24 INFLUENZA DEL METODO DI CONSERVAZIONE

VI Convegno Nazionale SOFIVET – Stintino (SS) 2005
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INFLUENZA DEL METODO DI CONSERVAZIONE SUL DOSAGGIO DEGLI
STEROIDI FECALI NELLA TIGRE DEL BENGALA (PANTHERA TIGRIS TIGRIS)
Carraro C., Da Dalt L., Gabai G. e Simontacchi C.
Dipartimento di Scienze Sperimentali Veterinarie, Università di Padova, Agripolis, 35020
Legnaro (PD), Italy.
Summary
Faecal hormone analysis has become a powerful non-invasive tool for the study of both
captive and free-ranging animal health, physiology and reproductive status. Variations in field
and storage conditions make it essential to know whether faecal steroid concentrations change
with the method and duration of sample storage. The aim of this study was to investigate the
effects of different preservation techniques on faecal testosterone (T) and cortisol (C) assay in
captive Bengal tigers (Panthera tigris tigris). We measured T and C concentrations in faecal
samples treated with 5 different methods: freezing at –20°C (a); storage in 95% ethanol at
room temperature (b); storage in isopropyl alcohol at room temperature (c); oven drying (d);
drying at room temperature (e). At different stocking times (days 1; 3; 8; 14), faecal T and C
were extracted by diethyl ether and then measured by a microplate RIA. The steroid values
from aliquots stored using the different methods were compared to those obtained from fresh
faeces on day 0 (controls). Faecal preservation methods produced changes from controls in
faecal steroids concentrations. Faecal T values (mean ± SE) resulted significantly higher (P <
0.05) in faeces stocked under the five different methods than the controls. Faecal C values
resulted significantly higher (P < 0.05) than the controls in faeces treated with methods b-c-de only, while method a showed stable C concentrations relative to the controls. On day 1 there
was no difference between the preservation techniques, but we observed a general tendential
increase in faecal steroid content compared with the controls. On the other stocking days,
methods a-b-c-d showed stable faecal T and C concentrations, while method e caused a
relevant increase in steroid concentrations compared with the controls on day 3 (peak) and
then a decline during day 8 and 14.
Keywords: Panthera tigris; faecal steroids; preservation techniques.
Parole Chiave: Panthera tigris; steroidi fecali; conservazione.
INTRODUZIONE
L’analisi degli steroidi fecali rappresenta un valido strumento in grado di fornire importanti
informazioni sulla fisiologia, lo stato riproduttivo e lo stato sanitario di animali sia in cattività
che in natura. Spesso, lo studio di popolazioni allo stato selvatico richiede lo stoccaggio ed il
trasporto dei campioni fecali, dai siti di raccolta al laboratorio, in un modo tale da prevenire la
degradazione o l’alterazione degli ormoni steroidei. La variabilità delle condizioni di campo e
dei metodi conservativi rende essenziale conoscere se e come il metodo e la durata di
stoccaggio influiscono sulle concentrazioni degli steroidi fecali. La liofilizzazione, con
conseguente stoccaggio a temperature di – 20°C o inferiori, viene generalmente riconosciuta
come il metodo più attendibile per una conservazione a lungo termine degli steroidi fecali (1).
Tuttavia, non avendo sempre a disposizione un liofilizzatore, solitamente si opta per dei
metodi di stoccaggio alternativi, tra cui il congelamento a – 20°C, la conservazione in solventi
organici, e/o l’essiccazione delle feci (in stufa, ai raggi solari, con silice o con altri metodi). Il
congelamento riduce al minimo il metabolismo degli steroidi da parte dei batteri ed è il
metodo d’elezione in condizioni di laboratorio controllate (4). In situazioni di campo però, può
mancare l’elettricità e il trasporto di materiale congelato può essere molto difficile poichè
ghiaccio secco e/o azoto liquido sono difficilmente reperibili. Tra i solventi organici il più
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utilizzato è sicuramente l’etanolo anche se alcuni autori citano l’alcool isopropilico come
scelta alternativa. In questo lavoro, abbiamo indagato gli effetti di cinque diversi metodi di
conservazione delle feci sulle concentrazioni di testosterone (T) e cortisolo (C) fecali in
esemplari di tigre del Bengala (Panthera tigris tigris).
Materiali e metodi
Per questo studio sono stati utilizzati campioni di feci fresche (n = 3) raccolti il giorno 0
(inizio esperimento) da 3 esemplari maschi di tigre del Bengala, nati in cattività ed
attualmente tenuti presso una struttura privata in provincia di Padova. Le feci, raccolte
immediatamente dopo la defecazione, sono state messe in appositi contenitori di plastica e
subito trasportate in laboratorio. Qui, ogni campione è stato adeguatamente mescolato, per
rendere la matrice più omogenea possibile, e suddiviso in aliquote da 100 mg (n = 60) che
sono poi state sottoposte ai diversi trattamenti conservativi: congelamento a – 20°C (a);
conservazione in etanolo 95% a temperatura ambiente (b); conservazione in alcool
isopropilico a temperatura ambiente (c); essiccazione in stufa a 50°C per 12 h (d);
essiccazione a temperatura ambiente (e). A diversi tempi di conservazione (giorni 1; 3; 8; 14)
gli steroidi sono stati estratti con etere dietilico e dosati mediante RIA su micropiastra. Come
controlli si sono considerati i valori di T e C ottenuti dall’analisi di ciascun campione fecale
fresco al giorno 0. Brevemente, il protocollo estrattivo usato prevede lo scongelamento
(aliquote a) o l’evaporazione dei solventi organici sotto corrente di N (aliquote b, c) e
l’aggiunta alle feci, messe in provette di vetro, di PBS (500 μl, 0.1% BSA, pH 7.2) e di etere
dietilico (5 ml). Le provette vengono quindi agitate per 15 minuti, centrifugate (5 min, 2500
RPM, 5° C) e poste in freezer (1h, -20°C). Dopo congelamento, si fa evaporare la fase eterea
sotto corrente di N e gli steroidi estratti vengono ripresi in PBS e dosati in triplicato mediante
RIA. I dati ottenuti sono stati sottoposti ad analisi della varianza e test di Tukey (3).
