Proteine da stress e chaperon molecolari Sono state recentemente

Proteine da stress e chaperon molecolari
Sono state recentemente descritte alcune
proteine che sono coinvolte in generale nel
ripiegamento di altre proteine. Furono, in origine,
descritte come proteine da shock termico. Per
esempio (vedi figura), nelle cellule di Drosophila,
è normalmente sintetizzata una proteina di P.M.
70000
la
cui
concentrazione
aumenta
notevolmente per esposizione della cellula a
temperature di 35° e 37°C. Cioè assistiamo ad
un calo di sintesi delle altre proteine della cellula
e i dispositivi deputati alla sintesi proteica
lavorano ad elevati regimi per la sintesi della
proteina di P.M. 70000. Tale proteina è stata
contraddistinta con la sigla hsp70 (heat shock
protein).
Addirittura si possono osservare dei rigonfiamenti, indotti dall’aumento di pochi gradi di
temperatura, sui cromosomi delle cellule di Drosophila (1974). In tali rigonfiamenti viene innescata
una aumentata sintesi di RNA messaggero che codifica hsp70.Con queste premesse è stato
dimostrato che le hsp sono proteine prodotte da tutte le cellule in risposta, non solo ad un aumento
della temperatura, ma anche in risposta ad una varietà di stimoli o agenti tossici (metalli pesanti,
alcoli e varie tossine metaboliche). Si è arrivati alla conclusione che le hsp rappresentano un
meccanismo generale di difesa delle cellule. Altrettanto generale è il loro tipo di intervento.
8
Le proteine da stress possono essere indotte da:
•
Fattori ambientali
Shock termico
Metalli pesanti di transizione
Inibitori del metabolismo energetico
Analoghi degli amminoacidi
Agenti chemioterapici
•
Stati patologici
Infezioni virali
Febbre
Infiammazioni
Ischemia
Lesioni da ossidanti
Neoplasie
•
Fattori cellulari normali
Ciclo di divisione cellulare
Fattori di crescita
Sviluppo e differenziamento
A) Le hsp sono altamente conservate
Confrontando la struttura primaria (sequenza amminoacidica) di molte hsp si è giunti alla
conclusione che presentano un’elevata omologia di sequenza. È chiaro che le hsp (o proteine da
stress, più in generale) devono essersi conservate lungo tutto il corso dell’evoluzione e
probabilmente hanno svolto una funzione analoga ed importante in tutti gli organismi.
Struttura primaria di hsp-70
N 

Dominio ATPasico
 Dominio di riconoscimento del substrato  C
∼ 450 AA
Esiste una forte omologia tra le varie chaperonine.
∼ 200 AA
B) Le hsp sono costitutive e/o indotte
Molte proteine da stress si esprimono anche normalmente, e quindi non soltanto in cellule
sottoposte a stress o traumatizzate. È possibile dividerle in due gruppi: quelle costitutive
(espresse in condizione di crescita normale), e quelle indotte (solo in cellule sottoposte a stress).
Come mai tanti stimoli tossici di natura così diversa generano la sintesi più o meno della stessa
proteina (o di una famiglia di proteine simili)? Gli agenti stressanti sono, in genere, denaturanti nei
confronti delle proteine cellulari, e le proteine da stress difendono dalla denaturazione l’apparente
generalità delle proteine. Ecco quindi identificato un comune denominatore.
Infatti Richard Voellmy e Alfred Goldberg dimostrano che l’iniezione di proteine denaturate in
cellule viventi basta per indurre una risposta allo stress.
La sintesi proteica è ovviamente della massima importanza per la vitalità cellulare. Fu dimostrato
che la hsp70 si accumula nel nucleolo e controlla il corretto assemblaggio delle numerose proteine
ribosomiali.
9
Ripiegamento delle proteine e proteine da stress
Le proteine si ripiegano, in genere, spontaneamente, ma una certa percentuale può seguire
spontaneamente una via che porta a proteine non funzionali. In presenza, invece, di proteine da
stress (che sono poi riciclate), il ripiegamento è sempre corretto. Espletando tale funzione, tali
proteine sono anche denominate chaperon molecolari o chaperonine (chaperon =
accompagnatore, assistente).
È stato dimostrato che tale processo ha un costo in termini di energia. Infatti le chaperonine
possiedono una specifica proprietà enzimatica: sono ATP-asi, cioè scindono ATP, che è
consumato, in ultima analisi, per assistere il corretto ripiegamento di proteine.
