuale accompagnata dall’esecuzione di alcuni esami di Laboratorio (dosaggio della
C.M. su siero ed urine, eventuale dosaggio delle catene
leggere K e Lambda, emocromo, creatinina, calcemia.)
Il paziente deve essere informato dei sintomi e segni
cui prestare particolare attenzione (dolori ossei, fratture spontanee, infezioni ricorrenti, parestesie, turbe del
ritmo, disturbi della diuresi e dell’alvo). E’ importante
ricordare che ogni paziente con C.M. di qualsiasi
dimensione merita di essere valutato sia da un punto
di vista clinico che di Laboratorio, e questo approccio
deve essere conservato per tutto il follow-up, evitando
di fare affidamento solo sulla C.M.
E’ utile ricordare che esistono situazioni nelle quali
la presenza di C.M. (stabile/progressiva/transitoria)
è determinata da una immunodeficienza primitiva o
secondaria. E’ questo ad esempio il caso della maggior
parte delle C.M. dell’anziano che riconoscono come
meccanismo fisiopatologico un invecchiamento del
sistema immunitario.
Vi sono inoltre delle G.M. transitorie che sono il
risultato della proliferazione di plasmacellule ancora
sotto il controllo dei normali meccanismi di espansione
dei cloni e che si possono riscontrare in corso di infezioni da Citomegalovirus, epatiti virali, dopo trapianto
di midollo, talvolta dopo assunzione di farmaci.
Integrazioni ed approfondimenti
• Biopsia osteomidollare ed immunoistochimica per
la valutazione dell’infiltrazione midollare plasmacellu lare.
• Determinazioni utili per la valutazione prognostico-evolutiva: beta-2 microglobulina.
• Determinazioni utili per la diagnosi di MCRD
(monoclonal component related diseases)
m ricerca delle crioglobuline
m reuma test
m esame istologico per la ricerca di amiloide o
di depositi di catene leggere
m ricerca e tipizzazione di crioagglutinine
m
determinazione dell’immunofenotipo dei
linfociti periferici.
NOTA TECNICA: nel 1974 Bauer e coll. riportavano il caso di un soggetto affetto da macroglobulinemia
di Waldenstrom, deceduto in seguito all’infusione di
“meglumineioglicamide” somministrata come mezzo
di contrasto per una colangio-colecistografia. Studi
successivi dimostrarono che, in quel caso, la C.M.
aveva mostrato attività anticorpale nei confronti del
mezzo di contrasto e che il decesso era stato determinato dalla massiva precipitazione intravascolare di
complessi CM/mezzo di contrasto.
A seguito di quella segnalazione, per l’uso di mezzi
di contrasto iodati è richiesta una valutazione dell’assetto sieroproteico.
83
L’attuale normativa, peraltro frammentaria e confusa, indica come controindicazione all’infusione di
mezzo di contrasto iodato la presenza di “macroglobulinemia di Waldenstrom o di mieloma multiplo”. Da
alcuni anni è invalso l’uso di escludere ingiustificatamente dalla diagnostica contrastografica i soggetti che
siano portatori di C.M. anche minime e, contemporaneamente, si è fatto ricorso ad indagini di laboratorio
non del tutto idonee alle necessità sopra esplicitate.
Pur tenendo presente che oggi vengono ampiamente
utilizzati in oltre il 95% delle indagini mezzi di contrasto organoiodati non ionici, i quali non rendono più
necessaria la disidratazione del paziente; questo fa sì
che non ci sia più il rischio di un’eventuale precipitazione della proteina di Bence Jones a livello dei tubuli
renali per l’effetto concomitante del mezzo di contrasto
e della disidratazione.
Pare opportuno sottolineare che:
la presenza di C.M. non è di per sé diagnostica di m.
di Waldenstrom o di mieloma multiplo e pertanto,
sulla base della normativa citata, non costituisce controindicazione alla infusione di mezzo di contrasto; la
opportunità di sottoporre o meno un soggetto con
C.M. ad un esame contrastografico rappresenta quindi
una valutazione del rapporto tra il rischio potenziale
di una reazione avversa al mezzo di contrasto e il
beneficio di una informazione diagnostica fornita dall’esame contrastografico. Ricordiamo a tal fine che i
dati del Ministero della Sanità segnalano 40 casi di rea zioni collaterali rapportati a 1.500.000 confezioni di
mezzo di contrasto di tipo ionico.
L’esame idoneo all’evidenziazione di una C.M. è, su
indicazione della Società Italiana di Biochimica clinica
(SIBioC), l’elettroforesi sieroproteica; l’immunofissazione è utilizzabile solo per tipizzare C.M. già diagnosticate con l’elettroforesi. In caso di presenza di C.M. è
necessario richiedere un campione di urine fresco per
la ricerca delle catene leggere K o Lambda tali da
escludere un mieloma micromolecolare o una proteina
di Bence-Jones.
IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSI DELLE MALATTIE
DEL PANCREAS ESOCRINO
Paola Spadacci
Il pancreas è una ghiandola a struttura e funzione
mista (esocrina/endocrina), implicato nell’omeostasi
del metabolismo glucidico (pancreas endocrino) e nelle
funzioni digestive (pancreas esocrino). La diagnosi
delle malattie pancreatiche è particolarmente difficile a
causa della sede anatomica e delle connessioni anatomo-funzionali dell’organo.
Le più frequenti malattie del pancreas esocrino per
le quali è rilevante il contributo diagnostico delle indagini di laboratorio sono rappresentate dai processi
infiammatori acuti e cronici (pancreatiti) e dalle malattie tumorali.
Le pancreatiti
I processi infiammatori del pancreas esocrino possono presentarsi in maniera acuta (p. acute) o cronicizzata (p. croniche), nelle forme descritte nella successiva tabella.
Pancreatite acuta:
• Episodio singolo
• Ricorrente
Pancreatite cronica:
• Ricorrente
• Persistente
Pancreatite acuta. Le principali cause di pancreatite acuta sono rappresentate dall’abuso di alcool, da
malattie delle vie biliari, dall’uso di farmaci, da alterazioni metaboliche e dalle infezioni virali.
La diagnosi di laboratorio si basa essenzialmente
sulla determinazione della attività dell’alfa amilasi (α
AMY).
L’α AMY è un enzima che idrolizza i legami a 1,4
glicosidici dell’amido; è prodotto ed immagazzinato
nelle ghiandole salivari e nel pancreas, viene secreto
nel tratto digestivo ma passa in piccole quantità nel
sangue ed è escreto nelle urine.
Normalmente le concentrazioni enzimatiche nel
siero e nelle urine sono basse e relativamente costanti,
aumentando notevolmente durante alcune malattie
quali la pancreatite acuta o processi infiammatori delle
ghiandole salivari.
L’α AMY totale sierica è costituita da due isoenzimi, uno di origine pancreatica (amilasi pancreatica - P
AMY) e l’altro di origine salivare (amilasi salivare - S
AMY).
84
Nel siero di soggetti normali P-AMY rappresenta
circa il 40-50% dell’attività totale mentre S-AMY corrisponde al restante 50-60%.
Il test di laboratorio più utilizzato nella diagnosi di
pancreatite acuta è rappresentato, tuttora, dalla determinazione dell’α AMY totale nel siero che aumenta rispetto al valore basale già dopo 3-12 ore e raggiunge il picco
dopo 20-30 ore dall’esordio della sintomatologia.
Occorre tuttavia precisare che l’aumento dell’α
AMY non è specifico dal momento che può rappresentare un riscontro comune in numerose condizioni patologiche diverse dalla pancreatite acuta (malattie delle
ghiandole salivari, insufficienza renale, assunzione di
oppiacei). Inoltre, circa il 30% di pazienti che presentano dolore addominale ed aumento dell’α AMY totale
possono essere affetti da patologie diverse dalla pancreatite acuta quali ad esempio: colecistite acuta, ostruzione intestinale, infarto mesenterico, gravidanza extra
uterina.
Un notevole incremento della specificità diagnostica è rappresentato dalla dimostrazione che l’aumento
dell’α AMY sierica è sostenuto prevalentemente dall’aumento della frazione isoenzimatica pancreatica
(P-AMY).
Per tale motivo appare corretto sostituire nella diagnostica routinario per la patologia pancreatica il
dosaggio dell’α AMY totale con quello della sola
P-AMY. Nel nostro laboratorio tale scelta è stata fatta
già da qualche anno.
Dal canto opposto occorre considerare l’eventualità
che alcuni quadri di pancreatite acuta siano accompagnati da valori di AMY totale e di P-AMY in ambito
normale; questa possibilità deve essere tenuta presente
nei casi in cui non vi sia interessamento del sistema
duttale pancreatico da parte del processo infiammatorio e, per motivi non ancora evidenti, nei soggetti con
valori sierici elevati di trigliceridi; inoltre va sempre
tenuta presente la possibilità che vi sia ritardo della
determinazione dell’amilasi rispetto all’insorgenza
della sintomatologia.
In quest’ultimo caso, un supporto diagnostico è
rappresentato dalla determinazione dell’α AMY urinaria che aumenta e ritorna nella norma più tardivamente rispetto all’amilasi sierica.
Maggiore specificità (ma inferiore sensibilità)
rispetto all’α AMY totale è posseduta dalla lipasi, enzima che catalizza l’idrolisi dei trigliceridi ed acidi grassi. La determinazione della lipasi, tuttavia, non presenta alcun vantaggio diagnostico rispetto a quella della P
-AMY.
Il “problema” della macroamilasemia. Si intende per
macroamilasi un complesso molecolare formato da P-AMY o SAMY ed immunoglobuline della classe IgG o IgA. Il conseguen te aumento di dimensioni del complesso molecolare riduce note volmente l’eliminazione renale dell’amilasi, determinandone,
conseguentemente, l’accumulo nel siero. L’eventualità di una
macroamilasemia deve essere considerata tutte le volte che un
soggetto asintomatico presenta valori sierici aumentati (fino ad
otto-dieci volte) e persistenti di amilasi, associati a valori nor mali o ridotti di amilasi urinaria.
Le pancreatiti croniche. La principale causa di pancreatite cronica nelle sue diverse forme cliniche (ostruttiva, calcificante, infiammatoria) è rappresentata, nei
paesi occidentali dall’assunzione cronica di alcool; una
notevole percentuale di pancreatiti croniche (specie
ricorrenti) è associata a colelitiasi.
La pancreatite cronica è una malattia di difficile
diagnosi. La progressiva distruzione del parenchima
ghiandolare e la sua sostituzione con tessuto connettivo sclerotico sono associate a valori di α AMY e lipasi
totale nella norma e, incostantemente, da valori ridotti
di P-AMY.
La maggior parte dei test di laboratorio utilizzati
come supporto diagnostica nel caso di pancreatite cronica, sono finalizzati alla evidenziazione del grado di
“insufficienza pancreatica”. Oltre al dosaggio della chimotripsina fecale (ridotta per minor produzione da
parte del pancreas) e all’ormai obsoleta ricerca di grassi nelle feci, sono stati via proposti numerosi test funzionali, molti dei quali hanno ormai solo valore storico. Tali test sono basati sul principio dell’assorbimento
intestinale e della successiva eliminazione urinaria di
componenti a basso peso molecolare, risultanti dalla
scissione da parte degli enzimi pancreatici di sostanze
somministrate con un pasto standard (pancreolauryltest; PABA-test; test alla trioleina)
La particolare collocazione anatomica dell’organo
concorre a determinare, nella maggior parte dei casi,
un decorso asintomatico ed una diagnosi tardiva.
In tale contesto, la diagnosi strumentale per immagini (ecografia, TAC, RNM) riveste un ruolo fondamentale insostituibile, mentre la diagnosi di laboratorio risulta generalmente poco specifica e sensibile,
spesso limitata ad aumenti modesti isolati dell’AMY o,
in caso di concomitante interessamento del pancreas
endocrino, della glicemia.
Tra i c.d. marcatori tumorali, nessuno tra i molti
proposti ha evidenziato sufficienti caratteristiche di
specificità e sensibilità. Attualmente vi è un buon
accordo per utilizzare nel bilancio di base del tumore
pancreatico altrimenti diagnosticato, il CA 19.9 come
marker di prima scelta ed il CEA come seconda scelta;
gli stessi marcatori, con la medesima gerarchia sono
utilizzati nelle successive fasi di risposta al trattamento
primario, riconoscimento della progressione e monitoraggio della malattia avanzata.
La fibrosi cistica
La fibrosi cistica del pancreas o mucoviscidosi è
una grave malattia genetica caratterizzata da ostruzione polmonare con infezioni ricorrenti, da insufficienza
pancreatica con steatorrea (eliminazione fecale di grassi in quantità superiore a 7 grammi/die) e da rallentamento della crescita.
I soggetti affetti hanno due geni alterati, uno di origine paterna ed uno di origine materna; i genitori portatori sani del gene mutato hanno a priori il 25% delle
probabilità di avere un figlio affetto.
La diagnosi di fibrosi cistica è basata sulle caratteristiche cliniche, sull’eventuale storia familiare e sul test
del sudore che evidenzia un aumento della concentrazione di cloro.
Poiché l’incidenza della malattia è elevata (1/2500 –
1/3000 nati), il SSN ha elaborato un programma di
screening neonatale che comprende l’analisi della lattasi sul meconio e della tripsina immunoreattiva nel
sangue. Tale screening permette l’individuazione di
circa il 95% degli affetti.
Adeguati trattamenti farmacologico, sostitutivi e
dietetici hanno notevolmente migliorato la prognosi
della malattia e l’aspettativa di vita media, oggi superiore a 25 anni.
I tumori del pancreas
La malattia neoplastica pancreatica più frequente è
rappresentata dall’adenocarcinoma.
85
IL LABORATORIO NELLO STUDIO DELLA MALATTIA
DIABETICA
Gerardina Russo
Nel 1997 l’Expert Committee of American Diabetes
Association pubblicava su Diabetes Care nuovi criteri per
la classificazione e la diagnosi della malattia diabetica.
Tale raccomandazione è stata recepita dall'ADA,
dal National Institute of Diabetes and Digestive and
Kidney Disease, dai Center for Disease Control and
Prevention e dal Comitato Italiano per la Standardizzazione dei Metodi Ematologici di Laboratorio
(Cismel). Nel marzo 2000 è stata tenuta a Mantova una
“Consensus Conference” organizzata dalla Società Italiana di Diabetologia per esprimersi sull’adozione dei
nuovi criteri diagnostici.
Classificazione
La classificazione ADA, basata essenzialmente su
criteri etiopatogenetici è riportata in tabella 1:
Criteri diagnostici
La diagnosi di diabete è possibile in presenza di
almeno una delle seguenti condizioni che, tuttavia,
deve essere confermata in una successiva determinazione:
1. glucosio plasmatico a digiuno (FPG) ≥126 mg/dL
2. curva da carico orale (OGGT) con valori a 2 ore
≥200 mg/dL;
3. sintomatologia associata a glucosio plasmatico
casuale ≥200 mg/dL.
Conseguentemente i diversi valori di glicemia a
digiuno definiscono le seguenti categorie:
• normale glicemia a digiuno: FPG ≤110 mg/dL;
• alterata glicemia a digiuno: FPG >110 ed <126
mg/dL;
• diabete (diagnosi provvisoria): FPG ≥126 mg/dL;
la diagnosi è confermata da un secondo valore FPG
>126 mg/dL.
1. Diabete tipo 1
• Immunomediato
• Idiopatico
2. Diabete tipo 2
3. Altri tipi specifici
• Genetico
• Da malattia pancreatica
• Da endocrinopatia
• Altri
4. Diabete gestazionale
Tabella 1. Classificazione ADA della malattia
diabetica.
Le principali modifiche rispetto alla precedente
classificazione sono le seguenti:
• ridefinizione dei cut off che individuano le diverse situazioni di alterata omeostasi glicidica;
• abbandono per il diabete tipo 1 e 2 delle precedenti denominazioni insulino dipendente (IDDM) e
non insulino dipendente (NIDDM);
• la distinzione, nell’ambito del tipo 1 tra forme
immunomediate, a genesi immunologica, e forme idio patiche;
• la definizione di un nuovo stadio di alterata
omeostasi glicidica (Impaired Fasting Glucose, IFG),
ovvero alterata glicemia a digiuno;
• ridefinizione dei criteri diagnostici dopo curva da
carico.
86
I valori 2hPG (glicemia a 120’ dopo curva da carico
orale di glucosio; OGGT: 75 g di glucosio per os; prelievo basale e a 120 minuti) definiscono le seguenti
categorie:
• normale tolleranza al glucosio: 2hPG <140
mg/dL;
• ridotta tolleranza al glucosio: 2hPG ≥140; < 200
mg/dL.
• diabete (diagnosi provvisoria): 2hPG ≥200
mg/dL; la diagnosi è confermata da un secondo valore
2hPG ≥200 mg/dL.
Il controllo metabolico
Il monitoraggio del controllo metabolico della
malattia diabetica è utilizzato essenzialmente per assicurare il mantenimento di livelli glicemici sufficienti a
prevenire le complicanze della iperglicemia cronica.
Attualmente, ridimensionato il ruolo del dosaggio
del glucosio urinario, scarsamente correlato con i valo-
ri glicemici e poco sensibile, il monitoraggio del buon
controllo metabolico è affidato alla misurazione del
glucosio ematico (controllo ed autocontrollo) e delle
proteine glicate (controllo).
Glicemia
Di seguito sono riportati gli obiettivi proposti e largamente accettati (S. Lostia. Rivista di Medicina di
Laboratorio. 2000:126-28)
1. Diabete insulino trattato
a. minimi: molti valori glicemici superiori a 300
mg/dL;
b. medi: valori glicemici prima dei pasti tra 160-200
mg/dL;
c. ottimali: valori glicemici prima dei pasti tra 70120 mg/dL e dopo i pasti <180 mg/dL.
2. Diabete non insulino trattato
a. minimi: valori glicemici prima dei pasti >140
mg/dL e dopo i pasti >180mg/dL;
b. medi: valori glicemici prima dei pasti tra 110-140
mg/dL e, dopo i pasti, tra 145-180 mg/dL;
c. ottimali: valori glicemici prima dei pasti tra 80110 mg/dLe, dopo i pasti, tra 80-145 mg/dL.
Emoglobina glicata e fruttosamina
L'iperglicemia cronica determina un processo di glicosilazione non enzimatica (glicazione) dei gruppi
aminici terminali o laterali delle proteine che risultano,
pertanto, modificate nella struttura e per alcune caratteristiche chimico-fisiche rispetto alle proteine native.
Tra le diverse proteine glicate, l'emoglobina (Hb) e le
proteine sieriche (principalmente l'albumina) sono utilizzate quale parametro di controllo metabolico del
diabete, rispettivamente come Hb glicata o HbA1c e
87
come fruttosamina. L’emoglobina glicata e la fruttosamina sono utilizzate nella pratica clinica per monitorare l'aderenza del paziente al programma terapeutico e
per confermare e completare le informazioni derivanti
dal controllo glicemico. Le informazioni fornite dalle
due determinazioni (fruttosamina e HbA1c) non sono
del tutto sovrapponibili e riflettono l'andamento retrospettivo del controllo glicemico di differenti intervalli
di tempo (fruttosamina 2-3 settimane; emoglobina glicata 6-8 settimane).
Attualmente il gold standard per la valutazione del
compenso glicemico cronico è rappresentato dalla
emoglobina glicata, essendo il dosaggio della fruttosamina praticamente abbandonato.
Altri parametri utili
• Acido lattico: il dosaggio dell'acido lattico fornisce informazioni sulla efficienza della glicolisi aerobia.
Oltre che nella diagnosi di gravi stati di scompenso
metabolico, il dosaggio dell'acido lattico è utilizzato
anche nel monitoraggio della terapia con fenformina il
cui sovradosaggio può portare ad un quadro di acidosi
lattica.
• Microalbuminuria. Le complicanze croniche della
malattia diabetica sono essenzialmente di tipo renale;
macrovascolare, neurologico ed oculare. La diagnostica di laboratorio non risulta attualmente di grande
ausilio nel predire direttamente l'evoluzione della
malattia verso una delle diverse forme cliniche espressione di complicanza cronica. Una eccezione è rappresentata dalla microalbuminuria la cui evidenziazione
precoce è predittiva nei confronti della evoluzione
verso la nefropatia diabetica.
TURN OVER OSSEO E METABOLISMO FOSFO CALCICO
Nicola Mazzuca*, Cosimo Solimeo
U.O. Medicina Nucleare – Grosseto*
U.O. Medicina Nucleare - Livorno
Lo scheletro rappresenta la più importante riserva
di calcio, magnesio, fosforo, sodio e altri ioni necessari
al mantenimento delle funzioni omeostatiche dell'organismo.
L'osso è un tessuto dinamico, in continuo rinnovamento: ogni anno dal 3 al 10% della struttura ossea
viene riassorbita e riformata (omeostasi scheletrica)
per mantenere elasticità e resistenza, indispensabili per
le sue funzioni meccaniche di protezione, sostegno e
movimento. Inoltre, l'osso, riserva quasi esclusiva del
calcio corporeo (99%) ed importante deposito soprattutto del fosforo (85%) e del magnesio (65%), partecipa
all'omeostasi minerale sistemica fornendo minerali
ossei all'organismo in risposta a stimoli sistemici. In
alcuni casi (ad esempio, morbo di Paget) possono esistere grossolane alterazioni dell'omeostasi scheletrica
che non influenzano l'omeostasi minerale sistemica; in
altre circostanze (per esempio, osteomalacia) sia l'omeostasi scheletrica sia quella minerale sistemica sono
profondamente alterate in modo interdipendente.
Le proprietà dell'osso dipendono dalle sue componenti extracellulari, minerale ed organica, tra loro in
stretta associazione.
La matrice organica costituisce circa il 30% dell'osso
stesso. La matrice è costituita per il 90-95% da collagene di tipo I e per la restante porzione da proteine plasmatiche (albumina e glicoproteine), da proteine “di
legame” (trombospondina, fibronectina, sialoproteine,
osteopontina), dall'osteocalcina, dall’osteonectina, e
altre proteine meno caratterizzate. Alcune di queste
proteine possono iniziare la mineralizzazione ed attuare un legame tra la componente minerale e la matrice.
La componente minerale (70% dell'osso) è costituita
da calcio e fosfato e può essere paragonata ad una
idrossiapatite poco cristallizzata. Viene depositata in
stretto rapporto con le fibrille collagene e principalmente in siti particolari, cioè negli spazi vuoti che si
creano nelle fibrille collagene al momento dell'aggregazione molecolare ed è probabile che la formazione e
la disposizione della fase inorganica siano determinate
in parte dalla matrice organica.
L'osso dunque, grazie a questa particolare struttura
architettonica a due componenti, minerale ed organica,
91
diviene adatto a sostenere gli stress meccanici.
Lo scheletro adulto è formato da due tipi di osso:
corticale o compatto e trabecolare o spugnoso. Il primo
è sul lato esterno dell'osso, mentre il secondo è interno
a ridosso del midollo osseo. L'80% delle ossa del
nostro scheletro sono di tipo corticale, il 20% sono di
tipo trabecolare.
Le vertebre sono costituite per lo più da osso trabecolare; nelle ossa lunghe le diafisi sono osso corticale,
le epifisi sono osso trabecolare. Le ossa piatte sono per
lo più osso corticale. Tra i due tipi di osso varia l'attività metabolica:
• 25% di osso trabecolare è sottoposto a turnover in
un anno.
• 2-3% di osso corticale è sottoposto a turnover in
un anno.
Il rimodellamento osseo è un processo mediante il
quale l'osso vecchio (corticale o trabecolare) viene eliminato e successivamente sostituito da osso nuovo.
Esso si verifica in punti separati sulla superficie ossea,
denominati "unità di rimodellamento osseo" o BMU
(basic multicellular units) che sono unità funzionalmente autonome in cui uno stimolo attiva le cellule
(osteoclasti) addette al riassorbimento della matrice
organica e minerale, determinando l'eliminazione di
un "quanto" di osso mineralizzato; questo processo
richiede pochi giorni. Successivamente intervengono
gli osteoblasti che indurranno, in un periodo di tempo
di alcune settimane, neoformazione e deposizione di
matrice ossea mineralizzata all'interno della cavità
creatasi. La quota di tessuto osseo riassorbito viene
rimpiazzata da un'equivalente quota di tessuto osseo
neoformato, con le varie BMU in fasi funzionali diverse tra loro.
Il rimodellamento osseo è controllato da fattori
sistemici ormonali e metabolici mediati da fattori locali
(tabella 1), prodotti nel microambiente delle BMU, tra
cui spiccano le citochine, le prostaglandine ed i “fattori
di crescita” che agiscono come messaggeri finali della
regolazione del metabolismo osseo e del rinnovamento
dello scheletro.
Citochine che regolano l'osteoclastogenesi
Fattori locali che stimolano l'osteoblastogenesi e/o
e l'attività osteoclastica
la funzione osteoblastica
Interleuchine (IL): IL-1, IL-6, IL-11
Insulin-like Growth Factor I e II (IGF I-II)
Tumor Necrosis Factor (TNF)
Transforming Growth Factor (TGF)
Colony Stimulating Factor (CSF)
Fibroblast Growth Factor acid and basic (FGF)
Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
Interleuchina 4 (IL-4)
Interferone (IFN)
Altri:
Osteo-Inductive Factor (OIF)
Bone Morphogenetic Protein (BMP)
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)
Tab.ella 1. Citochine e fattori locali nel rimodellamento osseo.
I fattori sistemici (tabella 2) regolanti il rimodellamento osseo sono ben conosciuti e rappresentati
soprattutto dal paratormone (PTH), dalla vitamina D3
e dagli ormoni sessuali (estrogeni ed androgeni), con
notevoli influenze anche da parte degli ormoni tiroidei, glucocorticoide e della crescita (GH), dell’insulina
zione, con distruzione della microarchitettura e perdita
finale di massa ossea tale da ridurre significativamente
la resistenza meccanica e predisporre lo scheletro
all’insorgenza delle fratture.
In base alle cause si riconoscono delle forme primitive, distinte in postmenopausale e senile, e forme
Fattore sistemico
Modalità di azione
PTH
Stimola il riassorbimento osseo tramite attivazione degli osteoclasti. Agisce
tramite produzione di fattori locali da parte degli osteoblasti
Calcitonina
Inibisce il riassorbimento osseo tramite azione diretta sugli osteoclasti
AMPc mediata
Vitamina D
E’ un potente stimolatore del riassorbimento osseo con azione PTH mediata
Insulina
Stimola gli osteoblasti tramite l'IGF-1
GH
Ha azione mediata dall'IGF-1 e azione diretta sulla proliferazione osteoblastica
Glucocorticoidi
Stimolano il riassorbimento osseo con meccanismo indiretto tramite riduzione
dell'assorbimento del calcio. Dopo terapie prolungate producono inibizione della
replicazione degli osteoblasti, mentre per dosaggi a breve termine producono
sintesi di matrice collagene
Ormoni tiroidei
Stimolano la crescita ossea in associazione con l'IGF-1. Possono indurre
stimolazione del riassorbimento osseo
Steroidi sessuali
Gli estrogeni diminuiscono il riassorbimento osseo tramite produzione di
sostanze prodotte dagli osteoblasti, mentre gli androgeni hanno funzione
anabolizzante
Tabella 2. Regolazione ormonale del rimodellamento osseo.
e della calcitonina. Tutti questi fattori (locali e sistemici) concorrono nel determinare una normale omeostasi
scheletrica; infatti, quando all’interno delle BMU si
determina una dissociazione tra riassorbimento e riapposizione di tessuto osseo si instaurano fenomeni
patologici. Tra questi, quello più diffuso è l’osteoporosi: malattia metabolica dello scheletro caratterizzata da
un prevalente riassorbimento rispetto alla neoforma-
92
secondarie. La forma primitiva postmenopausale è
caratterizzata da un aumento delle BMU attive con
iperattività osteoclastica (tramite produzione di fattori
locali da parte degli osteoblasti), non compensata da
una corrispondente attività di neoformazione ossea.
La forma senile è caratterizzata, invece, da una
ridotta attività osteoblastica con prevalenza dei fenomeni di riassorbimento osseo.
strumentali. In presenza di un significativo
sospetto clinico, la diagnosi di osteoporosi
ENDOCRINO-METABOLICHE
si basa prevalentemente su tecniche strumentali mirate alla stima della massa ossea.
REUMATOLOGICHE
Tra le varie metodiche disponibili, alcune
EMATOLOGICHE
come le tecniche densitometriche ossee ad
NEOPLASTICHE
US richiedono ancora una convalida; altre,
come
l’attivazione neutronica e la RM, sono
GASTROINTESTINALI
ancora confinate alla ricerca.
RENALI
La tecnica attualmente ritenuta più affidabiFARMACOLOGICHE (corticosteroidi, ormoni tiroidei, anticonvulsi- le è la densitometria ossea computerizzata
vanti, antiacidi, eparina, ciclosporina, chemioterapici, diuretici del- con tecnica DEXA, che presenta la migliore
accuratezza diagnostica e precisione e la più
l'ansa)
bassa irradiazione del paziente. La densità
ossea (tabella 5) è espressa come distanza in
Tabella 3. Osteoporosi secondarie.
deviazione standard (S.D.) rispetto ai controlli normali della
stessa età (Z-score)
e rispetto ai controlESAMI
PATOLOGIA
li giovani con picco
di
massa ossea (TEmocromo
Malattie emo-linfo-proliferative
score).
Proteine seriche totali, Albuminemia,
Mieloma, Malattie reumatiche
Un valore di TElettroforesi sieroproteica, VES
score <-2,5 S.D.,
secondo le indicaFosfatasi alcalina totale, Calcemia,
Osteomalacia, Iperparatiroidismo, Malattia epatica,
zioni
dell’OMS,
Fosforemia, PTH, Vitamina D,
Assunzione di anticomiziali, Insufficienza renale
depone
per
la preTransaminasi, gammaGT, Creatinina
cronica
senza di osteoporoCortisolo – ACTH
Sindrome di Cushing e valutazione effetti terapia
si, mentre valori
cortisonica
compresi tra -1,0 e 2,5 S.D., individuaTSH-fT3-fT4
Ipertiroidismo e valutazione terapia con ormoni
no
una situazione
tiroidei
di rischio osteopoFSH – LH – PRL– E2 – Pg - T
Insufficienza gonadica
rotico (“osteopenia”) da monitorare
nel tempo.
Tabella 4. Diagnosi differenziale.
La misura della
densità ossea viene
Le numerose forme secondarie, riportate nella
tabella 3, vanno sempre ricercate in presenza di osteo- eseguita in corrispondenza del rachide lombare per lo
studio dell’osteoporosi post-menopausale (maggiore
porosi.
E’, infatti, di fondamentale importanza la diagnosi contenuto di osso trabecolare), del rachide e della testa
differenziale tra osteoporosi primitiva e secondaria femorale nelle pazienti oltre i 60 anni per lo studio del(tabella 4) prima di qualsiasi terapia, poiché in caso di l’osteoporosi senile e su tutto il corpo (total-body) per
forma secondaria il trattamento sarà inefficace se lo studio dell’osso corticale e dell’osteoporosi localizprima non viene risolta la patologia alla base del rias- zata.
La densitometria ossea, oltre a fornire la diagnosi di
sorbimento osseo.
L’osteoporosi è una patologia diffusa, considerata osteoporosi ed una stima del rischio di frattura, perdall’OMS la 2a malattia sociale dell’età senile, con mette di monitorare la densità minerale ossea, consennotevole incidenza in Italia (tra le più alte d’Europa tendo, con misure ripetute nel tempo, sia una valutasecondo lo studio MEDOS che stima una frequenza zione dell’eventuale progressiva perdita ossea che il
pari a 251 casi/100.000 nelle donne e 71,5 casi/100.000 controllo dell’efficacia della terapia in pazienti già in
negli uomini) e che, se non riconosciuta e trattata, trattamento. Il suo valore inoltre aumenta ancor più
risulta invalidante per gli esiti in fratture ossee (verte- qualora la valutazione clinica indichi la presenza di
brali, femorali e del polso), con notevoli costi umani ed fattori di rischio aggiuntivi, quali l’età, la familiarità,
economici per ospedalizzazione, immobilità e morta- menopausa precoce, immobilizzazione protratta, e
lità, che peraltro aumentano progressivamente con qualsiasi condizione clinica potenzialmente osteopel’età. E’ proprio per questo motivo che appare oppor- nizzante.
La corretta gestione del paziente affetto da osteopotuno attuare una corretta prevenzione della patologia,
supportata da tecniche diagnostiche laboratoristiche e rosi, oltre che dell’indispensabile dato densitometrico,
GENETICHE (osteogenesi imperfecta)
Nel primo approccio diagnostico, oltre agli esami
necessari per la diagnosi differenziale tra forme primiNormalità
T-score: > -1 S. D.
tive e secondarie di osteoporosi (tabella 4), particolare
Osteopenia
T-score: compreso tra -1 S. D. e -2,5 S. D.
importanza rivestono il dosaggio ematico dell’isoenzima osseo della fosfatasi alcalina (ostase), dell’osteocalOsteoporosi
T-score: < -2,5 S. D.
cina, dei cross-links piridinolinici e dei telopeptidi (N)
- e (C) – terminali del collagene tipo I.
Tabella 5. Diagnosi densitometrica di Osteoporosi.
L’utilità dei markers di rimodellamento osseo nell’osteoporosi (integrata con gli esami relativi al metanecessita anche di una valutazione integrata con i dati bolismo fosfocalcico) è notevole sia per la previsione
di laboratorio relativi sia ai parametri per la diagnosi della perdita di osso (soggetti con elevato turn over,
differenziale delle forme secondarie sia al metabolismo più a rischio, definiti anche “fast looser”) e per la stima
fosfocalcico ed agli indici di turn over osseo.
del rischio di fratture, sia per il follow-up terapeutico
Tali indici comprendono due tipi di sostanze: atti- (la loro normalizzazione in 3-4 mesi di terapia indica
vità enzimatiche delle cellule impegnate nel metaboli- l’efficacia del trattamento).
smo osseo e componenti della matrice organica dell’osInfine, è importante ribadire la necessità di escludeso. Essi sono tradizionalmente suddivisi in markers di re un’osteoporosi secondaria ogni volta che l’anamnesi
neoformazione o di riassorbimento in base al loro rap- e l’esame clinico fanno sospettare una patologia con
porto con le due attività del processo di rimodellamen- possibile impatto con il bilancio minerale osseo, opputo (tabella 6).
re quando un’osteoporosi si manifesta in modo inatteso, ad esempio
nel sesso maFormazione
Riassorbimento
schile, in paziente di giovaFosfatasi alcalina totale
Fosfatasi acida tartrato-resistente
ne età, in una
Fosfatasi alcalina ossea
Idrossiprolina
forma particolarmente agOsteocalcina (BGP)
Galattosil-idrossilisina
gressiva o rapiPropeptide C-terminale del procollageno I (PICP)
Piridinolina e desossi-piridinolina(Pyr, d-Pyr)
damente ingravescente.
Telopeptidi N- e C-terminali del collagene
E’, infatti, indi(Ntx, Ctx)
spensabile che i
pazienti siano
Tabella 6. Markers biochimici di turnover osseo.
inquadrati nell’ambito della
Questi due processi sono intimamente connessi, per diagnostica differenziale prima della scelta del trattacui entrambi i gruppi di marcatori aumentano quando mento terapeutico, solitamente con bisfosfonati o calil rimodellamento avviene ad un ritmo accelerato (ele- cio-vitamina D (O. involutiva senile), estroprogestinici
vato turn over). I loro livelli esprimono, quindi, il (O. postmenopausale), mentre sarà invece rivolta all’egrado di turn over dell’osso, mentre non sono suffi- liminazione della causa etiopatogenetica nel caso di
cientemente precisi da permettere di evidenziare un osteoporosi secondarie, che necessitano di specifici
eventuale cronico disaccoppiamento dei due processi.
accertamenti clinico-strumentali (tabella 7).
Markers bioumorali
Tecniche strumentali
Scintigrafia ed Ecografia paratiroidea
Scintigrafia Ossea
Ipertiroidismo
PTH – osteocalcina
– Cross-links - Isoenzima osseo
Fosfatasi Alcalina – Vitamina D
TSH – fT3
Sindrome di Cushing
Cortisolo – ACTH – test di soppressione
Scintigrafia Surrenalica
Ipogonadismo
FSH – LH – PRL – E2 - Pg -T – test di stimolo
Iperparatiroidismo
Scintigrafia ed Ecografia tiroidea
Tabella 7. Diagnostica di laboratorio e strumentale nelle patologie endocrino-metaboliche.
94
DIAGNOSTICA DELL’IPERTENSIONE ARTERIOSA - IL
SISTEMA RENINA/ANGIOTENSINA
Nicola Mumoli*, Maria Bombara
*U.O. Medicina d’Urgenza
L’ipertensione arteriosa rappresenta probabilmente il
più importante problema di sanità pubblica nei Paesi
industrializzati: è frequente, non determina sintomi, è
di facile diagnosi, viene di solito controllata con semplici interventi terapeutici ma, se trascurata, provoca
spesso complicazioni mortali.
