APPARATO LACRIMALE IN PECORE CON INFEZIONE DA Brucella

APPARATO LACRIMALE IN PECORE CON INFEZIONE DA Brucella spp.:
REPERTI ISTOPATOLOGICI GHIANDOLARI ED ELETTROFORESI
LACRIMALE
LACRIMAL SYSTEM IN SHEEPS WITH Brucella spp INFECTION: GLANDULAR
HISTOPATHOLOGICAL FINDINGS AND LACRIMAL ELECTROPHORESIS.
GRUPPILLO A., GALIA S., BOSCO V.R.F., PARISI F., MAZZULLO G.*, PUGLIESE
A.
Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Università di Messina; * Dipartimento di
Sanità Pubblica Veterinaria, Università di Messina.
PAROLE CHIAVE: apparato lacrimale, Brucella spp., pecora, real time PCR, istologia,
elettroforesi.
KEY WORDS: lacrimal system, Brucella spp., sheep, real time PCR, histology,
electrophoresis.
RIASSUNTO
La ricerca è stata effettuata su n°20 pecore adulte siero-positive a Brucella spp.. Obiettivi
del presente lavoro sono stati: individuare la presenza del batterio nell’apparato lacrimale
attraverso la real-time PCR (ghiandola lacrimale principale e lacrime) e valutare eventuali
lesioni isto-patologiche ghiandolari in rapporto alla presenza del batterio a livello oculare.
Infine, determinare l’assetto quali-quantitativo del pattern proteico lacrimale, mediante
elettroforesi su gel d’agarosio, al fine di evidenziare variazioni nella composizione proteica
lacrimale. I tessuti ed i liquidi biologici prelevati sono stati sottoposti a real-time PCR per
Brucella spp. La positività dei campioni è risultata del 100% per quanto riguarda il secreto
lacrimale e leggermente inferiore per le ghiandole lacrimali.
L’esame istologico effettuato sulle ghiandole positive alla PCR ha messo in evidenza la
presenza di un infiltrato infiammatorio localizzato per lo più in sede perivascolare,
verosimilmente riconducibile all’azione patogena delle brucelle sui tessuti presi in esame.
L’elettroforesi lacrimale ha permesso di identificare nelle lacrime, su un valore di proteine
totali di 7 g/dl, le seguenti frazioni proteiche: proteine a migrazione rapida (PMR) (valore
medio: 15.82%); albumina (25.77%); lattoferrina ad elevato peso molecolare (37.55%) ed
immunoglobuline (20.85%).Tali valori non presentano modificazioni significative rispetto
al pattern proteico lacrimale fisiologico di specie.
SUMMARY
The research was carried on n°20 adult sheep serum-positive to Brucella spp. The
objectives of this study were: to detect the bacterium into the lacrimal system using the real
time PCR on the principal lacrimal gland and the tears, and to evaluate the histopathological lesions in the gland relate to the presence of the bacterial cell into the eye.
Another aim was to determine the quali-quantitative protein lacrimal pattern using the
agarose gel electrophoresis, underlying the possible variations in the protein composition of
tears. On the biological samples the real-time PCR to detect Brucella spp. was carried. The
lacrimal samples were all positive, while the lacrimal glands showed a lower positivity. The
histological examination performed on the positive to Brucella spp. lacrimal glands showed
the presence of an inflammatory perivascular infiltration, that can be related to the action of
the pathogen into the tissues. The lacrimal electrophoresis allowed to identify into the tears
the following protein fractions (total protein: 7 g/dl): proteins with a rapid migration (PMR)
(mean value: 15.82%); albumin (25.77%); lactoferrin with elevated molecular weight
(37.55%) and immunoglobulines (20.85%). Those values not show significant differences
in respect to the physiological lacrimal protein pattern of this animal specie.
PREMESSA
La brucellosi ovi-caprina, sostenuta prevalentemente da Brucella melitensis, è un’infezione
cosmopolita ad elevata contagiosità e rappresenta una tra le malattie zoonosiche più diffuse
in tutto il bacino del Mediterraneo. L’uomo può contrarre l’infezione per via diretta, ossia a
seguito del contatto con animali infetti, oppure per via indiretta attraverso il consumo di
latte non pastorizzato o formaggi freschi ottenuti da latte infetto (1). Nella specie ovina
l’infezione può realizzarsi per via orale, per via transplacentare e attraverso il coito; inoltre,
soprattutto negli animali stabulati al chiuso la mucosa congiuntivale può rappresentare una
via di trasmissione dell’infezione da non sottovalutare. Il batterio, una volta introdotto
nell’ospite e moltiplicatosi nei fagociti e nel tessuto linfoide, determina reazioni flogistiche
a carattere granulomatoso (granuloma brucellare), essudatizio-necrotizzante o purulento in
organi quali milza, fegato, midollo osseo e linfonodi. Possono inoltre essere coinvolti anche
l’apparato genitale (utero e placenta di femmine gravide, con conseguente aborto), la
mammella (micromastite interstiziale granulomatosa), i reni, il testicolo, l’epididimo, le
articolazioni, le guaine tendinee, le borse sinoviali e l’apparato oculare. In quest’ultimo
caso, le manifestazioni oculari più comunemente riportate sono rappresentate da forme di
episclerite, uveite, neuropatia ottica ed endoftalmite (2-7).
