caratterizzazione di lieviti secchi attivi durante la

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CARATTERIZZAZIONE DI LIEVITI SECCHI ATTIVI DURANTE LA PREPARAZIONE
DEL PIED DE CUVE
BENUCCI Ilaria, LIBURDI Katia, ESTI Marco
Dipartimento per la Innovazione nei sistemi Biologici, Agroalimentari e Forestali (DIBAF), Università degli
Studi della Tuscia, Via S. Camillo De Lellis snc, 01100 Viterbo, Italia
E-mail: [email protected]
Lavoro presentato alla 8ª edizione di Enoforum, Arezzo, 7-9 maggio 2013
Introduzione
La selezione del ceppo di lievito da utilizzare per la preparazione del pied de cuve è di
fondamentale importanza per il buon esito della rifermentazione in bottiglia degli spumanti; deve,
pertanto, essere condotta tenendo in considerazione la capacità del lievito di crescere in condizioni
avverse in termini di pressione, temperatura e presenza di etanolo (Martìnez-Rodrìguez et al.,
2001). L’attivazione dell’inoculo di fermentazione rappresenta, per tale ragione, un’operazione
essenziale che influenza in modo significativo le dinamiche di popolazione ed ha come obiettivo
quello di favorire l’adattamento graduale dei lieviti in un mezzo “ostile”, la cui composizione, in
termini di etanolo e SO2, è analoga a quella del vino base in cui avverrà la presa di spuma.
La quantità di cellule vitali in pied de cuve dipende dalla qualità del preparato commerciale di
lievito secco attivo, dalla modalità di conservazione (temperatura, esposizione all’ossigeno e
all’umidità) e dall’accuratezza adottata per la sua reidratazione (Delteil, 2004; Redòn et al., 2008).
E’ noto che lo stato fisiologico delle cellule, dopo reidratazione, condiziona la durata del periodo in
cui il lievito inizia a moltiplicarsi, influenzando, così, l’attivazione del metabolismo degli zuccheri e,
conseguentemente, la vigoria fermentativa (Delteil, 2004). La dinamica evolutiva di una
popolazione di lievito in pied de cuve, mantenuto per realizzare tiraggi successivi, ha evidenziato
che il numero di cellule vive aumenta leggermente nei primi 2 giorni, riducendosi, poi,
gradualmente nel corso dei successivi 5; il numero di cellule morte, invece, cresce fino al quarto
giorno, per poi stabilizzarsi nei 3 seguenti (Gerbaux e Thomas, 2009).
Il presente lavoro è stato condotto al fine di studiare e caratterizzare, nel corso della preparazione
dell’inoculo di rifermentazione, la vitalità e la vigoria fermentativa di 4 ceppi commerciali di lievito
(EC1118, IOC, DV10, CHP), diffusamente impiegati nella fase di tiraggio degli spumanti.
Materiali e Metodi
Lieviti
In tabella 1 sono indicati i 4 ceppi commerciali di lievito Saccharomyces cerevisiae testati durante
la sperimentazione.
Tabella 1: Lieviti commerciali impiegati per la preparazione di pied de cuve
Nome commerciale
Lalvin EC1118®
IOC-18-2007®
Vitilevure DV10®
Levuline CHP®
Azienda produttrice
Lallemand
Institut œnologique de Champagne
Station œnotechnique de Champagne
Oenofrance
Sigla
EC1118
IOC
DV10
CHP
Preparazione dell’inoculo
Il vino base impiegato per la sperimentazione, prodotto presso l’Azienda vitivinicola De Sanctis
Luigi (Frascati, RM) a partire da uve Bombino bianco, presentava una gradazione alcolica
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corrispondente all’11% v/v ed un tenore di SO2 libera pari a 8 mg l-1. In tabella 2 sono riportati i
principali parametri analitici delle uve Bombino bianco al momento della raccolta.
Tabella 2: Parametri chimico-fisici di uve Bombino bianco destinate alla produzione di vino base
Data
vendemmia
25/09/2010
°Brix
pH
21,6
3,15
Acidità totale
(g l-1)
6,9
Acido tartarico
(g l-1)
5,39
Acido malico
(g l-1)
1,82
L’attivazione del pied de cuve, da inoculare in bottiglia per la fermentazione secondaria, è stata
condotta secondo la tecnica sviluppata dal Comité Interprofessionnel du vin de Champagne
(CIVC) e consiste in una procedura che prevede 3 fasi:
• I stadio: reidratazione dei lieviti secchi attivi in soluzione zuccherina (temperatura 38°C);
• II stadio: induzione del metabolismo degli zuccheri in presenza di un’aliquota di vino base
pari al 50% del volume di inoculo (temperatura 20°C);
• III stadio: mantenimento del metabolismo degli zuccheri in presenza di vino base al 75%
del volume di inoculo (temperatura 20°C, intenso arieggiamento).
Vitalità del lievito
La biomassa è stata caratterizzata mediante valutazione del numero di cellule totali, vive e morte.