L'elevata prevalenza dell'ipertensione e la sua rilevanza come fattore di rischio sono stati tra i motivi più
importanti che hanno stimolato l'elaborazione delle
cosiddette linee guida diagnostico-terapeutiche a partire dalla metà degli anni '70. Esse sono state periodicamente aggiornate in relazione al progresso delle
conoscenze fisiopatologiche e farmacologiche; tra le
più recenti faremo riferimento a quell pubblicate a
cura della World Health Organization/International
Society of Hypertension WHO/ISH nel 1999.
In sintesi le novità contenute nelle linee guida
riguardano la stratificazione del rischio cardiovascolare globale nell'iperteso, gli obiettivi pressori da raggiungere e l'approccio farmacologico.
In accordo con queste linee, la valutazione clinica e
di laboratorio del paziente dovrebbe perseguire quattro obiettivi principali:
• confermare un aumento cronico di pressione arteriosa (PA) e determinarne il livello;
• escludere o identificare cause secondarie di ipertensione;
• determinare la presenza e quantificare l'entità del
danno a carico dell'organo bersaglio;
• ricercare la presenza concomitante di altri fattori di
rischio cardiovascolari e di condizioni cliniche che
possano influenzare la prognosi ed il trattamento dell'ipertensione.
A causa della rarità dell'ipertensione secondaria, del
costo e dei rischi elevati delle indagini diagnostiche
elaborate, gli esami da effettuare di routine prima di
intraprendere un trattamento antiipertensivo dovrebbero essere limitati a definire la severità dell'ipertensione, a identificare le complicanze di tale patologia ed
i fattori di rischio cardiovascolari associati.
L'ipertensione secondaria è infatti presente in meno
del 5% della popolazione adulta ipertesa; data comunque la sua elevata curabilità, la valutazione diagnostica è giustificata in alcuni pazienti selezionati.
Tale popolazione di pazienti è rappresentata da:
• soggetti in cui l'anamnesi, l'esame obiettivo o gli
esami di laboratorio di routine suggeriscono una specifica causa secondaria;
• pazienti di età inferiore ai 30 anni, data la maggiore prevalenza di ipertensione secondaria correggibile;
• soggetti in cui la terapia farmacologica è inadeguata o non soddisfacente;
• pazienti con peggioramento improvviso della PA;
• soggetti anziani che presentano improvvisamente
valori elevati di PA.
E' dunque giustificato procedere all'approfondimento diagnostico solo a patto che sia ipotizzabile un successivo intervento terapeutico mirato, come conseguenza dell'analisi eziologica.
L'elenco delle cause di ipertensione è piuttosto
lungo; tuttavia, la causa di oltre il 95% dei casi di ipertensione resta sconosciuta (primitiva essenziale). Tra le
condizioni morbose che conducono ad una ipertensione secondaria le più frequenti sono:
1. patologie parenchimali renali;
2. stenosi dell'arteria renale;
3. iperaldosteronismo primitivo;
4. sindrome di Cushing;
5. feocromocitoma;
6. coartazione aortica;
7. alcol, astinenza da alcol, nicotina, farmaci;
8. gravidanza.
L'iter diagnostico di minima per un follow up degli
ipertesi essenziali si limita a dati di laboratorio che
includono un esame emocromocitometrico, delle
urine, la microalbuminuria, la glicemia, la creatininemia, l’azotemia, gli elettroliti sierici, il profilo lipidico,
l'esame del fundus e l'ECG. Possono servire inoltre
una ecografia renale, un ecocolordoppler dei vasi
epiaortici e dell’aorta addominale e un ecocardiogramma.
Se, sulla scorta della anamnesi, dell’esame obiettivo e
degli esami sopraddetti si sospetta una causa secondaria di ipertensione si dovrebbero attuare procedure
aggiuntive ed ogni altro esame utile a confermare la
diagnosi:
1. per le nefropatie parenchimali sarà opportuno
effettuare una ecografia renale e, in casi particolari, una
urografia discendente ed una biopsia renale.
2. per l'ipertensione nefrovascolare andranno esegui-
95
te un ecocolordoppler delle arterie renali, una scintigrafia renale con captopril, il dosaggio di renina distinto, eseguendo prelievo ematico direttamente dalle due
vene renali, e l’ arteriografia renale selettiva.
3. per l'iperaldosteronismo primitivo importante sarà
la valutazione della kaliemia, l'esame delle urine, la
magnesiemia e l'emogasanalisi; successivamente il
dosaggio della renina plasmatica in clino ed in ortostatismo ed il dosaggio dell'aldosterone plasmatico (l'ingestione di elevate quantità di liquirizia dà luogo ad
alterazioni degli elettroliti del tutto simili a quelle dell'iperaldosteronismo primitivo); infine l'ecografia
addominale, la TAC e/o l'arteriografia selettiva.
4. per il Cushing verranno effettuati il dosaggio della
cortisolemia del mattino dopo soppressione con 1 mg
di desametasone assunto alle ore 24 e la determinazione del cortisolo libero urinario; per la diagnosi eziologica sarà opportuno il dosaggio di ACTH basale e
dopo stimolo con CRH e/o soppressione con desametasone ad alte dosi; inoltre l'effettuazione della scintigrafia radioisotopica, la TAC e/o la RMN.
5. per il feocromocitoma verrà dosato l'acido vanilmandelico (principale catabolita urinario delle catecolamine) nelle urine delle 24 ore raccolte dopo una crisi
ipertensiva. Meno frequentemente può essere utile
anche il dosaggio delle catecolamine urinarie e plasmatiche; anche in questo caso saranno eseguiti esami
strumentali come l'ecografia, la TAC e/o la RMN
seguita da una scintigrafia surrenalica e da una arteriografia selettiva.
6. per la coartazione aortica è fondamentale la valutazione della PA agli arti inferiori e l'aortografia.
Per le altre situazioni cliniche che determinano ipertensione secondaria sarà importante una attenta valutazione anamnestica ed esami di laboratorio mirati.
Concludendo, la ricerca di cause secondarie dovrà
essere tanto più aggressiva quanto più giovane è il
paziente e quanto più elevati sono i valori pressori.
Nei soggetti di mezza età o anziani, invece una maggiore attenzione andrà dedicata al profilo di rischio car-
diovascolare, dal momento che queste categorie sono
più suscettibili a gravi complicanze acute qualora non
vengano messe in atto le dovute misure preventive.
Il sistema renina-angiotensina-aldosterone
Il sistema renina-angiotensina-aldosterone rappresenta un sistema ormonale “a cascata” in grado di
modulare la pressione arteriosa con vari meccanismi.
Una riduzione del volume o della pressione sanguigna
induce il rilascio di renina da parte del rene, questa
determina la conversione dell’angiotensinogeno in
angiotensina I, un polipeptide di per sé privo di azione
biologica. L’angiotensina I è il substrato su cui agisce
l’enzima di conversione (ACE) che determina la produzione di angiotensina II biologicamente attiva. L’angiotensina II, oltre ad avere un’azione di vasocostrizione, regola la sintesi e la secrezione di aldosterone dal
surrene, e questo promuove il riassorbimento di sodio
e l’escrezione di potassio a livello dei tubuli renali
distali, innalzando in tal modo il volume ematico e la
pressione sanguigna.
Dal punto di vista analitico la misurazione dell’attività di questo sistema è possibile mediante la valutazione dell’attività reninica plasmatica (misurazione
dell’angiotensina I generata dalla renina in condizioni
standardizzate) oppure mediante la determinazione
diretta della renina attiva (test attualmente in uso nel
nostro laboratorio).
Il dosaggio dell’aldosterone completa lo studio del
sistema permettendo, unitamente a quello della renina,
la distinzione tra diverse patologie ipertensive.
Sia per la renina che per l’aldosterone è importante
valutare la presenza della variazione fisiologica col
cambiamento di postura (i livelli di entrambi si riducono nel passaggio dalla posizione eretta a quella supina
e, viceversa, aumentano con l’assunzione della posizione eretta).
Riportiamo alcuni esempi di orientamenti diagnostici
derivanti dal dosaggio di renina (R) e aldosterone (A).
R e A elevati
R e A soppressi
R elevata A diminuito
R diminuita Aelevato
• Ipertensione arteriosa
• Ipertensione arteriosa
• Trattamento con
• Iperaldosteronismo
renovascolare (stenosi
da trattamento
ACE-inibitori
da adenoma (Morbo di Conn)
arteria renale)
prolungato con farmaci
• Trattamento con
• Iperplasia surrenale
[iperaldosteronismo
e/o sostanze
secondario]
ad azione ipertensiva
++
Ca
antagonisti
Tratta e modificata da: F. Corso, Manuale di Patologia Clinica, Milano 1993.
96
[iperaldosteronismo primario]
TIROIDE: USO RAZIONALE DEI PARAMETRI DI
LABORATORIO
Carlo Falciani
La diagnostica di laboratorio delle tireopatie ha
compiuto enormi progressi con l’avvento dei metodi
immunometrici che hanno migliorato in maniera
significativa la specificità e la sensibilità dei dosaggi
ormonali, in particolare degli ormoni tiroidei.
La
disponibilità di test ultrasensibili per il dosaggio del
TSH (Thyroid Stimulating Hormone), con sensibilità
funzionale da 0,01 a 0,02 mIU/mL, e l’accuratezza raggiunta dai metodi basati sull’analogo marcato per la
determinazione dell’fT3 (Triiodotironina libera) e dell’fT4 (Tiroxina libera), confrontabili con quelli di riferimento che utilizzano la dialisi all’equilibrio, consentono una più mirata valutazione della funzionalità tiroidea ed un più efficace inquadramento nosografico
delle molteplici patologie correlate. Valori basali di
TSH ottenuti con kit ultrasensibili garantiscono, ad
esempio, la stessa accuratezza diagnostica della risposta al TRH (Thyrotropin Realising Hormone) nella diagnosi di ipotiroidismo primario o subclinico consentendo, nel contempo, un risparmio economico non
indifferente.
La tiroide produce ed immette giornalmente nel
torrente circolatorio 80/100 mg di tiroxina e modeste
quantità di triiodotironina, derivate dalla organificazione dello iodio proveniente prevalentemente dalla
dieta. Mentre la tiroxina è sintetizzata totalmente dalla
tiroide, la triiodotironina deriva per l’80% dalla conversione periferica (desiodazione) del 30-40% della
tiroxina a livello principalmente epatico e renale. L’ormone tiroideo metabolicamente attivo è la triiodotironina, con una potenza biologica 8/10 volte superiore a
quella della tiroxina.
Gli ormoni tiroidei circolanti sono legati in gran
parte a proteine di trasporto come la TBG (Thyroxin
Binding Globulin), la TBPA (Thyroxin Binding Prealbumin) o Transtiretina, e l’Albumina, con funzioni di
riserva e deposito, in costante equilibrio con piccole
quantità di ormoni liberi (fT4 0,05% della TT4, fT3
0,50% della TT3); sono tuttavia questi ultimi che legandosi a recettori nucleari delle cellule dei tessuti periferici esplicano l’attività metabolica (termogenetica, iperglicemizzante, lipolitica e stimolante la sintesi proteica), caratterizzata da molteplicità ed ubiquitarietà di
effetto (effetto pleiotropico).
La funzionalità della tiroide è controllata dall'ormo-
97
ne tireotropo o TSH, ormone ipofisario a sua volta regolato in senso stimolatorio dal TRH di origine ipotalamica.
La fisiologia dell’asse ipotalamo-ipofisi-tiroide
costituisce un meccanismo di feed-back di tipo negativo, dove gli ormoni tiroidei controllano in senso inibitorio sia il TSH ipofisario (feed-back lungo), sia il TRH
ipotalamico (feed-back lunghissimo), determinando il
rilascio di somatostatina che inibisce la sintesi di TSH.
Per ipotiroidismo si intende una sindrome clinica,
determinata da ipofunzione della tiroide conseguente
o ad un danno primitivo della ghiandola o, meno frequentemente, ad una ridotta o assente stimolazione da
parte del TSH e/o del TRH o, molto più raramente, ad
una resistenza periferica agli ormoni tiroidei (sindrome di Rafetoff) e caratterizzata da un generale rallentamento dei processi metabolici dell’organismo.
L’approccio diagnostico fondamentale in questo
tipo di patologia tiroidea è la distinzione tra ipotiroidismo primario o primitivo, dovuto ad alterazione del
parenchima tiroideo, che può essere congenito od
acquisito, ed ipotiroidismo centrale, determinato da
danno ipofisario e/o ipotalamico; si può considerare
obsoleta la suddivisione dell’ipotiroidismo centrale in
secondario e terziario, in quanto nella maggioranza dei
casi sono compromesse entrambe le strutture.
Le forme di ipotiroidismo primario acquisito possono avere origine infiammatoria (mixedema idiopatico o morbo di Gull, tiroidite cronica linfocitaria di
Hashimoto, tiroidite di Riedel), oppure iatrogena (farmaci antitiroidei od altri, come litio ed amiodarone) o
da ridotta funzionalità tiroidea.
L’inquadramento corretto della patologia consente
strategie terapeutiche completamente differenti.
Per tireotossicosi si intende la sindrome clinica presente quando i tessuti sono esposti ad alti livelli circolanti di ormoni tiroidei; l’ipertiroidismo è la causa più
frequente di tireotossicosi ed è caratterizzato da eccesso di ormoni tiroidei dovuto ad iperfunzione ghiandolare.
Il morbo di Graves-Basedow o gozzo diffuso tossico, rappresenta la forma più frequente di ipertiroidismo e riconosce una patogenesi autoimmune per la
presenza in circolo di anticorpi stimolanti diretti contro il recettore del TSH (TRAB) nell’80-100% dei casi,
di anticorpi anti-perossidasi tiroidea (AbTPO) nel 6080% dei casi e di anticorpi anti-tireoglobulina (AbTg)
nel 30-60% dei casi.
Altre cause di tireotossicosi possono essere il gozzo
multinodulare tossico o sindrome di Marine-Lenhart,
l’adenoma tiroideo tossico o morbo di Plummer, la sindrome da inappropriata secrezione di TSH, la tiroidite
autoimmune in fase di ipertiroidismo (Hashitoxicosis),
la tiroidite subacuta e tiroidite silente o painless thyroiditis in fase transitoria di tireotossicosi e la tireotossicosi factitia.
La problematica dell’ipotiroidismo (come quella
dell’ipertiroidismo) subclinico, caratterizzato da assenza di sintomatologia ma elevata probabilità di evoluzione in ipo(o iper)tiroidismo conclamato, è determinata dalla relazione log/lineare tra TSH e fT4, per cui
dimezzando l’fT4 il TSH non raddoppia ma aumenta
di alcune decine di volte; di rilevante importanza è
anche l’esistenza di un set-point individuale al quale (e
non al superamento dei limiti di normalità o di riferimento) scatta il feed-back tra i due ormoni secondo la
relazione sopra citata: con questo meccanismo si spiega perché con valori di fT4 ancora nella norma il TSH
ha già superato, seppur di poco, il limite superiore (od
inferiore nel caso dell’ipertiroidismo subclinico).
La prevalenza della patologia tiroidea si attesta su
percentuali significative, paragonabili a quelle di
malattie diffuse come ad esempio il diabete mellito;
sino al 25-30% delle donne, infatti, presenta lesioni
nodulari all’indagine ecografica della tiroide e circa il
10% della popolazione presenta alterazioni dei livelli
dell’ormone tireostimolante.
Riteniamo opportuno proporre delle Linee Guida
che consentano di intraprendere un iter diagnostico
gnostico logico ed economicamente conveniente.
Secondo Dans “le linee guida costituiscono una
sorta di work in progress curato da esperti che propongono uno strumento di lavoro per i colleghi: esse non
costituiscono documenti definitivi ma tappe provvisorie, da aggiornare periodicamente seguendo la rapida
evoluzione della tecnologia diagnostica e della pratica
clinica”.
Va comunque sottolineato che:
• lo studio biochimico della funzionalità tiroidea
non deve essere utilizzato come screening nella popolazione generale. Lo screening va limitato ai neonati, a
soggetti a rischio aumentato (familiarità), donne anziane, donne nelle 4-8 settimane dopo il parto, pazienti
affetti da malattie autoimmuni e pazienti affetti da diabete mellito di tipo 1.
• il sospetto di tiroidite autoimmune può essere
confermato dal dosaggio degli anticorpi anti-perossidasi tiroidea, più sensibili e specifici degli anticorpi
anti-tireoglobulina;
• solo le frazioni libere (fT3 ed fT4) possiedono
attività biologica; il dosaggio degli ormoni totali (TT3 e
TT4) è ridondante e spesso inattendibile, in quanto
risente di variazioni anche piccole delle proteine di tra-
98
sporto (gravidanza, epatite, terapia con estrogeni, farmaci iodati).
I più importanti consigli/raccomandazioni contenuti nel documento sulle “Linee guida per la diagnosi
ed il monitoraggio delle malattie della tiroide”, elaborato dalla National Academy of Clinical Biochemistry
(NACB) e pubblicato nel dicembre 1996, sono:
A. Ipotiroidismo
• Diagnosi:
m determinare il solo TSH come test iniziale;
m non determinare fT3 ed fT4 come prima tappa
nella diagnosi;
m determinare fT4, ma non fT3, nella diagnosi di
insufficienza tiroidea primitiva;
m non determinare routinariamente gli anticorpi
antitiroidei.
• monitoraggio della terapia:
m determinare il TSH durante la prima fase del
trattamento dell’ipotiroidismo primitivo, ma non l’fT4,
tranne i casi nei quali si sospetta la non compliance del
paziente;
m determinare, nel monitoraggio della terapia
sostitutiva, il TSH 1-3 volte l’anno.
B. Ipertiroidismo
• Diagnosi:
m determinare, con metodo preciso e sensibile, il
solo TSH come dosaggio di prima scelta (sensibilità
funzionale da 0,01 a 0,02 _IU/mL);
m determinare fT4 solamente in pazienti con
TSH < 0,1 IU/mL;
m determinare fT3 solamente nei casi in cui, in
presenza di sintomatologia compatibile con ipertiroidismo e TSH < 0,1 IU/mL, l’fT4 risulti nei limiti della
norma.
• Monitoraggio della terapia:
m determinare fT4 ad intervalli di alcune settimane dopo l’inizio della terapia, fino ad attenuazione
della sintomatologia e rientro dei valori di fT4 nel
range di normalità;
m determinare il TSH solamente nei casi in cui
l’fT4 scenda sotto i limiti di riferimento, la tiroide si
ingrandisca o compaiano sintomi di ipotiroidismo;
m Determinare TSH ed fT4 una o due volte l’anno dopo il completamento della terapia.
Questo protocollo non esclude l’opportunità di altri
dosaggi nei casi in cui il solo TSH appaia inadeguato
ad inquadrare il paziente come eutiroideo; d’altra
parte la predisposizione, anche su apparecchi automatici per immunometria, di protocolli di reflex testing,
consente di eseguire dosaggi addizionali sulla base dei
valori di TSH ottenuti.
In considerazione però delle difficoltà che nella
pratica medica corrente si possono incontrare nell’inquadramento corretto delle molteplici patologie tiroidee basandosi su un unico test iniziale, senza dover
costringere il paziente a successivi prelievi ematici,
riportiamo in tabella la schematizzazione delle linee guida
proposte nel protocollo elaborato dall’American Thyroid
Association (ATA) recepito anche nel nostro paese dalla
Società Italiana di Medicina di Laboratorio (SIMeL) e dal
Comitato Italiano per la Standardizzazione dei Metodi Ematologici e di Laboratorio (CISMEL), che utilizzano come test
di ingresso TSH ed fT4.
E’ opportuno indicare altre indagini di laboratorio
da utilizzare in patologie tiroidee non riportate nelle
linee guida:
• dosaggio della calcitonina, in caso di sospetto
carcinoma midollare della tiroide;
• dosaggio della tireoglobulina, accompagnato
sempre dalla determinazione degli AbTg, nel followup del carcinoma differenziato della tiroide;
• test al TRH, solamente in caso di ipotiroidismo
centrale e nei rari casi di dubbio tra ipotiroidismo centrale e primario;
Dal momento che la diagnostica tiroidea è estremamente complessa, i dati derivati dai dosaggi ormonali
vanno integrati, oltre che dalla clinica, anche da indagini strumentali che, nel campo specifico delle tireopatie, sono principalmente l’ecografia, la scintigrafia e
l’agoaspirazione della tiroide, di fondamentale importanza per un corretto inquadramento di patologie
spesso tra loro difficilmente distinguibili. In particolare
devono essere utilizzate nella diagnostica della patologia nodulare, per la quale elenchiamo alcuni consigli
procedurali:
fT4
⇑
⇓
fT4
⇒
⇑
fT4
• ecografia della tiroide, come diagnosi iniziale;
• agoaspirato tiroideo, per la caratterizzazione dei
noduli;
• dosaggio della calcitonina, indice di carcinoma
midollare;
• dosaggio del TSH;
• scintigrafia tiroidea, in caso di reperto citologico
dubbio e/o TSH basso, per la caratterizzazione della
funzionalità del nodulo: caldo o freddo.
BIBLIOGRAFIA
1. Dans PE. Credibilità, cookbook medicine and common sense: guidelines and the College. Ann Intern
Med 1994; 120:966.
2. Autori vari. NACB Symposium. Clin Chem 1996;
42: 119-92.
3. Dorizzi RM, et al. Linee guida per la diagnostica
della patologia tiroidea. Med Lab 1996; 3: 260-265.
4.
Barbaro D., Malfatti S. La tiroide. Quaderni di
endocrinologia pratica. Pisa, 1998.
⇒
⇒
fT3
fT4
⇒
⇑
fT4
⇓
⇑
IPOTIROIDISMO
SUBCLINICO
AbTPO ⇑
IPERTIROIDISMO
SUBCLINICO
IPOTIROIDISMO
AUTOIMMUNE
IPERTIROIDISMO
EUTIROIDISMO
99
IPOTIROIDISMO
AGOASPIRATO TIROIDEO - METODICA, INDICAZIONI
E CITOLOGIA
Umberto Simi
U.O. Anatomia Patologica
La metodica di aspirazione con ago sottile (FNA)
della tiroide è stata sviluppata per la prima volta al
Radiunhelmet Hospital di Stoccolma (Svezia) negli
anni 50. Da questo istituto fu determinata l’utilità
della FNA in un protocollo diagnostico nei pazienti
con problemi tiroidei e la sua correlazione con le manifestazioni cliniche di varie entità patologiche.
In linea di principio ogni ingrandimento tiroideo
può essere studiato con la FNA ma il massimo beneficio si ottiene nello studio del nodulo tiroideo.
L’agoaspirato in pratica serve a decidere quale
nodulo deve essere sottoposto ad intervento chirurgico, riducendo il costo economico della malattia. In pratica con la FNA il numero degli interventi sulla tiroide
si è ridotto del 50% ed il numero di lesioni maligne
operate si è raddoppiato.
Altre indicazioni alla FNA oltre al nodulo tiroideo
sono la valutazione del gozzo diffuso, il follow-up
degli individui esposti a radiazioni del collo, lo screening per i carcinomi midollari familiari ed il drenaggio
terapeutico delle lesioni cistiche.
La tecnica consiste nell’uso di aghi sottili da 22-25
gauge, inseriti o meno in siringhe sterili monouso da
10-20 cc.
Il paziente deve essere supino con il collo iperesteso. Il prelievo è eseguito a mano libera nelle lesioni
palpabili, sotto guida ecografica in quelle non palpabili. La ghiandola viene immobilizzata contro la trachea,
e, nella metodica classica per aspirazione, l’ago montato sulla siringa viene introdotto nell’organo dopo pulizia della cute con alcool. Lo stantuffo della siringa
viene tirato per creare il vuoto e l’ago mosso in varie
direzioni, poi lo stantuffo viene riportato in posizione
di inizio e l’ago estratto dalla cute. A questo punto
l’ago viene rimosso dalla siringa, lo stantuffo viene riestratto, l’ago rimontato ed il materiale spruzzato su
vetrini che vengono strisciati delicatamente e fissati
con materiali alcolici per la colorazione di Papanicolaou o all’aria per la colorazione di Giemsa.
Una metodica alternativa è quella del prelievo per
capillarità usando l’ago non montato sulla siringa. Una
volta effettuato il prelievo tutto il resto procede nella
stessa maniera.
Aspetti citologici
• Ghiandola normale: le cellule tiroidee sono sparse
e disposte in microfollicoli in piccoli gruppi. La colloide
è scarsa. Il citoplasma è pallido o mal definito. Il nucleo
è centrale, rotondo od ovale con cromatina granulare e
due piccoli nucleoli. Sono spesso presenti nuclei nudi di
citoplasma, molto simili a piccoli linfociti.
• Tiroidite acuta: sono presenti abbondanti neutrofili, macrofagi, scarse cellule follicolari con alterazioni
degenerative e detriti cellulari .
• Tiroidite subacuta di Quervain: all’inizio sono
presenti cellule follicolari degenerate, cellule giganti
multinucleate, cellule epitelioidi, linfociti maturi e neutrofili su un fondo necrotico- colloideo. Negli stadi
avanzati si osservano scarse cellule infiammatorie e
fibroblasti con nuclei attivati.
• Tiroidite cronica di Riedel: scarsa cellularità non
specifica con linfociti maturi, cellule follicolari degenerate, neutrofili e fibroblasti.
• Tiroidite di Hashimoto: tappeto di linfociti più o
meno attivati, cellule tiroidee spesso scarse con aspetti
a cellule di Hurtle con nucleo ipercromico e con marcata anisocariosi. Si osservano anche cellule multinucleate, macrofagi e cellule epitelioidi.
• Iperplasia – Morbo di Graves: l’utilità della FNA
è limitata poiché la diagnosi è clinica e di laboratorio.
Il materiale aspirato è costituito da numerose cellule
follicolari spesso in monostrato con sangue e scarsa
colloide. Il citoplasma contiene talora vacuoli marginali. Al Giemsa si osservano le cosiddette “cellule a fiamma” con citoplasma contenente materiale granulare
rosa acceso.
Neoplasie follicolari: La diagnosi tra adenoma e carcinoma follicolare ben differenziato è difficile perché i
criteri per questa diagnosi differenziale non si basano
su caratteri citologici delle cellule ma piuttosto sulla
invasione capsulare o vascolare che sono caratteri istologici. In entrambi i casi le cellule tiroidee follicolari
mostrano modelli micro-macrofollicolari o trabecolari
con scarsissima colloide (spesso assente). Le cellule
sono uniformi con nuclei rotondi e cromatina granulare con micronucleolo. Raramente sono presenti marcata citoanisocariosi, ipercromasia e nucleoli prominenti
100
che però non sono segni di lesione maligna.
• Neoplasie a cellule di Hurtle: crea gli stessi problemi delle lesioni follicolari in quanto la diagnosi di
benignità o malignità è basata su criteri istologici e non
citologici. La cellularità è molto alta con cellule a citoplasma ampio granulare e nucleo grande eccentrico
spesso pleiomorfo. E’ però possibile la diagnosi differenziale tra vera neoplasia a cellule di Hurtle e le lesioni benigne che contengono cellule di Hurtle (gozzo,
tiroidite di Hashimoto, morbo di Graves).
Nel primo caso il quadro è monomorfo senza linfociti e materiale detritico, le cellule sono coesive e
mostrano macronucleoli. Le sporadiche inclusioni
nucleari non sono necessariamente segno di lesione
papillare.
• Carcinoma papillare: l’aspetto citologico del carcinoma papillare è abbastanza caratteristico con cellule
disposte in strutture papillari o in monostrato con
espansioni digitiformi. Talora si osservano frammenti
sferici con contorno liscio e nuclei a palizzata periferica o sovrapposti.
Le cellule singole sono rare e quando predominano
bisogna tenere in considerazione la diagnosi differenziale con il carcinoma midollare.
Caratteristiche citologiche quasi peculiari del carci-
noma papillare sono le inclusioni citoplasmatiche
nucleari (cosiddetti pseudo nucleoli) e le pieghe longitudinali nucleari (grooves).
Altra caratteristica del carcinoma papillare è la presenza di calcificazioni sferiche a laminazione concentrica o corpi psammomatosi che acquistano particolare
interesse diagnostico specie quando inclusi in gruppi
cellulari.
• Carcinoma midollare: il quadro citologico può
essere molto variabile. Il quadro classico e’ quello a
cellule poligonali o fusiformi che si trovano sparse con
emazie. Può essere presente un marcato polimorfismo
cellulare ed al Giemsa il citoplasma si colora metacromaticamente a granuli rossi. Spesso le cellule sono
binucleate o multinucleate. Talora si possono vedere
cellule isolate plasmacitosimili e materiale amorfo
similcolloideo con la caratteristica rifrangenza della
amiloide quando colorato con rosso congo ed esaminato alla luce polarizzata.
• Carcinoma anaplastico: la citologia varia secondo
il tipo istologico: nella maggior parte dei casi si osservano cellule giganti assieme a cellule fusiformi in un
fondo necrotico ed ematico. Le cellule sono per lo più
singole.
101
TEST ENDOCRINOLOGI DINAMICI NELLA
PATOLOGIA IPOFISARIA
Daniele Barbaro
Sezione di Endocrinologia e Diabetologia
I moderni metodi di dosaggio degli ormoni consentono di esprimersi sullo stato funzionale delle ghiandole endocrine in modo certo. Nello studio della funzione tiroidea, per esempio, i valori relativamente stabili dell’ormone tireostimolante (TSH) e della tiroxina
(T4) libera permettono di esprimere un giudizio definitivo nella maggioranza dei casi con un singolo prelievo.
Il dosaggio contemporaneo dei due ormoni inoltre
rappresenta quasi un controllo di qualità interno
essendo solitamente i due valori inversamente correlati.
Per altre ghiandole endocrine comunque, la situazione non è sempre così lineare: sia perché può non
esistere una ghiandola bersaglio sia perché per motivi
fisiologici può esserci un’ampia sovrapposizione tra i
valori normali e patologici. Un esempio tipico è rappresentato dall’ormone della crescita (GH, growth hormone): in questo caso non esiste una ghiandola bersaglio (anche se il GH stimola diversi tessuti a produrre
IGF1, insulin-like growth factor 1, polipeptide del
gruppo delle somatomedine); inoltre, i valori normali
possono essere bassi o elevati, con un’ampia sovrapposizione tra situazioni di normalità e casi con deficit di
ormone o di ipersecrezione dello stesso. Altro esempio
può essere il cortisolo la cui ipersecrezione non sempre
si manifesta con valori mattutini francamente elevati,
particolarmente in condizioni quali l’obesità.
In medicina ogni volta che si debba escludere una
patologia sospettata ma si sia di fronte ad un test normale in condizioni basali si può ricorrere a test dinamici: la situazione classicamente nota è il test ergometrico
per il sospetto di ischemia cardiaca. Per l’endocrinologia spesso non si sfugge a questa regola con la differenza che vi può essere sia il sospetto di ipofunzione sia di
iperfunzione. In linea generale si usano test di stimolazione quando, ma non esclusivamente, vi è il dubbio di una ipofunzione. Si utilizzano test di soppressione quando vi è il dubbio di una iperfunzione. Nel
dubbio di ipersecrezione inoltre, si utilizzano test che
hanno lo scopo di indagare risposte normalmente non
presenti ad un certo stimolatore (risposte paradosse).
Riportiamo di seguito una sintesi dei principali test
dinamici utilizzati nella patologia ipofisaria.
Test che indagano la riserva ipofisaria
Tali test vengono utilizzati nel sospetto di ipofunzione; sono test dinamici da stimolo che utilizzano stimolatori fisiologici.
• GH: il test classico è l’ipoglicemia insulinica o test
di tolleranza all’insulina (ITT). L’ipoglicemia provocata dalla somministrazione di insulina stimola la produzione di GH; lo stimolo per essere efficace deve determinare una caduta della glicemia al di sotto di 40
mg/dL od almeno del 50% dei valori basali ed essere
associata a sintomi clinici di ipoglicemia. Tale test, che
consente di esplorare contemporaneamente anche la
riserva di ormone adrenocorticotropo (ACTH), è meno
sensibile, per lo studio della riserva di GH, rispetto a
test dinamici più moderni come la stimolazione con
GHRH (growth hormone realising hormone) + arginina. Comunque la semplicità di esecuzione e il basso
costo continuano a rendere l’ITT utile nella pratica
quotidiana; l’unica limitazione è la necessità di un operatore pronto in caso di ipoglicemia severa, oltre ad
alcune ovvie controindicazioni.
Altri test alternativi, che trovano minore applicazione, sono il test alla clonidina, con arginina e con LDOPA. Moderni peptidi secretagoghi come l’exarelin
sono attualmente allo studio e potranno avere utilità
clinica in casi dubbi.
Da ricordare che il dosaggio dell’IGF1 può dare
informazioni utili; in alcune condizioni di deficit di
GH, infatti, si ritrovano bassi livelli della somatomedina. La carenza di GH va comunque confermata con i
test dinamici.
• FSH e LH: il test dinamico classicamente utilizzato è lo stimolo con GnRH (gonadotropin realising hormone). Il GnRH è il fattore di rilascio fisiologico delle
gonadotropine, prodotto a livello ipotalamico. In condizioni normali determina un netto incremento di
ormone luteostimolante (LH), mentre la risposta dell’ormone follicolostimolante (FSH) può anche essere
assente. Il test è indicato nel sospetto di amenorrea
ipotalamica funzionale, dove si ritrovano bassi livelli
102
di gonadotropine, ma si assiste a normali incrementi di
LH e FSH in risposta allo stimolo esogeno. Non è di
particolare utilità nel maschio nel quale livelli di testosterone bassi, a fronte di valori di gonadotropine non
elevati, sono già indicativi di ipogonadismo centrale.
• TSH: come abbiamo detto in precedenza, in caso
di ipotiroidismo primario i valori di TSH sono inversamente correlati a quelli degli ormoni tiroidei liberi,
dell’fT4 in particolare. Nell’ipotiroidismo centrale
avremo invece una fT4 bassa con TSH basso o normale. I test dinamici trovano dunque relativa indicazione,
tranne nei casi dubbi, come ad esempio bassi valori di
fT4 con TSH solo lievemente o non appropriatamente
elevato. Lo stimolatore classicamente utilizzato è il
TRH (thyrotropin releasing hormone), il fattore di rilascio ipotalamico fisiologico, che in caso di ipotiroidismo primario provoca una risposta esagerata del TSH.
Nel caso di ipotiroidismo centrale, invece, il test al
TRH può essere piatto o con risposta ritardata, ma si
possono avere anche risposte normali. Inoltre, con
questo test non è sempre possibile distinguere tra ipotiroidismo prevalentemente ipofisario e quello ipotalamico.
• ACTH: la riserva di ormone adrenocorticotropo
(ACTH) è esplorabile con il test di tolleranza all’insulina con particolare cautela. In caso di deficit di tale
ormone, infatti, l’eventuale presenza di un iposurrenalismo primario può provocare un’ipoglicemia severa
con shock. Viene valutata la risposta del cortisolo, in
quanto più semplice da dosare. In caso di controindicazione all’ITT può essere utilizzato il test con CRH
(corticotropin releasing hormone), o con desmopressina.
• PRL: la riserva di prolattina riveste scarso significato; è indagabile con il test al TRH.
Test che si utilizzano in caso di sospetto di ipersecrezione
L’ipersecrezione di ormoni ipofisari è sostenuta
nella grande maggioranza dei casi da adenomi ipofisari secernenti. Si utilizzano test di soppressione e/o di
stimolo valutando talora risposte paradosse.
• GH: molte delle azioni del GH sono mediate dall’IGF1, la cui produzione, particolarmente a livello
epatico, è stimolata dal GH stesso. Il dosaggio di IGF1
consente già di formulare la diagnosi in caso di valori
elevati della somatomedina. Il dosaggio di IGF1 rappresenta inoltre il principale ausilio per il follow-up.
Per la conferma di malattia il test classicamente
usato è il carico glucidico. In condizioni normali dopo
carico glucidico si ha una soppressione dei valori plasmatici di GH; in caso di ipersecrezione di GH non si
assiste alla normale soppressione, ed in alcuni casi si
ha incremento paradosso.
Altri test utilizzabili sono il test al TRH ed al GnRH:
normalmente questi stimolatori non evocano una
risposta del GH, mentre nell’ipersecrezione patologica
dell’ormone si produce un incremento paradosso.
• PRL: l’iperprolattinemia viene rilevata con una
certa frequenza. Nella maggioranza dei casi non è
associata a patologia (forme funzionali da stress e casi
“idiopatici”); spesso, comunque, l’iperprolattinemia è
associata a adenomi ipofisari (prolattinoma e pseudoprolattinoma). I valori basali consentono in genere di
orientarsi sulla causa, ma adenomi e particolarmente
lo pseudoprolattinoma possono essere presenti anche
con valori non molto elevati di PRL. Sono stati proposti vari test dinamici di stimolo e di soppressione, ma
nessuno sembra in grado di discriminare con certezza i
portatori di adenoma. Più promettente sembra il test al
verapamile recentemente proposto (la secrezione di
PRL è mediata dal calcio): nei portatori di adenoma,
infatti, non si assiste ad incremento della secrezione di
prolattina dopo somministrazione orale del farmaco.