Considerato l’importante ruolo svolto dalla specie ovina nell’ambito dell’epidemiologia
della malattia e la carenza di dati bibliografici relativi alla brucellosi oculare in questa
specie animale, obiettivo del presente lavoro è stato quello di effettuare una valutazione
delle strutture oculari in pecore infette. In particolare, abbiamo rivolto la nostra attenzione
all’apparato lacrimale (ghiandola lacrimale principale) e al secreto lacrimale, dal momento
che l’occhio ed i suoi annessi possono rappresentare la prima via di penetrazione del
patogeno nell’organismo ospite e la sede di una prima reazione immunologica locale.
MATERIALI E METODI
La nostra ricerca è stata effettuata su n°18 pecore adulte, di razze diverse, sottoposte al
piano nazionale di eradicazione della brucellosi ovina e caprina. Su tutti i soggetti, prima
della macellazione, si è proceduto ad effettuare: prelievo di sangue, esame oftalmologico e
raccolta del secreto lacrimale di ciascun occhio tramite pipette Eppendorf, munite di
puntale, poste tangenzialmente alla mucosa del fornice congiuntivale ventrale. Subito dopo
l’abbattimento è stata effettuata l’enucleazione dei globi oculari e, successivamente, il
prelievo delle ghiandole lacrimali principali.
Parte di tessuto ghiandolare ed un aliquota di secreto lacrimale sono stati sottoposti a realtime PCR per Brucella spp., Mycoplasma spp. e Chlamydophila spp., con limite di
rilevabilità di 1 equivalente genomico per ml.
I rimanenti campioni lacrimali, mantenuti in ambiente refrigerato (4°C) durante il trasporto
in laboratorio, sono stati sottoposti ad esame spettrofotometrico, per la determinazione del
contenuto proteico totale, e ad elettroforesi zonale su gel d’agarosio, per valutare l’assetto
quali-quantitativo del pattern proteico. L’identificazione di alcune frazioni proteiche
contenute nelle lacrime è stata possibile grazie al confronto con protidogrammi di siero
proveniente dagli stessi soggetti e sottoposti a migrazione parallela nelle medesime
condizioni. La comparazione dei tracciati è stata possibile assumendo come riferimento la
migrazione dell’albumina sierica, in quanto la quota di albumina lacrimale è anch’essa di
derivazione ematica e la velocità di migrazione è identica in entrambi i campioni.
Dai preparati istologici delle ghiandole lacrimali, previa fissazione dei tessuti in formalina
tamponata al 10% e inclusione in paraffina, sono state ottenute sezioni di 4 µm di spessore,
successivamente colorate con Ematossilina-Eosina (EE).
RISULTATI
La positività dei campioni per Brucella spp alla real-time PCR è risultata del 100% nel
secreto lacrimale e del 41,66% nelle ghiandole. Di queste ultime, il 22,22% è risultato
positivo solo a Brucella spp mentre nel 19,44% del campione esaminato la positività era
legata alla compresenza di Brucella spp e Mycoplasma spp;
La positività dei campioni per Mycoplasma spp. alla real-time PCR è risultata del 94,44%
nel secreto lacrimale e del 69,44% nelle ghiandole, di cui il 50 % è risultato positivo solo a
Mycoplasma spp. e il 19,44% a Brucella spp., associata a Mycoplasma spp. (Tabella 1 e 2);
ancora, tutti i campioni sono risultati negativi per Chlamydophila spp.
Nelle ghiandole lacrimali negative alla RT PCR per Brucella spp. l’esame istologico non ha
messo in evidenza lesioni istopatologiche riconducibili all’azione patogena svolta dal
batterio.
Nelle ghiandole lacrimali risultate positive a Brucella spp. la valutazione istologica ha
permesso di evidenziare un infiltrato infiammatorio localizzato per lo più in sede
perivascolare e costituito prevalentemente da una popolazione linfo-istiocitaria e scarse
plasmacellule.
Relativamente al secreto lacrimale la concentrazione media delle proteine totali nei
campioni oggetto di studio è stata di 7 g/dl.
L’elettroforesi lacrimale, condotta in parallelo con la foresi sierica degli stessi soggetti
quale campione di riferimento, ha permesso di identificare nelle lacrime le seguenti frazioni
proteiche: proteine a migrazione rapida (PMR), albumina, lattoferrina ad elevato peso
molecolare ed immunoglobuline. Le rispettive concentrazioni medie erano: PMR =1,13 g/dl
(15.82%); albumina =1,75 g/dl (25.77%); lattoferrina ad elevato peso molecolare =2,61 g/dl
(37.55%); immunoglobuline =1,49 g/dl (20.85%).
