Valutazione dell`emorragia feto/materna (FMH) ed immunoprofilassi

Valutazione dell'emorragia feto/materna (FMH)
ed immunoprofilassi anti-D: la nostra esperienza
Daniela Inverardi(1), Lucia Rossi(1), Isabella Romano(1), Paolo Pesando(2),
Alessandro Levis(1)
(1)
Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale (Responsabile: Dott. Alessandro Levis )
Divisione di Ostetricia - Ginecologia (Responsabile: Dott. Paolo Pesando )
Azienda Ospedaliera "SS. Antonio e Biagio - Cesare Arrigo" Alessandria
(2)
Adeguate administration of Rh immune globulin
requires an accurate determination of foetomaternal
haemorrhage. We use a new agglutination method (ID
FMH), recently suitable for routine screening.
It provides a rapid and specific detection of
clinically relevant FMH. In three women we detected a
higher FMH and consequentely we administered a
double dose of RhIg.
Parole chiave: emorragia feto-materna, profilassi anti-D,
ID FMH.
Key words: foeto-mater nal haemorrhage,anti-D
prophylaxis.
Introduzione
L'alloimmunizzazione da anti-D rimane la più frequente
causa di mortalità/morbidità dovuta a malattia emolitica del
neonato, nonostante la sua frequenza si sia drasticamente
ridotta dopo l'introduzione della profilassi con
immunoglobuline (Ig) anti-D nelle donne D negative.
In Gran Bretagna si è infatti passati da 18 morti su
100.000 nati del 1977 a 1 su 100.000 nati nel 923. Tuttavia,
l'incidenza di nuove immunizzazioni da anti-D rimane ancora
di 1/1.000 nati vivi. La persistenza di tale immunizzazione
può essere dovuta ad una non corretta profilassi (dose
insufficiente, ritardo nella somministrazione) o addirittura
ad una sua mancanza (errore nella tipizzazione madre/
neonato oppure ad una vera e propria dimenticanza nella
somministrazione)1-5.
Ricevuto: 30 settembre 1999 – Accettato: 18 novembre 1999
Corrispondenza: Dott.ssa Inverardi Daniela
Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale
Azienda Ospedaliera “SS. Antonio e Biagio - C. Arrigo”
Via Venezia 18
15100 ALESSANDRIA
Per quanto riguarda il dosaggio di Ig da somministrare è
utile ricordare che:
- prima della 20a settimana di gestazione è sufficiente
una dose di 250 UI, mentre dopo la 20a settimana
si raccomanda una dose di 500 UI;
- dopo il parto una dose di 500 UI è sufficiente per
un'emorragia feto/materna non superiore a 4 mL; in alcune condizioni (taglio cesareo, gravidanza
plurigemellare, rimozione manuale di placenta)
l'entità dell'emorragia può superare ampiamente i
4 mL.
Dopo ogni manovra invasiva durante la gravidanza deve
essere effettuata la profilassi (250-500 UI): inoltre, del tutto
recentemente, è stata introdotta di routine o consigliata la
profilassi nell'ultimo trimestre di gravidanza (28a settimana)6-8.
Per quanto riguarda il tempo, si consiglia di effettuare
la somministrazione di Ig entro le 72 ore dall'evento
immunizzante anche se può risultare efficace quando
eseguita entro la settimana. L'incidenza di immunizzazione
può essere direttamente proporzionale alla quantità di
emazie D+ che entrano nel circolo materno. Anche se nella
maggioranza dei casi l'immunizzazione si verifica al momento
del parto, in alcuni rari casi può avvenire nella seconda
metà della gravidanza: particolare attenzione deve essere
posta ad emorragie vaginali o dolori addominali6. Pertanto,
una stretta aderenza alle raccomandazioni del National
Blood Transfusion Service (NBTS) inglese ed un dosaggio
corretto e correlato all'entità dell'emorragia feto/materna
possono essere in grado di ridurre e/o azzerare l'incidenza di
immunizzazione da anti-D5. I protocolli sull'immunoprofilassi
differiscono nei vari paesi (tabella I): si va da dosi standard
di 500 UI nel post-partum con o senza valutazione del FMH
(GB, Irlanda) a dosi di 1000-1500 UI senza richiesta di test
accessori (Italia, Olanda, Germania), a paesi (Belgio) dove
la dose della Ig viene stabilita paziente per paziente dopo
aver valutato l'entità del FMH1-8.