• ACTH: l’iperincrezione di ACTH è dimostrabile
con test dinamici complessi. Il dosaggio del cortisolo
urinario e il test di soppressione rapido al desametazone consentono di confermare l’ipercortisolismo, ma la
diagnosi di forme ACTH dipendenti richiede ulteriore
studio con test prolungati di soppressione e/o stimolazione con CRH. Nei casi di ipercortisolismo ACTH
dipendente si ha una soppressione del cortisolo plasmatico dopo desametazone ad alte dosi ed una risposta al CRH.
• TSH: l’ipersecrezione primitiva di TSH è una condizione rara. La diagnosi è praticamente certa se si
ritrovano elevati valori di fT3 e fT4 con TSH moderatamente elevato, normale e talora anche semplicemente
non soppresso. I test di stimolo con TRH e di soppressione con T3 possono consentire la diagnosi differenziale fra le varie forme di ipersecrezione.
• FSH e LH: la maggioranza degli adenomi ipofisari non secernenti in realtà sono spesso gonadotropinomi silenti. L’ipersecrezione di gonadotropine non viene
facilmente sospettata, in quanto spesso gli ormoni prodotti hanno scarsa attività biologica e non si accompagnano ad ipersecrezione di ormoni bersaglio. In questi
casi è dimostrabile risposta paradossa al TRH.
103
USO CLINICO DEI MARCATORI TUMORALI
Maria Bombara, Gerardina Russo
Nella diagnostica oncologica i marcatori tumorali
rappresentano un supporto valido per la valutazione
della presenza di una neoplasia, ed ancor più per il
monitoraggio del suo decorso.
In senso lato per marcatore biologico di neoplasia
s'intende ogni indicatore biochimico correlato alla presenza di un tumore: in quest’ambito rientrano alcuni
parametri ematochimici classici come la VES, le proteine della fase acuta, gli enzimi epatici, espressioni dell’interazione tumore-ospite e come tali alterati generalmente in uno stadio avanzato di malattia.
Per marcatore tumorale in senso stretto intendiamo
sostanze prodotte prevalentemente dalla neoplasia,
legate al fenotipo trasformato in senso maligno. Tali
sostanze sono indicatori più precoci di malattia; inoltre, la loro concentrazione nel sangue è correlata con
l’entità della massa tumorale. In quest’ambito sono
compresi marcatori a struttura biochimica nota, come
diversi enzimi ed ormoni, e marcatori identificati da
anticorpi monoclonali, ad esempio le diverse mucine o
gli antigeni associati al tumore.
Ai marcatori tumorali viene richiesto di evidenziare
le eventuali differenze tra i soggetti con o senza neoplasia e di descrivere qualitativamente e/o quantitativamente alcuni atteggiamenti della crescita neoplastica.
In realtà i marcatori tumorali conosciuti non sono
tumore-specifici, ma sono espressi anche in assenza di
malattia neoplastica, con un'inevitabile sovrapposizione di valori tra individui sani e individui con tumore: è
necessario quindi utilizzare un valore soglia (cut-off)
che permetterà di discriminare tra una popolazione
sana ed una malata, dando luogo però necessariamente
ad un certo numero di falsi positivi e di falsi negativi.
Per la maggior parte dei marcatori, la sensibilità,
intesa come capacità della sostanza di individuare i
soggetti affetti da tumore, è piuttosto bassa; questo li
rende inadatti ad essere utilizzati in procedure di
screening o nella diagnosi differenziale con la malattia
benigna.
I settori di applicazione clinica dei marcatori sono
quindi, in ordine d'importanza:
• il monitoraggio del paziente neoplastico (che comprende sia la valutazione della risposta della malattia
al trattamento, sia la diagnosi di ripresa di malattia nel
paziente trattato);
• la valutazione iniziale della neoplasia (che comprende la determinazione del marcatore nel paziente
sintomatico sia come parametro di presenza, sia come
parametro di estensione della malattia); si ricorda inoltre come, in previsione di dosaggi successivi e ripetuti
nel tempo, sia opportuno disporre di un valore basale
di riferimento;
• un aiuto diagnostico in casi particolari (che consiste nella diagnosi di malattia in presenza di livelli fortemente elevati del marcatore, in particolar modo
quando si tratti di sostanze strettamente associate ad
alcuni istotipi);
• informazioni prognostiche.
Il problema più importante da affrontare quando si
vogliono inserire i marcatori in un protocollo clinico
riguarda la scelta del marcatore tra tutti quelli proponibili e disponibili. La logica suggerisce che il marcatore tumorale da preferire sia quello correlato con maggiore frequenza con quel dato tipo di neoplasia e meno
frequentemente presente nella popolazione sana. I
marcatori migliori sono quelli organo e tessuto specifici, che costituiscono per definizione un prodotto del
metabolismo del tessuto da cui deriva il tumore. Tale
orientamento è giustificato dalla maggiore probabilità
di riscontrare livelli significativi di positività nei
pazienti studiati, nonché di ottenere una più elevata
selettività di informazioni dall’esame.
Per aumentare l’informazione diagnostica si può
ricorrere al dosaggio combinato di più marcatori; tale
scelta è giustificata quando il tumore, per le sue caratteristiche biologiche e istologiche (possibile derivazione da diversi istotipi), è potenzialmente in grado di
esprimere marcatori differenti (p.e. neoplasie del testicolo, dell’ovaio, della tiroide). E’ in ogni caso opportuno limitare al massimo l’impiego simultaneo di più
marcatori; se, infatti, da un lato l’associazione di più
marcatori permette di incrementare la sensibilità diagnostica globale, dall’altro può aumentare il numero
dei falsi positivi. Inoltre, il costo economico dell’indagine diventa talvolta sproporzionato al beneficio diagnostico.
Nel paziente sintomatico il problema diagnostico è
quello di differenziare il tumore dalla patologia non
neoplastica. Le limitate caratteristiche di sensibilità e
specificità sconsigliano l’uso dei marcatori tumorali e
104
scopo diagnostico, tranne che in poche patologie
(aumento di AFP e HCG in pazienti con tumefazioni
testicolari, di AFP in portatori di masse epatiche, di
calcitonina in soggetti con noduli tiroidei, di PSA in
pazienti con nodulo prostatico).
Va comunque ribadito che i marcatori tumorali non
possono costituire il solo parametro diagnostico differenziale e sono pertanto da considerare in questa fase
come indagine di supporto.
E’ importante ricordare inoltre che si possono avere
livelli ematici aumentati di vari marcatori tumorali in
diverse condizioni non neoplastiche, patologiche e
non.
Riportiamo qui le più significative:
gravidanza (AFP, HCG, CA125, TPS, TG); ciclo
mestruale (CA125); fumo (CEA, TPS, TG); abuso di
alcool (CEA, TPS); epatopatia cronica (CEA, TPS, Ferritina, CA19.9, CA125, CA15.3, CA50); ittero (CEA, TPS,
Ferritina, CA19.9); pancreatite (CA19.9, CA125, CA50);
peritonite, pleurite, endometriosi (CA125); ipertrofia
prostatica benigna, ritenzione urinaria (PAP, PSA);
tireopatie (TG); insufficienza renale cronica (CEA,
Obiettivo clinico
CA50, CA125, NSE, TPS); malattie reumatiche, diabete
(CA19.9); psoriasi (SCC). Infine alcuni marcatori possono subire un incremento in seguito a manovre diagnostiche, come il PAP e il PSA dopo esplorazione rettale, cateterismo vescicale o agobiopsia prostatica, la
TG dopo agobiopsia tiroidea, il TPS dopo broncoscopia o dopo un qualunque traumatismo chirurgico, il
CA125 dopo un traumatismo chirurgico sul peritoneo.
Di seguito sono riportate alcune tabelle relative
all’uso clinico dei marcatori di neoplasia nelle più frequenti localizzazioni della malattia. In ogni tabella
sono riportati l’obiettivo clinico (diagnosi, follow-up,
etc.), il marcatore di prima o di seconda scelta per ogni
obiettivo clinico ed alcuni criteri interpretativi.
Si sottolinea come, per la maggior parte delle localizzazioni, non sia previsto l’uso di un qualsivoglia
marcatore nella diagnosi differenziale con la malattia
benigna.
Le tabelle sono state riprese e modificate da “Guida
all’uso clinico dei markers tumorali” di Massimo Gion
[http://sos.unige.it], direttore del Centro Regionale
Indicatori Biochimici di Tumore di Venezia.
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
Tempi
Criterio di interpretazione
Diagnosi differenziale
con malattia benigna
nessuno
nessuno
___
___
Bilancio di base (estensione,
tipo istologico, prognosi)
CEA
CA19.9
TPS
Prima della chirurgia
Livelli decisionali
Risposta al trattamento
primario
CEA
CA19.9
TPS
Aun mese dal
trattamento primario
Variazioni rispetto
al valore di base
Riconoscimento precoce
della progressione
CEA
CA19.9
Regolarmente durante
il follow-up
(prima di ogni controllo)
Variazioni rispetto al
valore precedente
Monitoraggio terapia
malattia avanzata
CEA
CA19.9
TPS
Prima di ogni nuovo
ciclo terapeutico
Variazioni rispetto
al valore precedente
Carcinoma del colon-retto.
Obiettivo clinico
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
Tempi
nessuno
nessuno
___
___
CA 19.9
CA72..4
CEA
Livelli decisionali
primario
CA 19.9
CA 72.4
CEA
Aun mese dal
Variazioni rispetto
al valore di base
della progressione
CA 19.9
CA 72.4
CEA
il follow-up
valore precedente
malattia avanzata
CA 19.9
CA 72.4
CEA
Prima di ogni nuovo
ciclo terapeutico
Variazioni rispetto
Carcinoma dello stomaco.
105
Obiettivo clinico
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
Tempi
nessuno
nessuno
___
___
CEA
CA19.9
TPS
Livelli decisionali
primario
CEA
CA19.9
TPS
Aun mese dal
Variazioni rispetto
al valore di base
della progressione
CEA
CA19.9
il follow-up
valore precedente
malattia avanzata
CEA
CA19.9
TPS
Prima di ogni nuovo
ciclo terapeutico
Variazioni rispetto
Tempi
Carcinoma del fegato.
Obiettivo clinico
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
nessuno
nessuno
---
---
CA19,9
CEA
Livelli decisionali
primario
CA19,9
CEA
Aun mese dal
Variazioni rispetto
al valore di base
della progressione
CA19,9
CEA
il follow-up
valore precedente
malattia avanzata
CA19,9
CEA
Prima di ogni nuovo
ciclo terapeutico
Variazioni rispetto
Tempi
Carcioma del pancreas.
Obiettivo clinico
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
nessuno
nessuno
___
___
CEA
CA19.9
TPS
Livelli decisionali
primario
CEA
CA19.9
TPS
Aun mese dal
Variazioni rispetto
al valore di base
della progressione
CEA
CA19.9
il follow-up
valore precedente
malattia avanzata
CEA
CA19.9
TPS
Prima di ogni nuovo
ciclo terapeutico
Variazioni rispetto
Carcinoma dela prostata.
106
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
Obiettivo clinico
Tempi
nessuno
nessuno
___
___
Livelli decisionali
CA15,3
CEA
Prima della chirurgia o
radioterapia prechirurgica o
chemioterapia neo adiuvante
Livelli decisonali
primario
CA15,3
CEA
Aun mese dal
Variazioni rispetto
al valore di base
della progressione
CA15,3
CEA
il follow-up
valore precedente
malattia avanzata
CA15,3
CEA
TPS
Prima di ogni nuovo
ciclo terapeutico
Variazioni rispetto
Carcinoma della mammella.
Obiettivo clinico
Bilancio di base
(estensione,
tipo istologico,
prognosi)
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
Tempi
AFP(tum a celle germinali)
HCG (coriocarcinoma;
tum a celle germinali)
CA125 (adenoca sieroso)
CEA (adenoca mucinoso)
nessuno
Contemporaneamente
alla Ecografia
Livelli decisonali
AFP (tum a cele germinali)
HCG (coriocarcinoma; tum
cellule germinali)
nessuno
Prima della Chirurgia
o Chemioterrapia
Livelli decisonali
primario
della recidiva
malattia avanzata
celle germinali)
a celle germinali)
celle germinali)
nessuno
nessuno
nessuno
Aun mese dal
Variazioni rispetto
al valore di base
Regolarmente durante Variazioni rispetto al
il follow-up
valore precedente
Prima di ogni nuovo
cicloterapeutico
Variazioni rispetto
Carcinoma dell’ovaio.
107
Obiettivo clinico
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
HCG (mola vescicolare
nessun
Bilancio di base
(estensione, tipo
istologico, prognosi)
SCC (ca. spinocellulare
HCG (mola vescicolare)
CEA (adenocarcinoma)
nessuno
primario
SCC (ca. spinocellulare)
nessuno
della progressione
SCC (ca. spinocellulare)
nessuno
malattia avanzata
SCC (ca. spinocelulare)
nessuno
Tempi
prima della revisione
di cavità
livelli decisionali
prima della chirurgia
o Radioterapia o
endocrinoterapia
liveli decisionali
a un mese dal
variazioni rispetto
al valore di base
il follow-up
valore precedente
Prima di ogni nuovo
cicloterapeutico
Variazioni rispetto
Carcinoma dell’utero.
Obiettivo clinico
Bilancio di base
(estensione, tipo
primario
della progressione
malattia avnzata
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
NSE (microcitoma)
NSE (microcitoma)
CYFRA21:1
(spinocellulare)
CEA
(adenocarcinoma)
NSE (microcitoma)
CYFRA21:1
(spinocellulare)
CEA
(adenocarcinoma)
NSE (microcitoma)
CYFRA21..1
(spinocellulare)
CEA
(adenocarcinoma)
NSE (microcitoma)
CYFRA21.1
(spinocellulare)
CEA
(adenocarcinoma)
nessuno
prima della fibroncoscopia
o della biopsia stereotassica
livelli decisionali
o radioterapia o
chemioterapia
liveli decisionali
nessuno
a un mesedal
vriazioni rispetto
al valore di base
nessuno
regolarmente durante il
follow-up (prima di
ogni controllo)
variazioni rispetto al
valore precedente
prima di ogni nuovo
ciclo terapeutico
variazioni rispetto al
valore precedente
nessuno
nessuno
Carcinoma del polmone.
Tempi
108
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
Obiettivo clinico
Tempi
AFP (non-seminomi)
HCG (non-seminomi)
HCG (seminomi) (1)
nessuno
prima della biopsia
livelli decisionali
Bilancio di base
(estensione, tipo
AFP (non-seminomi)
HCG (non-seminomi)
HCG (seminomi) (1))
nessuno
liveli decisionali
primario
AFP (non-seminomi)
HCG (non-seminomi)
HCG (seminomi)
nessuno
(2)
variazioni rispetto
al valore di base
della recidiva
AFP (non-seminomi)
HCG (non-seminomi)
HCG (seminomi)
nessuno
malattia avanzata
AFP (non-seminomi)
HCG (non-seminomi)
HCG (seminomi)
nessuno
il follow-up
valore precedente (3)
Prima di ogni nuovo
cicloterapeutico
Variazioni rispetto
1) Positivo solo nel 25/30% dei casi. In ogni caso valori superiori a 200 U/ml sono molto improbabili nel seminoma puro
(2) In caso di chirurgia radicale: HCG un prelievo al giorno per 10 gg; AFP un prelievo ogni 3 giorni per 21 giorni. Un tempo di dimezzamento superiore ai valori previsti suggerisce la presenza di malattia residua
(3) Durante il trattamento con chemioterapia un tempo di dimezzamento dei livelli ematici superiore a 7 gg per AFP ed a 3 per HCG avrebbe significato prognostico sfavorevole
Tumori germinali del testicolo.
Obiettivo clinico
Markers da usare
Prima scelta
Seconda scelta
CT (solo ca. midollare) (1)
Bilancio di base
(estensione, tipo
CT (ca. midollare)
TG (ca. differenziato)
CEA(ca. indifferenziato)
TPS (ca. indifferenziato)
primario
CT (ca. midollare)
della progressione
CT (ca. midollare)
malattia avanzata
CT (ca. midollare)
Tempi
nessuno
prima della biopsia
livelli decisionali
nessuno
liveli decisionali
nessuno
a un mese dal
variazioni rispetto
al valore di base
nessuno
nessuno
il follow-up
valore precedente )
Prima di ogni nuovo
cicloterapeutico
Variazioni rispetto
(1) Utile anche nello screening dei consanguinei di pazienti portatori di ca. midollare multifocale bilaterale (valore di base più eventuale stimolo con pentagastrina)
Abbreviazioni: CEA: antigene carcinoembronario; TPS: antigene polipeptidico tissutale specifico; AFP: alfafetoproteina; HCG: gonadotropina corionica umana; SCC: squamous
cell carcinoma associated antigen; CT: calcitonina; TG: tireoglobulina; PSA: antigene prostatico specifico; PAP: fosfatasi acida prostatica; NSE: enolasi neurone specifica.
Carcinoma della tiroide.
109
IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSTICA DELLA
PATOLOGIA PROSTATICA: L’ANTIGENE
PROSTATICO SPECIFICO (PSA)
Antonio La Gioia
Il carcinoma della prostata è il tumore più frequente
nell’uomo e rappresenta la seconda causa di morte
tumorale negli stati Uniti, la quarta in Italia, dopo il
cancro del polmone, dello stomaco e del colon retto.
L’incidenza del carcinoma prostatico è in costante e
progressivo aumento nei paesi occidentali; nel 1996
negli Stati Uniti sono stati diagnosticati 317.000 nuovi
casi ed una mortalità specifica di 44.000 soggetti.
Da questi dati sono esclusi i casi di carcinoma latente per i quali è descritta una incidenza 1000 volte superiore. Per carcinoma latente s’intendono quelle lesioni
tumorali evidenziabili solo microscopicamente in prostate asportate chirurgicamente per altre cause o in
corso d’autopsia.
Numerosi fattori eziologici sono stati invocati per
questa neoplasia. Tra questi ricordiamo fattori genetici,
ormonali, ambientali, dietetici e legati al comportamento sessuale.
La diagnostica della patologia prostatica si avvale
essenzialmente dell’esplorazione rettale e di indagini
strumentali (ecografia transrettale accompagnata o
meno dal prelievo bioptico) e di laboratorio (esame
cito-istologico; determinazione di marcatori tumorali).
L’Antigene Prostatico Specifico (PSA) è una glicoproteina di circa 35 KD prodotta specificamente dalle
cellule prostatiche. Nel siero il PSA è presente essenzialmente in tre forme:
• A2M-PSA: PSA complessato con alfa 2-macroglobulina. Tale forma è biologicamente inattiva, non in
grado di reagire con anticorpi anti PSA e, di conseguenza, non evidenziabile con i test di laboratorio;
• ACT-PSA: PSA complessato con alfa-1 antichimotripsina. Anche l’ACT-PSA è biologicamente inattivo
ma, a differenza della forma precedente, è immunoreattivo e quindi è evidenziabile con i test di laboratorio;
• free-PSA: PSA non legato ad inibitori; è immunoreattivo e quindi evidenziabile con i test di laboratorio.
La diagnostica di laboratorio si avvale del dosaggio
del PSA totale o T-PSA (ACT-PSA + free-PSA) e del
dosaggio del free-PSA. I due dosaggi combinati sono
quindi utilizzati per il calcolo del rapporto
F/T PSA.
Nei soggetti sani di sesso maschile le concentrazioni
sieriche di T-PSA sono generalmente inferiori a 4.0
ng/mL; questo valore è usualmente accettato come
limite superiore del range di normalità.
Uso clinico del dosaggio del PSA: screening del
carcinoma prostatico
Numerosi dati della letteratura documentano che le
concentrazioni sieriche del PSA tendono ad aumentare
quando si passa da una situazione di benignità ad una
situazione di progressiva malignità.
Perché un esame diagnostico possa essere utilizzato
come screening di una determinata patologia occorre
che sia:
1. sensibile, capace in altre parole di riconoscere la
malattia in fase iniziale e quindi potenzialmente curabile (sensibilità diagnostica: frequenza degli esami con
risultato anormale o positivo in individui affetti dalla
patologia in esame);
2. specifico, con bassa incidenza cioè di risultati falsi
positivi che sono causa di approfondimenti diagnostici
inutile e fonte di preoccupazione ingiustificata per il
paziente (specificità: percentuale di risultati negativi o
normali in una popolazione di individui esenti dalla
patologia in esame);
3. non invasivo;
4. a basso costo.
Il PSA non è invasivo ed è utilizzabile con costi relativamente contenuti e comunque giustificati dal rapporto costi/benefici.
Per quel che riguarda la sensibilità e la specificità,
occorre precisare che tali concetti non sono assoluti ma
relativi e sono inversamente correlati (aumentando la
specificità di un test se ne diminuisce la sensibilità e
viceversa).
Sia la specificità che la sensibilità, infatti, sono
dipendenti da un valore “soglia” (cut-off) la cui scelta
dipende dal livello di operatività che si persegue: valori bassi di cut-off privilegiano la sensibilità (lo screening avrà capacità di evidenziare molti casi di carcinoma) a scapito della specificità (aumento dei falsi positivi); la scelta di un cut-off più alto, al contrario darà allo
screening minore sensibilità (aumento dei casi di
malattia non evidenziati) e maggiore specificità (riduzione dei falsi positivi).
Esiste attualmente notevole accordo in letteratura
nel considerare il valore di 4 ng/mL di PSA totale
110
come valore di cut-off al di sotto del quale sono prevalentemente compresi soggetti sani o con ipertrofia prostatica benigna; viceversa, valori di PSA totale >
4ng/mL sono associati in maniera statisticamente
significativa con una maggiore frequenza di positività
per carcinoma prostatico diagnosticato con ecografia
transrettale associata o meno a biopsia ecoguidata.
Nel range 4 - 10 ng/mL di PSA totale è compreso
circa il 60% dei carcinomi prostatici con PSA elevato.
Tuttavia, oltre il 90% dei soggetti con risultati compresi
in tale range, non presentano segni clinici di neoplasia
Infine, una discreta percentuale di neoplasie prostatiche presenta valori di PSA inferiori a 4 ng/mL.
Pertanto il dosaggio del PSA totale presenta, con il
cut-off di 4 ng/mL e nel range 4 - 10 ng/mL, una
buona sensibilità ma una non elevata specificità.
Numerosi sono stati, specie in passato, i tentativi di
proporre indici diagnostici che, utilizzando il dosaggio
del PSA, ne migliorassero la specificità diagnostica. Tra
questi ricordiamo:
• PSA Velocity. Tale termine si riferisce alle variazioni dei livelli di PSA nel tempo; il razionale di tale
test risiede nella evidenza che soggetti con carcinoma
prostatico vanno incontro ad un aumento relativamente rapido dei livelli di PSA in confronto ai soggetti
sani. L’intrinseca variabilità biologica del PSA, in
realtà, limita l’uso clinico di tale indice.
• PSA Density. Espressa in ng/cc di volume prostatico misurato con ecografia transrettale. Limitazioni
dell’accuratezza di tale metodica di misurazione del
volume prostatico e la necessità del ricorso ad una
manovra, comunque invasiva hanno limitato l’impiego
clinico anche di questo indice, teoricamente interessante.
La specificità diagnostica del dosaggio del PSA è
stata notevolmente aumentata dal dosaggio contemporaneo del PSA libero e dal calcolo del rapporto PSA
libero / PSAtotale (F/T PSA).
Il rapporto F/T PSA è significativamente più basso
nei soggetti con carcinoma prostatico non trattato
rispetto a quelli con valori aumentati di PSA totale,
determinati da affezioni prostatiche benigne.
Il dosaggio del free PSA ed il calcolo sistematico del
rapporto F/T PSA permettono una significativa riduzione delle ecografie transrettali e delle biopsie prostatiche.
Infatti, le curve R.O.C. che mettono a confronto la
capacità discriminante tra le due patologie (ipertrofia
benigna e carcinoma) del T-PSA e del rapporto F/T
PSA, mostrano per il rapporto una capacità nettamente
migliore.
Anche nella scelta del cut-off per il rapporto F/T
PSA valgono le medesime considerazioni, necessarie a
conciliare le opposte esigenze di sensibilità e specificità
con l’efficacia dello screening stesso:
1. cut-off basso: >> aumento della sensibilità >>
riduzione della specificità >> aumento di ecografie e
biopsie;
2. cut-off più elevato: >> aumento specificità >>
riduzione sensibilità >> minor numero di casi evidenziati.
Classicamente, il dosaggio del free PSA ed il conseguente calcolo del rapporto F/T è riservato ai valori di
PSA totale compresi tra 4 e 10 ng/mL. Attualmente si
tende ad allargare tale grey zone, valutando, in base al
cut off del rapporto F/T utilizzato, il migliore equilibrio tra sensibilità e specificità.
Nel nostro laboratorio utilizziamo una grey zone di
3 – 10 ng/mL ed un cut-off del rapporto F/T pari a 15.
Il cut-off deve essere inteso come il valore discriminante tra soggetti per i quali si rendono necessari ulteriori
approfondimenti diagnostici (valori inferiori a 15) e
soggetti per i quali in assenza di quadro clinico non
sono necessari ulteriori accertamenti (valori superiori a
15).
Per tale valore di cut-off, calcolato nel range di
T-PSA 3 –10, i valori di sensibilità e specificità sono
pari a circa, rispettivamente l’ 80% ed il 71%.
Il valore di cut-off è comunque oggetto di continuo
monitoraggio e, in accordo con le valutazioni cliniche
risultanti, potrà essere modulato per aumentare o
ridurre la sensibilità e la specificità.
Uso clinico del dosaggio del PSA: stadiazione e
monitoraggio del carcinoma prostatico
Le concentrazioni sieriche del T-PSA mostrano una
tendenza ad aumentare al crescere dell’estensione clinica della malattia.
I valori basali di T-PSA, tuttavia, non sono utilizzabili nella stadiazione clinica del paziente poiché vi è
una notevole sovrapposizione di valori nei diversi
stadi della malattia.
E’ stato comunque dimostrato che nei pazienti con
metastasi scheletriche non si osservano valori di TPSA inferiori a 20 ng/mL. Le implicazioni di questa
informazione sul piano della appropriatezza e razionalizzazione dell’uso delle risorse sono importanti: la
ricerca sistematica di metastasi mediante scintigrafia
ossea o radiografia scheletrica non dovrebbe essere
richiesta ed eseguita nel paziente asintomatico con
PSA< 20 ng/mL.
Più incoraggianti appaiono alcuni studi sul rapporto
F/T PSA che evidenziano una correlazione tra bassi
valori della ratio e virulenza del tumore. In particolare
è stato osservato che i tumori prostatici con maggiore
valore del rapporto F/T, sono tumori con Gleason
score più basso e quindi con andamento meno aggressivo.
Il dosaggio del PSA totale, del free PSA e il calcolo
del rapporto F/T trovano larga applicazione nel monitoraggio del carcinoma trattato chirurgicamente o con
terapia ormonale.
Nel trattamento chirurgico radicale valori persistenti di T-PSA totale superiori a 0.2 ng/mL sono espressione della mancata eradicazione; allo stesso modo, nel
soggetto con valori post chirurgici di T-PSA tendenti a
111
zero, incrementi ≥ 0.2 ng/mL orientano per una recidiva della malattia.
Il monitoraggio del carcinoma prostatico trattato
con terapia ormonale può avvalersi della determinazione del rapporto F/T PSA, che aumenta nei pazienti
responders ed invece tende a restare basso (come nei
pazienti non trattati) nei non responders.
performances cliniche evidenziate da uno studio clinico retrospettivo appaiono sostanzialmente sovrapponibili a quelle del rapporto F/T PSA nel distinguere tra
patologia benigna e patologia tumorale ma risultano
migliori nella distinzione tra patologia con prognosi
più favorevole o più infausta (migliore correlazione
con il Gleason score).
Nuove possibilità diagnostiche.
1. PSA Complessato. Sono stati recentemente messi
a punto test per la misurazione del PSA legato all’alfa
1-antichimotripsina. Tutti gli studi effettuati con tale
marcatore concordano nell’assegnare al PSA complessato performances diagnostiche migliori del TPSA e
sovrapponibili al free PSA ed al rapporto FPSA/TPSA.
Il vantaggio nell’uso del PSA complessato risiederebbe, quindi, nella sua “economicità” (un solo dosaggio
dà le medesime informazioni dei due TPSA e FPSA
combinati).
2. ProPSA. Si tratta del precursore del PSA. Studi
preliminari depongono per una buona specificità e
sensibilità nella diagnosi di tumore della prostata in
pazienti nel range di TPSA tra 4 e 10 ng/mL oltre ad
una ottima sensibilità e sufficiente specificità nei soggetti nel range di 2 – 4 ng/mL di TPSA. L’impressione
complessiva è, tuttavia, quella di performances diagnostiche e vantaggi (un solo dosaggio) sovrapponibili
al PSAcomplessato.
3. Callicreina umana (hK2). La callicreina ghiandolare umana è una proteina sierica espressa dalle cellule
epiteliali prostatiche ed è omologa per l’80% al PSA.
Osservazioni preliminari indicano che la determinazione dell’hK2 potrebbe essere un utile marcatore clinico, indipendente dal PSA, per il ca prostatico. Le
Integrazioni ed approfondimenti.
L’introduzione in diagnostica del PSA ha relegato in
un ruolo secondario la determinazione della fosfatasi
acida prostatica (PAP) che attualmente viene dosata
con metodo immunometrico che utilizza specifici anticorpi monoclonali. Il dosaggio della PAP presenta una
sensibilità diagnostica nettamente inferiore al PSA e
solo raramente fornisce informazioni supplementari
rispetto al PSA.
Modalità di richiesta suggerite
Al fine di non pregiudicare il valore clinico del
dosaggio del PSAè importante tener presente che alcune manovre o procedure diagnostiche sono in grado di
per sé di alterare le concentrazioni basali del marcatore. Ad esempio l’esplorazione rettale e la cistoscopia
innalzano di circa 1.5 e rispettivamente 4.0 volte il
valore basale di PSA; l’esecuzione di agobiopsie su formazioni nodulari prostatiche determina incrementi
superiori anche a 50 volte il valore basale. Parallelamente bisogna tener conto della cinetica di eliminazione dal circolo del PSA, per il quale è stata calcolata una
emivita compresa tra 2.2 e 3.2 giorni.
E’ opportuno che nella richiesta sia specificato se il
paziente è stato prostatectomizzato (indicare la data
dell’intervento e il valore precedente del PSA).
112
IL LABORATORIO NEL MONITORAGGIO
TERAPEUTICO DEI FARMACI
Adriana Palla
Il Monitoraggio Terapeutico dei Farmaci (indicato
con la sigla TDM, dall’inglese Therapeutic Drug
Monitoring) consiste nella determinazione della concentrazione ematica di alcuni farmaci allo scopo di
adattare la loro posologia alle esigenze del singolo
paziente.
Indicazioni al monitoraggio dei livelli plasmatici
Il monitoraggio terapeutico assume un ruolo di
estrema utilità in particolari situazioni:
• all'inizio della terapia per individuare un regime
terapeutico adeguato;
• nel follow-up;
• nella fase di ottimizzazione del dosaggio in determinate situazioni fisiologiche (età, gravidanza, puerperio) e patologiche (epatopatie, nefropatie);
• nelle terapie associate per evitare gli effetti dovuti
ad interazioni farmacologiche;
• nell’aggiustamento della posologia di farmaci
caratterizzati da cinetiche particolari (es. cinetica di
saturazione nel caso della fenitoina);
• in tutte le situazioni in cui vi sia un’alterata risposta rispetto allo schema terapeutico proposto.
Indagini di laboratorio
La pratica del TDM trova una reale utilità solo nell’ambito di un ristretto gruppo di farmaci poiché devono essere soddisfatti le seguenti condizioni:
• esistenza di una stretta correlazione tra concentrazione plasmatica ed efficacia/tossicità del farmaco;
• esistenza di una ben definita “finestra
terapeutica” dei livelli plasmatici ottimali, al di sotto
dei quali si hanno concentrazioni subterapeutiche ed
al di sopra si hanno concentrazioni tossiche (si ricorda
che gli intervalli di riferimento sono validi solo in termini statistici e pertanto sono solo indicativi);
• esistenza di un basso coefficiente terapeutico con
concentrazioni ottimali molto vicine a quelle tossiche
(es. fenitoina);
• esistenza di un’elevata variabilità interindividuale. La posologia standardizzata sulla base del peso o
della superficie corporea darebbe luogo in questi casi
ad un ampio range di concentrazione ematica oscillante dai valori subterapeutici a valori tossici.
I farmaci maggiormente interessati al monitoraggio
terapeutico sono i seguenti:
• alcuni antiepilettici (carbamazepina, fenitoina,
fenobarbitale, acido valproico, etosuccimide);
• vancomicina;
• metotrexate;
• digossina;
• teofillina;
• ciclosporina;
• tacrolimus;
• litio;
• alcuni antibiotici aminoglucosidici (amikacina,
dibekacina, gentamicina, tobramicina, kanamicina,
netilmicina).
Dal momento che un uso improprio del TDM può
compromettere i risultati attesi è opportuno considerare attentamente i seguenti aspetti:
campione: preferibilmente il dosaggio è eseguito su
siero, quindi al momento del prelievo non deve essere
usato alcun anticoagulante. Solo per ciclosporina e
tacrolimus è utilizzato sangue intero (anticoagulante:
Emodalità di prelievo: in generale viene determinata
la concentrazione ematica pre-dose in condizioni di
steady-state.
Per alcuni farmaci l'ora del prelievo è importante in
quanto si verificano fluttuazioni nell’arco della giornata anche con dosi ravvicinate (es. carbamazepina,
acido valproico). E’ buona regola quindi eseguire il
prelievo in corrispondenza del cosiddetto “livello di
valle” (ossia al mattino o durante la giornata, immediatamente prima dell’assunzione del farmaco) poiché
in tali condizioni il livello ematico è più riproducibile.
Qualora si desiderino avere indicazioni utili riguardo
la comparsa di effetti tossici transitori è opportuno eseguire il prelievo in corrispondenza del “livello di
picco”. Alcuni farmaci (antibiotici aminoglucosidici)
richiedono il dosaggio di entrambi i livelli.
Indicazioni del Laboratorio per un corretto TDM
Ai fini di una corretta interpretazione dei risultati
analitici e di un appropriato impiego del TDM è
opportuno fornire al Laboratorio importanti informazioni. E’ buona regola quindi al momento del prelievo:
113
• specificare lo scopo del monitoraggio: follow-up,
inizio terapia, sospetta tossicità, probabile interazione
farmacologica, assenza o diminuita risposta terapeutica ecc.;
• indicare la posologia: quantità di farmaco e frequenza giornaliera.
• indicare eventuali terapie associate;
• indicare eventuali condizioni patologiche esistenti (nefropatie, epatopatie, cardiopatie, endocrinopatie).
Nella tabella sono riportati i valori di alcuni parametri farmacocinetici e informazioni utili al dosaggio
dei principali farmaci inclusi nel TDM, riferiti all’età
adulta.
Figura 1. Grafico concentrazione ematica/tempo di un farmaco sino al raggiungimento dello steady-state. L’e mivita del farmaco è di 12 ore e lo steady-state sarà raggiunto al 3° giorno (ossia dopo 4-5 emivite). (illustra zione ripresa da “Il monitoraggio terapeutico dei farmaci” – Abbott Divisione Diagnostici) .
Steady-state o stato d’equilibrio - condizione di
equilibrio, raggiunta a seguito di somministrazioni
ripetute del farmaco, in cui si osservano oscillazioni
stabili e regolari delle concentrazioni ematiche tra un
valore minimo (valle) ed un massimo (picco). General-
mente lo steady-state è raggiunto dopo un intervallo
di tempo corrispondente a 4-5 emivite del farmaco
considerato.
Emivita (t 1/2) - tempo necessario affinché la concentrazione ematica del farmaco si dimezzi.
114
Principio
attivo
Nome
commerciale
Via di
somministraz.
Emivita
(ore)
considerata
Tempo necessario
(gg)per raggiungere
Tempo di
prelievo
lo steady-state
Range di
concentrazione
terpeutica
Fenobarbitale
COMIZIAL
GARDENALE
LUMINALE
ORALE
96 (49-120)
10 -15
pre-dose 1*
(livello valle)
15 -40 µg/mL
Carbamazepina
TEGRETOL
ORALE
10 -25
2 -6
pre-dose
(livello valle)
4 -10 µg/mL
Fenitoina
DINTOINA
ORALE
v. nota
v. nota
pre-dose 1*
(livello valle)
10 -20 µg/mL
Ac. Valproico
DEPAKIN
ORALE
8 -15
2 -3
pre-dose
(livello valle)
50 –100 µg/mL
Digossina
DIGOMAL
EUGINOX
LANICOR
LANOXIN
ORALE
40
5 -7
pre-dose
(livello valle)
0.9 -2.2 ng/mL
Teofillina
AMINOMAL
DIFFUMAL
EUPHYLLINA
TEFAMIN
TEONOVA
THEO-DUR
ORALE
3 -12
2
pre-dose
(livello valle)
può essere utile
det. anche il
livello del picco
8 -20 µg/mL
Ciclosporina
SANDIMMUN
ORALE
6 -14
2 -3
pre-dose
(livello valle)
100 -450 µg/mL
Vancomicina
VANCOCIN
ORALE
4 -10
20 -30 ore
pre-dose
(livello valle)
valle 5 -10
picco 20 -40 µg/mL
Litio
CARBOLITHIUM
LITIO CARB.
