Propuesta de Método para la Determinación de Lisozima en

RISOLUZIONE OIV-OENO 527-2015
DETERMINAZIONE DELLA DISTRIBUZIONE DI DEUTERIO NELL’ACIDO ACETICO DA ACETO DI VINO
MEDIANTE L’UTILIZZO DELLA RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE (NMR)
L’ASSEMBLEA GENERALE,
Visto l'articolo 2, paragrafo 2 iv, dell'Accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l'Organizzazione
Internazionale della Vigna e del Vino,
Su proposta dalla Sottocommissione "Metodi d’analisi",
DECIDE di completare i Metodi internazionali di analisi degli aceti di vino con il metodo seguente:
Determinazione della distribuzione di deuterio nell’acido acetico da aceto di vino mediante
l’utilizzo della risonanza magnetica nucleare (NMR)
Tipo di Metodo: IV
1. Obiettivo/Campo di applicazione
Il metodo consente l’analisi del rapporto isotopico dell’idrogeno (D/H)CH3 nel sito metilico
dell’acido acetico estratto dall’aceto di vino secondo la procedura riportata nel metodo OIV-OENO
510-2013. L’analisi è effettuata mediante 1H-NMR e 2H-SNIF –NMR utilizzando un esperimento
NMR composito (Fauhl et al., 1996; Hermann, 2001). L’esperimento 1H-NMR permette di
determinare il rapporto TMU/acido acetico che viene utilizzato, assieme ai risultati
dell’esperimento 2H-SNIF –NMR, per calcolare il rapporto isotopico (D/H)CH3. Se l’acido acetico
estratto risulta puro (> 99%) o nel caso in cui sia noto l’esatto contenuto di acido acetico
nell’estratto, l’esperimento 1H-NMR non è necessario.
2.
Definizioni
(D/H)CH3 : rapporto isotopico associato alla molecola CH2D COOH
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3.
Principio
Il deuterio contenuto negli zuccheri e nell'acqua nel mosto d'uva è ridistribuito dopo la
fermentazione alcoolica nelle molecole I, II, III e IV dell’etanolo del vino e dopo la fermentazione
acetica nelle molecole V e VI dell’acido acetico:
CH2D CH2 OH
I
CH3 CHD OH
II
CH2D COOH
V
CH3 COOD
VI
CH3 CH2 OD
III
HOD
IV
Il parametro (D/H)CH3 memorizza il rapporto D/H degli zuccheri del mosto.
4.
Reagenti e prodotti
-
Esafluorobenzene (C6F6) utilizzato come sostanza di stabilizzazione campo-frequenza (lock), o,
in alternativa Acido trifluoroacetico (TFA, CAS: 76-05-1) o, anidride trifluoroacetica (TFAA, CAS:
407-25-0)
-
N,N-tetrametil urea (TMU) standard; TMU standard con un rapporto isotopico D/H calibrato.
-
provette NMR 10 mm
-
filtro 0,45 μm
5.
Strumenti
-
Spettrometro NMR corredato di sonda specifica “deuterio” regolato alla frequenza
caratteristica ν0 del campo Bo (ad esempio, per Bo = 7,05 T, ν0 = 46,05 MHz e per Bo = 9,4 T,
ν0 = 61,4 MHz) con canale di disaccoppiamento del protone (B2) e canale di stabilizzazione del
campo frequenza (lock) alla frequenza fluoro. Il secondo canale B2 è usato anche per
l’esperimento 1H-NMR. La risoluzione misurata nello spettro, trasformato senza
moltiplicazione esponenziale (cioè LB = 0) ed espressa come larghezza a metà altezza del
segnale metilico dell’acido acetico e del segnale metilico della TMU, deve essere inferiore a
0.5Hz. La sensibilità (rapporto segnale/rumore), misurata con un fattore di moltiplicazione
esponenziale LB pari a 2, deve essere maggiore o uguale a 150 per il segnale metilico dell’acido
acetico contenente meno del 25% di acqua. Per esempio, usando uno spettrometro NMR di
campo Bo = 7.05T, sono necessarie 200 scansioni per raggiungere questo valore
-
bilancia con sensibilità di 0,1 mg o superiore,
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-
bilancia con sensibilità di 0,1 g o superiore
Le attrezzature di laboratorio e i consumabili indicati ai punti 5 e 6 sono esempi e possono essere
sostituiti con altri materiali aventi prestazioni equivalenti.
6.
Preparazione dei campioni
Al fine di poter essere analizzato mediante SNIF-NMR, l'acido acetico deve essere estratto
dall'aceto e purificato. Al termine dell'estrazione, si devono recuperare almeno 6 mL di acido
acetico puro.
La procedura di estrazione e purificazione è descritta nel metodo OIV 510-2013.
7.
Procedura
Nota preliminare: la quantità e il tipo di reagenti e le condizioni strumentali dipendono dal
tipo di strumento utilizzato. La procedura qui descritta costituisce solamente un esempio.