10
hsp10 e hsp60
E’ stato dimostrato che l’assenza di due
proteine di P.M. 10000 e 60000, nei batteri,
rende questi incapaci di provvedere alla crescita
di piccoli virus, dipendenti dalla “macchina
cellulare” dei batteri stessi. Tali proteine
vengono denominate gro-EL e gro-ES.
L’assemblaggio del batteriofago λ (una specie di
“siringa” che contiene DNA fagico) avviene
separatamente per la testa e la coda. È il primo
stadio di assemblaggio della pro-testa che viene
assistito dalle gro-EL e gro-ES. La gro-EL è una
delle proteine più abbondanti dell’E.coli. (vedi
pag.8)
Proteine con omologia di sequenza con le groEL e le gro-ES sono state identificate nei
mitocondri di cellule superiori (anche nei
cloroplasti). Sono state denominate hsp-10 e
hsp-60. Nei cloroplasti esiste una proteina
omologa della gro-EL che “assiste” il
ripiegamento
dell’importante
enzima
oligomerico che fissa la CO2 nelle piante
superiori (ribulosio bis-fosfato carbossilasi).
Nei mitocondri la hsp-60 forma due anelli
sovrapposti, ciascuno costituito da 7 membri.
Nei mitocondri esiste anche la hsp70 e le tre
proteine, hsp10-60-70, cooperano per il corretto
ripiegamento (che consuma ATP) delle proteine
importate.
Esiste inoltre la proteina Bip (Binding
Immunoglobulin Protein), che assiste il corretto
ripiegamento delle immunoglobuline destinate
alla secrezione. Più in generale “assistono” il
ripiegamento delle glicoproteine prodotte nel
reticolo endoplasmatico.
11
Nucleoplasmina
L’assemblaggio del nucleosoma nelle cellule eucariote è un processo estremamente complesso. È
stato dimostrato che una proteina denominata nucleoplasmina (una proteina acida che è stata
isolata dal nucleo dell’oocita di Xenopus laevis), insieme alla topoisomerasi I, controlla
l’assemblaggio dei nucleosomi. Tale proteina si lega infatti agli istoni, ma non al DNA, né ai
nucleosomi. La nucleoplasmina partecipa quindi a tale processo agendo da chaperon molecolare.
hsp-90 e virus oncogeni
Il virus del Sarcoma di Rous è responsabile della comparsa di proprietà tumorali (vedi più avanti:
proto-oncogeni). Tale virus codifica un enzima denominato pp6012C, che è una tirosin cinasi. Tale
enzima si associa nel citoplasma con due proteine, la p50 e una hsp-90. Quando è legato ad esse
si trova inattivo come enzima. Il pp60src individua i suoi substrati nella membrana cellulare
(vinculina e talina) ed è attivo quando si staccano le altre due proteine.
È stato inoltre dimostrato che l’hsp-90 è normalmente legata ai recettori per gli ormoni seroidei.
“Altre” Chaperonine:
[da TIBS 19 543 (1994)]
CCT o TCP-1
È una chaperonina abbondante nel citosol di eucarioti. È coinvolta nel ripiegamento della tubulina
(CCT = Cytosol Chaperonin of Tubulin) e di altre proteine. Presenta un’omologia del 45% con
l’omologa chaperonina trovata negli Archebatteri, per cui la CCT ha una funzione conservata
nell’arco dell’evoluzione. Ha un peso molecolare di circa 60000 Da, ma è alquanto diversa dalla
gro-EL, anch’essa di P.M. 60000.
CCT sembra essere la più importante chaperonina esclusiva del citosol. Ne sono note ben 7
differenti tipi (α, β, γ, δ, ε, ζ, η).
12
da “Le Scienze” luglio 1993
Sec-B
[da TIBS 20, (2) 65 (1995)]
È stata scoperta la chaperonina che assiste la secrezione di proteine da parte dei batteri: si tratta
della Sec-B, di MW = 17300. È esclusiva dei procarioti. È dedicata al ripiegamento di proteine
destinate ad essere secrete all’esterno. Interagisce con Sec-A, di membrana, che è una ATPasi,
per esportare effettivamente le proteine. Sec-B non presenta attività ATPasica.
13
Induzione delle proteine BIP
Alcune chaperonine (o proteine da stress) sono costitutive, cioè sono sempre presenti nella cellula.