ORALE
14 -33
3 -7
pre-dose
livello valle
12h dopo la
dose serale
0.3 -1.3 meq/L
1*) dato il valore alto di emivita, il tempo di campionamento non ha importanza tranne che nelle misurazioni comparative.
Nota: La fenitoina è soggetta a cinetica di saturazione (la concentrazione di farmaco nel plasma aumenta in modo non proporzionale all’aumento della dose), di conse guenza l’emivita non rappresenta un parametro utile, inoltre il tempo necessario per raggiungere lo steady-state è variabile dagli 8 ai 50 giorni di somministrazione orale ripe tuta secondo le capacità metaboliche del paziente.
115
ASPETTI FARMACOLOGICI E PROBLEMATICHE DI
MONITORAGGIO TERAPEUTICO DEI FARMACI
IMMUNOSOPPRESSORI: LA CICLOSPORINA
Adriana Palla
La Ciclosporina A (CsA) è un potente farmaco
immunosoppressore la cui introduzione nella prevenzione e nella terapia del rigetto ha rappresentato un
significativo progresso nel campo dei trapianti d’organo. Isolata nel 1970 da un fungo norvegese, il Tolypocladium inflatum, la CsA è un polipeptide ciclico,
costituito da 11 aminoacidi, altamente lipofilo.
Il suo meccanismo di azione si esplica attraverso l’inibizione della sintesi delle linfochine, in particolare
dell’Interleuchina 2 (IL-2). La CsA attraversa la membrana cellulare e va a legarsi nel citoplasma a due proteine Ca-dipendenti: la ciclofillina e la calmodulina. Il
complesso CsA-proteina migra nel nucleo dove interferisce con l’RNA messaggero responsabile della sinte si delle linfochine, e quindi dell’Interleuchina 2 (1).
Quest’ultima prende parte ai processi di amplificazione della risposta immunitaria e di proliferazione delle
cellule T e B, responsabili del rigetto. La CsA blocca la
proliferazione dei linfociti T citotossici, riduce la produzione dei linfociti B (mediante un’azione indiretta e
più limitata), mentre non interferisce sulla proliferazione dei linfociti T immunosoppressori, responsabili
della risposta immunitaria umorale.
La CsA viene somministrata per os o per via endovenosa. L’assorbimento gastro-intestinale è lento,
incompleto ed è caratterizzato da una notevole variabilità inter-individuale. Un miglioramento è stato ottenuto con l’introduzione di una nuova formulazione
basata su microparticelle lipidiche, il Sandimmune
Neoral. E’ stato osservato che per le vecchie formulazioni (Sandimmune) la biodisponibilità media è di
circa il 30%, mentre con il Sandimmune Neoral diventa
superiore al 50%.
Nel sangue la CsA si distribuisce negli eritrociti
(circa il 50%), nei leucociti (linfociti e granulociti 1020%), il resto (30-40%) si lega alle lipoproteine plasmatiche (HDL > LDL > VLDL); solo in minima parte (1%)
circola libera (2). La CsA si distribuisce ampiamente
nell’organismo (Vd = 1-6 L/Kg) e, dato il suo carattere
notevolmente lipofilo, si accumula soprattutto a livello
di milza, pancreas, rene e fegato, dove si esercitano
maggiormente i suoi effetti collaterali.
Il metabolismo della CsA è principalmente epatico.
Nel fegato i processi di biotrasformazione avvengono
ad opera del Citocromo p-450 e consistono essenzialmente in reazioni di ossidrilazione, N-demetilazione,
ciclizzazione e ossidazione. Esiste anche un metabolismo intestinale. Sono stati isolati ben 30 metaboliti
della CsA, la maggior parte dei quali privi di azione
terapeutica.
L’eliminazione è quasi esclusivamente biliare, solo il
6% della dose assunta viene escreta con le urine, di cui
lo 0,1% in forma immodificata.
L’introduzione della CsA nella terapia immunosoppressiva ha portato ad un netto miglioramento in termini di sopravvivenza di pazienti trattati e di organi
trapiantati, soprattutto nel periodo immediatamente
successivo al trapianto in cui il rischio di rigetto acuto
è maggiore. Il farmaco non sembra essere altrettanto
efficace nel prevenire il rigetto cronico a causa del suo
modesto effetto sui processi immunologici di tipo
umorale.
La CsAè caratterizzata da una elevata nefrotossicità,
che può manifestarsi anche a bassi dosaggi. La nefrotossicità acuta da CsA è solitamente reversibile con la
riduzione o la sospensione del farmaco mentre peggiora con la somministrazione di farmaci anti-infiammatori. Altre complicanze dovute alla CsA sono: iperten sione arteriosa, epatotossicità, neurotossicità, alterazioni metaboliche, ipertrofia gengivale, irsutismo e disturbi gastro-intestinali.
La CsAviene impiegata:
• nei trapianti di: cuore, cuore/polmone, fegato,
rene, pancreas, midollo osseo, cornea (azione immunosoppressiva);
• nel trattamento della psoriasi e di altre malattie
autoimmuni (malattia di Crohn, artrite reumatoide,
dermatomiositi, lupus eritematoso sistemico, eczema
recidivante).
Monitoraggio terapeutico della Ciclosporina
In genere tutti i farmaci immunosoppressori, avendo
un ristretto range terapeutico, necessitano di un attento controllo della dose somministrata. Il monitoraggio
terapeutico dei farmaci (TDM), ossia la misura della
concentrazione ematica del farmaco come guida alla
terapia, è ormai una pratica consolidata per la Ciclosporina e l’FK506 (Tacrolimus), mentre è ancora in via
116
di sviluppo per l’Acido Micofenolico e la Rapamicina
(Serolimus) (3).
I motivi che giustificano l’applicazione del TDM al
trattamento farmacologico con CsAsono i seguenti:
• basso indice terapeutico, soprattutto in relazione
alla sua nefrotossicità;
• ampia variabilità dei parametri farmacocinetici
intra- ed inter-individuali;
• difficoltà clinica nel riconoscimento degli stati tossici;
• verifica della “compliance”;
• fattori fisiologici che possono incidere sulla farmacocinetica del farmaco;
• interazioni farmacologiche.
L’esigenza di personalizzare il regime terapeutico per
ogni singolo paziente mediante il monitoraggio della
concentrazione ematica ha tuttavia focalizzato alcuni
problemi metodologici, argomento di discussione di
vari incontri a livello internazionale (4-8). Esistono
attualmente dei documenti di consenso che stabiliscono
una sorta di “linee guida” per il monitoraggio della
CsA; le raccomandazioni dettate dai Consensus Panel
(1990 Canadian Consensus Meeting; 1995 Lake Louise
Consensus Conference) sono riportate nella Tab. 1.
A proposito delle indicazioni fornite è opportuno
aggiungere:
1. matrice biologica. Il sangue intero rappresenta la
matrice d’elezione rispetto al siero o plasma per:
a. motivi analitici – la concentrazione della CsA nel
sangue intero è maggiore (circa il doppio) rispetto a
quella presente nel plasma; questo comporta un rapporto segnale/rumore di fondo più elevato a vantaggio dell’accuratezza del risultato;
b. motivi pratici – l’impiego di sangue intero consente di mantenere lo stesso range di riferimento terapeutico rendendo i risultati “comparabili” da Centro a
Centro. La stessa cosa sarebbe difficilmente ottenibile
usando il plasma che deve essere separato in condizioni controllate di tempo e temperatura.
2. raccolta del campione. Nel monitoraggio viene
fatto riferimento alla concentrazione basale o “di
valle”, in quanto questo dato correla piuttosto bene
con la tossicità della CsA. E’ stata osservata una variazione di tipo circadiano della concentrazione ematica
della CsA: i valori di “valle” serali risultano significativamente più bassi di quelli mattutini
La matrice biologica da preferire per il dosaggio della CsAè il sangue intero con l’impiego di EDTAcome anticoagulante.
Il dosaggio va effettuato nel momento di concentrazione minima della CsA, eseguendo il prelievo poco prima (1 ora) della
dose successiva.
La somministrazione della CsAdeve avvenire lontano dai pasti, in quanto gli effetti del cibo sull’assorbimento della CsA
possono essere considerevoli.
Le informazioni relative a dose, ora di assunzione e via di somministrazione devono essere fornite al laboratorio.
Il metodo analitico impiegato deve essere specifico per la CsA“parent drug”.
E’ richiesto un controllo costante della “performance” del dosaggio della CsA.
E’ essenziale che il laboratorio partecipi a Programmi di Controllo di Qualità Esterno (VEQ) per mantenere la qualità del
metodo di misura.
Nel periodo immediatamente successivo al trapianto la frequenza del monitoraggio raccomandata è una volta ogni 24-48
ore; in questo periodo il laboratorio deve fornire le risposte in giornata.
Devono esistere intervalli terapeutici ben definiti.
Nella maggior parte delle situazioni cliniche non è giustificato il monitoraggio dei metaboliti della CsA; qualora ne sia
richiesto il monitoraggio si raccomanda l’uso di un metodo analitico specifico.
Tabella 1.
117
Monitoraggio farmacocinetico
Nel caso di somministrazione orale di Sandimmune
l’assorbimento della CsA può essere di ordine zero,
rendendo problematico il monitoraggio terapeutico.
Per ovviare a questi inconvenienti sono stati proposti
alcuni metodi o algoritmi in base ai quali è possibile
avere una stima dell’AUC da un numero limitato di
prelievi.
Metodo analitico
ll metodo analitico raccomandato per il dosaggio
della CsA deve possedere una elevata specificità per la
molecola “parent drug”. Attualmente le tecniche maggiormente impiegate nella routine di laboratorio sono:
radioimmunologiche (RIA), metodiche basate sulla
fluorescenza a luce polarizzata (FPIA), immunoenzimatiche in fase omogenea (EMIT). Alcuni di questi
metodi sono specifici in quanto misurano la concentrazione della CsA intatta, altri lo sono meno in quanto
misurano la concentrazione della CsAintatta e rilevanti frazioni dei suoi metaboliti. Appartengono a questo
secondo gruppo i metodi immunologici che utilizzano
anticorpi policlonali. La CsA può essere determinata
anche utilizzando l’HPLC (High Performance Liquid
Chromatography), metodo considerato di riferimento
in quanto dosa solo la CsA intatta e non i suoi metaboliti. Questa tecnica è tuttavia poco impiegata nei Laboratori Analisi per la sua maggiore complessità rispetto
alle tecniche citate.
Intervallo terapeutico di riferimento
I valori degli intervalli terapeutici si riferiscono alle
concentrazioni “basali” o di valle, in condizione di
equilibrio (steady state), ossia dopo un tempo pari a 5
volte il tempo di emivita del farmaco, dopo ogni modifica posologica. La definizione di intervallo terapeutico
è piuttosto complessa in quanto questo dipende da
vari fattori:
• tipo di organo trapiantato;
• regime immunosoppressivo;
• terapia induzione/mantenimento;
• metodo analitico usato.
E’ auspicabile che ogni centro trapianti adotti dei
valori di riferimento tenendo conto dei parametri indicati e il Laboratorio renda noto il metodo analitico
impiegato.
Nella Tab. 2 sono riportati gli intervalli terapeutici
per la CsA nel sangue intero secondo l’organo trapiantato, il regime di immunosoppressione, la terapia di
induzione/mantenimento e la tecnica analitica impiegata (unità di misura: mg/L).
Metaboliti
Sono stati identificati più di 30 metaboliti della CsA,
alcuni presenti in elevata concentrazione, soprattutto
in pazienti con ridotta funzionalità epatica. Almeno 4
metaboliti sono attivi.
In “vitro” i metaboliti della Csa hanno dimostrato
attività immunosoppressiva e tossicità inferiori a quelle della CsA “parent drug”. Per quanto riguarda la
sperimentazione in “vivo”, risultata peraltro piuttosto
difficoltosa, è stato osservato un analogo comportamento rispetto al “vitro” dell’attività immunosoppressiva dei metaboliti, mentre la loro tossicità richiede
un’ulteriore valutazione. Nella maggior parte delle
situazioni cliniche il monitoraggio dei metaboliti non
sembra essere giustificato.
Interazioni farmacologiche
I farmaci che possono interferire con il metabolismo
della CsA sono molti; qualora si verifichi una loro contemporanea assunzione con il farmaco immunosoppressore è raccomandato uno stretto monitoraggio
terapeutico.
Metodo
Terapia induzione
HPLC
mFPIA
m RIA
EMIT
Rene
Cuore
Fegato
Tripla terapia
Tripla terapia
Tripla terapia
Doppia terapia
150 - 225
250 - 375
160 - 200
125 - 200
250 - 325
300 - 400
250 - 325
275 - 375
225 - 300
250 - 313
250 - 300
300 - 375
100 - 150
100 - 250
75 - 150
75 – 150
125 - 175
150 - 250
90 - 160
150 - 250
100 - 150
135 - 200
150 - 238
125 - 200
Terapia mantenimento
HPLC
mFPIA
m RIA
EMIT
100 - 150
150 - 250
75 - 150
Tratta da: Oellerich M.et al., Lake Louise Consensus Conference on Cyclosporin Monitoring in Organ Transplantation: Report of the Consensus Panel. Ther. Drug Monit.
1995;17(6):642-654.
Tabella 2.
118
Bibliografia
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primary molecular target for cyclosporine: structural and functional implications. Transplantation
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119
ASPETTI FARMACOLOGICI E PROBLEMATICHE DI
MONITORAGGIO TERAPEUTICO DEI FARMACI
IMMUNOSOPPRESSORI: IL TACROLIMUS (FK 506)
Maria Bombara
Negli ultimi anni si è reso disponibile per la terapia
immunosoppressiva un nuovo farmaco, il tacrolimus
(FK 506), macrolide isolato dallo Streptomyces tsukubaensis. Il tacrolimus possiede proprietà immunosoppressive simili ma più potenti rispetto alla ciclosporina, potendo quindi essere utilizzato a dosaggi più
bassi rispetto a quest’ultima.
Il meccanismo di inibizione della risposta immune è
simile a quello della ciclosporina, con un’azione più
incisiva a livello della risposta immune cellulo-mediata. Il tacrolimus si lega nei linfociti T ad una famiglia
di proteine citoplasmatiche denominate FKBP (“FKbinding proteins”, o “proteine leganti l’FK) con conseguente inibizione dell’attività fosfatasica della calcineurina. Il blocco delle vie di trasduzione del segnale
calcio-dipendenti così ottenuto, provoca un arresto
dell’attività proliferativa e della funzionalità dei linfociti T.
In vitro, il tacrolimus inibisce, con una potenza da
10 a 100 volte superiore a quella della ciclosporina, la
reazione linfocitaria mista, la formazione di interleuchina-2 dai linfociti T e la formazione di altri mediatori
solubili, inclusi l'interleuchina-3 e l'interferone gamma.
Come la ciclosporina, il tacrolimus risulta più efficace
nel prevenire il rigetto acuto piuttosto che quello cronico. L’efficacia del tacrolimus rispetto alla ciclosporina
nel ridurre l’incidenza di rigetto sembra maggiore,
particolarmente nei trapianti di fegato, mentre nel trapianto di rene gli effetti sono paragonabili.
Anche l’uso del tacrolimus è associato ad effetti
secondari tossici gravi, in primo luogo a nefrotossicità.
Altri effetti secondari nocivi includono neurotossicità,
alterata tolleranza glucidica, ipertensione, insonnia e
disturbi gastrointestinali. Sembra però che tali effetti
collaterali si verifichino meno frequentemente rispetto
al trattamento con ciclosporina.
Il tacrolimus può essere somministrato per via
endovenosa o per via orale. L’assorbimento nel tratto
gastrointestinale avviene in modo variabile ed irregolare. Il farmaco viene metabolizzato in misura elevata
nel fegato e nei microsomi dell’intestino tenue tramite
gli enzimi del citocromo epatico p-450. Sono stati identificati nove differenti metaboliti del tacrolimus dei
quali non è ancora chiaro il significato clinico. Attualmente, in particolare, non è ancora definito se la nefrotossicità del tacrolimus sia da attribuire al farmaco, ai
metaboliti o ad entrambi.
Come la ciclosporina, il tacrolimus presenta una
notevole variabilità intra- ed inter-individuale nel suo
profilo farmacocinetico. Per raggiungere il dosaggio
ottimale è quindi necessario il monitoraggio terapeutico, particolarmente raccomandato anche in considerazione dell’elevata tossicità del farmaco. Dai dati clinici
comunque risulta che non esiste un rapporto chiaro tra
il dosaggio di tacrolimus, le concentrazioni del farmaco nel sangue intero ed effetti negativi quali il rigetto
di trapianto e la nefrotossicità.
Il range terapeutico di tacrolimus non è quindi
ancora chiaramente definito; più comunemente si
ritrovano concentrazioni nel sangue intero tra 5 e 20
ng/mL. Concentrazioni più elevate sono associate ad
un aumento nell’incidenza di effetti negativi.
La complessità del quadro clinico e le differenze
individuali di sensibilità agli effetti immunosoppressori del tacrolimus comportano esigenze diverse per raggiungere livelli ottimali del farmaco nel sangue intero.
Ciascun paziente deve essere sottoposto ad una valutazione clinica esauriente prima di effettuare cambiamenti nella terapia e per ciascun paziente deve essere
stabilito il range individuale in base a questi reperti clinici.
Studi farmacocinetici hanno identificato nel sangue
intero il mezzo più idoneo, rispetto al plasma, per
descrivere le caratteristiche farmacocinetiche del tacrolimus. Infatti, il tacrolimus oltre al legame con le proteine plasmatiche, principalmente albumina e alfa-1glicoproteina acida, presenta un alto grado di legame
agli eritrociti.
I metodi di dosaggio usati nella routine di laboratorio sono metodi immunometrici. Tali metodiche presentano una reattività crociata con i metaboliti del
tacrolimus. In caso di accumulo dei metaboliti (p. es.
eliminazione del tacrolimus impedita in corso di colestasi) può quindi verificarsi una sovrastima della concentrazione del farmaco. In questi casi è necessario
l’uso di un dosaggio specifico (HPLC).
In conclusione, il tacrolimus può essere utilizzato
come valida alternativa alla ciclosporina, particolarmente nei trapiantati di fegato; viene comunque utilizzato in sostituzione della ciclosporina nel trattamento
dei rigetti di trapianto resistenti alla stessa o dopo la
comparsa di effetti tossici.
120
ECSTASY: NUOVA DROGA DA DISCOTECA
Adriana Palla
Negli ultimi decenni il repertorio delle sostanze d’abuso si è arricchito di numerosi composti. La continua
ricerca di nuove sostanze di evasione ha portato alla
creazione di droghe sintetiche derivate dalla manipolazione chimica di molecole già note per i loro effetti psicotropi. Si tratta delle cosiddette “designer drugs”,
nate dalla necessità di aggirare le normative che regolano l’uso delle sostanze stupefacenti iscritte nelle
apposite tabelle. L’ECSTASY, con la sua struttura chimica derivante dall’amfetamina, è il rappresentante
più conosciuto di queste “nuove droghe”. Definita
“nuova droga”, non tanto per la sua relativamente
recente scoperta quanto per il fatto che il suo consumo
costituisce un fenomeno nuovo rispetto a quello dell’eroina, l’ecstasy possiede una serie di proprietà che ne
giustificano la rapida diffusione: affinità strutturale
con una sostanza d’abuso nota (metamfetamina), facilità di sintesi, basso costo, effetti gradevoli, buona via
di somministrazione. Il consumo di ecstasy è legato in
particolare agli ambienti dei locali notturni dove la
sostanza viene assunta a scopo ricreativo. I giovani frequentatori di discoteche e dei cosiddetti “rave parties”
sono gli assuntori abituali di questa sostanza, la cui
popolarità risiede nelle sue proprietà “enctatogene”(*)
ed “empatogene”(**). Gli effetti dell’ecstasy, facilitando
la comunicazione interpersonale in particolari situazioni emozionali, giustificano la sua funzione di
“social enhancer”. E’ noto dalla relazione annuale dell’Unione Europea relativa al fenomeno droga che
dall’1% al 5% degli individui di età compresa tra i 16 e
i 35 anni ha fatto uso di ecstasy e/o di amfetamine. In
particolare la Gran Bretagna si distingue per un elevato consumo: il 16% per le amfetamine e l’8% per l’ecstasy. Tale diffusione è sicuramente da attribuire ad
una notevole facilità di sintesi (questo spiegherebbe il
numero elevato di laboratori clandestini) e ai ricercati
effetti affettivo-sensoriali.
Breve storia
Ecstasy è il nome con il quale viene generalmente
indicata la MDMA (3,4-metilendiossi-N-metilamfetamina abbreviata a MetilenDiossiMetAmfetamina)
derivato sintetico della metamfetamina. Nell’ambito
del mercato illecito la droga è nota anche come
“Speed”, “X”, “Rave”,”Adam”. Sintetizzata nel 1912
dalla Merck in Germania e brevettata nel 1914 come
farmaco anti-appetito, la MDMA non fu mai posta sul
mercato. Negli anni ’50, dopo decenni di disinteresse,
fu inserita nei programmi militari dell’esercito USA e
nel periodo anni ’70-’80 fu impiegata in psicoterapia
per le sue proprietà “entactogene”.
L’impiego della MDMA come droga e quindi la sua
crescente diffusione avvenne inizialmente negli Stati
Uniti (anni ’70) quindi nel Nord Europa e in Italia (fine
anni ’80 – inizi anni ’90). Da allora il consumo di ecstasy risulta essere in continuo aumento, in particolare
nei Paesi a più alto sviluppo economico.
Dal 1986 è sotto il controllo internazionale.
Struttura chimica e attività farmacologica
Dal punto di vista chimico la caratteristica peculiare
della MDMAè la presenza del sostituente metilendiossi- (-O-CH2-O-) sull’anello benzenico della molecola
della metamfetamina. Questo gruppo, presente anche
in altri composti come la MDA e la MDEA, rende i
derivati amfetaminici particolarmente interessanti alla
luce delle proprietà farmacologiche acquisite, diverse
da quelle proprie delle amfetamine classiche (amfetamina e metamfetamina). E’ noto che gli assuntori di
queste “nuove droghe” vanno incontro a fenomeni di
caduta delle barriere comunicative, vivono in sintonia
con se stessi e con gli altri e risentono degli effetti derivanti da una vicinanza emozionale. Tali proprietà farmacologiche spiegano la diffusione di questi derivati,
in particolare della MDMA, in ambienti ricreazionali
come le discoteche, dove tra l’altro la stimolazione sensoriale provocata dalla musica ritmata e della luci psichedeliche tende ad esaltare gli effetti descritti.
Meccanismo di azione ed effetti
La MDMA, come gli altri metilendiossiderivati
amfetaminici, interagisce essenzialmente con il sistema
serotoninergico. A livello presinaptico favorisce il rilascio di serotonina e ne impedisce il re-uptake, contemporaneamente blocca la sintesi del mediatore chimico
per inibizione della triptofano-idrossilasi. Da tutto
questo ne consegue un impoverimento di serotonina a
livello neuronale.
La MDMA, provocando il rilascio di serotonina,
influenza lo stato emotivo della persona. Gli effetti
121
psico-comportamentali dell’ecstasy consistono in:
miglioramento dell’umore, aumento dell’estroversione
e modesta derealizzazione.
Non sono da sottovalutare gli effetti neurovegetativi, in particolare quelli cardiovascolari: aumento della
pressione arteriosa, aumento della gittata e della frequenza cardiache. Inoltre si riscontrano aumento delle
concentrazioni ematiche di cortisolo e di prolattina,
midriasi e soprattutto aumento della temperatura corporea (causa di morte durante i rave parties).
Effetti tossici
La crescente popolarità dell’ecstasy ha favorito lo
sviluppo di studi riguardanti le complicanze legate al
suo consumo. E’ proprio dall’osservazione degli effetti
riscontrati su alcune specie animali da esperimento che
scaturiscono fondati motivi di notevole preoccupazione riguardo la reale pericolosità di questa droga. Esistono effetti tossici di tipo acuto, che costituiscono la
temibile sindrome da intossicazione acuta, il cui quadro clinico è caratterizzato da irrequietezza, confusione mentale, alterazione della coscienza, convulsioni
miocloniche, pallore cutaneo, iperriflessia, midriasi,
secchezza delle fauci e disturbi gastro intestinali (nausea e diarrea).
In condizioni più gravi questi sintomi possono essere accompagnati da rabdomiolisi con mioglobinuria,
insufficienza renale acuta, coagulazione intravasale
disseminata e ipertermia. L’aumento della temperatura
(oltre 40°C) è un effetto caratteristico dell’ecstasy e le
conseguenze letali possono essere aggravate dall’attività fisica intensa e prolungata, come il ballo, e dalle
particolari condizioni ambientali connesse a locali
sovraffollati e poco ventilati. E’ noto che le principali
cause di ricovero nei DEU sono da attribuire a disidratazione e a colpi di calore associati al consumo di
ecstasy.
Si riscontrano anche aumenti della frequenza cardiaca, della pressione arteriosa e comparsa di gravi
aritmie. Le cause principali di tossicità grave e di
morte sembrano essere attribuite a complicanze cardiache e alla CID. Fortunatamente i casi di overdose
da ecstasy non sono molto frequenti, anche se possono
essere letali, e non sono dose-correlati.
E’ stata segnalata epatotossicità legata all’assunzione di MDMA. Anche se non ancora chiarita completamente sembra che la responsabilità di questo effetto
tossico sia attribuibile non tanto all’ecstasy quanto a
sostanze contaminanti presenti nella droga stessa.
Infine si registrano manifestazioni correlabili a stati
di psicosi cronica provocate da un uso prolungato di
MDMA. Disturbi psicologici del tipo ossessività, ansia,
ideazioni paranoiche in associazione a disturbi del
sonno e dell’appetito sono stati riscontrati in forti consumatori di ecstasy. Sicuramente l’uso cronico ed
intenso della droga porta a disturbi del sonno, ansia,
deficit della memoria e dell’attenzione. In ogni caso
pur essendo state segnalate nell’uomo complicazioni
legate all’assunzione di ecstasy, il numero di persone
interessate è da considerarsi esiguo rispetto alla totalità dei consumatori.
Neurotossicità
La questione della neurotossicità legata al consumo
di ecstasy è tuttora molto dibattuta e non ancora del
tutto chiarita.
A questo proposito deve essere fatto riferimento al
meccanismo di azione dell’ecstasy. La MDMA agendo
essenzialmente a livello dei neuroni serotoninergici
favorisce la liberazione di serotonina a livello delle
sinapsi gangliari: è proprio la presenza massiva di
questo neurotrasmettitore libero che giustifica le modificazioni dell’attività elettrica cerebrale e provoca gli
effetti ricercati dell’ecstasy.
Studi effettuati su animali da esperimento, primati
compresi, hanno messo in evidenza la possibilità di
lesioni a livello dei neuroni coinvolti. Il danno interesserebbe le terminazioni nervose in particolar modo i
trasportatori deputati al trasferimento della serotonina
dentro e fuori la cellula nervosa. Questo tipo di evidenze sperimentali sulla neurotossicità dell’MDMA
ottenute sul modello animale sono state oggetto di critica nel momento in cui si è inteso estenderle all’uomo.
Infatti nell’animale da esperimento vengono solitamente impiegate dosi maggiori rispetto a quelle assunte dall’uomo, la via di somministrazione spesso è
diversa (non è quella orale) e le somministrazioni sono
più frequenti. D’altra parte però è riconosciuto il fatto
che l’uomo dimostra una sensibilità maggiore agli psicofarmaci rispetto al ratto e che il suo sistema metabolico è meno efficiente. Per questi motivi si può assumere che gli effetti osservati sull’uomo siamo molto
vicini a quelli osservati sugli animali tanto più che il
primate non umano, la scimmia, ha dimostrato una
maggiore suscettibilità agli effetti neurotossici della
MDMArispetto al ratto.
Lo studio di McCann e colleghi (McCann UD, Szabo
Z, Scheffel U, Dannais RF, Ricaurte GA Positron emission
tomographic evidence of toxic effect of MDMA on brain
serotonin neurons in human being The Lancet 1998;
352:1433-7) può essere definito come una sperimentazione naturale. In questo lavoro furono analizzate le
scansioni cerebrali di 14 ex-consumatori di MDMAe di
15 controlli, ottenute impiegando la tecnica PET (Positron Emission Tomography). Valutando l’attività dei
neuroni direttamente coinvolti nella trasmissione della
serotonina McCann potè dimostrare una relazione
diretta tra il consumo di MDMA e un decremento
generale dell’attività neuronale. In pratica coloro che
avevano usato ecstasy avevano delle scansioni cerebrali alterate e mostravano una riduzione delle cellule
serotoninergiche attive dal 20 al 60%. L’esperimento fu
ripetuto sulle scimmie e ache in questo caso gli animali
sotto l’effetto di MDMA mostravano lesioni a livello
dei neuroni serotoninergici. Un dato che può essere in
un certo senso confortante è che i danni a lungo termi-
122
ne, osservati nelle scimmie dopo 7 anni di trattamento
con MDMA, si mostrarono minori di quelli più recent.
Questo fatto lascia pensare che le cellule cerebrali si
ricostituiscano, anche se non completamente.
Conclusioni
Analizzando i dati forniti dalla letteratura sorge
spontanea una domanda: è giustificata un’allarmante
preoccupazione per il fenomeno “ecstasy”?
Considerando l’esigua casistica di eventi sanitari
gravi a fronte del numero elevato di assuntori, della
diffusione mondiale del fenomeno e della sua durata
nel tempo si potrebbe propendere per una risposta
negativa.
Tuttavia il fatto che la MDMA possa causare degenerazione delle terminazioni nervose in specie animali,
compreso il primate non umano, attribuisce al fenomeno una gravità non indifferente e impone maggiore
attenzione a tutto ciò che è connesso all’uso di questa
droga.
Non a caso la MDMAinsieme ad altre droghe amfe-
tamino-simili (le cosiddette ATS da AmphetamineType-Substances) sono state indicate come fonti dei
principali problemi di droga del nuovo secolo.
(*) Enctatogeno
Termine usato per indicare la proprietà di indurre
uno stato psicologico tale da aumentare le capacità
introspettive di un soggetto.
(**) Empatogeno
Termine impiegato per indicare un effetto capace di
realizzare un più efficace contatto producendo una
sensazione di vicinanza e comprensione dell’altro
nelle situazioni in cui si vanno sviluppando relazioni
di tipo sociale e/o affettivo.
123
SINDROMI MONONUCLEOSICHE
Giuliana Gracci
La Mononucleosi Infettiva (MI) è classicamente una pica sono compatibili con la diagnosi di Mononucleosi
malattia dei giovani adulti causata dal virus di Epstein Infettiva; la positività della PBD o del test rapido
Barr (EBV).E’ clinicamente caratterizzata da faringite orientano per una eziologia da EBV.
essudativa, linfoadenopatia laterocervicale, splenomeIl titolo anticorpale della PBD ed il suo andamento
galia e dalla presenza nel siero di anticorpi eterofili, nel tempo non correlano con l’andamento della malatcapaci cioè di reagire con antigeni diversi e filogeneti- tia e non danno quindi di nessuna informazione procamente lontani da quelli che ne hanno indotto la for- gnostico-evolutiva; è questo il motivo per cui una sola
mazione.
determinazione a scopo diagnostico, all’esordio, risulta
L’altro elemento caratterizzante la MI è rappresen- in genere sufficiente.
tato dalla presenza in circolo di linfociti atipici.
E’ importante ricordare che il 25% dei pazienti con
Tali elementi rappresentano il corrispettivo morfo- MI acuta da EBV pregressa, presenta ancora anticorpi
logico dei linfociti T CD8 positivi “attivati” dall’infe- eterofili residui anche a distanza di molti mesi; questo
zione virale; negli strisci colorati di sangue periferico può indurre in errori diagnostici qualora compaiano
hanno morfologia ben riconoscibile e sono variamente altre malattie dovute ad agenti infettivi diversi.
denominati (linfociti attivati; virociti; linfomonociti;
Nel 2-3% dei casi inoltre gli anticorpi eterofili posimmunoblasti; cellule di Downey). Tutte queste deno- sono comparire anche 4-8 settimane dall’esordio della
minazioni sono improprie, alcune potenzialmente malattia e delle anomalie ematologiche.
devianti e sono attualmente sostituite da “linfociti
Oltre alla ricerca di anticorpi eterofili, la diagnostiattivati”.
ca sierologica della MI utilizza anche altri test quali la
Malattie simil-mononucleosiche, non associate ad ricerca di antigeni EBV in immunofluorescenza o di
anticorpi eterofili possono essere causate ugualmente anticorpi anti EBV in immunoenzimatica.
dall’EBV ma anche da citomegalovirus (CMV), toxoTra questi ultimi la ricerca delle IgM anti VCA
plasma, virus dell’immunodeficenza acquisita (HIV), (Viral Capsid Antigens), più precoci, e delle IgM anti
herpes virus 6 e, raramente, da farmaci quali idantoi- EBNA (Epstein Barr Nuclear Antigens), più tardive,
na ed alotano. Queste malattie presentano quadri clinici e devono essere utilizzate solo nel caso in cui un sospetdi laboratorio caratterizzati dalla adenopatia diffusa e to di MI non risultati confermato dalla presenza di
dalla linfocitosi atipica.
anticorpi eterofili.
Nel corso di MI non EBV possono svilupparsi
La negatività per PBD ed anti VCA / EBNA esclurisposte anticorpali eterofile transitorie, tuttavia solo la de la diagnosi di mononucleosi infettiva da EBV ed
presenza di anticorpi eterofili del tipo Paul Bunnel è orienta per una sindrome similmononucleosica.
specifica per la MI da EBV.
In tal caso la diagnostica di laboratorio è basata
Questi anticorpi sono agglutinine dirette verso essenzialmente sulla ricerca degli anticorpi di classe
emazie di pecora e di cavallo che resistono all’assorbi- IgM, specifici per i diversi agenti eziologici (CMVmento su sospensioni di rene di cavia (antigene di HH6, HBV, toxoplasma, ecc.). Tali anticorpi, classicaForssman), ma si assorbono su globuli rossi di mucca.
mente, “marcano” l’esordio e le fasi precoci di una
Si evidenziano attraverso la reazione di Paul Bun- malattia infettiva, raggiungono il picco dopo 3-4 settinel Davidhson (PBD) classica (agglutinazione a diver- mane per divenire non più svelabili entro pochi mesi
so titolo di globuli rossi di montone), test consolidato dall’esordio.
dall’uso ma meno sensibile dei test di successiva
Esistono però, rispetto a questa cinetica, delle ecceintroduzione. Questi, economici, semplici e di rapida zioni che possono indurre in errore diagnostico.
esecuzione, sono basati sulla agglutinazione di globuli
E’ questo il caso delle infezioni da Citomegalovirus
rossi di cavallo sensibilizzati. Nell’interpretazione di (CMV) in cui è possibile trovare IgM ancora presenti a
questi test dobbiamo comunque tener presenti i dati titoli significativi anche dopo 12 o più mesi dall’inizio
clinici ed ematologici: una linfoadenopatia con pre- della malattia. Questo accade prevalentemente in
gressa faringodinia e febbre associate a linfocitosi ati- pazienti trapiantati o affetti da AIDS ma si possono
127
avere anche nel 25% circa dei soggetti non immunocompromessi.
La positività per le IgM può essere quindi, in questo caso, indice di una infezione primaria come pure
di una riattivazione, diversamente da quanto accade
per le infezioni da EBV nelle quali è sempre associata
ad infezione primaria.
Un ulteriore problema può essere rappresentato
dalle c.d. cross reazioni eterotopiche, determinate dalla
presenza in virus diversi di antigeni con determinanti
comuni. Questo causa la comparsa di anticorpi capaci
di dare reazioni positive nei test sierologici per i diversi virus, determinando di fatto delle false positività. E’
questo il caso, ad esempio, della MI acuta da EBV nella
quale, nel 30% dei casi, si ritrovano risposte positive
per ricerca di IgM specifiche antiCMV.
In presenza di un quadro clinico suggestivo per
sindrome mononucleosica, l’iter diagnostico di laboratorio prende avvio dalla valutazione quantitativa
(linfocitosi) e qualitativa (ricerca di linfociti atipici) del
sangue periferico e continua con la ricerca con un test
rapido degli anticorpi eterofili per MI.
Oltre il 95% dei pazienti di età superiore a 5 anni
con infezione primaria da EBV sviluppa anticorpi eterofili; in questi casi non sono necessari ulteriori accertamenti.
Nei pazienti al di sotto dei cinque anni sono comuni le forme eterofilo negative; in questi casi è consigliabile la ricerca degli anticorpi anti EBV (VCA/ EBNA).