La sospensione microbica, diluita 1:100, è stata sottoposta a conta microscopica in camera di
Thoma, ingrandimento x40, al fine di determinare il numero di cellule totali. La vitalità è stata
accertata mediante osservazione microscopica dopo colorazione con Blu di Metilene: cellule vitali
incolori/bianche, cellule morte di colore blu (Medawar et al., 2003).
Determinazione della vigoria fermentativa
La vigoria fermentativa dei 4 diversi ceppi di lievito è stata determinata monitorando il decremento
della densità dell’inoculo durante il II e III stadio dell’attivazione del pied de cuve, estrapolando
come indice la densità istantanea, che rappresenta il rapporto fra la densità corrente e quella
iniziale (DL/DL0) in funzione del tempo. Il coefficiente angolare della retta di regressione (IKI), che
correla (DL/DL0) al tempo, è stato impiegato come parametro di confronto del tasso di consumo
degli zuccheri, sia nel II che nel III stadio di preparazione del pied de cuve.
Risultati e discussione
La riattivazione dei lieviti secchi attivi, mediante reidratazione (I stadio), rappresenta la prima
importante operazione da svolgere per la preparazione del pied de cuve. Nel corso di questa fase,
le cellule, che in seguito all’essiccazione hanno subito cambiamenti strutturali, cominciano a
mobilitare le loro riserve lipidiche incorporando costituenti extracellulari (steroli), recuperando
rapidamente la funzionalità delle membrane plasmatiche danneggiate (Redòn et al., 2008).
Successivamente, l’aggiunta di aliquote crescenti di vino base (50% e 75% rispettivamente nel II e
III stadio) serve a garantire l’adattamento del metabolismo degli zuccheri in un mezzo di reazione
che, per composizione, assomiglia sempre di più al vino base in cui avverrà la presa di spuma.
I risultati ottenuti hanno mostrato che, al termine della reidratazione e nel corso del II stadio, la
popolazione microbica non ha subito variazioni significative in termini di numero di cellule totali
(Fig. 1), mantenendosi costante per tutti i lieviti testati (1,1x109 - 7,7x109 cellule/ml). Al contrario, i
4 ceppi hanno manifestato una differente vitalità già a partire dall’inizio del II stadio, come appare
in figura 2, dove, dalle foto al microscopio risulta evidente che il CHP è risultato essere il più vitale
fra i lieviti. Durante le 24 ore successive la percentuale di cellule vive è aumentata, da un minimo
del 10% per CHP ad un massimo del 29% per EC1118 (Fig. 1), raggiungendo i valori più elevati
per DV10 (90%) ed EC1118 (89%) ed i più bassi per CHP (83%) e IOC (72%).
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9
1,1x10
1,1x109
3,1x109
2,0x109
1,1x109
2,3x109
2,7x10
8
7,0x10
1,7x109
9
1,3x109
9
1,6x10
100
7,7x109
Vitalità (%)
80
60
40
20
0
0
0
6
6
24
24
Tempo (ore)
Figura 1: Percentuale di cellule vive (EC1118: verde; IOC: arancio; DV10: rosa; CHP: blu) e morte (grigio)
rispetto alla popolazione totale, durante il II stadio di preparazione del pied de cuve
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Figura 2: Foto al microscopio delle cellule di lievito, all’inizio del II stadio, dopo colorazione con Blu di
Metilene. Le cellule vive appaiono incolori/bianche, quelle morte di colore blu
Il III stadio è stato monitorato e si è protratto fino a che il pied de cuve ha raggiunto la densità
adatta per la presa di spuma in bottiglia. All’inizio di questa fase, per effetto della significativa
diluizione della sospensione cellulare con vino base, si è osservato un decremento della
popolazione microbica totale dei 4 lieviti che, nelle ore successive, si è mantenuta a valori prossimi
a 107 cellule ml-1. La vitalità, invece, si è differenziata tra i ceppi, con un ulteriore incremento
percentuale per EC1118 e CHP nelle prime 24 ore (Fig. 3), a fronte di un lieve calo osservato per
gli altri 2 lieviti fino al momento del loro inoculo in bottiglia (dopo 48 ore).
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7
7,6x10
5,8x107
5,8x107
7,2x10
8
1,1x10
7
1,0x108
7
7,6x10
9,3x107
7,4x107
100
1,3x108
Vitalità (%)
80
60
40
20
0
0
0
24
24
48
48
Tempo (ore)
Figura 3: Percentuale di cellule vive (EC1118: verde; IOC: arancio; DV10: rosa; CHP: blu) e morte (grigio)
rispetto alla popolazione totale, durante il III stadio di preparazione del pied de cuve
In tabella 3 sono riportati, per i 4 ceppi di lievito, i coefficienti angolari delle rette di regressione
(IKI), che correlano il rapporto (DL/DL0) al tempo e che sono stati impiegati come parametro di
confronto del tasso di consumo degli zuccheri, durante il II ed il III stadio di preparazione del pied
de cuve.
