UB100 – Real Check TRENB Urine 1 Introduzione 2 Preparazione

UB100 – Real Check TRENB Urine
Materiale di riferimento in matrice per 17-α-trenbolone e 17-β-trenbolone nell’urina bovina
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Introduzione
Il trenbolone acetato (nome completo:17β-Hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one, numero CAS 10161-33-8) è uno
steroide anabolizzante sintetico con effetto androgenico (Figura I). E’ vietato nella UE, ma viene ancora usato
negli USA e in Canada come trattamento anabolizzante per gli animali da allevamento. Solitamente viene
somministrato come trenbolone acetato mediante impianti sottocutanei. Nel sangue viene idrolizzato a 17-βtrenbolone (forma attiva del farmaco). Nelle urine, oltre alla forma attiva, si riscontra anche la presenza del
metabolita 17-α-trenbolone.
Il Piano Nazionale Residui 2012 indica il limite di rilevabilità del trenbolone a 2 µg/l (livello minimo richiesto
dalla prestazione analitica) nell’analisi di urine di vitelli, vitelloni e vacche.
Il materiale UB100 è un’urina bovina contaminata naturalmente contenente un’elevata concentrazione di 17-βtrenbolone e 17-α-trenbolone. Il materiale, diluito in un campione negativo secondo il fattore desiderato, può
venire utilizzato nelle procedure di validazione di metodi analitici.
Figura I: formula del trenbolone acetato
2
Preparazione, studio e assegnazione del valore
2.1 Preparazione del materiale
Il materiale UB100 – Real Check TRENB Urine è stato preparato miscelando opportunamente le urine
provenienti da tre animali (maschi di razza Salers di età compresa tra gli 11 e i 19 mesi). La prima urina e la
seconda urina erano di tipo incurred (naturalmente contaminate) ed erano state ottenute da animali trattati con
trenbolone acetato somministrato per via intramuscolare. I campioni sono stati uniti in un unico pool.
La terza urina era di tipo blank, proveniente da un animale esente da trattamenti farmacologici.
Tutte le urine sono state analizzate per il contenuto di trenbolone prima di venire utilizzate per la preparazione
di UB100. Il pool incurred è stato opportunamente diluito con il campione blank e il tutto è stato
omogeneizzato su un agitatore magnetico.
Il materiale è stato dapprima distribuito in vials in vetro ambrato con un dispensatore, poi sottoposto ad un ciclo
di liofilizzazione ed infine chiuso sottovuoto e conservato a -20°C.
Test Veritas S.r.l. - Via Svizzera 16, Padova, Italia
tel: 049/8256292, fax: 049/21064938, e-mail: [email protected]
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2.2 Omogeneità e stabilità
Le prove hanno dimostrato che il materiale è omogeneo e stabile al trasporto a temperatura ambiente. Una volta
ricevuto deve essere conservato al buio a -20°C.
2.3 Valore assegnato e incertezza del materiale ricostituito
Il valore di concentrazione di α-trenbolone e β-trenbolone (Tabella 3) è stato assegnato attraverso un circuito
interlaboratorio formato da tre laboratori esperti, di seguito elencati in ordine alfabetico:
- AKER Norwegian Control Doping Laboratory (Oslo, Norvegia)
- IZSLER Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna "Bruno Ubertini" –
Reparto chimica degli alimenti di origine alimentare (Brescia, Italia)
- LABERCA Laboratoire d’Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (Nantes, Francia).
Molecola
17-α-trenbolone
17-β-trenbolone
UB100: Real Check TRENB Urine
Concentrazione1
Valore assegnato2
15,4 µg/kg
10,5 µg/kg
Incertezza3
±2,6 µg/kg
±2,9 µg/kg
1
Calcolata sulla media di 3 set di risultati ottenuti con metodologia di conferma
Ottenuto su prove in cui il materiale era stato diluito di un fattore 10
3
Incertezza semplice
2
Tabella 3: valore assegnato, concentrazione e incertezza del materiale di riferimento UB100
Tutti
i
laboratori
erano
in
possesso
dell’accreditamento ISO 17025 per la prova in
questione. A ciascuno è stato assegnato un codice
identificativo.