La positività al test rapido con negatività dello striscio di sangue deve far pensare ad un falso positivo o,
in alternativa, ad una ricerca troppo precoce o tardiva
rispetto alla storia clinica della malattia
Nel caso di test per anticorpi eterofili negativo e
striscio positivo per linfociti atipici, l’iter diagnostico
non si discosta da quello visto per i bambini inferiori a
cinque anni.
La negatività anche per anti VCA / EBNA indirizzerà verso la ricerca sierologica per altri agenti infettivi
(CMV, HHV-6, HIV, HBV, HCV; Toxoplasma condii),
ricerca guidata anche dalle differenze clinico-sintomatologiche tra le diverse forme.
128
EPATITE C: ATTUALITA’ DI LABORATORIO
Mario Manetti
Il controllo e la diagnosi dell’epatite virale esigono
All’estremità 5’ del genoma è localizzata una
che il medico e gli altri operatori sanitari conoscano:
sequenza di circa 324-341 nucleotidi, estremamente
• i rischi di contagio noti e potenziali per i diversi conservata, che non viene tradotta (“untraslated
tipi
region” o 5’ UTR). Questa regione contiene le informa• la casistica dei comportamenti a rischio dei zioni regolatrici per la replicazione e la traduzione del
pazienti
genoma virale ed è usata nei test di amplificazione e
• i test diagnostici appropriati per ciascun tipo di per la classificazione dei vari genotipi virali.
epatite
Le proteine strutturali del virus, derivate dalla
• le misure preventive e terapeutiche appropriate.
poliproteina precursore, comprendono la proteina del
Virus, droghe, tossine o consumo
eccessivo di alcool possono essere
causa di epatite. Indipendentemente
REGIONE
REGIONE NON
dalla causa, tutti i tipi di epatite virale
STRUTTURALE
STRUTTURALE ( NS )
danneggiano le cellule epatiche, ed è
per questa ragione che molti dei segni e
dei sintomi sono simili per i diversi
5’
C
E1 E2/
NS2
NS3 NS4 NS5
3’
tipi.
UTR
NS1
UTR
Essendo i sintomi non specifici
rispetto all’agente-causa, nell’epatite
KD 22
33
70
23
72
10
58
risulta impossibile distinguere tali
27
70
agenti sulla base della sola sintomatologia clinica. Si rende, quindi, necessario ricorrere ai test sierologici per i
markers specifici.
RNA_polimerasi
Elicasi/
Glicoproteine
I pannelli sierologici per l’epatite vira- Proteina
RNA-dipendente
del
capside
proteasi
dell’envelope
le sono utilizzati per:
• Diagnosi: differenziazione dell’HAV,
HBV, HCV HDV (rispettivamente virus epatite A, epa- core, codificata dal gene C e quelle di superficie, coditite B, epatite C ed epatite delta)
ficate dai geni E1 ed E2/NS1.
• Screening
C: regione Core codificante per le proteine del
• Monitoraggio
nucleocapside (C22)
E1, E2/NS1: regioni codificanti per le proteine delIl Virus dell’Epatite C
l’envelope (gp 33, gp70)
Virus ad RNA a singolo filamento di circa 9.400
NS2 : regione codificante per una elicasi/proteasi
nucleotidi, di 60 nm di diametro, in grado di codificare (p23)
per una poliproteina di 3010-3011 aminoacidi che
NS3 : regione codificante per le proteine c33c e p72
viene successivamente elaborata attraverso l’azione
NS4 : regione codificante per le proteine c100-3 e 5combinata di proteasi virali e dell’ospite nelle diverse 1-1
proteine strutturali e di funzione del virus.
NS5 : regione codificante per una polimerasi RNA
Il genoma dell’HCV contiene una regione struttu- dipendente (replicasi/polimerasi) (p58, p70)
rale, in direzione 5’, che codifica per le proteine componenti la particella virale (core, E 1, E 2/NS1) e una
Il virus dell’HCV, come quello di altri virus ad
sequenza non strutturale, in posizione 3’, che codifica RNA, presenta un notevole grado di eterogeneità, con
per le proteine di funzione (elicasi/proteasi, RNA poli- frequenza di mutazioni a livello di vari segmenti genomerasi).
mici. Esistono sequenze più conservate (es.: 5’ UTR,
129
insieme al gene core e ad alcuni segmenti delle regioni
NS3 e NS5) ed esistono geni più variabili (geni che
codificano per l’ “envelope” virale E1 ed E2/NS1).
Dalla elevata variabilità genomica deriva che, nello
stesso paziente, esista una popolazione virale polimorfa e che alcune varianti possano, in opportune condizioni, divenire predominanti influenzando il decorso
clinico dell’infezione.
I virus HCV sono quindi da considerarsi una
“quasi specie” con una sequenza dominante (“master
sequence”) ed un insieme di diversi mutanti virali. La
natura di “quasi specie” dell’HCV appare come un
possibile meccanismo attraverso il quale il virus sfugge alla sorveglianza immunitaria ed instaura l’infezione persistente nell’ospite.
Genotipi di HCV
Sono state presentate diverse classificazioni, tra cui
quella più attuale proposta da Simmonds prevede il
raggruppamento dei vari isolati virali in 6 distinti
genotipi (da 1 a 6), ciascuno caratterizzato da più sottotipi (a, b, c); 1a, 1b, 2a e 2b sono i più frequenti in
Europa; è presente anche il tipo 3, che è più frequente
in sud America.
Oltre ad un interesse epidemiologico, lo studio dei
genotipi virali pare abbia anche una importante rilevanza clinica. Alcuni studi, concordano nell’attribuire
ai diversi genotipi diverso potere patogeno, virulenza,
infettività, tropismo cellulare e risposta al trattamento
con interferone. Attualmente dati disponibili in letteratura associano quadri più severi di malattia al genotipo 1, soprattutto di sottotipo b.
I pazienti infetti con il genotipo 2a sembrerebbero
rispondere meglio alla terapia con interferone rispetto
a quelli infetti da genotipo 1. Sono per una migliore
prognosi anche bassi livelli sierici di HCV-RNA e
basso grado di eterogeneità.
Vie di trasmissione:
L’HCV viene trasmesso attraverso il sangue. Non si
registrano casi di HCV trasmesso per via enterica
(orale/fecale), attraverso il latte materno, o la saliva.
Soggetti e comportamenti a rischio:
• Tossicodipendenti per via iniettiva (aghi contaminati) 50%
• Attività sessuali con soggetti HCV positivi / contatto con oggetti di uso quotidiano (spazzolino da
denti, forbici da unghie, ecc.) 13%
• Riceventi di trapianti e trasfusioni (prima del
1992) 3%
Decorso clinico:
• Periodo di incubazione da 2 a 26 settimane
(periodo medio di 6-7 settimane )
• Esordio insidioso
• La maggior parte dei soggetti infetti (75% ed
oltre) può essere asintomatica
• Il 10 –25% non sviluppa sintomi specifici
• L’85% circa dei soggetti infetti da HCV sviluppa
una infezione cronica
• Delle persone affette da epatite C cronica circa 10
– 20% progredisce verso la cirrosi; di questi più dell’
1% sviluppa epatocarcinoma
TEST PER LA DIAGNOSI DI INFEZIONE DA
HCV
(proposta di iter diagnostico)
La diagnostica di laboratorio per le infezioni da
HCV utilizza, come per altre malattie infettive, metodiche indirette, basate sulla ricerca della risposta anticorpale dell’organismo e metodiche dirette finalizzate,
cioè, alla evidenziazione nell’organismo di materiale
nucleico virale. In sintesi:
1. test sierologici di screening;
2. test sierologici di conferma;
3. ricerca diretta di HCV-RNA con tecniche di bio logia molecolare
Test sierologici di screening
Ia generazione: test importanti per la identificazione della forma virale (fino ad allora classificata genericamente come epatite non A non B). Proteina ricombinante C100 ottenuta da lievito e composta da 363 aminoacidi (aa) derivati dalle regioni non strutturali
NS3–NS4 del virus, fusi con 154 aa della superossidodismutasi umana (SOD) e 10 aa linkers (test di bassa
sensibilità e specificità).
2a/3a generazione: utilizzano anch’essi la proteina
ricombinante C100 con l’aggiunta di altri peptidi
ricombinanti o sintetici.
Gli attuali test di 3a generazione (più sensibili e
specifici) sono costituiti da ”cocktail” di antigeni quali
quello strutturale derivato dal Core (c22-3, Hc-34) e
quelli NS derivati dalle regioni NS3, NS4, NS5.
Test sierologici di conferma
(Immunoblot / Riba). Ricercano anticorpi verso le
singole proteine del virus C, codificate dalle regioni
C22, NS3, NS4, NS5.
Servono per la conferma di avvenuta infezione.
I marcatori sierologici, di screening e di conferma,
pur avendo un importante valore diagnostico non riescono tuttavia a coprire l’intervallo di tempo che intercorre fra il momento dell’esposizione all’infezione e la
sieroconversione. Resta una zona finestra di circa 70
giorni, coperta solo in parte dal test HCV-Core Antigen
Elisa. Questo test di recente introduzione sembra
ridurre la finestra da circa 70 a circa 20 giorni.
La metodica di elezione per cercare di coprire la
zona finestra resta la ricerca del virus con tecniche di
biologia molecolare, positive già nelle fasi precoci della
malattia.
130
Ricerca diretta con tecniche di biologia molecolare
Sono utilizzate essenzialmente per:
• Confermare la presenza del virus in Positivi evidenziati con i test sierologici (replicazione virale)
• Esclusione della presenza virale in neonati da
madre anti HCV positiva
• Monitoraggio terapia
La ricerca di HCV-RNAmediante tecniche di Biologia Molecolare assume anche valore prognostico, dal
momento che l’RNA virale tende a scomparire precocemente nei pazienti con malattia autolimitante, e a
persistere ad elevati livelli nei casi con evoluzione cronica.
ESEMPI DI MODELLI INTERPRETATIVI PER
TEST DIAGNOSTICI HCV
Screening
POS
POS
POS
NEG
Conferma
NEG
POS
POS
=
INTERPRETAZIONE
Positivo
Immunoblot/ Riba
Positivo
Test di screening
Positivo
Conferma
Positivo
HCV–RNA
Qualitativo
Negativo
Test di screening
Negativo
HCV RNA
Qualitativo
Positivo
Test di screening
NEG
1
NEG
2
POS
3
Infezione confermata
Infezione pregressa
Infezione avvenuta
(Zona finestra)
Neonato da madre HCV-RNApositiva
Ricerca del
Virus con PCR
Test di screening
POS
Positivo
HCV–RNA
Qualitativo
Negativo
HCV–RNA
Qualitativo
Positivo
Genotipo HCV
Valutazione ai fini della terapia
HCV–RNA
Quantitativo
Assenza d’infezione
4
1. Falso positivo (Cross reattività)
2. Infezione pregressa (replicazione virale assente) /
Infezione assente in neonato da madre HCV-RNA
positiva
3. Infezione ancora in atto
4. Zona finestra. Presenza del Virus con anticorpi
ancora assenti.
131
ATTUALITA’ DI LABORATORIO IN TEMA DI AIDS
Mario Manetti
Dopo 15 anni dalla comparsa dell’epidemia di
AIDS, il virus della immunodeficienza umana (HIV)
non è più un virus misterioso.
Le ricerche si sono concentrate particolarmente
sulla caratterizzazione sierologica molecolare del virus
HIV-1.
Il genoma virale è stato estesamente studiato, tutti i
geni riconosciuti dell’HIV-1 sono stati clonati e la maggior parte delle proteine (con relative funzioni) è stata
identificata.
Allo stato attuale le prospettive di vita sono tanto
più buone quanto più precoce è la diagnosi di infezione da HIV.
Utile quindi una visione retrospettiva e la conoscenza dei test di diagnosi.
specifiche e formerà l’RNAgenomico.
L’infezione da HIV-1 e la conseguente progressiva
distruzione delle difese immunitarie costituiscono la
base patogenetica che andrà a configurare la Sindrome
da Immunodeficienza Acquisita. Una sindrome del
tutto analoga è stata associata all’infezione da parte di
un retrovirus che presenta ampie quote di omologia
con HIV-1, pur con una virulenza più moderata. La circolazione di tale virus, denominato HIV-2, appare limitata al Corno Occidentale d’Africa, con sporadiche
apparizioni anche in Europa.
L’infezione
Le modalità di trasmissione possono essere sostanzialmente ricondotte a trasmissione sessuale, parenterale e trasmissione verticale, in analogia ad altre infezioni sistemiche virali.
Nella seguente tabella viene riportata l’efficienza di
trasmissione delle differenti modalità ed il loro contributo complessivo a livello mondiale nel sostenere l’at-
I retrovirus
Il virus HIV appartiene alla famiglia dei retrovirus;
Con tale denominazione si definisce una famiglia di
virus il cui genoma è costituito o da RNA, nella fase in
cui il virione completo si trova al di
fuori della cellula, o da DNA, nel
momento in cui il microrganismo
TRASMISSIONE
Efficienza di trasmissione
Proporzione stimata
infetta la cellula ospite e si integra
da singolo contatto
su sospetti positivi
nel suo genoma.
L’evento fondamentale della
SESSUALE
0,1 – 1%
70 – 80%
replicazione di questo virus è perciò
la sintesi di DNA a partire dall’RPARENTERALE
0,5 – 1%
5 – 10%
NA presente nel proprio genoma.
Tossicodipendenza
Tale sintesi avviene ad opera di una
DNA polimerasi RNA dipendente
PARENTERALE
< 0,5%
< 0,01%
virus-specifica (trascrittasi inversa).
Puntura accidentale
I retrovirus si attaccano alla cellula
bersaglio per mezzo di proteine delPERINATALE
13 – 30%
5 – 10%
l’envelope specializzate nel riconoscere specifici recettori della superficie cellulare.
Tratta da: Le infezioni umane da Retrovirus. (Roche Diagnostic Systems).
Inizia allora un processo di conversione delle proteine virali quiescenti in complessi enzimatici attivi che presiedono tuale pandemia di infezione da HIV.
alla trascrizione e all’integrazione del virus.
L’infezione da HIV può essere asintomatica o sintoIl DNA virale integrato (provirus) è a sua volta tra- matica (malattia acuta).
scritto dalla RNA polimerasi della cellula ospite in
A distanza di 2 - 24 settimane dal contagio il sogRNA messaggero che codificherà per le proteine virus getto infettato produce anticorpi contro il virus (siero-
132
conversione) e diviene sieropositivo cioè portatore
asintomatico del virus, per cui sta bene, ma può infettare altre persone. Questa fase può durare alcuni anni.
Il primo segno clinico della malattia è un ingrossamento generalizzato delle linfoghiandole (Persistent
Generalized Linphoadenopathy, PGL); poi, con il progredire dell’immunodepressione, cominciano a palesarsi i sintomi di malattia genericamente indicati come
ARC (AIDS Related Complex).
Successivamente, dopo un periodo di tempo variabile da alcuni mesi ad un paio di anni, si svilupperanno le infezioni opportunistiche e le neoplasie caratteristiche dell’AIDS conclamata.
La diagnosi
La strada maestra per la diagnosi di ogni patologia
infettiva è la ricerca e l’identificazione dell’agente eziologico oppure di una sua traccia non equivoca (un
antigene o un segmento di genoma) in un campione
patologico adeguato.
L’infezione da HIV possiede la peculiarità di persistere, una volta instauratasi, anche nei periodi di
remissione clinica, perciò la diagnosi di certezza dell’infezione in atto può essere posta anche attraverso il
rilievo degli anticorpi specifici nel siero dell’individuo.
La positività del test di screening immunoenzimatico, soprattutto in presenza di dati anamnestici positivi,
è indicativa della presenza dell’infezione. L’infezione
deve comunque essere sempre convalidata mediante
l’esecuzione del test di conferma in Western blot (WB).
Questo test appare di grande rilevanza soprattutto
in assenza di dati anamnestici positivi e di bassa reattività del test di screening.
Il test WB combinato con l’evidenza degli anticorpi
contro la proteina P36 propria del virus HIV-2 è inoltre
indicativo dell’infezione da HIV-2.
La diagnosi sierologica dell’infezione da HIV si
basa su metodi indiretti (ricerca di anticorpi) e su
metodi diretti (ricerca del genoma virale).
1. Metodi indiretti
• Test immunoenzimatico (Elisa): è il primo test eseguito quando si sospetta il contagio, ed il test più noto
e più diffuso per lo screening (Test HIV 1/2).
• Test Western blot: è il test più utilizzato come conferma della positività del test Elisa. Distingue i diversi
anticorpi prodotti dal sistema immunitario in risposta
a particolari prodotti (antigeni) del virus. I principali
sono: GAG, POL, e le proteine del rivestimento virale
(envelope, ENV).
2. Metodi diretti
Metodi basati sulla ricerca del genoma del virus
HIV.
Il test PCR (che individua anche minime quantità di
acido nucleico, amplificandole) viene usato anche per
la conferma del test anticorpale e come primo esame
per la diagnosi neonatale.
Criteri di indagine e precauzioni
Prelievo: tutti i prelievi di sangue debbono essere
considerati potenzialmente infetti. Per la raccolta dei
campioni per test sierologici (test di screening e di conferma per gli anticorpi anti HIV) utilizzare provette
sottovuoto.
Per la ricerca di sequenze genomiche (PCR) utilizzare provette Vacutainer contenenti EDTA come anticoagulante (l’eparina inibisce la Polimerasi)
Trasporto: dopo il prelievo i campioni devono essere consegnati quanto prima al Laboratorio.
Per i test di PCR il plasma deve essere separato
entro 6 ore dal prelievo e congelato a -20° C o conservato a 4° C per non più di 3 giorni.
133
Sospetta infezione
da HIV
Test
Elisa
Positivo
Western
Blot
Positivo
Positivo
Negativo
Con segni
di possibile
infezione
Senza segni
di possibile
infezione
Negativo
PCR
HIV
Negativo
PCR
HIV
Test Elisa
dopo 6 mesi
Positivo
Negativo
Infezione
da HIV
Paziente
HIV
negativo
Algoritmo diagnostico infezione da HIV.
134
Infezione
da HIV
IL LABORATORIO NELLA PATOLOGIA DA
HELICOBACTER PYLORI
Patrizia Petricci
La patologia gastroenterologica nel corso di questi stata identificata la sequenza del gene cagA (cytoultimi anni è stata rivoluzionata dalla scoperta di un toxin-associated gene) perhè codifica una proteina di 128
batterio: l'Helicobacter pylori, fatta da due ricercatori KDa, responsabile della produzione di citotossina ma
australiani Warren e Marshall.
non dell'attività di mediatore della citotossina. AntiL'Helicobacter pylori rappresenta la chiave pato- corpi per il cagA e per la citotossina vacuolizzante
genetica che ha aperto la porta della comprensione di sono maggiormente presenti nei pazienti con ulcera
molte patologie gastroenteriche; ma mentre per alcune duodenale rispetto a quelli senza ulcera. Questi dati
di esse esistono molti studi che ne provano la colpevo- depongono per l'esistenza di ceppi specifici di H. pylolezza (vedi gastrite cronica antrale e ulcera peptica) per ri associati ad ulcera duodenale. L’utilizzo di test per la
altre ci sono solo fondati sospetti (dispepsia, carcinoma ricerca degli anticorpi anti CagA ha caratterizzato la
e linfoma gastrico).
prima fase della diagnostica sierologia per l’H. Pylori
L'Helicobacter pylori è un batterio Gram negativo, in soggetti portatori o con sintomatologia suggestiva
spiraliforme dotato di una spiccata mobilità e di un per ulcera duodenale.
elettivo tropismo per l'epitelio gastrico.
Un ruolo non indifferente nel danno epiteliale da
H. pylori è giocato dalla reazione immunitaria verso il
Meccanismi patogenetici
batterio. Buona parte della comprensione della patoge1) spiccata motilità dovuta alla caratteristica forma nesi delle malattie gastroduodenali passa attraverso
elicoidale e alla presenza di flagelli;
l'interazione tra batterio e reazione immunitaria locale
2) capacità di adesione dell'H. pylori nei confronti dell'ospite, anche perchè sembra che la risposta infiamdell'epitelio gastrico dovuta a sostanze glicoproteiche matoria locale possa essere differente in base ai diversi
della superficie batterica che consentono il riconosci- ceppi di H. pylori. E' quindi sulla base di queste intemento di specifici recettori di membrana delle cellule razioni (caratteristiche del batterio e caratteristiche
epiteliali gastriche;
immunitarie e fisiologiche dell'ospite) che probabil3) produzione di tossine: una volta adeso alla mente opera la diversa evoluzione dell'infezione.
superficie della mucosa gastrica l'H. pylori può contriL'H. pylori oltre ad indurre alterazione dell'istolobuire al meccanismo patogenetico danneggiando le gia gastrica, in particolare della mucosa antrale dello
cellule con i suoi prodotti metabolici e/o con citotossi- stomaco, determina verosimilmente modificazioni di
ne, impedendo l'assunzione di sostanze nutritive o tipo funzionale sulla secrezione acida e sul rilascio di
innescando una reazione infiammatoria in risposta a enzimi ed ormoni quali pepsinogeno, gastrina e somadeterminati stimoli antigenici. In particolare, una delle tostatina. La maggior parte delle alterazioni fisiopatosostanze ritenute maggiormente responsabili è l'ureasi, logiche indotte dall'H. pylori riguarda la malattia ulceenzima che, oltre a caratterizzare l'H. pylori, produce rosa peptica. Sembra che l'ipergastrinemia riscontrata
ammonio scindendo l'urea plasmatica che trasuda nei soggetti ulcerosi sia un fattore dipendente dall'infenello stomaco. L'ammonio, tamponando l'acidità zione, o meglio dall'infiammazione causata dalla cologastrica crea un ambiente più favorevole alla crescita nizzazione batterica dell'antro gastrico. Ne sarebbe
del batterio e inoltre, alterando l'equilibrio elettrolitico prova anche il fatto che tra i sottotipi di gastrina esiintracellulare danneggia gravemente il muco e l'epite- stenti, nei soggetti ulcerosi H. pylori positivi sia
lio gastrico.
aumentata proprio la gastrina 17 che viene secreta a
L'H. pylori produce anche altre sostanze diretta- livello antrale. Oltre all'azione stimolante sulle cellule
mente o indirettamente citolesive. Tra queste le citotos- G secernenti gastrina, l’H. pylori sembra avere effetto
sine sono probabilmente le più importanti. Ne esistono inibente sulla secrezione di somatostatina, prodotta
diverse, alcune delle quali, come la citotossina da 120 dalle cellule D, il cui ruolo fisiologico è quello di inibiKDa, dotata di effetto vacuolizzante è strettamente re proprio il rilascio di gastrina e la secrezione acida
associata a diverse patologie gastroduodenali e, in par- gastrica. Da questa serie di eventi deriva un'azione
ticolare, all'ulcera del duodeno. E' stato clonato ed è globalmente stimolante sulla secrezione acida. La
135
gastrina oltre a stimolare le secrezioni acide gastriche
agisce anche come ormone trofico nei confronti delle
cellule parietali acido secernenti nel corpo gastrico.
Una prolungata ipergastrinemia secondaria all'infezione di H. pylori può dar luogo ad un incremento del
numero di cellule parietali ovvero ad un aumento
della massa di tali cellule.
L'H. pylori ha inoltre messo in discussione le precedenti teorie relative alla supposta origine familiare
dell'ulcera peptica, in base alla quale si riteneva che
fattori come l'iperpepsinogenemia e l'ipersecrezione di
acido fossero fattori trasmessi ereditariamente. La
dimostrazione che il trattamento dell'infezione determina sia la riduzione della pepsinogenemia che della
secrezione di acido, ha di fatto trasformato questi fattori da markers genetici di ulcera ad indicatori di infezione. In particolare, si ritiene che l'aumento del pepsinogeno sia dovuto all'aumentato turn over delle cellule del corpo gastrico in corso di infezione da H. pylori
e di conseguenza la sua riduzione è considerata un
indice per accertare l'avvenuta eradicazione dopo trattamento antibiotico.
Epidemiologia
L'infezione da H. pylori e la gastrite ad esso correlata non evolve necessariamente in una patologia clinicamente manifesta, anzi nella maggior parte dei casi
decorre asintomatica. Non sorprende quindi che essa
sia considerata la più comune "malattia infettiva" nel
mondo. Il batterio è maggiormente diffuso nei paesi in
via di sviluppo, tra le classi sociali più povere e in condizioni igieniche precarie. Queste caratteristiche geografiche e sociali depongono per un contagio inter
umano di tipo oro-orale e oro-fecale.
L'H. pylori può essere trasmesso e acquisito lungo
tutto il corso dell'esistenza di un individuo, tuttavia
sembra che l'infanzia rappresenti il periodo della vita
con il più alto rischio di trasmissione-acquisizione e
quello in cui l'infezione probabilmente comporta la
prognosi peggiore.
La percentuale di soggetti infetti è quindi strettamente dipendente dalla regione considerata. Nelle
nostre zone varia dal 40 al 60 % tra i soggetti di età
compresa tra i 50 e i 60 anni
Diagnosi
I test impiegati nella diagnosi di infezione da H.
pylori si distinguono in test invasivi che comportano
l'esecuzione di una gastroscopia e di un prelievo bioptico, e test non invasivi, per i quali viene richiesto un
prelievo di sangue o un semplice respiro.
E' intuibile quindi che in base alle loro caratteristiche i vari tests potranno essere utilizzati a scopo diagnostico, nella popolazione adulta o in quella pediatrica per screenare una popolazione, per monitorare un
trattamento eradicante o per ottimizzarlo.
1. Metodi invasivi
Istologico: questa tecnica si basa sulla valutazione
diretta su vetrino dell' H. pylori e richiede pertanto l'esecuzione di una biopsia gastrica e di una endoscopia.
• Tra gli svantaggi della metodica, oltre al requisito della gastroscopia vi è la necessità di personale preparato ed esperto, per contro possiede importanti vantaggi quali un'ottima sensibilità e specificità e consente
una valutazione della carica batterica e della gravità
della gastrite.
• Test rapido all'ureasi: il principio su cui si basa
questa metodica è quello di sfruttare la presenza di
ureasi nel batterio. Infatti l'H. pylori, prelevato
mediante biopsia, viene posizionato in apposite provette in cui è presente urea che in presenza dell'ureasi
batterica viene scissa in NH3 e CO 2. La produzione di
NH3 alza il pH del mezzo che viene rilevato da un
apposito indicatore.
• Coltura: l'esame colturale è l'esame diagnostico
più preciso; tuttavia accanto alla ovvia specificità assoluta, presenta limiti dovuti all'alto costo ed alla complessità tecnica. L'H.pylori è un germe molto difficile
da coltivare, che oltre al prelievo bioptico accurato,
richiede il trasporto in particolari media e quindi la
semina in appositi terreni di coltura a specifiche condizioni ambientali .
2. Metodi non invasivi
• Sierologia: l'infezione gastrica da H. pylori
determina una risposta immunitaria sistemica che permane per tutta la durata dell'infezione. Tale risposta è
caratterizzata dalla iniziale e transitoria produzione di
IgM, alla quale segue un aumento in poche settimane
di IgG e IgA. Il titolo delle immunoglobuline resta elevato in presenza di gastrite cronica attiva e tende lentamente a ridursi dopo l'eradicazione del batterio. La
determinazione del titolo anticorpale avviene mediante tecniche immunoezimatiche, tra cui l'ELISA, un test
dotato di una discreta sensibilità e specificità. Attualmente, tuttavia, la sierologia classica, ivi compresa
quella che utilizza la ricerca di anticorpi anti CagA
appare ridimensionata nel suo significato diagnostico
dall’avvento dei metodi diretti di ricerca dell’antigene.
Per tali motivi, attualmente, la ricerca e titolazione
degli anticorpi trova maggior impiego nella valutazione della risposta alla terapia antibiotica (riduzione del
titolo anticorpale).
• Breath-test: il principio di questa indagine è
sovrapponibile a quello del test rapido all'ureasi. Esso
si basa sulla capacità dell'ureasi batterica di scindere
l'urea con carbonio radiomarcato somministrato al
paziente. La scissione dell'urea libera anidride carbonica marcata con C13 che passa nell'aria espirata e viene
rilevata nel respiro mediante un gascromatografo.
Questa tecnica, rilevando minime quantità di ureasi a livello gastrico, consente di valutare la presenza o
l'assenza dell'infezione da H. pylori prima, durante e
136
dopo il trattamento. Diversamente dal breath-test con
C14 che impiega carbonio radioattivo, il C13 è assolutamente sicuro e può essere impiegato su qualsiasi
individuo.
Il breath test, considerato fino a poco tempo fa il
metodo di riferimento, ha trovato un ampio impiego
nonostante gli alti costi e la eseguibilità riservata a
pochi centri; attualmente il suo impiego è stato drasticamente ridotto.
• Ricerca diretta dell’antigene. Alcuni anni fa è
stato proposto un test qualitativo basato sulla ricerca
di antigeni strutturali dell’H. pylori presenti nelle feci
dei pazienti. Tale test, ed altri successivamente commercializzati, utilizzano anticorpi policlonali adesi
sulle pareti dei pozzetti della micropiastra; tali anticorpii si legano in modo specifico agli antigeni del batterio presente nel campione.
La ricerca diretta dell’antigene H. Pylori nelle feci è
attualmente il metodo d’elezione per la diagnosi ed il
monitoraggio post terapeutico dell’infezione.
137
IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSTICA DELLE
INFEZIONI DELLE VIE URINARIE
Cinzia Martinelli
L’esame colturale delle urine (Urinocoltura), permette un riscontro quantitativo dei germi patogeni, la
cui entità viene descritta dalla c.d. carica batterica.
L’unità di misura della carica batterica è
l’UFC/mL (Unità Formanti Colonie/mL), basata sul
presupposto che da ciascun batterio seminato sul terreno di coltura si sviluppi una sola colonia del ceppo in
esame.
Se la carica batterica è superiore o uguale a 100.000
UFC/mL la batteriuria è clinicamente significativa ed è
indicazione per l’esecuzione dell’antibiogramma eventualmente richiesto.
Per cariche batteriche inferiori si seguono i seguenti
criteri:
• se le colonie sono rappresentative di una flora batterica polimorfa, la “batteriuria” è ritenuta risultato di
una contaminazione; in questo caso può essere consigliata una nuova raccolta del campione;
• se la crescita batterica presenta caratteristiche di
coltura pura di un germe patogeno, l’entità della carica
viene comunque segnalata e, se richiesto, viene eseguito l’antibiogramma. In questo caso, comunque, l’esatta
interpretazione del dato colturale deve essere integrata
da informazioni di laboratorio aggiuntive (esame del
sedimento urinario) e tener conto del contesto clinicoanamnestico (batteriostasi da precedente terapia antibiotica).
In mancanza di specifico quesito diagnostico che
indirizzi la ricerca verso particolari patogeni, sono correntemente utilizzati terreni di coltura che permettono
la crescita dei batteri aerobi responsabili della maggior
parte delle infezioni delle vie urinarie: Enterobatteri,
Gram negativi ossidanti (Pseudomonas ecc.), Streptococchi, Stafilococchi e Miceti.
dell’uretra e la zona circostante, sciacquarsi con acqua
ed asciugarsi;
• tenere divaricate le grandi labbra durante la minzione;
• emettere la prima parte delle urine senza raccoglierla;
• raccogliere direttamente nel recipiente sterile la
seconda parte (non più di 10 - 15 ml);
• richiudere accuratamente il contenitore in modo
che l’urina non fuoriesca durante il trasporto.
Sesso maschile:
• lavarsi le mani con acqua e sapone ed asciugarsi;
• retrarre il prepuzio, lavare accuratamente con
acqua e sapone l’orifizio dell’uretra e la zona circostante, sciacquarsi con acqua ed asciugarsi;
• tenendo retratto il prepuzio emettere la prima
parte delle urine senza raccoglierla;
• raccogliere direttamente nel contenitore sterile la
seconda parte;
• richiudere accuratamente il contenitore in modo
che l’urina non fuoriesca durante il trasporto.
Bambini piccoli (raccolta in sacchetto di plastica
sterile quando non è possibile ottenere le urine del
getto intermedio):
• detergere con acqua e sapone i genitali esterni e la
regione circostante, sciacquare con acqua ed asciugare;
• applicare il sacchetto facendolo aderire alla zona
intorno ai genitali;
• se dopo circa 60 minuti non si è verificata minzione, rimuovere il sacchetto e provvedere alla sostituzione ripetendo il lavaggio;
• appena avvenuta la minzione, rimuovere il sacchetto e travasare con attenzione le urine in un contenitore sterile e portare in Laboratorio.
Il “problema” della raccolta
Le modalità della raccolta del campione di urina da
sottoporre a coltura influenzano enormemente la qualità del risultato. E’, infatti, in questa fase che può verificarsi la maggior parte degli inquinamenti.
Le raccomandazioni per una corretta raccolta delle
urine sono, in genere, differenziate per sesso ed età:
Sesso femminile:
• lavarsi le mani con acqua e sapone ed asciugarsi;
• lavare accuratamente con acqua e sapone l’orifizio
Quantità da raccogliere e modalità di conservazione
Per germi comuni e miceti sono necessari 10-15
mL di urina. Se passano più di 2 ore prima della consegna al laboratorio, tenere il campione in frigo a + 5°C;
non superare, in ogni caso, le 24 ore dalla raccolta.
Per l’esame colturale dell’urina per Mycobatteri è
necessario un volume di almeno 40 mL. E’ consigliabile effettuare l’esame per tre giorni consecutivi. Anche
per questa ricerca valgono, nel caso di consegna non
immediata, le stesse raccomandazioni di conservazio-
138
ne. Le stesse modalità di raccolta sono utilizzate anche
per la ricerca diretta dei Mycobatteri nelle urine con
la tecnica di amplificazione genica mediante reazione
polimerasica a catena (PCR).
Accanto alle metodiche tradizionali su piastra, si
sono affermate negli ultimi anni, tecniche di screening
per le urinocolture che permettono una valutazione
rapida della crescita batterica e, di conseguenza, la
discriminazione, in meno di 3 ore, delle colture negative da quelle positive; quest’ultime vengono successivamente avviate alla tradizionale semina su piastra.
Questi sistemi utilizzano il principio della lettura
nefelometria o turbidimetrica di particelle in sospensione e, quindi, sono in grado di rilevare, con l’uso di
un software dedicato, sia la crescita batterica (presenza
di particelle in sospensione), sia la velocità di crescita
(aumento del numero di particelle nell’unità di
tempo); il confronto con standard nefelometrici di riferimento (Mc Farland) permette, inoltre, di esprimere il
risultato di positività anche con l’indicazione della
carica in UFC/mL.
Un’interessante implicazione dell’uso dei sistemi
automatici di screening delle urinocoltura è rappresen-
tata dalla non interferenza sul risultato delle terapie
antibiotiche eventualmente intraprese. Infatti, la diluizione iniziale cui è sottoposto il campione in esame,
determina una diluizione della concentrazione urinaria dell’antibiotico al di sotto della Concentrazione
Minima Inibente (M.I.C.), facendo sì che il risultato
non sia influenzato dall’eventuale potere antibiotico
residuo.
Può accadere che sulle urine raccolte in maniera sterile sia richiesta la ricerca di patogeni che, non implicati in processi di infezioni delle vie urinarie in senso
stretto, rivestono importanza rilevante in patologie di
tipo urologico-ginecologico: tale è il caso della Chlamidia o del Gonococco o del Micoplasma. Occorre precisare, tuttavia che, in tali casi, è maggiormente indicato
il primo getto di urina” e che tale modalità di ricerca
deve essere riservata solo a pazienti maschi sintomatici. In tutti gli altri casi è indicato il campionamento
mediante tampone uretrale, valutando altresì la possibilità che, in relazione al quesito diagnostico, non
siano da preferire, per Chlamidia e Gonococco, tecniche di amplificazione genica mediante PCR.
139
LE CLAMIDIE
Cinzia Martinelli
Le Clamidie sono batteri intracellulari obbligati
delle cellule eucariotiche. Il loro ciclo cellulare, unico
nell’ambito dei procarioti, è caratterizzato dall’alternanza tra corpo elementare di piccole dimensioni ed
infettante ed il corpo reticolare, di maggiori dimensioni ma non infettante.
Al genere Clamidia appartengono tre specie: C. trachomatis, C. pneumoniae e C. psittaci.
C. trachomatis è un patogeno strettamente umano
che infetta prevalentemente l’epitelio congiuntivale e
genitale. C. pneumoniae è un patogeno che sembra
essere esclusivamente umano ed è responsabile di infezioni respiratorie. C. psittaci presenta invece un ampio
spettro d’ospite e l’uomo risulta essere un ospite accidentale.
Le infezioni umane dovute a C. trachomatis producono la comparsa di anticorpi diretti verso componenti
sia proteici che lipopolisaccaridici. La risposta immediata dell’organismo all’infezione è caratterizzata da
un’infiltrazione di polimorfonucleati a livello dell’epitelio della mucosa interessata sostituita rapidamente
da macrofagi, linfociti o plasmacellule in rapporto al
tipo di infezione. In seguito al trattamento antibiotico
molte infezioni acute guariscono mentre una piccola
parte cronicizza.