Tutte le fasi preparatorie devono essere effettuate senza alcuna perdita significativa di acido
acetico per evaporazione, che modificherebbe la composizione isotopica del campione.
7.1. Preparazione del campione di acido acetico per la misurazione NMR
- Provetta NMR 10 mm di diametro: raccogliere, in una boccetta di vetro preventivamente pesata,
3,25g della soluzione contenente acido acetico ottenuta al punto 6 e pesare con
un’approssimazione vicina allo 0,1 mg (mA); aggiungere poi 1.1 g dello standard interno TMU e
pesare nuovamente la boccetta con un’approssimazione vicina allo 0,1 mg (mST).
A seconda del tipo di spettrometro e di provetta utilizzati, aggiungere una quantità sufficiente di
esafluorobenzene come sostanza di stabilizzazione del campo frequenza (lock):
Spettrometro
7,05 T
9,4 T
10 mm provetta
150 µl
35 µl
Queste cifre sono indicative e il reale volume da utilizzare dovrà essere regolato in base alla
sensibilità dello strumento NMR. Durante le operazioni per la preparazione della provetta e fino
alla misurazione NMR, l’addetto deve porre attenzione nell’evitare l’evaporazione di acido acetico
e TMU, con conseguente frazionamento isotopico.
Il campione viene poi versato nel tubo NMR e se necessario viene filtrato con siringa dotata di
filtro 0.45 µm.
NB: Si raccomanda di effettuare la procedura di preparazione del tubo NMR sotto cappa,
indossando guanti ed occhiali protettivi.
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7.2 Acquisizione dello spettro NMR
Si suggeriscono le seguenti condizioni per l’ottenimento dello spettro 2H-SNIF-NMR:
- la temperatura della sonda deve essere costante (ad es. 303 K)
- rotazione del campione (ad es. 15-20 Hz)
- tempo di acquisizione di almeno 5,5 s per 1200 Hz di ampiezza spettrale (memoria 16 K)
(vale a dire, circa 20 ppm a 61,4 MHz o 27 ppm a 46,1 MHz);
- impulso 90°;
- aggiustamento del tempo di acquisizione: il suo valore deve dello stesso ordine del tempo
di esposizione
- rivelazione in quadratura: fissare l'offset 01 tra i segnali di riferimento OD e CH2D per
l’acido acetico.
- determinare il valore dell'offset di disaccoppiamento 02 utilizzando lo spettro protonico
misurato dalla bobina di disaccoppiamento sulla stessa provetta. Si ottiene un buon
disaccoppiamento quando 02 si trova al centro dell'intervallo di frequenza esistente tra il
gruppi CH3- e TMU. Utilizzare la modalità a disaccoppiamento a banda larga o le sequenze
composite di impulso (es.: WALTZ16) al fine di garantire un disaccoppiamento uniforme
sull’intero spettro.
Effettuare, per ciascuno spettro, un numero di accumulazioni NS sufficiente ad ottenere il
rapporto segnale/rumore indicato al punto 6 e ripetere 5 volte tale serie di accumulazioni NS. I
valori di NS dipendono dal tipo di spettrometro e di sonda utilizzati.
Le condizioni suggerite per l’ottenimento dello spettro 1H-NMR sono le seguenti:
- la temperatura della sonda deve essere costante (ad es. 303 K)
- rotazione del campione (ad es. 15-20 Hz)
- tempo di acquisizione di almeno 4,1 s per 8000 Hz di ampiezza spettrale (memoria 16 K)
- impulso a 30° o meno
- D1=7s almeno
- rivelazione in quadratura: fissare l'offset 01 tra i segnali di riferimento OH e CH3 per
l’acido acetico
- assenza di disaccoppiamento
Per 1H-NMR sono sufficienti 16 scansioni + 4 di prova per ottenere un appropriato rapporto
segnale/rumore. Inoltre sono necessarie almeno 5 ripetizioni.
8.
Calcolo dei risultati
Un software appropriato basato su un complesso algoritmo di fittaggio del segnale basato sul
metodo dei minimi quadrati deve essere adottato per determinare l’area del segnale (la fase e la
linea di base sono parametri sensibili che devono essere correttamente aggiustati). In caso di
assenza di significativi errori di fase e di linea base (ad es. utilizzando appropriate correzioni),
possono essere adottati altri software.
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Determinare per ognuno degli spettri 1H-NMR, il rapporto RH come segue:
RH = S TMU / S acido acetico
Dove S è l’area del segnale 1H-NMR, integrato dal software di elaborazione dati, secondo
trasformata di Fourier del Free Induction Decay, con una larghezza di banda pari a 0.5 Hz;
Calcolare la media delle ripetizioni e la deviazione standard.