Ogni laboratorio ha ricevuto 3 unità di materiale
UB100 ed un quantitativo di urina blank (urina
BOV04 del pannello Real Check di Test Veritas)
sufficiente per eseguire 3 determinazioni
indipendenti dopo aver diluito il materiale 1:10.
La Tabella 4 elenca risultati ottenuti. I dati sono
stati sottoposti al test di Dixon e al test del box
plot per escludere la presenza di outliers. Il
valore assegnato del materiale è dato dalla media
delle medie, mentre il valore di incertezza
corrispondente è dato dall’errore standard
relativo.
I dettagli dei metodi impiegati sono indicati in
Tabella 5.
α-TRENBOLONE (µg/kg)
Laboratorio Misura 1 Misura 2 Misura 3 MEDIA
1
1,92
1,83
1,96
1,90
2
0,77
1,18
1,13
1,03
3
2,00
0,80
2,30
1,70
Media delle medie [µg/kg]
1,54
Deviazione standard relativa RSD [%]
29,7
Errore standard RSE [%] 17,17
β-TRENBOLONE (µg/kg)
Laboratorio Misura 1 Misura 2 Misura 3 MEDIA
1
0,76
0,75
0,80
0,77
2
0,79
0,75
0,73
0,76
3
1,80
1,70
1,40
1,63
Media delle medie
1,05
Deviazione standard relativa RSD [%]
47,7
Errore standard relativo RSE [%] 27,53
Tabella 4: singoli risultati provenienti dal circuito di
caratterizzazione. I dati, corretti per il recupero, sono
stati ottenuti dopo diluizione 1:10 in urina blank.
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Codice laboratorio
ISO 17025
α-trenbolone CCα (µg/kg)
α-trenbolone CCβ (µg/kg)
β-trenbolone CCα (µg/kg)
β-trenbolone CCβ (µg/kg)
Metodo analitico
Standard per le analisi
cromatografiche
Estrazione SPE
Altre estrazioni
Digestione
SPE Clean up
Clean up (altro)
Metodologia HPLC
Colonna
Lunghezza colonna (cm)
Diametro colonna (mm)
Dimensione particelle
1
2
yes
yes
0,60
0,12
0,66
0,12
0,54
0,43
0,59
0,49
HPLC/MS/MS
GC/MS/MS
NARL (α-tren), dr.
Roussel Uclaf
Ehrenstorfer (β-tren)
Trattamento dei campioni
MeOH/Acetate buffer
β-gluc aryl sulfatase
β-gluc aryl sulfatase
ChromP+SiOH
Immunoaffinity
Hexane/diethylether
chromatography
Metodologia HPLC e condizioni
gradient
C18
15
2,1
3,5
-
3
yes
0,06
0,10
0,09
0,15
HPLC/MS/MS
RIVM
C18
Liq-Liq extraction (npentan)
β-gluc aryl sulfatase
OASISHLB
-
gradient
C18
10
2,1
3
Tabella 5: dettagli sulle metodologie impiegate dai laboratori partecipanti al circuito di caratterizzazione.
3
Istruzioni per l’uso
3.1 Caratteristiche
UB100 – Real Check TRENB Urine si presenta in forma liofilizzata ed è fornito in una singola bottiglietta in
vetro ambrato. Ciascuna bottiglietta contiene la quantità di materiale sufficiente per ottenere 2,2 ml di urina
bovina dopo ricostituzione in acqua bidistillata.
3.2 Precauzioni
Applicare le normali procedure per la sicurezza in uso presso il laboratorio.
3.3 Ricostituzione
- Portare UB100 a temperatura ambiente.
- Ricostituire con 2,15 g di acqua bidistillata. La pesatura deve avvenire immediatamente dopo l’apertura della
bottiglietta per ridurre al minimo il contatto del liofilo con l’umidità atmosferica. Agitare delicatamente per
inversione.
- Conservare overnight a 2-8°C ed utilizzare il giorno seguente.
3.4 Conservazione
Il materiale deve essere conservato a -20°C.
3.5 Utilizzo
Il materiale è destinato ad essere utilizzato nei controlli di qualità e nei processi di validazione dei metodi
analitici.
3.6 Scadenza
La scadenza di UB100 è fissata ad aprile 2014.
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