Particolari sierotipi di C. trachomatis sono considerati gli agenti eziologici dei tracoma endemico a
tutt’oggi è una delle cause maggiori di cecità.
La trasmissione dell’infezione avviene soprattutto
in situazioni di sovraffollamento, scarsa igiene, presenza di mosche che possono mediare la trasmissione.
I sierotipi D-K di C. trachomatis infettano invece i
genitali con una prevalenza dei 16-38% in donne
appartenenti a popolazioni a rischio di infezioni sessualmente trasmesse e dei 30-50%in uomini con uretrite non gonococcica.
I sierotipi (L1, L2, L3) sono invece gli agenti eziologici dei linfogranuloma venereo, malattia sistemica trasmessa per contagio sessuale, scarsamente osservabile
nei paesi occidentali.
I soggetti di sesso maschile con infezione uretrale
non gonococcica o post gonococcica presentano scarsa
secrezione purulenta, bruciore e disuria.
Nella donna invece l’infezione è localizzata alla cervice o alla portio e spesso all’uretra. L’infezione della
cervice può risalire nella cavità uterina e propagarsi
alle tube ed anche al peritoneo definendo il quadro
della malattia infiammatoria pelvica (PID).
La sintomatologia varia a seconda della localizzazione per cui nelle cerviciti purulente si osserva
aumento della secrezione, prurito, bruciore, dolore pelvico e perdite ematiche mentre la sindrome uretrale
acuta è caratterizzata da disuria, piuria ed esame batteriologico delle urine negativo.
Nella PID il segno clinico prevalente è il dolore
addominale che simula un addome acuto mentre nelle
forme subacute o croniche l’infezione provoca alterazioni dell’epitelio delle tube provocando sterilità di
tipo meccanico.
Qualora la donna portatrice di infezione sia gravida, il rischio per il neonato di infezione della congiuntiva è del 20-25% mentre quello di contrarre polmonite
o bronchiolite è del 5-10%.
L’infezione da C. pneumoniae si contrae per contatto diretto tra soggetto infetto e sano, è molto comune
nella popolazione e la persistenza, a titoli elevati, di
anticorpi nella popolazione adulta fa pensare che le
reinfezioni siano molto frequenti e che si manifestino
spesso in forma asintomatica o paucisintomatica.
La diagnosi delle infezioni sostenute da Clamidia
necessita l’apporto dei laboratorio poiché l’anamnesi e
l’indagine clinica non sono da sole sufficienti per la
diagnosi eziologica.
L’indagine microbiologica si avvale principalmente
della ricerca diretta delle Clamidie o loro parti nel
materiale patologico ed in misura minore dell’indagine
sierologica che presenta notevoli limitazioni eccetto i
rari casi in cui è possibile osservare una evidente sieroconversione.
La ricerca diretta, nella quale è di fondamentale
importanza la corretta raccolta del campione, può essere eseguita con:
1. la tecnica di immunofluorescenza diretta (IFD)
2. la Polimerase Chain Reaction (PCR)
3. metodo colturale.
Immunofluorescenza diretta: viene utilizzata prin-
140
cipalmente per la ricerca di C. Trachomatis in tamponi
congiuntivali, cervicali ed uretrali. Il test ha una sensibilità dal 70% all’87% ed una specificità dei 100%.
PCR: questo test è senz’altro il più specifico e sensibile (=100%). Questa caratteristica presenta però il suo
rovescio: ha infatti un costo ancora elevato ed è molto
sensibile alla presenza di inibitori nel campione.
Metodo colturale: è considerato da molti il metodo
di riferimento per la diagnosi, tuttavia, essendo un’indagine lenta laboriosa e richiedendo l’uso di colture
cellulari, è riservata solo a particolari centri. Essa inoltre richiede che i campioni patologici contengano il
microrganismo in forma vitale e capace di riprodursi.
Perché la ricerca di Clamidia nei vari materiali
abbia un esito soddisfacente deve essere posta partico-
lare attenzione durante l'esecuzione dei prelievo che
nella donna deve essere effettuato all'interno del canale cervicale (es, con citobrush) o dall'uretra, avendo
cura di allontanare il materiale purulento, il muco ed il
sangue eventualmente presenti.
Il materiale purulento risulta infatti non idoneo per
le indagini mentre muco e sangue inibiscono il processo di amplificazione (per inibizione della polimerasi)
ed ostacolano la lettura in fluorescenza. E' importante
altresì che il paziente non abbia urinato nell'ora precedente al prelievo, poiché l'urina rimuove le cellule
durante il passaggio dall'uretra. Inoltre, nel prelievo
dal canale cervicale, è importante che il tampone utilizzato per la raccolta dei materiale venga ruotato con
una pressione tale da ottenere un adeguato numero di
cellule dell'epitelio colonnare, evitando il contatto con
le superfici vaginali.
141
IL LABORATORIO NEL MONITORAGGIO DELLA
GRAVIDANZA
Antonio La Gioia
A) PREVENZIONE DEL DANNO DA AGENTI
INFETTIVI
Le malattie infettive possono danneggiare il feto sia
indirettamente per gli effetti sfavorevoli sull'organismo materno, sia direttamente per via ematogena o
per contiguità.
La gravità delle lesioni causate da un’infezione in
utero è in relazione con l'agente infettivo e con l'epoca
gestazionale di contagio.
Toxoplasmosi
L'infezione toxoplasmica contratta prima del concepimento conferisce alla donna un’immunità permanente nei confronti del rischio d’infezione fetale. L'infezione contratta durante la gravidanza può essere trasmessa al feto con effetti variabili in relazione all’età
gestazionale (aborto nel primo trimestre; idrocefalo,
corioretinite, calcificazioni endocraniche nel secondo
trimestre; lesioni meno gravi nel terzo trimestre).
Diagnosi di Laboratorio: il problema principale è
BATTERI
VIRUS
ALTRI AGENTI
Listeria Monocitoides
Virus della Rosolia
Toxoplasma Gondii
Treponema pallidum
Citomegalovirus
Plasmodium
Mycobacterium tubercolosis
Epstein-Barr
HIV
Parvovirus B 19
Nella tabella sono riportati i principali agenti infettivi responsabili di infezioni prenatali ematogene transpalcentari; in grassetto sono evidenziati quelli oggetto
della presente scheda, convenzionalmente compresi
sotto l'acronimo TORCH (Toxoplasmosi, Rosolia, Citomegalovirus, Herpesvirus).
Le infezioni da toxoplasma, citomegalovirus e rosolia contratte in gravidanza debbono, ai fini di un’efficace prevenzione, essere diagnosticate tempestivamente
affinché, le conseguenti misure terapeutiche possano
essere attuate in tempo utile. Ciò è tanto più necessario in quanto le probabilità per una donna in età fertile
di contrarre spontaneamente l'infezione in epoca antecedente la gravidanza si sta significativamente riducendo e, per quanto possa apparire inverosimile, le
possibili pratiche vaccinali (rosolia) non assicurano
ancora una copertura ottimale della popolazione esposta. La diagnostica sierologica mediante ricerca di anticorpi specifici è la sola che possa essere applicata a
bassi costi e su larga scala. Di seguito sono esaminati i
profili sierologici maggiormente significativi per le tre
patologie infettive di più frequente riscontro e di maggior rischio teratogeno.
rappresentato dalla datazione di una possibile infezione, nel caso in cui la donna non abbia documentato il
proprio stato sierologico preconcezionale. Di seguito
sono fornite le interpretazioni di alcuni profili sierologici, con la precisazione che si tratta solo di aspetti
orientativi poiché, ogni caso, deve essere valutato
anche sulla base dei criteri clinico anamnestici.
La sierologia attuale prevede la ricerca e quantificazione delle IgG e la ricerca delle IgM antitoxoplasma.
Criteri interpretativi:
• IgM ed IgG negative: soggetto non immunizzato,
recettivo nei confronti dell’infezione toxoplasmica;
• IgM presenti ed IgG presenti: tale profilo sierologico è in genere caratteristico dell'esordio dell’infezione; tuttavia non è raro il caso di persistenza delle IgM
anche per oltre 18 mesi dall'inizio dell’infezione (IgM
residue). In questi casi è indispensabile ripetere le
determinazioni a distanza di 14-21 giorni allo scopo di
valutare la cinetica anticorpale (nessuna variazione =
infezione pregressa con persistenza residua di IgM;
incremento o riduzione = infezione recente). Maggiori
informazioni sono fornite dal dosaggio delle IgAspeci -
145
fiche antitoxoplasma che sono prodotte dal sistema
immunitario leggermente più tardi delle IgM, prima
delle IgG e permangono in circolo per non più di tre
mesi: la loro positività è indicativa d’infezione recente.
• IgG presenti ed IgM assenti: la presenza di IgG
antitoxoplasma a basso titolo depone per infezione
pregressa. Se le IgG sono ad alto titolo e il dosaggio è
stato effettuato per la prima volta dopo il quarto mese
di gravidanza, non può essere esclusa un’infezione primaria postconcezionale.
• IgM presenti IgG assenti: le IgM antitoxoplasma
sono presenti, prima della positivizzazione delle IgG,
nelle fasi iniziali dell’infezione; in questo caso un successivo prelievo a distanza di due settimane evidenzierà una variazione del titolo IgM e la positivizzazione delle IgG. Nel caso in cui Le IgM persistono in
assenza delle IgG si può escludere l'infezione ed attribuire la reattività IgM alla presenza di IgM naturali,
formatesi, vale a dire, in assenza di contatto con il
toxoplasma.
Rosolia
La maggior parte delle gestanti presenta anticorpi
anti virus della rosolia di classe IgG, acquisiti a seguito
di malattia o di vaccinazione. Questi soggetti non
necessitano, in gravidanza, di ulteriori controlli.
La diagnosi sierologica di rosolia acuta richiede la
documentazione della sieroconversione, vale a dire la
comparsa ex-novo di anticorpi anti virus della rosolia.
Più frequentemente lo stato immunitario preconcezionale non è conosciuto e i dati anamnestici non sono
conclusivi per precedente infezione o per vaccinazione; in questi casi occorre determinare il movimento
anticorpale specifico su due prelievi eseguiti a distanza
di alcuni giorni l'uno dall'altro, valutando l'aumento di
titolo IgG ed IgM.
Le IgM antirosolia compaiono generalmente 1-3
giorni dopo l'esantema, raggiungono il picco dopo
circa sette giorni e scompaiono dal circolo entro 8-12
settimane; in alcuni soggetti, tuttavia, le IgM permangono per mesi o anni. Appare opportuno ribadire, pertanto, che l'unico modo per distinguere un’infezione
recente (potenzialmente pericolosa per la gravidanza)
da un’anomala persistenza delle IgM (di nessun effetto
sulla gravidanza) è rappresentato dalla variazione del
titolo anticorpale valutata a distanza di 2-4 settimane.
Infezione da citomegalovirus (CMV)
I problemi diagnostici relativi all’infezione da virus
citomegalico possono essere così schematizzati:
• accertamento di infezione pregressa: a tale scopo
è sufficiente la rilevazione di IgG anti CMV che documentano l'avvenuto contatto del virus con il sistema
immunitario dell'ospite;
• identificazione di infezione attiva : la documentazione di IgM anti CMV non sempre è sufficiente a questo scopo poiché le IgM possono permanere in circolo
per molti mesi dopo la fase acuta; il criterio della varia-
zione di titolo non è affidabile sia per motivi metodologici sia per una cinetica particolarmente "lenta". Tale
diagnosi poggia quindi essenzialmente sulla ricerca
diretta nelle urine del virus infettante con l'uso di
metodiche di amplificazione del materiale nucleico; tra
queste la più affidabile è rappresentata dalla Reazione
di Polimerizzazione a Catena (PCR); oltre che nelle
urine il virus può essere ricercato nel sangue e, particolarmente nei neutrofili periferici.
• identificazione di infezione primaria: le possibilità di trasmissione transplacentare del CMV sono
legate all’infezione primaria della madre, piuttosto che
alle reinfezioni. La diagnosi di infezione primaria poggia esclusivamente sulla possibilità di documentare
che un’infezione attiva (vedi punto precedente) abbia
determinato la comparsa di anticorpi specifici in un
soggetto precedentemente sieronegativo (sieroconversione).
I test di avidità delle IgG
L'analisi dei diversi profili sierologici per le infezioni da toxoplasma, CMV e rosolia è spesso di interpretazione non agevole. Inoltre, non è sempre possibile
determinare con sicurezza sufficiente a dettare l’intervento terapeutico (o il non intervento), il periodo di
infezione, anche a causa di rilevanti variazioni individuali nella risposta anticorpale.
In tempi recenti è stata messa a punto la metodica
IgG avidity che, affiancata alla sierologia "classica"
permette una migliore datazione dell'esordio infettivo.
Tale metodica si avvale dell'evidenza che le immunoglobuline di classe IgG anti toxoplasma, anti rosolia ed
anti CMV posseggono una più bassa capacità di legame per l'antigene (avidity) nelle prime fasi di infezione; pertanto le IgG precoci, a bassa affinità di legame,
possono essere più facilmente distaccate dall'antigene
rispetto alle IgG che si formano più tardivamente. Utilizzando tale principio sono stati messi a punto test
IgG avidity anti toxo, anti CMV ed anti rosolia che permettono una migliore interpretazione dei profili sierologici e quindi una maggiore affidabilità diagnostica
della fase precoce d'infezione.
B) IL CONTROLLO BIOCHIMICO DELLA
GESTANTE E DELL’UNITA’FETO-PLACENTARE
Oltre che nella prevenzione del danno fetale da
malattie infettive, la diagnostica di laboratorio in ostetricia mantiene una grande utilità clinica ed alcune
determinazioni si affiancano ancor oggi alle indagini
strumentali come ausilio per il corretto monitoraggio,
sia dello stato di salute della gestante che dell’unità
feto-placentare.
Monitoraggio biochimico della gestante
Se la donna ha eseguito un controllo preconcezionale, possono essere omessi ulteriori accertamenti di
laboratorio nel corso del primo trimestre di gravidan-
146
za. Più frequentemente accade che il controllo preconcezionale sia stato omesso; in tal caso si rende necessaria una valutazione della situazione immunologica e
dei principali parametri di laboratorio con lo scopo di
accertare:
a) se eventuali modificazioni sono già presenti nelle
fasi iniziali della gravidanza;
b) se i fenomeni di adattamento dell’organismo
femminile presenteranno un andamento regolare. Tale
adattamento coinvolge il sistema ematologico ed
immunologico, i metabolismi lipidico, glicidico, protidico ed idrominerale e le funzioni renali ed epatiche.
Poiché la gravidanza è una situazione dinamica,
molti parametri biochimici devono essere riferiti per la
loro interpretazione all’età gestazionale.
Anomalie dei test di primo livello o la valutazione
anamnestica e clinica possono suggerire ulteriori
approfondimenti come, ad esempio:
• valutazione del bilancio del ferro (ferritinemia;
transferrinemia; indice di saturazione della transferrina; recettore solubile della transferrina) nel caso si evidenzi anemia ipocromica;
• test coagulativi (vedi scheda relativa);
• studio della funzionalità renale (creatinina e clearance della creatinina; proteinuria ed eventuale elettroforesi delle proteine urinarie).
Il diabete gestazionale
Lo screening va condotto su tutte le donne tra la 24a
e la 28 a settimana di gravidanza e consiste in una glicemia a 60’ dalla assunzione di 50 g di glucosio per os:
valori a 60’ superiori a 140 mg/dL sono indicazione
per la esecuzione di una curva da carico con 100 g di
glucosio. La curva completa va eseguita anche nei
seguenti casi:
• glicemia a digiuno uguale o superiore a 105
mg/dL;
• presenza di glicosuria normoglicemica;
• familiarità di I° grado per diabete;
• precedenti aborti;
• precedente macrosomie fetali;
• obesità.
La diagnosi di diabete gestazionale viene posta in
presenza di due o più dei criteri sotto specificati:
• glicemia a digiuno ≥ 105 mg/dL;
• glicemia a 60’ ≥ 190 mg/dL;
• glicemia a 120’ ≥ 165 mg/dL;
• glicemia a 180’ ≥ 145 mg/dL.
Valori a 120’ compresi tra 120 e 164 mg/dL depongono per “ridotta tolleranza gestazionale al glucosio”.
Nota ai criteri diagnostici di diabete gestazionale
Su tale argomento vi è attualmente una notevole
confusione. Se infatti è abbastanza largamente accetta-
to il criterio della diagnosi in 2 tempi (“mini curva” e
successiva OGTT), vi sono ancora controversie sia
sulle modalità di somministrazione del glucosio (75
grammi come per la curva degli adulti o 100 grammi)
che, soprattutto, sui criteri decisionali (O’Sullivan,
1964; NDDG, 1979; Carpenter, 1982).
Nel 1998, il 4° Workshop di Chicago ha raccomandato l’utilizzo dei criteri di Carpenter (carico da 100 gr
di glucosio; glicemia a digiuno 95mg/dL; ed a 1, 2, 3
ore 180, 155, 140 mg/dL rispettivamente). Tale raccomandazione è stata recepita dalla Società Italiana di
Diabetologia (SID) a seguito delle indicaziono di uno
specifico gruppo di studio “Diabete e Gravidanza. Il
Diabete, 2000).
A complicare le cose interviene una delibera della
Regione Toscana (n.1074 del 1/10/2001) che recepisce i
criteri ADA e SID sia per la definizione di malattia sia
per i criteri diagnostici del diabete ma mantiene i criteri NDDG per il diabete gestazionale.
Per tali motivi, tenuto soprattutto conto del fatto
che le prestazioni assistenziali sanitarie erogate dal S.S.
Regionale sono conseguenti alla diagnosi, i criteri da
noi adottati e precedentemente descritti sono quelli
indicati dalla Regione Toscana.
Monitoraggio biochimico dell’unità fetoplacentare
Durante la gravidanza compaiono nel sangue
nuove proteine prodotte dalla placenta e dal feto. Di
queste, alcune sono dosate per valutare la funzionalità
e l’evolutività feto-placentare. Negli ultimi anni il perfezionamento delle indagini strumentali ha parzialmente ridimensionato il significato e l’uso clinico di
tali parametri, tanto che alcuni di questi, come l’ormone lattogeno placentare (HPL) e l’estriolo totale (E3),
utilizzati fino a poco tempo fa come indicatori delle
funzionalità placentare e, rispettivamente, dell’unità
feto-placentare, risultano oggi praticamente abbandonati.
Tra quelli ancora utilizzati, ricordiamo:
• Gonadotropina corionica o hCG: viene prodotta
dal trofoblasto ed ha azione luteotropa. Il suo dosaggio
o come molecola intatta o come sub-unità β-hCG esprime la funzionalità del sinciziotrofoblasto; i valori di
hCG crescono esponenzialmente fino alla 12a settimana
e quindi decrescono rapidamente, restando per le successive settimane a valori pari ad 1/5 - 1/10 di quelli
iniziali.
• alfa-fetoproteina: glicoproteina prodotta dal fegato fetale, con funzioni analoghe a quelle dell’albumina
dell’adulto. Il suo livello aumenta fino alla 32a settimana per poi diminuire gradatamente. Nei casi di minac cia d’aborto nel secondo trimestre la sua progressiva
riduzione è un indice sfavorevole, mentre valori elevati (oltre 2.5 multipli di mediana) sono in relazione con
anomalie del tubo neurale.
147
LA DIAGNOSTICA PRENATALE - 1. IL LABORATORIO
NELLO SCREENING BIOCHIMICO PRENATALE PER I
DIFETTI DEL TUBO NEURALE E LA SINDROME DI
DOWN
Maria Bombara
La sindrome di Down è la più comune anomalia
cromosomica del neonato e consiste, nella maggior
parte dei casi, in una trisomia del cromosoma 21 o, più
raramente, in una traslocazione di una porzione del
cromosoma 21 su un altro cromosoma (di solito il 14).
Il rischio di gravidanza Down nella popolazione
generale è pari a circa lo 0,13%; a tale rischio corrisponde l’attesa di una nascita con trisomia 21 ogni 800
nascite circa.
La probabilità di avere un feto affetto da s. di Down
aumenta esponenzialmente con l’aumentare dell’età
materna (ad esempio, una gestante di 25 anni al parto
ha un rischio di 1/1350, mentre una gestante di 40 anni
al parto ha un rischio di 1/110). Tuttavia, poiché la
distribuzione delle nascite è prevalente nelle donne
giovani, circa il 70-75% dei bambini Down nasce da
madri di età inferiore ai 35 anni, considerate a basso
rischio.
I difetti del tubo neurale (DTN) sono embriopatie
comprendenti un insieme molto complesso di malformazioni del sistema nervoso centrale, dovute ad
imperfetta fusione delle strutture cranio-encefaliche o
delle strutture dorsali mediane. Ad eziologia multifattoriale (importanti i deficit nutrizionali come la carenza di acido folico), presentano un’incidenza in Italia,
con particolare riferimento alla spina bifida aperta, di
circa 0,5-0,9 casi per 1000 nati.
Negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi di
diagnosi prenatale per l'identificazione delle più frequenti anomalie genetiche e particolarmente, a causa
della elevata incidenza, per l'evidenziazione prenatale
della s. di Down; tali metodi vengono tradizionalmente suddivisi in invasivi e non invasivi.
Metodi invasivi:
consistono nella “invasione” strumentale dell’ambiente feto-placentare e nel prelievo di materiale utilizzato per indagini citogenetiche o biochimiche.
• Prelievo dei villi coriali: ottenuto per via transcervicale o, più comunemente, per via transaddominale, permette l’analisi cromosomica già nel primo trimestre di gravidanza. Il prelievo dei villi coriali è associato con un aumento del rischio di aborto pari a circa
il 2,5%.
• Amniocentesi: prelievo di liquido amniotico otte-
nuto, generalmente, tra la 15a e la 17 a settimana di gra vidanza. Le cellule fetali sospese nel liquido amniotico
vengono poste in coltura ed utilizzate per la determinazione del cariotipo; viene determinata anche la concentrazione dell’alfa-fetoproteina, per l’evidenziazione
di eventuali DTN (per un approfondimento vedi scheda amniocentesi).
La possibilità di effettuare la diagnosi prenatale
mediante amniocentesi viene offerta dal S.S.N. alle
gestanti di età più avanzata (35 anni al parto), oppure
alle gestanti risultate positive allo screening biochimico. E’ da sottolineare che l’amniocentesi è associata con
un aumento del rischio di aborto pari a circa 0,5-1%.
Per questo motivo, oltre che per gli alti costi, non viene
generalmente consigliata alle gestanti a basso rischio.
Metodi non invasivi:
Sono rappresentati essenzialmente dalla ecografia e
dagli screening biochimici prenatali.
• Ecografia: nel secondo trimestre di gravidanza
possono essere rilevati diversi dati ultrasonografici
indicativi per s. di Down, tra cui l’ispessimento della
plica nucale o le dimensioni ridotte di femori ed omeri;
presentano, però, una scarsa sensibilità. Più promettente risulta essere la misura della translucenza nucale,
effettuata da operatori esperti in 10 a-13a settimana, particolarmente in associazione allo screening biochimico.
Per quanto riguarda i DTN, un valido esame ecografico può essere eseguito solo dopo la 20a-22a settimana a causa della tardiva ossificazione dell’arco vertebrale nel tratto distale (nel secondo trimestre è possibile escludere solo l’anencefalia).
• Screening biochimici: sono basati sulla valutazione quantitativa di proteine fetoplacentari la cui concentrazione risulta significativamente diversa nelle
gravidanze con feto affetto rispetto a quelle con feto
normale. Negli ultimi anni sono stati proposti numerosi parametri (hCG, free β-hCG, alfa-fetoproteina,
estriolo libero, inibina-A) valutabili nel secondo trimestre di gravidanza che, utilizzati singolarmente o
diversamente associati, hanno evidenziato differente
specificità e sensibilità. Fra i marcatori proposti più di
recente è da ricordare la Proteina A specifica della gravidanza (PAPP-A), utilizzabile per lo screening del
primo trimestre in associazione alla free β-hCG ed alla
148
misura ultrasonica della translucenza nucale. Recentemente è stato messo a punto da Nicholas Wald il cosiddetto test integrato, che combina in un’unica risposta i
risultati dello screening ecografico e biochimico
(PAPP-A) al primo trimestre con lo screening biochimico al secondo trimestre, ottenendo notevoli miglioramenti di sensibilità e specificità.
Al momento attuale, tuttavia, il test di screening
maggiormente utilizzato rimane il tri-test o test di
Wald.
IL TRI-TEST
Il test biochimico di screening per la sindrome di
Down è stato proposto, nella forma attualmente più
utilizzata (tri-test o triplo test), da Wald e coll. nel 1988.
Si basa sulle variazioni dei livelli nel siero materno di
tre analiti (ormoni e proteine) di origine fetale e/o
feto-placentare: l’alfa-fetoproteina (AFP), l’estriolo non
coniugato (uE3) e la gonadotropina corionica (hCG),
determinati nella 15a-18a settimana di gestazione. E’
stato osservato, infatti, che nelle gravidanze con feto
affetto da sindrome di Down i livelli di AFP e uE3
risultano mediamente più bassi rispetto alle gravidanze con feto normale di pari età gestazionale, mentre i
livelli di hCG risultano mediamente più alti. E’ possibile quindi, con un semplice prelievo di sangue, determinare i livelli ematici dei tre analiti e calcolare, utilizzando programmi computerizzati appropriati, il
rischio individuale di gravidanza affetta, a partire da
quello proprio dell'età materna; alle gestanti più a
rischio viene quindi proposta, indipendentemente
dalla loro età, la diagnosi prenatale mediante amniocentesi.
La valutazione del livello di AFP, effettuata nello
screening biochimico per la sindrome di Down, permette anche di individuare le gravidanze con rischio
aumentato di (DTN) aperti , nelle quali si verifica un
caratteristico aumento della proteina; viene quindi calcolato anche il rischio individuale per DTN.
Sulla base delle variazioni dei tre analiti è possibile
fornire anche altre informazioni, tra cui la segnalazione di gravidanze con rischio aumentato di trisomia 18
(notevole diminuzione dei livelli dei tre analiti).
Il ritrovamento, infine, di bassi livelli di estriolo
associati ad aumento dei livelli di AFP ed hCG depone
per un rischio aumentato di preeclampsia al terzo trimestre.
I risultati sono espressi come multipli della mediana di riferimento (MoM) dell’epoca gestazionale corrispondente; tutti i valori vengono corretti in base al
peso materno.
Attendibilità del tri-test
Fondamentale è la scelta della soglia del valore di
rischio (cut-off), che determinerà la capacità di individuazione dei soggetti affetti e il tasso di falsi positivi.
Un basso valore di cut-off permette, infatti, di individuare un maggior numero di gravidanze con feto
Down, ma avvia all’indagine invasiva un numero elevato di soggetti con feto normale, mentre un cut-off
alto fa diminuire il ricorso all’amniocentesi a scapito
dell’identificazione di un numero adeguato di gravidanze affette. Il cut-off da noi utilizzato è di 1 caso su
300 a termine, vicino al rischio di una donna di 36 anni
al parto. La sensibilità attesa con questo cut-off nelle
nostre condizioni operative è del 69%, mentre il tasso
di falsi positivi è di circa il 6,2%. Questo significa che
potranno essere individuate circa 2 gravidanze Down
su 3, avviando alla diagnostica invasiva un numero
sostanzialmente basso di gestanti.
Da segnalare che nella gestante fumatrice si verifica
una perdita di sensibilità del test, a causa di una diminuzione dei livelli di hCG, provocata dall’abitudine al
fumo.
In alcune particolari condizioni (screening negativo, ma con rischio aumentato rispetto a quello per età
a causa della presenza di una concentrazione moderatamente elevata di hCG) è possibile aumentare la capacità di individuazione del test valutando il decorso dei
livelli di hCG a distanza di una settimana dal primo
prelievo; infatti, contrariamente alle gravidanze con
feto normale, nei casi di sindrome di Down il livello
dell’hCG diminuisce col progredire della gravidanza
del 10% in meno rispetto ai valori attesi.
Per quanto riguarda lo screening per DTN il cut-off
utilizzato è di 2,5 MoM (multipli di mediana): si considera quindi a rischio aumentato per DTN una gravida
con livelli di AFP superiori di almeno due volte e
mezzo rispetto al valore mediano di gravidanze non
affette nello stesso periodo gestazionale. La sensibilità
è del 70-80% con un tasso di falsi positivi di circa 1%.
Informazioni alle gestanti
La peculiare natura del test rende necessario che la
gestante sia adeguatamente informata sul significato e
sui limiti del test stesso e sulle sue capacità di individuazione di feti affetti ed, inoltre, sul fatto che una
positività allo screening comporta indicazione alla diagnostica invasiva. In particolare, vengono fornite le
seguenti informazioni:
• Il test non è diagnostico ma fornisce solo il valore
di probabilità o rischio che in quella gravidanza il feto
sia affetto (divide le gestanti in un gruppo ad alto
rischio - risultato di screening positivo - e in un gruppo a basso rischio - risultato di screening negativo).
• Le gestanti a basso rischio sono informate che la
patologia non può essere esclusa anche se l’evento ha
bassa probabilità di verificarsi; in questi casi l’accertamento diagnostico invasivo comporta un rischio di
aborto superiore a quello dell’evento patologico.
• La “positività” per il test può essere indicazione
per l’esecuzione dell’amniocentesi; la gestante deve
essere tuttavia informata della probabilità che il test sia
un falso positivo (effettivamente la maggior parte delle
gestanti con un test positivo non ha una gravidanza
affetta).
149
A chi è rivolto lo screening
• Ad una popolazione di donne a basso rischio per
età per individuare quelle che hanno maggiori probabilità di avere un feto affetto.
• Alle donne ad alto rischio per età che non desiderino sottoporsi in prima istanza a test invasivi.
A chi non è rivolto lo screening
• Alle donne che per motivi religiosi, etici o personali non sono favorevoli alla diagnostica invasiva e per
le quali un eventuale risultato positivo sarebbe fonte di
stress emotivo fino alla conclusione della gravidanza.
• Alle donne orientate, indipendentemente dal
risultato del test, ad effettuare l’amniocentesi.
150
LA DIAGNOSTICA PRENATALE - 2: AMNIOCENTESI ED
ANALISI CITOGENETICA
Paola Marelli, Maura Vannucci
L’analisi cromosomica studia normalmente la metafase con lo scopo di valutare possibili alterazioni
numeriche e/o strutturali dei singoli cromosomi.
L’esame può essere effettuato su tutte le cellule
nucleate in divisione utilizzando tessuti in attività
mitotica spontanea o in coltura.
Grazie alla possibilità di effettuare prelievi di tessuti fetali, questo esame è stato esteso anche al periodo
prenatale.
L’indagine citogenetica viene eseguita in gravidanza e permette lo studio del cariotipo fetale. Le cellule
fetali prelevate vengono osservate durante la divisione
cellulare quando il materiale genetico (DNA) si condensa in cromosomi. Questi cromosomi possono essere
identificati sulla base della loro forma, dimensione e
schema di bandeggio ottenuto con colorazioni speciali.
Nella cellula umana i cromosomi sono 46 (23 coppie) e
il loro ordinamento numerico e strutturale costituisce
il cariotipo.
L’indagine citogenetica viene eseguita in gravidanza a carico della S.S.R. nei seguenti casi:
• gestanti con età superiore a 35 anni al parto;
• genitori con precedente figlio affetto da anomalia
cromosomica o da malattia genetica diagnosticabile;
• genitori portatori di riarrangiamento strutturale o
affetti da malattia genetica;
• patologia fetale ecoevidenziata;
• indicazioni biochimiche (tri-test positivo).
Dal momento che il prelievo del materiale fetale
necessario per tale diagnosi comporta un aumento di
rischio di aborto (comunque inferiore all’1%), tale
esame non dovrebbe essere considerato un esame di
routine e dovrebbe essere eseguito solo nelle gravidanze a rischio.
L’esame può essere eseguito anche in gravidanze
non a rischio genetico su richiesta della paziente. La
diagnosi prenatale può essere eseguita su tre diversi
tipi di materiale fetale: villi coriali (dalla 9a-11a settimana di gestazione), liquido amniotico (dalla 15a-18a
settimana di gestazione), e sangue fetale (dalla 18a-19a
settimana di gestazione). La tecnica più utilizzata per
l’esame cromosomico prenatale è l’amniocentesi.
Il liquido amniotico è costituito essenzialmente da
essudati, urina fetale e cellule fetali. Tali cellule derivano dallo sfaldamento dei tessuti di rivestimento, deri-
vanti prevalentemente dalle ultime vie urinarie e dalla
cute.
L’amniocentesi è il prelievo transaddominale, ecoguidato, di liquido amniotico eseguito intorno alla 16a
settimana di gestazione. In questa epoca la quantità
degli amniociti appare ideale ai fini della loro coltura
in vitro.
Il prelievo consiste nell’aspirare 20 mL di liquido
amniotico: una piccola quantità di liquido prelevato è
usata per analisi biochimiche, mentre la parte cellulare
è utilizzata per l’indagine cromosomica.
Le cellule ottenute dal liquido amniotico, sono coltivate in vitro. Per la crescita cellulare occorrono circa
8-10 giorni di coltura; successivamente le cellule sono
bloccate durante la metafase quando sono visibili i cromosomi. Dopo aver bloccato le cellule in metafase i
cromosomi sono colorati ed osservati al microscopio.
Si passa successivamente all’analisi dei singoli cromosomi fetali e al loro raggruppamento in coppie di cromosomi omologhi allestendo così il cariotipo costituzionale del feto.
Quest’analisi cromosomica di 1° livello permette di
evidenziare anomalie cromosomiche, sia numeriche
(quali trisomie, per esempio la trisomia 21 libera = sindrome di Down; monosomie, per esempio monosomia
X = sindrome di Turner), che strutturali (traslocazioni,
delezioni ed inversioni).
In alcuni casi è necessario eseguire ulteriori analisi
di secondo livello per studiare nei dettagli l’anomalia
in questione. Queste analisi sono eseguite con tecnica
di ibridizzazione in situ (FISH). La tecnica FISH permette l’ibridazione di sequenze di DNA specifiche
(sonde) oltre che direttamente sui cromosomi anche
sui nuclei in interfase.
E’ possibile inoltre eseguire diagnosi di malattie
genetiche quali fibrosi cistica, distrofie muscolari, emoglobinopatie, talassemie, sindromi da microdelezioni
(per es. X fragile), ecc., qualora in sede di consulenza
prenatale venga evidenziato un rischio familiare per
tali patologie.
In questi casi dalle stesse cellule del liquido amniotico coltivate in vitro ed utilizzate per eseguire il cariotipo è possibile estrarre il DNA ed evidenziare la presenza di tali anomalie geniche nel nascituro con metodiche di 2a livello quali la PCR.
151
LA DIAGNOSTICA PRENATALE - 3: DOSAGGIO
DELL’ALFAFETOPROTEINA NEL LIQUIDO AMNIOTICO
Maria Bombara
Il dosaggio dell’alfafetoproteina (AFP) nel liquido
amniotico viene effettuato per evidenziare eventuali
difetti del tubo neurale aperti (DTN).
In condizioni normali l’AFP, glicoproteina prodotta
dal fegato fetale, viene rilasciata in grandi quantità nel
liquido amniotico, in concentrazioni decrescenti con
l’avanzare della gravidanza (dalla 15a settimana in
poi). In presenza di DTN, l’esposizione di membrane e
vasi sanguigni del feto provoca una trasudazione dell’AFP nel liquido amniotico proporzionale alle dimensioni delle aree esposte; il livello di AFP risulta così
almeno raddoppiato rispetto al livello mediano di gravidanze non affette nella stessa epoca gestazionale.
Il dosaggio di AFP nel liquido amniotico è molto
più sensibile e specifico per la diagnosi di DTN di
quello effettuato su siero materno.
Il risultato, espresso in multipli di mediana (MoM)
per uniformare le diverse metodiche di dosaggio dell’AFP, viene considerato positivo per DTN quando
supera un valore soglia di 2 MoM. Con questo cut-off
la sensibilità, nell’arco della 15a-21a settimana di gestazione, va dal 90 al 99%, con un tasso di falsi positivi
dall’1 al 5% circa.
Un risultato positivo indica la necessità di effettuare approfondimenti diagnostici (ecografia di 2° livello
alla 20 a – 22 a settimana) per accertare l’effettiva presenza di DTN, e per individuare il tipo e l’entità del difetto.
152
LE MALATTIE AUTOIMMUNI
Patrizia Petricci
Per malattia autoimmune si intende una condizione
patologica in cui le principali alterazioni strutturali
e/o funzionali sono indotte da, o correlate a, risposte
immunitarie rivolte verso costituenti propri dell’organismo.