Specie batterica
Tipo di
campione
Secreto
Ghiandola
Tabella 1. Positività di ghiandole lacrimali e secreto.
Specie batterica
BRUCELLA SPP.
MICOPLASMA SPP.
CHLAMYDOPHILA SPP.
100%
41,66%
94,44%
69,44%
-
Tabella 2. Positività nella ghiandola lacrimale principale.
BRUCELLA SPP. TOTALE
BRUCELLA SPP. +
7 (19,45%)
18 (50%)
25 (69,45%)
MICOPLASMA SPP. +
8 (22,22%)
3 (8,33)%
11 (30,55%)
MICOPLASMA SPP. 15 (41,67)%
21 (58,33)%
36 (100%)
TOTALE
CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI
La brucellosi rappresenta nel nostro paese un notevole problema per la salute pubblica, in
quanto è caratterizzata da un’elevata diffusibilità tra la popolazione, comprese le categorie a
rischio.
Il coinvolgimento dell’apparato oculare in corso di brucellosi è un’evenienza tutt’altro che
rara nell’essere umano, in cui sono stati osservati episodi di uveite ricorrente ed
endoftalmite e più raramente cheratocongiuntivite e dacrioadenite. Al contrario, scarso
interesse è stato riservato alle possibili lesioni oculari determinate da Brucella spp. negli
animali da reddito (biblio).
I risultati del presente lavoro sottolineano la presenza di Brucella spp a livello oculare nelle
pecore, con particolare riferimento ad un interessamento dell’apparato lacrimale, come
evidenziato dall’elevata positività dei test diagnostici impiegati, sia a livello del fluido
lacrimale (100% di positività alla RT PCR) che delle strutture ghiandolari (40 % circa di
positività). Tali riscontri, se da una lato evidenziano che il batterio può essere presente in
elevate concentrazioni anche a livello oculare, dall’altro testimoniano la possibilità che le
lacrime di animali infetti possono rappresentare un veicolo di trasmissione della brucellosi
all’uomo e ad altri animali di non trascurabile interesse.
Le lesioni istopatologiche riscontrate a livello delle ghiandole lacrimali positive tramite RTPCR a Brucella spp., pur non potendo essere considerate patognomoniche dell’infezione
brucellare, possono essere verosimilmente ricondotte all’azione flogogena svolta da tali
batteri sui tessuti ghiandolari presi in esame, confermando l’esistenza di una stretta
correlazione tra brucellosi e lesioni oculari. La presenza dell’infiltrato linfoplasmocitario
perivascolare ghiandolare può essere riconducibile, esclusivamente, all’azione flogogena di
Brucella spp., considerata la negatività dei campioni esaminati a Chlamydophila spp. e
l’assenza di lesioni istopatologiche ghiandolari in quei soggetti risultati positivi unicamente
a Mycoplasma spp.
I dati ottenuti nel presente lavoro rappresentano la prima segnalazione del coinvolgimento
della ghiandola lacrimale principale in corso di infezione naturale di brucellosi ovina, così
come dimostrato per le strutture extraoculari del bovino soltanto in seguito ad esposizione
sperimentale al batterio. Diversamente nell’uomo sono già state riportate manifestazioni
extra ed endo-oculari della malattia, con quadri clinici riferibili ad uveiti, endoftalmiti,
dacrio-adeniti e neuriti ottiche (biblio).
La valutazione elettroforetica delle proteine lacrimali degli animali infetti, comparata con il
pattern proteico lacrimale della specie ovina in condizioni fisiologiche, non ha evidenziato
differenze significative relativamente alla composizione quali-quantitativa del pool proteico
lacrimale.
Il quadro elettroforetico lacrimale riscontrato testimonia un normale funzionamento del
sistema di produzione delle lacrime, evidentemente non inficiato in maniera significativa
dalla presenza dei batteri in sede oculare.
Ancora, la presenza di elevate concentrazioni di materiale genetico brucellare nelle strutture
esterne dell’occhio (vedi tabella) può confermare, in analogia con quanto riportato in
letteratura per la specie bovina (Meador VP et al., 1988), che la via congiuntivale possa
rappresentare la porta d’ingresso della brucella nell’organismo ospite anche negli animali
oggetto di studio.
Quanto affermato sottolinea l’importanza di un precoce controllo diagnostico dei fluidi
oculari, considerato che la oculo-congiuntivale rappresenta una via di trasmissione non
trascurabile nell’ambito dell’epidemiologia della malattia, non potendo escludere a nostro
avviso un contagio diretto intra ed interspecifico con tale materiale biologico, anche in
assenza di lesioni oculari macroscopiche.
Riteniamo, infine, che il nostro lavoro possa rappresentare un nuovo traguardo nell’ambito
dell’epidemiologia e della profilassi della brucellosi, considerato che il riscontro di brucelle
nella ghiandola lacrimale principale e nel secreto lacrimale di pecore infette è un reperto di
nuova acquisizione, espressione della colonizzazione del patogeno nel segmento esterno
dell’occhio.
BIBLIOGRAFIA
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