Risultati e discussione
In media, i sistemi di conservazione utilizzati hanno portato ad un aumento dei contenuti
fecali di T rispetto ai controlli (a, 44%; b-d, 55%; c, 75%; e, 440%) (P < 0.05). I valori medi
di C fecale, invece, sono aumentati significativamente (P < 0.05) del 31% (b), 35% (c-d) e
150% (e), mentre risultano statisticamente simili ai controlli con il metodo a. Al giorno 1 non
si sono riscontrate differenze tra i metodi di conservazione, ma si è osservato un tendenziale
aumento generale rispetto ai controlli. Nei giorni seguenti (giorni 3; 8; 14), i valori ormonali
riscontrati nelle aliquote fecali conservate con i metodi a-b-c-d sono risultati per lo più
costanti e a livelli simili a quelli riscontrati il giorno 1; mentre nelle aliquote conservate con il
metodo e T e C sono ulteriormente aumentati fino al giorno 3 per poi diminuire in modo più
(C) o meno (T) consistente nei giorni 8 e 14 (Figura 1). Il congelamento, quindi, risulta essere
il metodo che influisce meno sulle concentrazioni degli steroidi fecali, e mantiene i contenuti
fecali degli ormoni abbastanza stabili nel tempo, come del resto già riportato da altri autori (1).
In questo lavoro appare evidente l’aumento consistente delle concentrazioni di T e C nelle
feci trattate con il metodo e, dato che coincide con quanto riscontrato in un precedente lavoro
(5)
in cui, in feci di babbuino tenute a temperatura ambiente, si sono osservati alti contenuti di
progestogeni, dovuti probabilmente ad una cross-reazione dell’anticorpo con i metaboliti neo
formati da parte dei batteri sviluppatisi nelle feci. I risultati ottenuti mostrano, inoltre, come
anche i solventi organici usati determinino un aumento delle concentrazioni dei due steroidi.
Tale effetto dello stoccaggio in etanolo era già stato individuato da altri autori (1, 2) ed è in
contrasto con i dati riportati da Terio et al. (2002) secondo cui le concentrazioni di steroidi
nelle feci di ghepardo non sono significativamente alterate da tale metodo di preservazione.
Per quanto riguarda invece l’alcool isopropilico, stando alle nostre conoscenze, si tratta dei
primi dati disponibili.
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Figura 1. Effetti del metodo di conservazione e del tempo di stoccaggio sulle concentrazioni
(media ± ES) di testosterone (A) e cortisolo (B) in feci di tigri del Bengala. Entro ciascun
giorno, lettere differenti indicano medie significativamente diverse (P < 0.05).
Conclusioni
Mediamente, tutti i sistemi di conservazione utilizzati hanno influenzato l’analisi degli
steroidi fecali portando ad un tendenziale aumento degli stessi. I risultati ottenuti confermano,
comunque, la minor influenza del congelamento a – 20°C sui livelli di steroidi nelle feci. La
preservazione con solventi organici e l’essiccazione in stufa, invece, hanno comportato in
percentuale un maggiore aumento, dimostrandosi quindi dei metodi di conservazione meno
attendibili rispetto al congelamento. In situazioni di campo, però, l’utilizzo dei solventi resta
comunque il metodo più pratico ed utile, specialmente quando tutti i campioni vengono
trattati con lo stesso protocollo conservativo e se si considera che i risultati generalmente
vengono espressi come trends piuttosto che come livelli assoluti. In ultima analisi, va fatta
una considerazione sul diverso comportamento dimostrato dai due steroidi dosati nelle feci,
probabilmente dovuto ad un diverso metabolismo degli ormoni operato dai batteri.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Sig. Gianni Mattiolo per aver messo a disposizione la
propria struttura e le proprie tigri, e Valentina Bottacin per la raccolta dei campioni e l’aiuto
nella fase di analisi radioimmunologica.
Bibliografia
1) Hunt KE, Wasser SK. 2003. Physiol. Biochem. Zool. 76(6):918-928.
2) Millspaugh JJ, Washburn BE, Milanick MA, Slotow R, van Dyk G. 2003. Wildl. Soc. Bull.
31(2):399-406.
3) SPSS ® 12.0 Command Syntax Reference. Copyright © 2003 by SPSS Inc.
4) Terio KA, Brown JL, Moreland R, Munson L. 2002. Zoo Biol. 21:215-222.
5) Wasser SK, Risler L, Steinder RA. 1988. Biol. Reprod. 39:862-872.