Occorre sottolineare che “indotte da” implica che
l’etiologia stessa della malattia autoimmune è da
ricondurre ad un’aberrante risposta del sistema immunitario che avviene indipendentemente dall’intervento
di stimolazioni esogene di qualsiasi natura, mentre che
“correlate a” sottolinea che la patogenesi è principalmente da ricondurre a risposte autoimmunitarie. In
realtà, sebbene l’etiologia sia ancora in gran parte sconosciuta, le più recenti ricerche condotte in biologia
sperimentale e umana indicano che le malattie autoimmuni sono in gran parte, se non esclusivamente,
malattie a patogenesi autoimmune, malattie cioè nelle
quali uno o più fattori esogeni possono innescare, in
un individuo geneticamente predisposto, una reazione
autoaggressiva dalla quale poi dipendono l’insorgenza
di alterazioni e l’automantenimento della malattia. Il
lupus eritematoso (LES), ad esempio, considerato
come il prototipo delle malattie autoimmuni sembra
essere eziologicamente associato ad agenti virali.
Migrom e Witebsky nel 1962 stabilirono dei criteri
per definire una malattia come “autoimmune”:
1. presenza di risposte autoimmunitarie umorali
e/o cellulo-mediate;
2. riconoscimento di uno specifico antigene verso
cui le risposte autoimmunitarie sono rivolte;
3. induzione di una risposta autoimmunitaria contro lo stesso antigene nell’animale da esperimento;
4. riproduzione nell’animale da esperimento di
lesioni corrispondenti a quelle riscontrate in patologia
umana;
5. trasporto passivo della malattia mediante il siero
contenente gli autoanticorpi.
Può accadere nel corso di malattie infettive acute e
croniche, di malattie linfoproliferative, di neoplasie, di
malattie da deficienza immunologica, che si verifichi
la produzione, anche rilevante, di alcuni autoanticorpi;
tale produzione ha carattere transitorio e si esaurisce,
in genere, nel corso della evoluzione naturale della
malattia (autoimmunità transitoria).
Ciò può dipendere sia dalla presenza nell’organi-
smo di sostanze capaci di alterare molti cloni linfocitari
quali ad esempio gli “attivatori policlonali” di linfociti
di origine microbica, sia da difetti nell’ambito dei sistemi di regolazione. In questi casi gli autoanticorpi spesso non provocano alcuna manifestazione clinica; talora, quando si verificano circostanze particolari, gli
autoanticorpi possono dar luogo ad alterazioni anatomo-cliniche quali vasculiti e glomerulonefriti da complessi immuni.
Le malattie autoimmuni si dividono in:
A. FORME ORGANO SPECIFICHE: caratterizzate
da una risposta immunitaria umorale e/o cellulo
mediata rivolta verso costituenti antigenici dei singoli
organi e da alterazioni organiche o funzionali limitate
agli organi verso cui la risposta autoimmunitaria è
rivolta.
B. FORME NON ORGANO SPECIFICHE: caratterizzate dalla perdita di tolleranza nei confronti di costituenti antigenici dell’organismo diffusamente distribuiti e da alterazioni anatomo-istologiche estese a
diversi organi e tessuti;
C. FORME INTERMEDIE: nelle quali non è stato
possibile dimostrare con sicurezza l’organo specificità
dell’autoantigene. In tali forme, accanto a risposte
autoimmunitarie organo specifiche, coesistono risposte
rivolte verso autoantigeni diffusamente distribuiti e le
lesioni sono estese a più organi o tessuti.
MECCANISMI DI AUTOIMMUNIZZAZIONE
• Reattività crociata antigenica. Una risposta
autoimmune può essere scatenata dalla disponibilità
di “nuovi determinanti di tipo carrier” (NDC) a livello
di autoantigeni. Gli NDC, di norma non presenti negli
autoantigeni, sarebbero in grado di attivare cloni di
linfociti T che inizierebbero la risposta autoimmune
mediante la cooperazione cellulare con i linfociti B. Ciò
si può verificare o in seguito a modificazione strutturale degli autoantigeni o in seguito a reazioni crociate.
• Reattività crociata idiotipica. E’ stata dimostrata
attraverso modelli sperimentali. La reattività crociata
idiotipica può rendere conto delle risposte autoimmuni verso ormoni e recettori ormonali in conseguenza di
infezioni virali
• Attivazione policlonale. Virus e derivati batterici
153
e protozoari sono in grado di indurre un’attivazione
policlonale di linfociti B, questo comporta anche l’attivazione di cloni B che hanno la capacità di produrre
autoanticorpi.
• Interazioni anomale con antigeni di istocompatibilità di classe I. A tal proposito sono state formulate tre
ipotesi:
a. espressione aberrante di tali antigeni;
b. aumento della loro concentrazione;
c. alterazioni strutturali dei medesimi.
l’organo contro cui sono diretti e quelli non organospecifici.
AMA (anticorpi anti mitocondrio). Costituiscono
una famiglia di autoanticorpi che riconoscono diversi
determinanti antigenici di una struttura lipoproteica,
non dotata di funzione enzimatica associata all’ATPasi
delle membrane mitocondriali.
Il metodo di ricerca più specifico è l’immunofluorescenza su sezioni criostatiche di un pannello di organi
umani (tiroide, stomaco, pancreas) ed animali (rene e
fegato di ratto). Si distinguono almeno 6 diversi patterns.
Gli AMA risultano positivi generalmente ad alto
titolo (superiori a 1:1000) in oltre il 90% dei casi di cirrosi biliare primitiva di cui costituiscono un importante marcatore sieroimmunologico. Assai più raramente
ed a titoli più bassi si possono ritrovare nel siero di
pazienti con epatite cronica attiva. Si possono riscontrare anche associati a forme non epatiche.
Da quanto sinora affermato si evince che l’espansione incontrollata prima di cloni linfocitari T e poi di
cloni B autoreattivi rappresenti l’evento biologico
necessario per l’inizio ed il mantenimento delle lesioni
nelle malattie autoimmuni. Da tempo è stato proposto
che anche deficienze nell’ambito dei circuiti dei linfociti T ad attività regolatrice possano costituire una condizione facilitante l’espansione incontrollata dei linfociti autoreattivi.
I possibili meccanismi attraverso i quali le risposte
autoimmunitarie possono provocare lesioni tessutali
sono molteplici:
• Immunoreazioni di tipo I (reazioni anafilattiche)
correlate alla presenza di IgE;
• Immunoreazioni di tipo II (reazioni citolitiche o
citotossiche) mediate da anticorpi IgG e IgM che reagiscono con antigeni localizzati alla superficie delle cellule o delle strutture bersaglio; l’effetto lesivo degli
anticorpi è mediato dal complemento;
• Immunoreazioni di tipo III (reazioni da complessi
immuni) in cui l’azione lesiva è dovuta ad una serie di
reazioni tra complessi immuni, complemento, leucociti, neutrofili, mastociti, piastrine;
• Immunoreazioni di tipo IV (ipersensibilità cellulomediata): l’azione è legata alla presenza di linfochine
prodotte dai linfociti killer;
• Immunoreazioni di tipo V correlate alla presenza
di IgG rivolte verso recettori della superficie cellulare;
• Immunoreazioni di tipo VI determinate da IgG
rivolte in modo specifico verso antigeni presenti sulle
cellule e capaci di fissare tramite il loro frammento Fc
cellule in grado di svolgere azione citotossica (cellule
killer);
• Immunoreazioni di tipo VII che sono correlate alla
presenza di anticorpi IgG, in grado di indurre deficit
funzionali in quanto rivolti verso recettori di superficie
di neurotrasmettitori o di ormoni.
Occorre sottolineare che i vari tipi di immunoreazioni patogene di rado intervengono in modo isolato,
infatti la patogenesi delle malattie autoimmuni è da
ricondurre all’intervento di due o più tipi di immunoreazioni variamente correlate tra loro.
ASMA (anticorpi anti muscolatura liscia). Famiglia
di autoanticorpi non organo specifici che riconoscono
antigeni di membrana ed elementi del citoscheletro
(actina) comuni a numerosi tipi cellulari. Poiché il citoscheletro è particolarmente abbondante nel muscolo
liscio di organi ricchi di questo tessuto (stomaco) o
molto vascolarizzati (rene) costituiscono il miglior substrato per la loro determinazione in immunofluorescenza.
Il significato diagnostico degli ASMA è piuttosto
modesto in quanto si possono trovare a basso titolo
(1:40 -1:80) in numerose malattie infettive e varie neoplasie.
A titolo modesto e transitorio si possono notare
nelle fasi acute di epatopatie da virus e nelle epatiti
persistenti. Titoli superiori a 1:80 (IgG) si trovano in
pazienti con epatite cronica attiva, in cui rappresentano un marcatore sieroimmunologico.
Diagnostica immunologica
La diagnostica delle malattie autoimmuni si avvale
del dosaggio di autoanticorpi.
Si possono evidenziare più tipi di autoanticorpi:
quelli organo-specifici associati ad una malattia del-
ANCA (anticorpi anti citoplasma dei granulociti
neutrofili). In immunofluorescenza si riconoscono tre
diversi pattern: citoplasmatica (c-ANCA), associato
alla granulomatosi di Wegener e a varie vasculiti, perinucleare (p-ANCA) legato a vasculiti sistemiche e
LKM (anticorpi anti microsomi epatici e renali).
La metodica di elezione per la dimostrazione degli
anticorpi LKM è rappresentata dall’immunofluorescenza su sezioni criostatiche di rene e fegato di ratto.
L’antigene verso cui sono rivolti gli anticorpi LKM è
stato solo parzialmente caratterizzato ed è presente
sulle membrane del reticolo endoplasmico liscio degli
epatociti e delle cellule dell’epitelio tubulare prossimale del rene e pertanto il quadro di positività all’immunofluorescenza è localizzato nel citoplasma di tali cellule. Il reperto sierico degli anticorpi LKM è piuttosto
raro ad eccezione di casi con epatite cronica aggressiva
evolvente in cirrosi post necrotica.
154
renali e un terzo pattern x-ANCA che permette la
distinzione tra rettocolite ulcerosa e morbo di Crohn,
oltre a permettere il riconoscimento della colangite
sclerosante primitiva.
APCA (Anticorpi anti cellule parietali gastriche).
Le malattie gastriche autoimmuni sono state classificate nei tipi A e B basandosi sulle variazioni morfologiche del fondo e della porzione antrale dello stomaco. I
pazienti con anticorpi anti cellule parietali o contro fattori intrinseci (o contro entrambi), presentano atrofia
della mucosa del fondo (tipo A) ed una incidenza elevata di anemia perniciosa, spesso associata ad altri
disordini endocrini autoimmuni. Un test APCA positivo, in presenza di anemia megaloblastica orienta veso
la diagnosi di anemia perniciosa. In gastriti di tipo B
non sono invece presenti anticorpi APCA e non c’è
alcuna correlazione con l’anemia perniciosa ed altri
disturbi endocrini autoimmuni. Il test di immunofluorescenza indiretta è il metodo più sensibile per determinare gli APCA ed il substrato usato in questo tipo di
test è la mucosa gastrica di ratto.
L’incidenza di anticorpi anti cellule parietali in
pazienti con anemia perniciosa è del 93%. Altre condizioni, oltre l’anemia perniciosa, possono determinare
positività al test APCA: gastrite atrofica, diabete mellito, malattia di Hashimoto, ulcera gastrica, carenza di
ferro, artrite reumatoide, morbo di Addison, miastenia
grave, sindrome di Sjögren e mixedema primario.
Nella popolazione normale la presenza di APCA varia
dal 2% in gruppi di età inferiore ai 20 anni, al 16% in
gruppi di età superiore ai 60 anni.
ANA (anticorpi anti nucleo). Famiglia di autoanticorpi non organo-specifici che reagiscono con numerosi antigeni nucleari. (DNA, istoni, proteine non istoniche, nucleoli).
Si riconoscono in immunofluorescenza su substrati
ricchi di nuclei come le cellule epatiche, le cellule dei
tubuli renali, le cellule parietali e principali dello stomaco oltre che su colture di cellule ricche di mitosi
(cellule Hep-2 derivate da un carcinoma laringeo
umano).
L’uso di colture cellulari Hep-2 ha permesso l’indi-
viduazione di 5 pattern di fluorescenza:
Come evidenziato dalla tabella, titoli ANA positivi
si riscontrano in una serie di altre malattie autoimmuni del tessuto connettivo, oltre che nel LES. Alcuni
esempi sono lo sclerodermia, la dermatomiosite, l’artrite reumatoide, la sindrome di Sjögren, la miastenia
grave, il lupus eritematoso discoide, il lupus eritematoso indotto da farmaci. I titoli ANA più alti si trovano
in genere nel LES attivo. La classe anticorpale principalmente coinvolta nel LES è quella IgG, ma talvolta si
può riscontrare la presenza anche di IgM. Nelle altre
malattie del connettivo gli anticorpi antinucleo possono appartenere alle tre maggiori classi di immunoglobuline, tranne nel caso dell’artrite reumatoide in cui gli
ANAsono principalmente IgM.
Anticorpi anti DNA. Questo tipo di anticorpi è presente nel sangue di pazienti affetti da malattie del tessuto connettivo. Pazienti affetti da LES producono più
tipi differenti di anticorpi nucleari, e quelli che hanno
specificità per la doppia elica del DNA (dsDNA)
hanno un’elevata correlazione con pazienti affetti da
LES. Gli anticorpi diretti contro dsDNA non possono
essere rivelati con il metodo di immunofluorescenza
usato per gli ANA, per i quali si riconoscono diversi
pattern di fluorescenza. Gli anticorpi diretti contro
DNA reagiscono sia con la doppia elica che con la singola elica di DNA producendo lo stesso pattern omogeneo. Il substrato usato in questo tipo di test è un tripanosoma non patogeno, la Crithidia luciliae, che possiede un mitocondrio gigante (chinetoplasto) in cui si
trova del DNA a doppia elica. Tale DNA è privo degli
antigeni istone-simili normalmente presenti negli altri
substrati.
Anticorpi anti ENA (antigeni nucleari estraibili).
Gli anticorpi anti ENA sono classificati nei seguenti
tipi :
• anticorpi anti Sm: considerati come marker altamente specifico per il LES, possono anche ritrovarsi in
assenza di anticorpi anti DNA;
• anticorpi anti RNP: caratteristici della malattia
mista del tessuto connettivo (MCTD) e molto più raramente, per il LES;
• anticorpi anti SSA (Ro): sono presenti in pazienti
Pattern nucleare
Aspetto microscopico
Antigeni nucleari
Clinica
Omogeneo
Fluorescenza uniforme
dsDNA, DNP, istoni
LES. LES da farmaci
Periferico
Fluorescenza membrana nucleare
dsDNA
LES
Puntiforme
Fluorescenza punteggiata
ENA:RNP, Sm, SSA,
SSB, Scl70, Jo-1
Connettiviti sistemiche
Nucleolare
Fluorescenza del nucleolo
RNAnucleolare
Sclerodermia s.di Sjö
gren
Centro merico
Fluorescenza a grossi granuli
Antigeni del centromero
Sindrome di Crest
155
con la sindrome di Sjögren e possono essere presenti in
pazienti con LES ANA negativi. E’ consigliabile la
ricerca di questi anticorpi in donne in gravidanza affette da LES in quanto la loro presenza è correlata a blocco cardiaco o a lupus neonatale;
• anticorpi anti SSB (La): sono correlati con la sindrome di Sjögren e si trovano associati ai sieri positivi
per anticorpi anti SSA.
• anticorpi anti SCL 70: presenti in circa il 50% dei
pazienti con SSP
• anticorpi anti Jo-1: altamente specifici per la polimiosite.
La metodica attualmente più diffusa per il dosaggio
degli ENAè quella immunoenzimatica.
Possibilità di SS-A
positivi in pazienti
ANA negativi con
LES
(su specifico
quesito clinico)
TEST ANA
Negativo per
LES in fase
attiva
NO
SI
NO
POSITIVO?
PCNA+
ACA+
LES in
fase attiva
NUCLEAR
BODIES
Sindrome
C.R.E.S.T.
TEST ANTI
ENA
POSITIVO?
SI
LES in
fase attiva
SI
PCB
ECA
PATTERN
OMOGENEO
PATTERN
PERIFERICO
PATTERN
PUNTEGGIATO
PATTERN
NUCLEOLARE
Per SSP o
Sclerodermia
Titolo
>1:80
SI
Verificare
anti n-DNA
DIFFUSE
GRAINY
Per SSP
Determinare
anti-ENA
Titolo
>1:160
SI
NO
Probabili
collagenopatie
diverse da LES
NO
POSITIVO?
NO
SI
LES
PM
SSP
LES subclinico
o
farmacoindotto
Stesso titolo o più basso
Probabile pattern
aspecifico. Titoli 1:40
presenti in soggetti sani
soprattutto anziani
Possibile
induzione da
farmaci o
malattia virale.
Controllo
dopo circa 1
mese
Titolo aumentato
UlRNP SM SS-A SS-B SCl-70 Jol PCNA KU Mi-l PM
MCTD LES LESn
SS
SSP PM LES PM/SSP DM PM
LES
LES
SS LES/SS
LES
SS
LES
LEGENDA
ACA: Anti Centromero
AR: Artrite Reumatoide
ARSS: AR associata a Sindrome di Sjogren
DM:Dermatomiosite
HCA: Epatite Cronica Attiva
LES: Lupus Eritematoso Sistemico
AR/SS
MCDT: Malattia Mista del Tessuto Connettivo
n-DNA: DNA a doppia elica
PBC: Cirrosi Biliare Primitiva
PCNA: Antigene Nucleare delle Cellule in Proliferazione
PM: Polimiosite
SS: Sindrome di Sjogren
SSP: Sclerosi Sistemica Progressiva
Schema interpretativo degli anticorpi anti-nucleo in I.F.A. su cellule HEp-2(R. Pozzoli, modificato)
156
IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSI DELLA
MALATTIA CELIACA
Patrizia Petricci
La malattia celiaca (MC) od enteropatia da glutine è
una condizione caratterizzata da intolleranza permanente al glutine, complesso proteico contenuto nel frumento nell’orzo e nella segale.
L’organo bersaglio è rappresentato dalla mucosa
dell’intestino tenue, ma l’interessamento clinico di
questa malattia è molto vario perchè spesso è accompagnata da manifestazioni molto diverse come l’anemia, l’osteoporosi o l’epilessia.
Lo sviluppo della celiachia dipende da due fattori: il
primo, endogeno, che è la predisposizione genetica ed
il secondo, esogeno, costituito dal glutine.
Il glutine comprende una famiglia di proteine vegetali, le prolammine, contenute nel frumento (gliadine),
nell’orzo (ordeine) e nella segale (secaline). E’ ancora
dubbia la tossicità legata alle prolammine presenti nell’avena (avenine).
La predisposizione all’intolleranza al glutine viene
trasmessa geneticamente attraverso il Sistema Maggiore di Istocompatibilità (HLA).
L’azione patogena del glutine nei soggetti geneticamente predisposti è svolta a livello della mucosa intestinale grazie anche all’azione dell’enzima transglutaminasi ed alla conseguente produzione di autoanticorpi antimucosa intestinale.
In passato la celiachia era considerata una malattia
tipica dell’infanzia.
La forma classica di celiachia esordisce durante i
primi anni di vita, generalmente dopo alcune settimane o mesi dalla assunzione da parte del bambino dei
primi cereali nel divezzamento.
I sintomi sono rappresentati da diarrea cronica, rallentamento della crescita, inappetenza marcata e, talora, vomito.
L’introduzione di una dieta contenente cereali privi
di glutine come riso o mais porta nel giro di poche settimane alla scomparsa della sintomatologia conseguente ad una completa normalizzazione della mucosa
(celiachia tipica).
Accanto a questa forma si descrive una malattia
“atipica” che si manifesta tardivamente senza una
chiara sintomatologia intestinale ma con manifestazioni che interessano altri organi od apparati (bassa statura, anemia isolata, ritardo puberale).
La forma “silente” comprende i casi che vengono
diagnosticati in modo occasionale a seguito di accertamenti sierologici in soggetti che, apparentemente, non
presentano alcuna evidente sintomatologia. Esiste
anche una forma “potenziale” che è caratterizzata
dalla positività ai marcatori sierologici e dalla normalità della mucosa intestinale.
Questi casi devono essere seguiti nel tempo perchè
possono sviluppare, anche a distanza di anni, una tipica enteropatia celiaca.
Diagnosi di laboratorio
Gli anticorpi anti gliadina (AGA) sia di classe IgG
che IgA sono stati i primi ad essere utilizzati nella diagnostica sierologica della malattia celiaca. Adesso sono
quasi del tutto abbandonati per la loro insufficiente
accuratezza.
La determinazione degli anticorpi antiendomisio
(EMA) di classe IgA è a tutt'oggi il test che garantisce
la migliore efficienza diagnostica, poichè soddisfa i
requisiti di una elevata sensibilità e specificità. La
ricerca degli EMA, tuttavia, viene, effettuata utilizzando la tecnica di immunofluorescenza indiretta (IFI) su
sezioni tissutali di 3° medio di esofago di scimmia, il
che comporta elevati costi e pone problemi etici legati
all’utilizzo di questi Primati.
Una svolta significativa nella sierologia della MC si
è avuta nel 1997 quando Dieterich ha evidenziato che
il principale antigene responsabile della produzione
degli EMA è l'enzima transglutaminasi (tTG), aprendo
la strada allo sviluppo di un test ELISA per la determinazione di autoanticorpi anti tTG di classe IgA ed IgG
con performance analitiche simili a quelle degli EMA.
L'analisi genetica ha inoltre evidenziato che tutti i
soggetti celiaci presentano genotipo DQ2 o DQ8 (vicevers, non tutti i soggetti a genotipo DQ2 o DQ8 sono
celiaci).
Alla luce di queste nuove acquisizioni scientifiche e
per l'esperienza maturata in questo settore, il Laboratorio di Patologia Clinica ha sviluppato un algoritmo
diagnostico che, allo stato attuale, sembra essere il più
vantaggioso sul piano del rapporto costi/beneficio.
Premesso che il gold standard nella diagnosi di
malattia celiaca rimane l'esame bioptico della mucosa
duodenale, i test sierologici possono essere proposti sia
a scopo di screening che di valutazione della com-
157
pliance al regime dietetico.
I test HLA DQ2 (DQA1*501/DQB1*201 cis/trans) e
DQ8 (DQA1*/0301/DQB1*0302) vengono effettuati
presso l’U.O. di Immunoematologia del nostro Ospedale.
L’indagine genetica potrebbe essere estesa anche ai
soggetti a rischio, negativi ai test sierologici.
La loro assenza ha un elevato valore predittivo
negativo.
Anti tTG IgA
+
IgA sieriche
Anti tTG IgA Neg
IgA sieriche < val. normali
Anti tTG IgA Neg.
IgA sieriche nella norma
Anti tTG IgA
Pos
Pos.
Pos.
Neg.
Neg.
Determinazione
HLA DQ2 o DQ8
Probabile assenza
di MC
Algoritmo diagnostico per celiachia
MC quasi certa.
Biopsia
EMA
Anti tTG IgG
158
SISTEMA HLA E SUSCETTIBILITA’ ALLE MALATTIE
Riccardo Luti
Servizio di Medicina Trasfusionale
Uno degli interrogativi più inquietanti e parzialmente irrisolti in medicina riguarda le ragioni per le
quali alcuni soggetti contraggono certe malattie ed
altri no. Si è tentato di rispondere a questa domanda
associando determinati caratteri ereditari alla suscettibilità o alla resistenza ad alcuni stati morbosi.
Dal 1964, anno in cui fu dimostrata per la prima
volta, nel topo, l’associazione tra il MHC (complesso
maggiore di istocompatibilità) ed una malattia (leucemia), numerose ricerche hanno dimostrato associazioni
più o meno significative.
Per definire l’esistenza di una associazione tra una
determinata malattia ed un antigene, si ricorre al
riscontro di una frequenza dell’antigene significativamente più elevata nel gruppo dei soggetti ammalati
rispetto alla popolazione sana di controllo.
Questo concetto si esprime con il termine di rischio
relativo (RR) con il quale si intende il rapporto tra la
frequenza dell’antigene nei soggetti affetti dalla malattia e la frequenza dello stesso antigene nei sani. Il
rischio relativo è un indice della forza dell’associazione: un’associazione positiva è indicata da un rischio
relativo >1, un‘associazione negativa da uno <1 (ovviamente quando non c’è associazione il RR è =1).
In generale si tratta di malattie a patogenesi immunitaria che presentano alcune caratteristiche in comune
quali:
• frequente ereditarietà; ma la segregazione del
carattere non segue le leggi mendeliane perché a bassa
penetranza (frequenza con cui il genotipo si esprime
nel fenotipo);
• bassa espressività (grado di espressione fenotipica
del genotipo);
• decorso subacuto o cronico;
• abituale espressività dopo la maturità sessuale e
scarso effetto sulla riproduzione;
• raramente influenzano la sopravvivenza in età
fertile;
• sono associate spesso ad alterazioni del sistema
immunitario;
• eziologia multifattoriale nella quale hanno una
forte rilevanza anche fattori extragenetici legati all’ambiente.
Nelle tabelle 1 e 2 sono riportate le più comuni
associazioni riscontrate.
I meccanismi che sono stati ipotizzati poter essere
causa delle associazioni riscontrate sono diversi ma l’ipotesi universalmente accettata per spiegare l’associazione tra HLA e malattie è quella secondo la quale l’agente eziologico è riconosciuto da una specifica molecola HLA e questa combinazione provoca la malattia
attraverso una reazione immune. A prescindere dall’ambiente e dagli altri loci genetici coinvolti, solo una
parte degli individui portatori di un particolare fenotipo HLA sarà in grado di sviluppare tale risposta.
Bisogna ricordare però un altro aspetto del rapporto tra HLA e malattie, in quanto vi sono patologie
associate con il sistema HLA come la narcolessia o l’emocromatosi in cui più propriamente si dovrebbe parlare di linkage perché si tratta meramente di una cosegregazione dell’allele mutato con alcuni alleli HLA
di classe I o II adiacenti.
Narcolessia
La malattia è causata da una mutazione nel gene
codificante il recettore di tipo 2 per il neuropeptide
ipotalamico ipocretina, che rende il recettore non funzionale. Il gene in questione, HCRTR2, è localizzato in
prossimità dei loci DR, DQ. Si ritiene che la mutazione
sia relativamente recente e sia comparsa in un antenato
comune a tutti i pazienti, portatore degli alleli DR2 e
DQ6. Quindi, il numero di generazioni intercorso non
è stato sufficientemente elevato da permettere una
combinazione random dell’allele mutato con gli alleli
DR2 e DR6: ne deriverà perciò questa apparente associazione.
Emocromatosi
L’emocromatosi ereditaria (HH) rappresenta probabilmente la patologia genetica più frequente nella
popolazione caucasica. E’ una patologia comune (frequenza di portatori sani nel nostro Paese di 1/10; quella di persone affette di 1/200-400) caratterizzata da un
aumentato assorbimento di ferro a livello intestinale
con conseguenti disturbi a carico dei parenchimi. La
scoperta dell’associazione tra HH e l’allele HLA A3 da
solo o insieme al B7, ha stabilito la modalità autosomica recessiva di trasmissione ereditaria della maggior
parte dei casi di HH. In particolare si pensa che 60-70
generazioni fa diverse mutazioni, di cui le più impor-
159
tanti sono denominate C282Y e H63D, abbiano interessato il gene HFE (un gene HLA “non classico” coinvolto appunto nell’assorbimento del ferro) di un individuo portatore dell’allele “classico” HLA A3. La forte
associazione tra A3 e HFE che si trovano appunto sullo
stesso cromosoma 6 ci indica che esiste un aplotipo
ancestrale con effetto “fondatore” che spiega come l’emocromatosi sia apparentemente associata con questo
allele e l’esistenza di variazioni della % di individui
omozigoti, per questa specifica mutazione genica in
popolazioni diverse.
La diagnosi di HH viene genericamente posta attraverso l’individuazione dell’espressione fenotipica dell’accumulo di ferro, ma le nuove conoscenze genetiche
e gli studi funzionali danno oggi la possibilità di presentare una strategia diagnostica più accurata e specifica al fine di individuare precocemente individui asintomatici ad alto rischio e differenziare in modo specifico questa patologia ereditaria da altre forme da accumulo di Fe. Infatti oltre alla prescrizione di esami come
trasferrina, ferritina, sideremia, ecc., è opportuno
richiedere anche la tipizzazione HLA ABC da associare alla ricerca dei geni mutati C282Y e H63D con tecni che di biologia molecolare.
L’emocromatosi è più frequente nei soggetti di età
compresa tra i 40 e 60 anni, ma può essere diagnostica,ta anche negli adolescenti e negli anziani ed inoltre
,si manifesta più tardi ed in modo meno grave nella
donna rispetto all’uomo.
Ovviamente, non essendo possibile discutere esaurientemente tutte le malattie associate con il sistema
HLA, ci soffermeremo solo su quelle più importanti
dal punto di vista clinico-epidemiologico.
Celiachia
La malattia celiaca (MC) è un‘enteropatia indotta
dall’intolleranza al glutine, nei confronti del quale si
stabilisce una reazione immune che provoca danni alla
mucosa intestinale del digiuno, con conseguente atrofia dei villi, iperplasia delle cellule delle cripte ed infiltrazione di cellule linfoidi.
In Italia l’incidenza della celiachia è di circa 1/150
indicandola come uno dei problemi di salute più
importanti e spesso sottovalutati. L’elevata prevalenza
della malattia nei parenti di primo grado dei celiaci
indica la notevole influenza del background genetico
nella patogenesi della malattia. La maggior parte dei
dati derivati dagli studi sulle famiglie di pazienti celiaci indica come cluster genetico più importante per la
trasmissione della malattia il complesso HLA. La comparsa della malattia celiaca è, infatti, associata all’aplotipo DR3-DQ2 e quando nello stesso individuo sono
espressi contemporaneamente i due aplotipi DR5-DQ7
e DR7- DQ2. Poiché gli aplotipi contenenti i suddetti
alleli DQ sono presenti in più del 30% della popolazione sana, occorre ammettere che la presenza di questi
alleli, pur essendo un importante fattore di predisposizione genetica, ovviamente non può essere considerato
l’unica causa della malattia, ma altri fattori ambientali
e genetici sono sicuramente coinvolti nella patogenesi
della malattia.
Diabete Tipo 1
Il diabete mellito di tipo 1(Diabete insulino dipendente, IDDM della vecchia classificazione) comprende,
nei suoi 2 sottogruppi (idiopatico ed immunomediato),
le forme di malattia dipendenti, per il mantenimento
della omeostasi glucidica, dalla somministrazione esogena di insulina. Lo studio della familiarità e delle
modalità di trasmissione della forma immunomediata
ha dimostrato come la comparsa di questa malattia
autoimmune sia legata all’interazione tra fattori
ambientali e fattori individuali caratterizzati da una
predisposizione di tipo multigenica. Componente
essenziale di questo background genetico è il sistema
HLAe gli studi più recenti di mappatura genica hanno
permesso di confermare il ruolo che i geni del sistema
HLA giocano nella predisposizione all’IDDM. Dagli
anni ’80 in poi gli alleli DR3-DR4 sono stati considerati marcatori privilegiati della suscettibilità alla malattia
con effetti sinergici legati alla contemporanea espressione dei due alleli nello stesso individuo. Contemporaneamente è stato accertato che nella popolazione
caucasica anche gli alleli del locus HLA-DQ (DQ2 e
DQ3) erano associati alla predisposizione al diabete
tipo 1 immunomediato. La presenza di questi alleli
non è, ovviamente, sufficiente alla comparsa della
malattia che è fortemente influenzata dalla interazione
con fattori ambientali e da una notevole familiarità
legata a meccanismi epigenetici di controllo dell’espressione genica: nelle famiglie con un bambino diabetico la percentuali di padri affetti è del 3,4% mentre
quella delle madri è dell’1,8%; inoltre la possibilità che
una bambina affetta da IDDM abbia un padre ammalato è maggiore di quella di un figlio maschio mentre la
relazione reciproca fra madre e figlio non è significativa.
Spondilite anchilosante
L’associazione della spondilite anchilosante con
l’allele HLA-B27, documentata oltre 25 anni fa, rimane
la più classica associazione conosciuta: più del 90% dei
pazienti è positivo per l’allele, mentre risulta positivo
meno del 10% della popolazione sana. Questa malattia
fa parte del gruppo di artropatie conosciute come
spondiloartriti sieronegative perché accomunate da
alcune caratteristiche quali: artrite periferica e sacroileite, lesioni cutanee, oculari (uveite acuta anteriore)
mucositiche o genitali, assenza di fattore reumatoide,
assenza di noduli sottocutanei. Esse colpiscono principalmente il sesso maschile in età compresa tra la
seconda e la terza decade.
Le altre principali malattie sono: l’artrite reattiva
(inclusa la sindrome di Reiter ), l’artrite psoriasica e le
artriti associate a malattie infiammatorie intestinali.
Tutte queste malattie sono associate con l’allele HLA-
160
B27, anche se la forza di associazione (RR) è minore
rispetto alla spondilite anchilosante. Occorre ricordare
che talvolta le manifestazioni extra-articolari possono
essere presenti in assenza apparente delle lesioni artritiche.
Artrite reumatoide (A.R.)
L’A.R., tra tutte le malattie associate al sistema
HLA, è quella con la più alta prevalenza (1%). E’
un’artrite infiammatoria cronica con manifestazioni
sistemiche a genesi autoimmune, caratterizzata da
localizzazione primitiva del processo patologico nella
membrana sinoviale delle articolazioni diartroidali,
delle guaine tendinee e delle borse e presenza nel siero
di fattore reumatoide (70-80% dei casi). Da molti anni è
stata stabilita l’associazione dell’A.R. con gli alleli DR1
e DR4 in parecchie popolazioni ma è stato solo con
l’introduzione delle metodiche in biologia molecolare
che si è potuto approfondire il valore clinico-diagnostico di queste associazioni. Si è passati cioè da un mero
dato statistico dell’associazione tra HLA-DR4 e la
malattia, all’analisi del ruolo giocato dai singoli alleli
nel modulare la suscettibilità e la gravità della malattia, Infatti, con tecniche di biologia molecolare applicate alla ricerca degli alleli HLA si è potuto stabilire che
tra gli alleli HLA-DRB1*04, l’allele DRB1*0401, ed in
minor misura l’allele DRB1*00403 sono coinvolti non
solo nella suscettibilità alla malattia ma sono anche un
marker prognostico sfavorevole (i soggetti positivi presentano un fenotipo clinico più grave), mentre l’allele
DRB1*0402 è addirittura coinvolto nella resistenza alla
malattia (i soggetti positivi presentano una minore
incidenza della malattia).
Lupus eritematoso sistemico (LES)
Il LES può essere definito come una malattia
autoimmune non organo specifica, molto variabile
nella sua presentazione clinica e caratterizzata da esacerbazioni e remissioni. Tipicamente la malattia è
caratterizzata dalla comparsa di autoanticorpi diretti
contro antigeni ubiquitari nell’organismo come i fosfolipidi e il DNA. L’eterogeneità delle manifestazioni cliniche è inoltre associata con la produzione di differenti
tipi di autoanticorpi. Il LES è una malattia multifattoriale in cui sono coinvolti fattori genetici (concordanza
del 58% tra gemelli omozigoti), ambientali (infezioni
virali, farmaci, radiazioni UV), endocrini (rapporto
donna/uomo 9/1) e immunologici (numerose anomalie del sistema immunitario). E’ da tempo noto che la
suscettibilità al LES ha una base genetica in cui i geni
del complesso maggiore di istocompatibilità hanno un
ruolo centrale anche se occorre specificare che gli alleli
HLA coinvolti, appartenenti all’aplotipo ancestrale 8.1
(vedi sotto), sono abbastanza frequenti anche a livello
di popolazione generale. Questo fa supporre che questi alleli costituiscano solo una delle componenti implicate nella patogenesi della malattia e che interazioni
fra alleli di geni presenti su cromosomi differenti (e
quindi non legati al sistema HLA) con fattori ambientali siano necessarie per la comparsa della malattia.
Aplotipo 8.1 e malattie infettive
Come accennato precedentemente il LES è associato
con l’aplotipo ancestrale 8.1 (con il termine ancestrale
definiamo aplotipi altamente conservati che sembrano
essere derivati da un antenato comune). Questo aplotipo 8.1 caratterizzato tra gli altri dagli alleli HLA-A1,
B8, Cw7, DR3, DR52, DQ2, è associato con un incredibile numero di malattie autoimmuni (vedi tabella 3).
Nonostante ciò, più di 10 milioni di europei sono portatori dell’aplotipo, suggerendo un suo ruolo positivo
nell’evoluzione e specificamente nella risposta alle
malattie infettive nel senso che un’iperreattività geneticamente determinata conferirebbe ai soggetti portatori
dell’aplotipo un’iperresponsività che da un lato determina un aumentato rischio di autoimmunità, mentre
dall’altro conferisce una maggiore resistenza alle infezioni. Infatti nei soggetti sani portatori dell’aplotipo
sono riscontrabili diverse alterazioni dei parametri
immunologici e della produzione di citochine simili a
quelli osservati nei pazienti affetti da Lupus (vedi
tabelle 4 e 5). In conclusione quindi, l’associazione
nello stesso aplotipo HLA di una costellazione di geni
interreagenti è in grado di conferire una capacità
immunologica che sarà “benefica“ (questo aplotipo è
associato significativamente con la longevità nei
maschi, confermando un suo ruolo positivo nella
risposta alle malattie che interferiscono con la sopravvivenza) o “dannosa” (è associato anche con una manifestazione più grave delle varie malattie infettive e correlato con una più rapida progressione della malattia).