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 45 - num. 2 marzo-aprile 2000 (115-118)
115
D. Inverardi et al.
Tabella I: immunoprofilassi anti-D in alcuni paesi europei (per i riferimenti bibliografici vedi testo)
Stato
profilassi pre-natale*
Austria
Olanda
Belgio
Francia
Germania
Gran Bretagna/
Irlanda
Italia
Spagna
valutazione FMH
dosaggio post-partum UI
no
no
1.000-1.250
no
alcuni centri
si
alcuni centri
si
alcuni centri
alcuni centri
si
correlato a FMH
500
1.250 - 1.500
500
alcuni centri
si
alcuni centri
no
1.000
1.250
* IgG -D somministrate nel terzo trimestre (28a settimana)
Valutazione FMH
Il test di Kleihauer-Betke9 è il più noto e da tempo
utilizzato. Si basa sulla resistenza dell'emoglobina fetale
(HbF) all'eluizione acida: dopo il trattamento con un
tampone acido, la percentuale di emazie fetali presenti nello
striscio periferico materno viene utilizzata per calcolare
approssimativamente l'entità del FMH.
Il test risulta economico e semplice ma di difficile
standardizzazione (necessità di personale esperto); un altro
limite è rappresentato da risultati falsamente positivi nelle
donne con persistenza di elevati valori di HbF o con
produzione anomala di HbF durante la gravidanza. Una
nuova tecnologia, la citometria a flusso, è stata impiegata
per valutare il numero di cellule fetali D+ presenti nel
campione materno D-: il test risulta molto preciso e permette
una esatta valutazione quantitativa, risulta però
dispendioso e alla portata di pochi laboratori
trasfusionali10,11.
Di recente è stato commercializzato un nuovo test (ID
FMH: ditta Diamed, Velate/Usmate, MI) in agglutinazione
su colonna che permette una valutazione semiquantitativa
delle emazie fetali D+ presenti nel campione materno D
negativo 12-13. Viene utilizzato uno specifico anticorpo
monoclonale anti-D in grado di legarsi alle emazie D+: il
principio del test è basato sul consumo dell'anticorpo,
misurato indirettamente tramite cellule indicatrici D
positive, fornite dalla ditta.
I risultati sono confrontati con una serie di campioni
con differente concentrazione di eritrociti D+ (negativo;
0,1%; 0,2%; 0,4% fornite dalla ditta) utilizzate in parallelo.
Considerando una massa eritrocitaria materna di 1.800 mL
la percentuale di cellule fetali presenti nel campione materno
può essere calcolata tramite l'uso della seguente formula:
X% x 1.800 = Y mL emazie fetali
100
dove X% rappresenta il risultato ottenuto con il
campione materno (X=0; X=0,1; X=0,2; X=> 0,4).
116
Lo scopo dello studio e stato quello di valutare l'entità
del FMH nel post-partum per adeguare il dosaggio di Ig
anti-D (dose standard 1000 UI) e controllare l'efficacia della
profilassi (dopo 3 mesi).
Materiali e metodi
Periodo di osservazione: aprile 98 - giugno 99.
Pazienti: 39 donne D negative che hanno partorito
neonati D positivi (35 parti eutocici, 4 parti cesarei, 1 donna
con parto gemellare ).
Protocollo:
durante la gravidanza: determinazione gruppo
sanguigno materno, ricerca anticorpi irregolari (RAI) nel
primo e nell'ultimo trimestre (se RAI negativa);
dopo il parto: determinazione gruppo + test di Coombs
diretto (TDC) sul neonato; se neonato D + valutazione FMH
(ID FMH) su campione materno pre-profilassi, se FMH <
7,2 mL somministrazione 1000 UI Ig -D im; se FMH ≥ 7,2 mL
somministrazione di una seconda dose;
dopo 48 ore dall'avvenuta profilassi: RAI su campione
materno (risultato, ovviamente, positivo per presenza IgG
anti-D introdotti e relativa titolazione per diluizione scalare
dell'anticorpo);
dopo 3 mesi dal parto: RAI.