Determinare per ognuno degli spettri 2H-SNIF-NMR:
1) il rapporto RD come segue:
RD = S’ acido acetico / S’ TMU
Dove S è l’area del segnale 2H-SNIF-NMR, integrato dal software di elaborazione dati, secondo
trasformata di Fourier del Free Induction Decay, con una larghezza di banda pari a 2 Hz;
2) il D/H CH3 (ppm) come segue:
(D/H) CH3 = RH * RD * D/H TMU
dove (D/H) TMU è il rapporto isotopico dello standard interno (TMU) indicato sul certificato fornito
da IRMM.
Calcolare la media delle ripetizioni e la deviazione standard.
Un software opzionale consente di eseguire tali calcoli online.
9.
Controllo della qualità delle analisi
Lo spettrometro deve essere controllato per sensibilità e risoluzione in accordo alle specifiche
dello strumento (5).
10. Caratteristiche del metodo
È stato condotto uno studio preliminare per la caratterizzazione del metodo.
Lo scarto di ripetibilità (Sr) è in media 0.4 ppm e il limite di ripetibilità medio (r) è 1.0 ppm.
Lo scarto di riproducibilità (SR) è in media pari 0.5ppm e il limite di riproducibilità medio (R) è 1.4
ppm.
I dettagli e i risultati dello studio sono presentati nell’allegato A.
Il limite di ripetibilità media (r) e il limite di riproducibilità media (R) risultano comparabili a quelli
osservati per l’alcool del il vino (OIV 426-2011).
11. Bibliografia
A. Hermann. (2001) Determination of D/H isotope ratio in acetic acid from vinegars and pickled
products by H-2-NMR spectroscopy Eur Food Res Techn 212 683-686
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C. Fauhl, R. Wittkowski (1996) On-line1H-NMR to facilitate tube preparation in SNIF-NMR analysis,
Z Lebensm Unters Forsch (1996) 541-545
Thomas, F., Jamin, E. (2009). (2)H NMR and (13)C-IRMS analyses of acetic acid from vinegar, (18)OIRMS analysis of water in vinegar: International collaborative study report. Analytica Chimica Acta,
649, 98-105.
Metodo OIV-OENO 510-2013: Metodo per la determinazione del rapporto isotopico13C/12C
dell'acido acetico nell'aceto di vino mediante spettrometria di massa isotopica.
Metodo OIV-OENO 426-2011: Determinazione della distribuzione di deuterio nell’etanolo derivato
dalla fermentazione dei mosti di uva, dei mosti di uva concentrati, dei mosti di uva concentrati
rettificati e dei vini mediante l’utilizzo della risonanza magnetica nucleare (SNIF-NMR/)
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ALLEGATO A
RISULTATI DELLO STUDIO DI CARATERIZZAZIONE
Questo documento presenta i risultati dello studio di caraterizzazione del metodo di analisi del
rapporto (D/H)CH3 nell'acido acetico dell'aceto di vino.
E’stato condotto uno studio di ripetibilità interna su 2 campioni di aceto. I risultati sono riportati
nella tabella di seguito.
Ripetibilità interna su 2 campioni estratti ed analizzati 10 volte
Ripetizione
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Sr
Limite di Ripetibilità r (2,8×Sr)
Campione 1
(D/H)CH3
100,8
101,7
100,9
101,3
101,0
102,1
101,8
101,2
101,6
101,0
0,4
1,2
Campione 2
(D/H)CH3
104,9
104,9
104,7
104,4
104,9
104,8
104,5
104,6
104,3
104,8
0,2
0,6
E’stato poi condotto nel 2012 uno studio intercollaborativo internazionale coinvolgente 3
laboratori.
1. Laboratori partecipanti
Allo studio hanno partecipato 3 laboratori:
Eurofins, Nantes
FEM-IASMA, San Michele all’Adige, Trento
Landesuntersuchungsamt, Speyer
Francia
Italia
Germania
2. Campioni
Lo studio ha riguardato 4 campioni di aceto di vino (n. 1-4) e 6 (n. 5-10) campioni prodotti da un
vino aggiunto di percentuali crescenti (10, 14, 20, 33, 40, 42%) di alcool da zucchero di canna e poi
sottoposto a fermentazione acetica. Da ciascun campione è stato estratto l'acido acetico ed è
stato analizzato il (D/H) CH3. I risultati sono indicati nella tabella riportata di seguito.
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(D/H)CH3
Sample
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
SR mean
lab1
104,8
105,0
106,0
106,2
106,9
107,7
107,3
108,5
109,2
108,9
lab2
105,4
105,0
106,0
106,5
106,6
108,2
107,9
107,5
109,2
109,5
lab3
104,8
104,5
104,8
106,9
106,6
107,6
107,3
108,6
107,9
107,5
SR
Limite di Riproducibilità R (2,8×SR)
0,4
0,3
0,7
0,3
0,2
0,3
0,3
0,6
0,8
1,0
0,5
1,1
0,8
2,0
0,8
0,6
0,8
0,8
1,7
2,2
2,8
1,4
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