161
MALATTIE
ANTIGENE
RISCHIO RELATIVO
Artrite reumatoide
Sindrome di Sjögren
Lupus eritematoso sistemico
B27
B27
B27
B27
B27
B13
B27
DR5-DR8
DR1-DR4
DR2-DR3
DR2-DR3
69-91
37
8-10
18
2-10
9.1
3.9
3.6
4.0
6-10
2.6-6.0
Gastroenteriche
Celiachia
Epatite cronica attiva
Colite ulcerosa
DR3-DR2-DR7
DR3
B5
11.6
6.8
3.8
A3
B14
A3+B14
DR15–DR2
6.7
26.7
90.0
5.4
DR3
Cw7
DR4
A10
B5
A1
16-17
8.5
14.6
4.8
3.8-6.3
3.0
DR3-DQ6; DR4-DQ8
DR3-DQ6 + DR4-DR8
B8
DR3
B35
DR3
B35
DR5
DR3-DR5
DR3
B47
3.6
20-51
2.5
3.7
4.4
10.5
14.00
3.2
4.0
6.0
15.4
Reumatiche
Spondilite anchilosante
Sindrome di Reiter
Uveite anteriore acuta
Artrite reattiva (da yersinia, salmonella, gonococco)
Artrite psoriasica
Artrite reumatoide giovanile
Ematologiche
Emocromatosi
Anemia perniciosa
Cutanee
Dermatite erpetiforme
Psoriasi volgare (giapponesi)
Psoriasi volgare (ebrei)
Malattia di Behçet
Herpes labialis ricorrente
Endocrine
Diabete mellito tipo 1
Ipertiroidismo
Ipertiroidismo (giapponesi)
Insufficienza surrenalica
Tiroidite subacuta di De Quervain
Tiroidite di Hashimoto
Malattia di Graves (Basedow)
Malattia di Addison
Iperplasia surrenale congenita
Tabella 1.
162
MALATTIE
ANTIGENE
RISCHIO RELATIVO
Neurologiche
Miastenia grave
Sclerosi multipla
Narcolessia
Schizofrenia
B8
DR2; DR4; DR6
DR2-DQ6
A28
2.7
2.7-4.1
100
2.3
Renali
Glomerulonefrite membranosa idiopatica
Sindrome di Goodpasture
Sindrome nefrosica a lesioni minime
Rene policistico
Nefropatia a IgA
Nefropatia da sali d’oro
DR3; DR2
DR2
B12
B5
DR4
DR3
5.7
15.9
4.2
2.6
3.1
14.0
Infettive
Lebbra tubercolare (asiatici)
Poliomielite paralitica
Bassa risposta al virus vaccinico
B8
B16
Cw3
6.8
4.3
12.7
Immunodeficienze
Deficit di IgA(donatori di sangue)
DR3
13.0
(%percentuale pazienti positivi per l’antigene) X (% controlli negativi per l'antigene)
Rischio Relativo=
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
(%percentuale pazienti negativi per l’antigene) X (%controlli positivi per l'antigene)
Tabella 2.
Malattie a patogenesi immunitaria associate con l’aplotipo ancestrale 8.1
Blocco cardiaco congestizio indotto da autoanticorpi
Carcinoma epatico
Cirrosi biliare primaria
Colangite sclerotizzante primitiva
Crioglobulinemia da HCV
Deficienza di IgA
Dermatite erpetiforme
Dermatomiosite
Epatite autoimmune
Herpes gestazionale
Lupus eritematoso sistemico
Malattia di Dupuytren
Malattia di Peyronie
Miastenia gravis
Miosite da corpi inclusi
Morbo di Addison
Morbo di Flajani-Basedow-Graves
Morfea indotta da silicone
Nefropatia idiopatica membranosa
Piastrinopenia neonatale alloimmune
Polimiosite
Porpora trombocitopenica cronica idiopatica
Sarcoidosi
Sindrome di Lambert-Eaton
Sindrome di Sjögren
Tossicità da sali d’oro
Alcune di queste malattie sembrano associate con singoli alleli dell’aplotipo 8.1
Tabella 3.
163
Parametri immunologici osservabili nei soggetti sani positivi per l’aplotipo ancestrale8.1
Apoptosi dei linfociti
↑
Attività natural killer
↓
Autoanticorpi
↑
Chemiotassi neutrofila
↓
Cortisolemia
↑
Risposta ai mitogeni
↓
Risposte anticorpali
≡
Tabella 4.
Profilo delle citochine osservabile nei soggetti sani portatori dell’aplotipo ancestrale 8.1
IL–2
↓
IL–4
≡
IL–5
↓
IL–6
≡
IL–10
≡
IL–12
↓
IL–13
≡
IFN-γ
↓
TNF-α
↑
Tabella 5.
164
ALLERGIA: UN PROBLEMA DIAGNOSTICO ANCORA
APERTO
Antonio La Gioia
Il termine allergia viene in genere riservato alle
diverse forme cliniche di ipersensibilità acquisita che
riconoscono una base immunologica. Più esattemente,
si intendono come allergie le condizioni in cui sono in
gioco reazioni IgE- o linfocito-mediate.
Attualmente non esistono singoli test di laboratorio
o altre procedure diagnostiche in grado di definire un
paziente come allergico; la diagnosi si basa piuttosto
sull’anamnesi e su una serie di indagini, in vivo ed in
vitro.
Esiste un diffuso accordo nel definire l’allergia IgEmediata come positività ai test cutanei eseguiti con
uno o più dei comuni allergeni, associata eventualmente ad un elevato valore sierico di IgE specifiche.
In realtà non è raro che soggetti con positività ai
test cutanei siano IgE negativi e non mostrino sensibilità clinica dopo esposizione all’allergene. E’ pur vero,
tuttavia, che tali soggetti presentano una alta probabilità di sviluppare una sintomatologia allergica entro i
tre anni successivi.
Dal punto di vista clinico l’ipersensensibilità IgEmediata si traduce generalmente in rinite allergica,
asma, ipersensibilità alimentare di tipo immediato,
allergia alle punture di insetti e, talvolta, in orticaria ed
angioedema.
In pazienti con sospetto di malattia allergica IgEmediata, i test cutanei rimangono il metodo diagnostico più accurato e vantaggioso dal punto di vista del
rapporto costo/efficacia.
I test cutanei si basano sul principio che un allergene, messo a contatto per via percutanea o epicutanea
con gli effettori cellulari dell’allergia (mastociti e basofili, essenzialmente) sono in grado di determinare la
liberazione degli specifici mediatori chimici (istamina,
serotonina), liberazione che si evidenzia come reazione
cutanea ponfo-eritematosa.
E’ generalmente accettato che una risposta positiva
del test cutaneo ad un determinato allergene sia confermata dal dosaggio delle IgE specifiche il cui livello,
espresso in Unità Internazionale e in classi convenzionali (da 0 a V) è in qualche modo descrittivo dell’
”impegno” del sistema immunitario di quel soggetto
nei confronti di quel particolare allergene.
Il dosaggio delle IgE specifiche trova inoltre applicazione in quei soggetti con “anergia” nei confronti dei
test cutanei e quadro clinico compatibile con la diagnosi di malattia allergica IgE-mediata.
I test cutanei ed il dosaggio delle IgE specifiche trovano il maggior campo di impiego nella diagnosi di
ipersensibilità da allergeni inalanti (polli, polveri, epiteli) o da veleni di imenotteri.
Particolari attenzioni interpretative devono essere
invece poste nella valutazione clinica dei test (positivi
o negativi) con allergeni alimentari; più in dettaglio va
tenuto conto del fatto che:
• la sintomatologia allergica da alimenti può essere
determinata non dallo specifico alimento ma da additivi (coloranti, conservanti) o dai prodotti intermedi di
digestione;
• numerosi alimenti (fragole, crostacei, alcool, cioccolata) sono direttamente istamino liberatori e, per
questo, determinano manifestazioni, specie cutanee,
non IgE mediate.
• vi è la possibilità di risposte crociate: il sistema
immunitario produce IgE specifiche capaci di reagire
con “famiglie” di allergeni, oltre che con quello che ne
ha indotto la formazione; conseguentemente la reattività in vivo ed in vitro non è generalmente attribuibile
ad una singola sostanza.
Gli aspetti precedentemente esaminati pongono
rilevanti problemi di appropriatezza nella scelta degli
allergeni da testare nel singolo soggetto e problemi
interpretativi particolarmente nel campo della diagnostica allergologica da inalanti ed in quella da alimenti
Tali problemi possono essere minimizzati utilizzando nella diagnostica solo pochi allergeni rappresentativi di ciascuna famiglia e valorizzando, in presenza di
un quadro clinico suggestivo, gli aspetti
anamnestico/informativi (stagionalità; calendario dei
pollini, organo bersaglio) capaci di dettare la scelta
degli allergeni più verosimilmente implicati.
Particolarmente nel campo delle allergie alimentari
le difficoltà d’inquadramento clinico precedentemente
richiamate si sommano a problemi metodologici relativi alla diagnostica sia in vivo che in vitro.
Per quanto riguarda la prima, il prick test con alimento fresco, potenzialmente dotato di elevata accuratezza diagnostica, risente dell’insufficiente standardizzazione, principale responsabile delle false negatività
(Alberse RC et Al. Standardization of in vivo and in
165
vitro diagnostics procedures in food allergy. Allergy
1998; 53:62). Tale metodica, chiamata anche prick –
prick prevede l’immersione della punta di un ago nell’alimento fresco da testare (prick) e la successiva puntura percutanea (prick) seguita dalla valutazione delle
caratteristiche del ponfo eventualmente sviluppatosi.
Per quanto riguarda la diagnostica in vitro, invece,
le maggiori difficoltà (e delusioni) derivano dalla frequente non corrispondenza tra gli estratti allergenici
utilizzati e le molecole realmente allergizzanti che,
spesso, sono il risultato dei processi di digestione,
assorbimento e metabolizzazione delle molecole alimentari native.
Per questi motivi si sono sviluppati nel tempo test
diagnostici alternativi ritenuti idonei per l’identificazione degli alimenti responsabili di manifestazioni
allergiche. Tra questi, quello meglio conosciuto ed
applicato è il test di Bryan o test citotossico, spesso
conosciuto e richiesto come citotest.
Il test, proposto anche per allergeni non alimentari,
si basa sulla supposizione che leucociti umani sottoposti al contatto con sostanze allergeniche subiscono
modificazioni morfologiche fino alla lisi; tali modificazioni sono riconoscibili e classificabili con l’osservazione morfologica.
Numerosi studi hanno dimostrato l’assoluta infondatezza del presupposto metodologico e riconoscono
l’inutilità diagnostica del citotest e la conseguente pericolosità delle decisioni cliniche basate sui risultati
dello stesso (E. Brestel. Malattie Allergiche. In McClat chey KD. Clinical Laboratory Medicine. Prima edizione Verduci Edit. Roma ,1996)
Sulla base di tale evidenza, ad esempio, l’agenzia
federale statunitense MediCare e le compagnie di assicurazione non riconoscono il pagamento del test di
Bryan; l’American Academy of Allergology, inoltre, ha
classificato il citotest come non affidabile per la diagnostica allergologica.
166
IL VALORE DIAGNOSTICO DELL’ESAME CHIMICOFISICO DEI VERSAMENTI IN CAVITA’ SIEROSE
Fabio Bonini
L’analisi dei versamenti in cavità sierose comprende:
• La valutazione dell’ASPETTO macroscopico. Il
normale contenuto delle sierose ed i trasudati sono
limpidi. La torbidità indica o un elevato contenuto
proteico o un alto numero di cellule. Un liquido ematico indica la presenza di un processo infiammatorio, un
danno vascolare o un trauma. La presenza di coaguli o
filamenti di fibrina si riscontra negli essudati. Il colore,
normalmente giallo-paglierino (trasudati) o giallo-carico (essudati), può variare al giallo verdastro negli essudati purulenti o per presenza di bilirubina fino ad un
colore bluastro negli essudati contaminati da Pseudomonas.
• La PROVA DI RIVALTA non è più eseguita perché di scarso valore diagnostico
• Il PESO SPECIFICO, correlato al contenuto proteico, è maggiore di 1.015 negli essudati ed è minore
nei trasudati.
• Il pH, costantemente alcalino nei trasudati e neutro o lievemente alcalino negli essudati.
• Le CELLULE, normalmente inferiori a cinque per
campo microscopico (x400), se presenti in numero elevato (specialmente neutrofili) sono indice di patologia.
• L’ANALISI CHIMICA, che in genere comprende
la misura del glucosio, proteine e LDH, dovrebbe comprendere anche il rapporto proteine del versamento e
quelle del siero e LDH versamento, LDH siero.
VERSAMENTI PLEURICI
La suddivisione dei versamenti pleurici in trasudati
ed essudati è di notevole importanza. Tuttavia nessuno
dei test menzionati sopra, da solo, è diagnostico. I versamenti a elevato contenuto di proteine, con aumentato del rapporto fra valore dell’LDH nel versamento e
quello dell’LDH del siero (LDH vers./LDH siero) e
con numerosi leucociti, sono indicativi di forme essudative. Tuttavia i trasudati secondari allo scompenso
cardiaco congestizio possono avere un elevato contenuto proteico dopo trattamento con diuretici; inoltre
qualsiasi versamento contenente residui cellulari può
avere un aumento del rapporto LDH vers./LDH siero.
Ovviamente, la diagnosi dipende dall’interpretazione
che si dà ai risultati del test nel contesto della malattia
del paziente. Infatti possono essere presenti frazioni
particolari, secondo della patologia di base. Ad esempio:
• Proteine. Nelle collagenopatie si ritrovano elevate
concentrazioni del fattore reumatoide e del fattore
antinucleo; nell’artrite reumatoide e nel LES sono
diminuiti C3 e C4.
• Eritrociti. In presenza di 5.000 – 6000 RBC/mL il
liquido pleurico appare francamente ematico. Con più
di 100.000 RBC/mL ha un aspetto emorragico ed è
suggestivo per neoplasie maligne, infarto polmonare,
T.B.C., traumi.
• Leucociti. Sono tipici dell’empiema i granulociti
polimorfonucleati (> 50.000/mL); nei trasudati si ha il
50% di mononucleati, in particolare negli essudati
tubercolari si ha prevalenza di linfociti.
• Marcatori tumorali. Esistono problemi legati alla
standardizzazione e problemi interpretativi legati ai
livelli di concentrazione; infatti mentre per CEA, CA
19.9 e CA 15.3 i valori del versamento sono sovrapponibili a quelli plasmatici, per altri no; ad esempio:
m TPA, che è sempre associato a fenomeni di
proliferazione cellulare, è quindi presente in elevate
concentrazioni in tutti i liquidi a contatto con reazioni
infiammatorie.
m CA-15.3 è presente a valori elevati in tutti i
casi di attivazione mesoteliale.
m Ferritina è sintetizzata attivamente dalle cellule del Sistema Reticolo-Endoteliale.
m Alfafetoproteina è poco selettiva nel differenziare i versamenti benigni da quelli maligni.
m NSE presenta buona sensibilità nelle metastasi
pleuriche da carcinoma polmonare a piccole cellule,
ma la sua specificità è bassa nei versamenti benigni.
m Per il CEA, invece, una recente indagine
dimostra una sensibilità di circa il 60-70% (superiore a
quella della citologia) con una specificità superiore al
90% per i versamenti benigni. Valori di CEA superiori
a 10 ng/mL sono altamente suggestivi per versamenti
di origine neoplastica, per quanto occasionalmente
valori superiori a 20 ng/mL siano stati trovati in caso
di empiema o di versamenti non neoplastici, e bassi
livelli, <10 ng/mL, sono stati trovati dalla maggior
parte degli Autori costantemente in versamenti pleurici di origine benigna. Livelli di CEA elevati sono stati
167
riportati in casi di versamenti maligni con citologia
negativa. Per cui, alla luce di tutto ciò, si può concludere che il solo dosaggio di questo marcatore può rivelarsi utile nell’applicazione routinaria.
VERSAMENTI PERITONEALI
Il liquido peritoneale, normalmente giallo paglierino, diventa torbido in corso di patologie infiammatorie
o neoplastiche o assume una colorazione verdastra se
contaminato da bile. È importante la diagnosi di emoperitoneo (di norma RBC < 100.000/mL) e di infezione
batterica (WBC < 300/mL) in cui il numero dei neutrofili supera i 350/mL.
La differenziazione tra trasudato ed essudato nel
liquido ascitico ha un range più basso per le proteine
(2,5 g/dL). La quantità di proteine nel liquido ascitico
è determinata più dalla pressione nel circolo portale,
con secondaria traduzione di linfa (ricca di proteine),
che da processi neoplastici o infiammatori. Inoltre
anche se l’ascite da ipertensione portale può avere
all’esordio le caratteristiche di un trasudato, si trasforma molto spesso in essudato per effetto della terapia
diuretica. Per questa ragione è stato proposto di utiliz-
zare il gradiente tra albumina plasmatica e albumina
del liquido ascitico come indice diagnostico differenziale dell’ascite da
1. ipertensione portale – differenza tra albumina
plasmatica e ascitica superiore a 1,1 g/dL
2. processi infiammatori e processi neoplastici – differenza inferiore a 1,0 g/dL
Altri analiti chimici eseguiti sul liquido peritoneale
sono:
• glucosio. I livelli sono ridotti nelle infiammazioni
prodotte da infezioni batteriche, nonché nella peritoniti tubercolari o secondarie a localizzazioni neoplastiche; amilasi. Aumenta in pazienti con pancreatite o
lesioni pancreatiche;
• ammonio. Aumenta in presenza di perforazioni
dello stomaco, dell’intestino e della vescica;
• fosfatasi alcalina. È notevolmente aumentata in
presenza di perforazione o strozzamento di anse intestinali;
• marcatori tumorali. Sulla base dei dati presentati
in letteratura si evidenzia che l’aumento del CEA e
CA19-9 è dovuto alla diffusione peritoneale del tumore, mentre CA-125 e AFP non sono dei validi marcatori.
PERCORSO DIAGNOSTICO PER DIAGNOSI DIFFERENZIALE TRAESSUDATO E TRASUDATO
Liquido pleurico
Liquido ascitico
ASPETTO
Trasudato
Essudato
Limpido o lievemente
Da opalescente a
opalescente
torbido e/o cromatico
< 1.015
> 1.015
Alcalino
Neutro o lievemente alcalino
Lievemente inf.
Nettamente inf.
alla glicemia
alla glicemia
<3
>3
< 200
> 200
< 0.5
> 0.5
< 0.6
> 0.6
Vedi testo
Vedi testo
*per maggiori dettagli vedi testo
PESO SPECIFICO
Ph
GLUCOSIO (mg/dL)
PROTEINE (g/dL)
LDH (U/L)
PROTEINE vers./ PROTEINE siero
LDH vers./LDH siero
ERITROCITI
LEUCOCITI
*Esami richiedibili per entrambi i versamenti
Percorso Diagnostico Per Diagnosi Differenziale
Patologia associata
Liqido pleurico
Liqido ascitico
GRADIENTE ALB.siero – ALB. Vers.
Per determinare l’origine dell’ascite
C4, ANA, Fattore Reumatoide
Nelle malattie autoimmuni
CEA
CEA CA19.9
Lesione e diffusione neoplastica
AMILASI
Pancreatite, lesioni pancreatiche
AMMONIO
Perforazione dello stomaco, intestino, vescica
FOSFATASI ALCALINA
Perforazione o strozzamento delle anse intestinali
Tabella riassuntiva del percorso diagnostico suggerito.
168
DIAGNOSTICA CITOLOGICA DEI LIQUIDI DA
VERSAMENTO ENDOCAVITARIO
Roberta Sarnelli
In condizioni fisiologiche le grandi cavità sierose
(pleuriche, pericardica, peritoneale), rivestite da un
monostrato di cellule mesoteliali piatte, contengono
solo pochi millilitri di liquido con funzione lubrificante. La possibilità di eseguire un esame di citologia esfoliativa è indicativa di una situazione patologica in atto,
cioè dell’esistenza di un versamento endocavitario.
A seconda delle caratteristiche chimico-fisiche del
liquido e della sua eziopatogenesi, si distinguono trasudati ed essudati.
I trasudati sono di origine meccanica o discrasica,
hanno un contenuto proteico <20 gr/L e un peso specifico <1015.
Gli essudati sono di origine flogistica, neoplastica,
traumatica, hanno un contenuto proteico >20 gr/L ed
un peso specifico >1015. Dal punto di vista macroscopico, il liquido trasudatizio ha un aspetto limpidocitrino ed è caratterizzato citologicamente dalla presenza prevalente di cellule mesoteliali con occasionali
istiociti, linfociti e granulociti neutrofili. Il liquido
essudatizio invece è torbido ed è caratterizzato citologicamente da cellule mesoteliali, frammiste a granulociti neutrofili, macrofagi, linfociti e plasmacellule in
varia proporzione fra loro, nonché da eventuali altri
elementi cellulari non tipici per morfologia e sede.
Modalità di conservazione e di invio dei campioni
al laboratorio
Il liquido biologico deve pervenire al laboratorio
preferibilmente subito dopo essere stato prelevato e
comunque non oltre 24 ore, in tal caso conservato nel
frattempo in frigorifero a + 4°. La quantità suggerita
per poter effettuare l’esame è di 1-5 mL. Il liquido deve
essere collocato in contenitori eparinati reperibili in
commercio. Il materiale conservato in maniera non
corretta darà luogo a preparati insoddisfacenti per
poter esprimere un giudizio diagnostico. La richiesta
medica deve essere corredata da un modulo di accompagnamento ad uso interno, su cui siano specificati
dettagliatamente tutti i dati utili per l’identificazione
del paziente, del prelevatore, del materiale inviato e i
dati clinici salienti necessari per un corretto approccio
diagnostico, nonché eventuali quesiti particolari. Per
maggiori precisazioni si rimanda alle istruzioni operative allegate allo “Standard di Prodotto” dell’U.O.
Anatomia Patologica.
Note tecniche sull’allestimento e la colorazione dei
preparati per la microscopia ottica
Il preparato ottimale è rappresentato da un “monostrato” di cellule prive di artefatti tecnici (distorsione)
e separate fra loro. Gli elementi cellulari dovrebbero
Finalità dell’esame citologico del liquido da versa - essere tutti rappresentati nel preparato citologico, in
mento endocavitario
percentuale sovrapponibile a quella in vivo. Nel nostro
Il principale quesito clinico posto al laboratorio laboratorio è adottata per l’allestimento la tecnica tradi anatomia patologica è tradizionalmente: << dizionale di citocentrifugazione a basso numero di
Sono presenti cellule tumorali? >>. In genere e priori- giri. La fissazione cellulare può avvenire allo stato
tariamente, al medico curante interessa dunque sapere umido o previo essiccamento all’aria, a seconda della
se è possibile documentare l’esistenza di una patologia colorazione di routine che si preferisce usare, rispettineoplastica in atto e stabilirne eventualmente l’origine, vamente Papanicolau o May Grünwald Giemsa
a conferma di un sospetto clinico-strumentale e per (MGG). Talora può essere di qualche utilità per la defiindirizzare il percorso diagnostico-terapeutico futuro nizione diagnostica, in caso di specifici quesiti clinici,
del loro assistito.
ricorrere a colorazioni speciali sia istochimiche (per
Oltre a queste fondamentali informazioni, l’esame esempio PAS per il muco intracellulare e Perls per il
può consentire al citopatologo di fornire ulteriori indi- ferro), sia immunoistochimiche.
cazioni in caso di patologia non neoplastica, specialmente nella diagnosi differenziale circa la natura di
Esame dei preparati citologici al microscopio ottico
una flogosi (per esempio batterica, tubercolare o
L’osservazione a piccolo ingrandimento consente di
espressione di collagenopatie).
verificare la qualità tecnica del preparato e fornisce
169
informazioni preliminari circa la possibile presenza di
strutture cellulari variamente aggregate (rosette, tubuli, clusters, papille) da indagare a più forte ingrandimento.
Diagnostica citologica dei versamenti endocavitari
di natura neoplastica
I versamenti di natura maligna sono dovuti a
tumori primitivi dell’epitelio di rivestimento delle sierose (mesoteliomi) oppure sono secondari ad infiltrazione neoplastica della sierosa per espansione diretta
o per disseminazione metastatica di un tumore primitivo (carcinomi, sarcomi, linfomi, melanomi) originato
in altra sede. Se l’identificazione di cellule maligne è
indicativa della natura neoplastica del versamento,
non è altrettanto vero il contrario. Infatti le cellule
tumorali possono non essere evidenziabili (“falso
negativo”) per molteplici ragioni. Ad esempio, le cellule neoplastiche non sono esfoliate o sono esfoliate in
quantità troppo scarsa o non sono riconoscibili per la
qualità subottimale del preparato dovuta a conservazione difettosa o ad artefatti tecnici. Inoltre, talora, una
neoplasia esiste effettivamente nel paziente, ma non è
topograficamente correlata al versamento endocavitario, che quindi non conterrà cellule maligne seppure
sia stato causato indirettamente dal tumore.
In conclusione, qualora persista il sospetto clinico di
malignità con referto citologico negativo, il medico
curante insisterà con altri accertamenti diagnostici
inclusa la eventuale ripetizione dell’esame citologico,
stante la possibilità di un “falso negativo”.
a) Mesoteliomi
All’esame citologico, le cellule mesoteliali maligne
sono di regola frammiste a cellule mesoteliali benigne.
Possono essere isolate, disposte in aggregati o in formazioni papillari. Si pongono problemi di diagnostica
differenziale sia con cellule mesoteliali reattive di
natura benigna, sia con cellule neoplastiche maligne
non mesoteliali. Nonostante sia stata codificata una
serie di parametri citopatologici suggestivi di mesotelioma, la diagnosi citologica di certezza è difficoltosa,
specie in assenza del conforto di dati anamnestici
significativi quali l’esposizione all’asbesto o, nel caso
di localizzazioni pleuriche, senza l’identificazione dei
corpi di asbesto unitamente all’assenza di cellule maligne nell’espettorato. Talora la diagnosi citologica non è
in grado di fornire elementi sufficienti e/o conclusivi e
può essere utile procedere al prelievo bioptico per
approfondimenti diagnostici quali l’esame istologico,
l’analisi cromosomica, la microscopia elettronica.
b) Tumori maligni di altra natura
I criteri per la diagnosi citologica di certezza di versamento di natura maligna di origine non mesoteliale
si basano essenzialmente sul riconoscimento di:
1) due popolazioni cellulari (escluse le cellule
infiammatorie) morfologicamente distinte e senza
forme di transizione fra loro, di cui una mesoteliale
benigna e l’altra organizzata in aggregati grossolani
non caratteristici dei mesoteliomi;
2) una sola popolazione di cellule atipiche isolate e
monomorfe;
3) occasionali cellule isolate con caratteri inequivocabili di malignità nel contesto di un tappeto di cellule
infiammatorie;
4) inclusi caratteristici di cellule non mesoteliali,
come melanina e muco.
La citologia esfoliativa può fornire inoltre informazioni relative all’istotipo della neoplasia primitiva,
consentendo di diagnosticare per esempio: carcinomi
squamosi ben differenziati, per la presenza di formazioni a tipo di “perle cornee”; carcinomi indifferenziati
a piccole cellule, per la caratteristica organizzazione “a
fila indiana”; linfomi e leucemie, per la presenza di cellule piccole ma isolate fra loro, a differenza della
disposizione assunta nei carcinomi indifferenziati;
melanomi, per la presenza di inclusi di melanina; adenocarcinomi, per la presenza di muco. In tutti i casi è
di importanza fondamentale il confronto anatomo-clinico fra medico e citopatologo, al fine di poter confermare il sospetto clinico e/o indirizzare verso la possibile sede di origine del tumore primitivo.
Diagnostica citologica dei versamenti endocavitari
di natura non neoplastica
Le cellule mesoteliali benigne presenti nei versamenti, comunemente definite attivate, sono reattive a stimoli irritativi e assumono caratteri morfologici diversi
rispetto alle cellule normali. Infatti non sono piatte ma
cubiche o cilindriche, per fenomeni di ipertrofia, e
pluristratificate, per fenomeni di iperplasia. Nel preparato citologico appaiono di solito isolate, mostrano
atipie di natura flogistica anche marcate e ingravescenti con la durata del versamento. La diagnosi differenziale con cellule maligne può risultare difficile in varie
situazioni morbose non tumorali (collagenopatie, epatopatie, malattie infiammatorie croniche, terapie
radianti, infarti) e quando la morfologia cellulare non è
ottimale a causa di modificazioni intervenute per troppo prolungata permanenza nel liquido del versamento, indipendentemente dalle precauzioni usate per la
corretta conservazione. Per quanto riguarda poi le
principali cellule della flogosi, la loro tipologia e la
percentuale numerica possono orientare o confermare
un sospetto clinico. Per esempio, il versamento sieroso
classicamente caratterizzato da una costante e prevalente componente linfocitaria è quello tubercolare,
peraltro indistinguibile con l’esame citologico routinario dalla infiltrazione sierosa in corso di leucemia linfatica cronica. Anche nei versamenti metapneumonici,
col tempo, si verifica un viraggio dai granulociti neutrofili a linfociti e plasmacellule. Una quota ben rappresentata di granulociti eosinofili si evidenzia in
numerose situazioni patologiche non neoplastiche, fra
cui collagenopatie, malattie allergiche e da ipersensibi-
170
lità, micosi e parassitosi, tubercolosi e pneumotorace e
talora in corso di neoplasie maligne, come il linfoma di
Hodgkin.
Conclusioni diagnostiche
Per standardizzare la diagnosi e semplificarne al
massimo l’interpretazione, nel referto citologico emesso dal nostro laboratorio le conclusioni diagnostiche
sono riassunte in uno schema che prevede cinque possibili CATEGORIE (C1-C5), con particolare riferimento
alla presenza/assenza di cellule neoplastiche: C1 non
valutabile, C2 negativo, C3 dubbio, C4 sospetto, C5
positivo. Risulterà barrata la categoria di appartenenza del campione in esame.
referto dell’esame citologico su liquido da versamento
endocavitario è da intendersi comunque, da parte del
medico curante, soltanto come un elemento in più nel
complesso spettro di dati a sua disposizione, la cui
valutazione deve essere interpretata nel contesto generale del quadro clinico e deve armonizzarsi con tutti
gli altri dati. E’ ragionevole considerare l’esame citologico come un’analisi di supporto per la conferma di un
sospetto clinico o per orientare ulteriori approfondimenti. Non sempre infatti la citologia può soddisfare
aspettative più ambiziose, risolvendo di per se stessa
in maniera inequivocabilmente certa il quesito diagnostico posto.
Approfondimenti bibliografici
Confronto anatomo-clinico: possibilità e limiti del Per l’approfondimento di temi generali o specifici di
l’esame
citopatologia, si indica in particolare agli interessati il
Concludendo, si ribadisce in primo luogo l’impor- riferimento bibliografico del testo considerato “un
tanza fondamentale per il citopatologo della disponibi- classico” nel settore:
lità dei dati anamnestici essenziali e delle notizie cliniche salienti del paziente per l’inquadramento del caso
BIBBO M. Comprehensive Cytopathology,
e dunque per un corretto orientamento diagnostico. Il
Saunders Company Ed., 1997
171
IL LABORATORIO NELL’ESAME DEL LIQUIDO SEMINALE
Fabio Bonini
L’analisi del liquido seminale è un momento cruciale per lo studio della coppia infertile. Circa il 15-20%
delle unioni è infertile; se questa situazione persiste
per più di un anno di rapporti sessuali non protetti è
definita infertilità primaria. Il fattore maschile rappresentato da un numero ridotto o da una ridotta motilità
o da alterazioni morfologiche degli spermatozoi, è
responsabile di circa il 50% dei casi di infertilità e merita di essere valutato quanto il fattore femminile.
Inoltre è importante considerare che se anche una
coppia ha già procreato ciò non garantisce in maniera
assoluta la futura capacità di procreare, questa situazione è definita infertilità secondaria.
Ad evidenziare l’importanza che ha acquistato questo esame si possono citare i risultati di un recente
lavoro comparso su “Il Patologo Clinico”. Solo il 30%
dei pazienti che si sottopongono all’esame presentano
una normalità dei parametri seminali; invece il 69%
dei pazienti con sterilità di coppia, il 59% dei pazienti
affetti da varicocele, il 68% dei pazienti con infezioni
urogenitali hanno presentato anormalità di uno o più
degli stessi parametri. Inoltre, il 19% di soggetti vasectomizzati presentano a distanza di tempo una criptozoospermia persistente e l’azoospermia viene raggiunta, mediamente, dopo circa 6 mesi.
Quindi il test è indicato nei seguenti casi:
• Pazienti con sterilità di coppia
• Pazienti con varicocele
• Pazienti con infezioni urogenitali
• Pazienti vasectomizzati
Attualmente vi è una richiesta sempre maggiore di
esami del liquido seminale e per la standardizzazione
delle procedure di esecuzione del test nel nostro Laboratorio vengono seguite le indicazioni dell’American
Fertility Society che raccomanda che il personale
addetto ai laboratori andrologici abbia almeno un’esperienza biennale nel settore e che i protocolli analitici seguano le raccomandazioni dell’OMS.
Nelle seguenti tabelle vengono elencate le istruzioni dell’OMS pubblicate nel 1992 per uniformare le
istruzioni di raccolta, l’esecuzione e la refertazione dell’esame seminale.
E’ utile sottolineare che è importante valutare
numericamente la presenza di granulociti neutrofili e
delle cellule germinali, la prima per la valutazione
oggettiva di processi flogistici a carico dell’apparato
riproduttivo, la seconda è fondamentale per la diagnosi differenziale delle azoospermie. Infatti la presenza
di tali cellule permette di escludere un’ostruzione bilaterale totale.
A causa della variabilità in funzione del tempo dei
parametri seminali nello stesso individuo, il basarsi sui
dati di un solo esame é un criterio di scarso significato,
specialmente per valori patologici, per cui secondo
l’OMS é opportuno eseguire due test a distanza di 20 30 giorni ed un terzo dopo 2 - 3 mesi dal primo.
1. La raccolta del campione va eseguita al mattino dopo un periodo di astensione sessuale di 4 - 5 giorni.
2. Il campione va raccolto per masturbazione con eiaculazione direttamente in un contenitore sterile di vetro o di plastica
dopo accurata igiene dei genitali. Sono inadatti metodi di raccolta col profilattico per la presenza di fattori immobilizzanti gli spermatozoi ed il coito interrotto per la perdita delle prime frazioni dell’eiaculato.
3. Il materiale deve essere consegnato in Laboratorio entro 40’ dalla raccolta. Durante il trasporto il paziente deve prestare
attenzione alle brusche variazioni di temperatura che non deve mai essere inferiore a 20°C e superiore a 36°C, mantenendo il campione avvolto in un panno, in una borsa.
4. Sul contenitore deve essere riportata la data, il nome e cognome del paziente, l’ora di eiaculazione e la data dell’ultimo
rapporto sessuale.
Tabella 1. Modalità di raccolta del liquido seminale.
172
OLIGOSPERMIA
Spermatozoi < 20 milioni/mL
ASTENOZOOSPERMIA
Motilità < 50% o movimenti progressivi rettilinei < 25%
TERATOZOOSPERMIA
Forme morfologicamente normali < 30%
AZOOSPERMIA
Eiaculato senza spermatozoi
CRIPTOZOOSPERMIA
Spermatozoi < 1 milione/mL
Tabella 2. Criteri interpretativi dei risultati di laboratorio.
PARAMETRI DAVALUTARE
VALORI DI RIFERIMENTO
FLUIDIFICAZIONE COMPLETA
ENTRO 1 ORA
COLORE ED ASPETTO
GRIGIASTRO, OMOGENEO
VISCOSITÀ
< 2 cm
pH
7.2 - 8.0
VOLUME
2.0 - 6.0 mL
NUMERO DI SPERMATOZOI
20 - 120 MILIONI
MOTILITÀ
a + b > 50% OPPURE
a) MOVIMENTI PROGRESSIVI RETTILINEI
a > 25%
b) MOVIMENTI PROGRESSIVI NON RETTILINEI
c) MOVIMENTI NON PROGRESSIVI
d) FORME IMMOBILI
TEST DI VITALITÀ ALL’EOSINA
> 50%
AGGLUTINAZIONE SPONTANEA
< 5%
FORME NORMALI
SUPERIORI O UGUALI AL30%
CELLULE GERMINALI IMMATURE
< 5 MILIONI
LEUCOCITI
< 1 MILIONE
EMAZIE
ASSENTI
FLORA BATTERICA
ASSENTE
CRISTALLI
ASSENTI
Tabella 3. Modalità di esecuzione del test.
173

servizio di laboratorio - Accademia di qualitologia

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