Altre sono inducibili in risposta a stress. È stato studiato in dettaglio (vedi articoli di D. J. Sweet,
Current Biology 3-622-1993) il processo di induzione delle BIP (Immunoglobulin Binding Protein)
che, come abbiamo visto (pag.11) accompagnano il ripiegamento delle proteine prodotte nel lume
del reticolo endoplasmatico. Le immunoglobuline secrete dalle plasmacellule sono controllate da
tali BIP, ma la loro azione è estensibile alla generalità delle proteine secrete dalle cellule e
generalmente prodotte all’interno del reticolo endoplasmatico (ER). Più oltre (vedi pag.28) ci
occuperemo dell’importantissimo processo di glicosilazione delle proteine che avviene nell’ER. La
sintesi di BIP è incrementata in tutte quelle situazioni che portano all’accumulo di proteine nell’ER.
Questo può avvenire quando il livello di glicosilazione (che pure esso contribuisce ad un corretto
ripiegamento) diminuisce: esiste infatti una sostanza, la tunicamicina, che è uno specifico inibitore
della glicosilazione. Se si trattano cellule in coltura con tunicamicina, si osserva un’incrementata
sintesi di BIP.
Il gene che codifica le BIP, nel lievito, è denominato KARK2. E’ stato descritto nei dettagli il
promotore di tale gene:
Struttura del promotore del
gene KARK2
HSE = heat shock element. A tale sequenza nucleotidica si lega una proteina fosforilabile,
denominata Heat Shock transcription Factor (HSF). Vedremo il processo che porta alla
fosforilazione di tale HSF che, nella forma fosforilata, si lega a tale zona (HSE) del promotore
inducendo, in ultima analisi, la trascrizione del gene BIP con produzione del relativo RNA
messaggero. Tutto questo si tradurrà in sintesi proteica della BIP nel lume del reticolo
endoplasmatico.
UPR = unfolded-protein response element, la cui presenza è importante nel promotore per
assicurare la risposta alla presenza di proteine in stato unfolded.
Esistono poi i consueti TATA box.
Ricordiamoci quindi che esiste un HSF che si lega, quando è fosforilato, al promotore BIP, e quindi
tale HSF fa da cinghia di trasmissione tra ER e gene da trascrivere.
Chi fosforila l’HSF? Sono stati descritti in dettaglio dei recettori proteici che risiedono nella
membrana del reticolo endoplasmatico. Sono proteine transmembrana, con proprietà del tutto
simili ad altri recettori della membrana plasmatici: possiedono una parte N terminale che protrude
nel lume dell’ER; un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico con attività proteina
cinesica. Si tratta dell’Ire 1 p (Inositol Reticolum Endoplasmic, perché identificato in precedenza
come recettore per la crescita in assenza di Inositolo).
Il recettore del reticolo endoplasmatico è una proteina di peso molecolare putativo 136000.
Struttura del recettore del
reticolo endoplasmatico
Ire 1 p
All’N-terminale contiene una sequenza segnale, tipica delle proteine dell’ER. Nella parte luminale
contiene 4 siti di glicosilazione (sono precisamente identificabili: trattasi delle sequenze Asn-X-Ser,
dove l’asparagina è glicosilata all’N, vedi pag.28). Contiene il solito dominio transmembrana,
facilmente identificabile perché costituito da amminoacidi idrofobici. Nella parte C-terminale esiste
il dominio di tipo cinasico. Più avanti classificheremo ben 8 subdomini nelle proteine cinasi, in base
alla sequenza amminoacidica. Il dominio dell’Ire 1 p è simile alla cdc-2, che determina l’ingresso in
mitosi di una cellula (vedi pag.127), e sembra essere più una Ser/Thr cinasi che una Tyr cinasi.
14
La struttura del recettore Ire 1
p è omologa ai noti recettori
per EGF e per PDGF che
sono recettori della membrana
plasmatica.Con la descrizione
di questi elementi (HSE su
promotore del gene – fattore
di trascrizione fosforilabile
HSF – recettore Ire 1 p) è
stato formulato un modello per
la trasmissione del segnale
per indurre la sintesi di BIP nel
reticolo endoplasmatico:
Il recettore ha il dominio luminale (che guarda cioè il lume del reticolo endoplasmatico) che
normalmente lega le BIP e, in tale situazione, non può dimerizzare. Se le BIP sono impegnate nel
folding di proteine, tali BIP abbandoneranno i recettori Ire 1 p, che dimerizzano. In tale stato di
aggregazione viene attivata l’attività proteina cinasica della parte citosolica e il fattore proteico HSF
è fosforilato. L’HSF fosforilato si lega alla sequenza nucleotidica HSE sul promotore per il gene
che codifica BIP. Questo rappresenta un esempio interessante di trasmissione di segnale
intracellulare (dall’ER al nucleo).