2
Tabella 3: Coefficienti angolari (IKI) e R delle rette di regressione che correlano (DL/DL0) al tempo, durante il
II e III stadio di preparazione del pied de cuve
Lievito
EC1118
IOC
DV10
CHP
II Stadio
IKI
0,0010
0,0015
0,0018
0,0012
III Stadio
R2
0,974
0,992
0,989
0,962
IKI
0,0002
0,0003
0,0003
0,0001
R2
0,924
0,912
0,997
0,905
La vigoria fermentativa, espressa in termini di densità istantanea del pied de cuve, è risultata
indipendente dalla vitalità delle popolazioni in entrambe le fasi e, come appare in figura 4, nel II
stadio, è stata maggiore e contraddistinta da differenze significative tra i ceppi. Il DV10 ha mostrato
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il più elevato tasso di consumo degli zuccheri (IKI pari a 0,0018) rispetto agli altri lieviti (tab. 3). Nel
III stadio gli andamenti erano analoghi e di pari entità tra i ceppi con valori di IKI molto più bassi e
compresi tra 0,0001 e 0,0003.
1
EC1118
IOC
0,99
III stadio
DV10
CHP
(DL/DLO)
0,98
0,97
II stadio
0,96
0,95
0,94
0
10
20
30
40
50
60
Tempo (ore)
Figura 4: Rapporto fra la densità corrente e quella iniziale (DL/DL0) in funzione del tempo, nel II e III stadio di
preparazione del pied de cuve
Conclusioni
I 4 ceppi di lievito (EC1118, IOC, DV10, CHP), oggetto del presente studio, hanno dimostrato di
possedere diversa vitalità e vigoria fermentativa nel corso della preparazione del pied de cuve,
sebbene questi 2 parametri siano risultati indipendenti tra loro. La vitalità delle 4 popolazioni è
apparsa crescente nelle prime 24 ore del II stadio con una differente evoluzione nella fase
successiva. Nel II stadio, la vigoria fermentativa, espressa dalla densità istantanea del pied de
cuve, è stata maggiore e contraddistinta da differenze significative tra i ceppi, con il DV10 che ha
mostrato il più elevato tasso di consumo degli zuccheri. Nel III stadio, invece, gli andamenti erano
analoghi e di pari entità tra i ceppi con valori di IKI molto più bassi.
Bibliografia
Delteil D. 2004. Aspetti pratici dell’inoculo in condizioni mediterranee. Tecnica di inoculo e rapporto tra
popolazione selezionata ed indigena. Pratica di inoculo dei lieviti selezionati. Vinidea.net – rivista
internet tecnica del vino, 5, 1-10.
Gerbaux V, Thomas J. 2009. Utilizzazione pratica della citometria di flusso per il controllo dei lieviti in
enologia. Revue Française d’OEnologie, 236, 8-13.
Martìnez-Rodrìguez A, Carrascosa AV, Barcenilla JM, Pozo-Bayòn MA, Polo MC. 2001. Autolytic capacity
and foamanalysis as additional criteria for the selection of yeast strains for sparkling wine production.
Food Microbiology, 18, 183-191.
Medawar Wi, Strehaiano P, Délia ML. 2003. Yeast growth: lag phase modelling in alcoholic media. Food
Microbiology, 20, 527–532.
Redòn M, Guillamòn JM, Mas A, Rozès N. 2008. Effect of active dry wine yeast storage upon viability and
lipid composition. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24, 2555–2563.
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Riassunto
L’esito della presa di spuma nella fermentazione secondaria degli spumanti dipende, oltre che dal vino base,
dalle dinamiche di popolazione del lievito inoculato tramite pied de cuve. Vitalità e vigoria fermentativa,
durante la preparazione dell’inoculo di rifermentazione, di 4 lieviti (EC1118, IOC, DV10, CHP) diffusamente
impiegati nella fase di tiraggio degli spumanti, sono l’oggetto del presente studio. L’attivazione del pied de
cuve da incorporare alla presa di spuma, in rapporto 5:100, nel vino base (Bombino bianco) è stata
realizzata secondo 3 fasi: reidratazione dei lieviti secchi attivi (I stadio) e induzione del metabolismo degli
zuccheri in presenza di aliquote crescenti di vino, pari al 50% (II stadio) e al 75% (III stadio) del volume di
inoculo. Nel corso del II stadio la popolazione totale dei 4 lieviti è rimasta costante ed a concentrazioni
9
-1
analoghe (circa 10 cellule ml ), con una vitalità crescente nelle 24 ore, a tassi variabili tra i ceppi (dal 10%
CHP al 29% EC1118). La vigoria fermentativa (densità istantanea del vino) è apparsa indipendente dalla
vitalità delle popolazioni, con un massimo tasso di consumo degli zuccheri per DV10. Nelle 48 ore
successive (III stadio), la popolazione totale dei 4 lieviti, per effetto dell’aggiunta di vino base, si è attestata a
7
-1
circa 10 cellule ml con differente evoluzione della vitalità. Questa è risultata decrescente per DV10 e IOC
(più elevato tasso di decremento della densità negli stadi II e III) e ancora crescente per CHP ed EC1118.
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