Metodi
Test immunoematologici di routine (emogruppo, TCD,
RAI: agglutinazione su colonna con "schedine" Diamed).
Valutazione FMH: ID FMH (su campione materno in
EDTA, pervenuto pre-profilassi; emazie D positive fornite
dalla ditta alle concentrazioni 0%; 0,1%; 0,2%; 0,4% da
utilizzare in parallelo; emazie rivelatrici D+ fornite dalla ditta;
anticorpo monoclonale anti-D fornito dalla ditta;
"schedine" in Coombs specifiche fornite dalla ditta;
soluzione LISS; soluzione di lavaggio emazie materne fornita
Emorragia feto-materna e immunoprofilassi anti-D
dalla ditta. Altro materiale necessario: puntali, pipette,
centrifuga con adattatore per "schedine", termostato.
Tempo globale del test (esecuzione-lettura-referto): 2 ore.
Esecuzione del test: 250 µL di emazie sedimentate (dopo
lavaggio con idonea soluzione) della paziente e dei 4
campioni di emazie standard sono trasferiti nelle rispettive
provette Eppendorf; quindi vengono aggiunti, in ciascuna
provetta, 100 µL di diluente (ID 2) e 50 µL di siero anti-D
ricostituito secondo le raccomandazioni della ditta.
Ciascuna provetta viene posta su un agitatore orizzontale
per 60'; successiva centrifugazione dei campioni a 3.500
rpm per 5'; in cinque pozzetti, opportunamente
contrassegnati, della schedina "ID-card FMH screening
test" vengono trasferiti 50 µL delle emazie testo rivelatrici
DiaCell II e, poi, vengono aggiunti 50 µL del sovranatante
di ciascuna provetta Eppendorf; si procede con
un'incubazione a 37 °C in termostato per 15'; si centrifugano,
quindi, le schedine in idonea centrifuga e, infine, si leggono
i risultati.
Interpretazione dei risultati: se tutte le emazie materne
sono presenti sul fondo del pozzetto si è verificato un alto
consumo di anti-D (approssimativamente 0,4% di emazie
D+); se una buona percentuale di emazie materne è
precipitata sul fondo del pozzetto con presenza di alcuni
agglutinati nella parte inferiore della microcolonna si è
verificato un discreto consumo di anti-D
(approssimativamente 0,2% di emazie D+); se le emazie
materne sono distribuite lungo la microcolonna con nessuna
emazia sul fondo, si è verificato un basso consumo di antiD ( approssimativamente 0.1% di emazie D+); se le emazie
materne sono tutte sulla sommità della microcolonna si è
verificato uno scarso o nullo consumo di anti-D (<0,1% o
0%). Controllo di qualità: le emazie negative fornite dalla
ditta devono presentarsi distribuite in modo omogeneo sulla
sommità della microcolonna; le emazie 0,1-0.2% devono
presentare una parte di emazie che scende lungo la
microcolonna; le emazie 0,4% devono essere
prevalentemente sul fondo del pozzetto.
Profilassi anti-D: Immunoglobuline Rhesus anti-D Berna
(1.000 UI) (Istituto Sieroterapico, Berna, Como).
Risultati
Nel periodo considerato, abbiamo valutato 39 donne D
negative con neonato D positivo. L'entità dell'emorragia
fetale variava da 1,8 a 7,2 mL; in un solo caso risultava
lievemente superiore a 7,2 mL (vedi tabella II ).
Una dose supplementare di IgG anti-D è stata pertanto
eseguita in soli tre casi. Il titolo dell'anticorpo passivamente
trasmesso con la profilassi variava da 1/2 a 1/32 (vedi tabella
Tabella II: entità FMH e profilassi anti-D
mL emazie fetali
N. donne
FMH <= 1.8
1,8<FMH <=2,7
FMH = 3,6
FMH = >7,2
Unità IgG anti-D
32
2
2
3
1.000
1.000
1.000
2.000
Tabella III: entità FMH e titolo anti-D post-profilassi
Titolo
FMH<=1,8 mL
1,8<FMH<3,6
FMH>=7,2
1/2
4
2
1
1/4
4
//
//
1/8
1/16
1/32
13
7
3
2
1
//
//
1
1
III). L'esito della RAI, eseguita circa 3 mesi dopo la profilassi,
ha dato esito negativo: nessun caso, quindi, di
immunizzazione da anti-D.