Ruolo della calnexina nel reticolo endoplasmatico
Il corretto ripiegamento (folding) delle glicoproteine del reticolo endoplasmatico non dipende
soltanto dalle BIP. È stata descritta un’importante proteina – la calnexina – che attraversa la
membrana del reticolo endoplasmatico e che lega calcio, pur non appartenendo alla superfamiglia
delle calmoduline.
La calnexina si lega al polipeptide nascente:
per esempio è stato dimostrato che, durante
l’assemblaggio
dell’importante
complesso
maggiore di istocompatibilità di classe I (MHC
I), la catena pesante dell’MHC resta legata alla
calnexina.La calnexina, in particolare, sembra
riconoscere la parte glucidica delle proteine.
Vedremo (vedi pag.28) che sulle proteine neosintetizzate è trasferito un oligosaccaride legato
ad asparagina formato 14 residui glucidici (in
maggioranza mannosio = 9 residui) che
subisce
rielaborazione,
restando legato
all’asparagina un “nocciolo” di 5 residui. Tale
“nocciolo” glucidico è riconosciuto dalla
calnexina. La tunicamicina, che inibisce la
sintesi dell’oligosaccaride, impedisce il legame
delle proteine alla calnexina.
La calnexina da sola non è sufficiente per un
corretto ripiegamento. Sono necessarie anche
le BIP e l’attività enzimatica proteina – disolfuro
– isomerasi (PDI, vedi pag.5). La seguente
illustrazione è tratta da una recente
pubblicazione (C. Hammond & A. Helenius,
Current Biology, 3, 884, 1993):
15
Sequenza riconosciuta dalle BIP
L. M. Gierasch (Current Biology, 4, 173,1994) ha descritto il processo di riconoscimento da parte
delle BIP.
Le sequenze proteiche riconosciute, e quindi legate, dalle BIP sono rilasciate in seguito ad
esposizione con ATP. In pratica, se si fa percolare su di una colonna cromatografia legante BIP
una miscela di peptici, si avrà il legame con molti peptici effettivamente legati alle BIP. Dall’analisi
dei peptici rilasciati per trattamento con ATP, si è giunti alla conclusione che la BIP riconosce la
seguente sequenza di 7 amminoacidi:
Hy – Trp/X – Hy – X – Hy – X – Hy
dove:
Hy indica un amminoacido idrofobico, frequentemente Trp, Leu o Phe
X indica un qualsiasi amminoacido
In pratica ogni due amminoacidi, uno è idrofobico. È possibile constatare che gli amminoacidi
idrofobici sono il bersaglio dell’azione della BIP. Questo è, in linea teorica, corretto perché la
denaturazione delle proteine è accompagnata dall’esposizione all’esterno della macromolecola
degli amminoacidi idrofobici, che normalmente sono relegati nel nucleo idrofobico interno alla
macromolecola proteica. Quindi la chaperonina “vede”, o meglio, si lega a tali amminoacidi e opera
verso la rinaturazione.
Inserto: NiceProt
Q9LKR3 (Bip 1)
Inserto: NiceProt
Q00613 (HSF 1)
View
of
SWISS-PROT:
View
of
SWISS-PROT:
La “gabbia” di Anfinsen
R. J. Ellis (Current Biology, 4, 633, 1994) ha
ipotizzato un modello per un corretto
ripiegamento di proteine ad opera delle
chaperonine 60 (Gro EL in E. coli) e 10 (Gro ES
in E. coli) che prevede la formazione di un doppio
anello (7 + 7 subunità) di chaperonina 60 che
legherà 14 molecole di ATP. È stato dimostrato
che, in seguito all’idrolisi dell’ATP, la chaperonina
subisce un netto cambio conformazionale. La
chaperonina 10 forma invece un solo anello di 7
subunità.
16
17
Modifiche post-sintetiche delle proteine
La proteina viene prodotta sui ribosomi. Dopo può subire modifiche post-sintetiche, quali:
fosforilazioni e defosforilazioni (es. Ser 14 della glicogeno fosforilasi)
metilazioni e demetilazioni
acetilazioni e deacetilazioni
glicosilazioni
miristoilazioni
ancore a membrana per proteine extracellulari
varie (es. biotinilazioni)
proteolisi
18