Discussione
Per ridurre il rischio di alloimmunizzazione anti-D in
donne D negative che abbiano partorito neonati D positivi
è necessario determinare l'entità della FMH (quantificare le
emazie fetali D positive eventualmente passate nel circolo
materno) e, di conseguenza, eseguire una corretta
somministrazione di immunoglobuline anti-D1-4. I dati di
letteratura affermano infatti che 500 UI di IgG anti-D sono
in grado di neutralizzare 4-5 mL di emazie fetali5-6.
Recentemente è stato introdotto un nuovo test in
agglutinazione su colonna (ID FMH) per una rapida
indicazione dell'entità dell'emorragia nel post-partum: gli
studi comparativi con il test di eluizione acida sono risultati
accettabili12, 13.
L'ID-FMH risulta essere un test sensibile, specifico e di
facile interpretazione, permettendo, inoltre, una valutazione
semiquantitativa dell'emorragia.
Delle due puerpere che presentavano valori uguali a
7,2 mL, una aveva partorito con taglio cesareo, l'altra, con
valore addirittura superiore a 7,2 mL, aveva avuto un parto
eutocico; delle puerpere con valore di FMH di 3,6 una aveva
partorito due gemelli. Va, comunque, segnalato che le
diverse modalità del parto (eutocico, distocico o con taglio
cesareo) non hanno influenzato i risultati finali.
La nostra esperienza ci consente di affermare che
l'esecuzione del test risulta semplice, facilmente
standardizzabile e relativamente breve (circa 2 ore totali). Il
tempo speso dal personale tecnico risulta globalmente più
limitato: circa 25 minuti per lavaggio/centrifugazione dei
117
D. Inverardi et al.
campioni e 5 minuti per seminare i relativi campioni
nell'apposita "schedina".
La lettura dei campioni risulta molto semplice, avendo
sulla stessa card i rispettivi valori di riferimento ( campione
negativo; 0,1%; 0,2%; 0,4%).
L'applicazione della formula consente di quantificare
approssimativamente l'entità dell'emorragia. ID-FMH è un
test che permette pertanto una valutazione dell'emorragia
feto/materna e, anche secondo la nostra esperienza, può
essere utilizzato per una corretta profilassi anti-D nelle
puerpere.
Il controllo (RAI) effettuato a distanza dal parto non ha
evidenziato la presenza di anticorpi anti-D.
In accordo alla letteratura, possiamo, quindi, affermare
che per azzerare il rischio di nuove MEN da anti-D è
necessario:
- eseguire una corretta profilassi durante la gravidanza
(somministrazione di IgG anti-D post amnio/
funicolocentesi, post-aborto, in presenza di dolori
addominali sospetti o emorragie vaginali);
- adeguare, nel post-partum, la dose di IgG all'entità dell'emorragia feto/materna.
Bibliografia
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containing haemoglobin F in fixed smears. Internist, 1, 292, 1960.
Riassunto
Per effettuare una corretta profilassi anti-D nelle
puerpere D negative è necessario valutare l'entità
dell'emorragia feto-materna.
Il nuovo test in agglutinazione su colonna (ID FMH)
si è rivelato di semplice esecuzione, sensibile e specifico,
in grado di valutare emorragie fetali di rilevanza clinica.
Il suo utilizzo ci ha consentito di evidenziare casi tre
donne " a rischio" e di somministrare un idoneo dosaggio
di IgG anti-D.
118
10) Duguid JKM, Bromilow I, Eggington J et al.: Kleihauer testing
and flow cytometry.A comparative study for assessment of fetomaternal haemorrhage. Haematology, 1,79, 1996.
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method. Am J Clin Pathol, 91, 288, 1989.
12) Salama A, David M, Wittmann G et al.: Use of the gel
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13) Conte R, Tassi C, Malferrari F et al.: Valutazione comparativa
fra ID-FMH Diamed e il test di eluizione acida di KleihauerBetke. Studio multicentrico. La Trasf del Sangue, 44,141, 1999.