Progetto GRASTEPP Programma di attività scientifica di ricerca

GRASTEPP: TRA GRAVINE E STEPPE
Programma di attività scientifica di ricerca
Azione B.2
REGIONE PUGLIA
Area Politiche per lo sviluppo rurale
Assessorato Risorse Agroalimentari
Servizio Caccia e Pesca
Osservatorio Faunistico Regionale
Progetto GRASTEPP
AZIONI PER LA CONSERVAZIONE DELLA BIODIVERSITA’
IN DUE AREE PROTETTE DELLA REGIONE PUGLIA
Delibera Cipe 19/2004
Fondi F.A.S. 2004/2007
Azione B.2 : " Azioni per la specie prioritaria Lanario (Falco biarmicus feldeggii)
ed altre specie prioritarie di rapaci, in particolare
Capovaccaio (Neophron percnopterus)”
Programma di attività scientifica di ricerca
Riproduzione assistita per la conservazione ex situ
di specie prioritarie di rapaci
A cura di
Vincenzo Costantini
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GRASTEPP: TRA GRAVINE E STEPPE
Programma di attività scientifica di ricerca
Azione B.2
PROGRAMMA
1.1 Titolo del Progetto:
GRASTEPP
TRA GRAVINE E STEPPE
AZIONI PER LA CONSERVAZIONE DELLA BIODIVERSITA’IN DUE AREE PROTETTE DELLA
REGIONE PUGLIA
Delibera CIPE 19/2004
1.2 Settore di intervento: Azione B.2
1.2.1 AZIONE B
AZIONI PER LA CONSERVAZIONE DELLA SPECIE PRIORITARIA LANARIO (FALCO
BIARMICUS FELDEGGII) ED ALTRE SPECIE DI RAPACI, IN PARTICOLARE
CAPOVACCAIO (NEOPHRON PERCNOPTERUS)
1.2.2 OBIETTIVO
Conservare ed incrementare la popolazione del Lanario (Falco biarmicus feldeggii) ed altre specie
prioritarie di rapaci, in particolare il Capovaccaio (Neophron percnopterus), presenti nelle aree
protette “Terra delle Gravine” ed “Alta Murgia”
1.2.3 SOTTOAZIONE B.2
Costruzione e gestione voliere per la riproduzione del Lanario ed altre specie prioritarie di rapaci, in
particolare Capovaccaio
1.2.4 PROCEDURE
Costruzione delle voliere e gestione degli animali all’interno dell’Osservatorio Faunistico Regionale
della Regione Puglia in Bitetto (Ba)
1.2.5 ATTI AMMINISTRATIVI
a. Bando di gara per la costruzione delle voliere
b. Convenzione con il Veterinario esperto per la riproduzione assistita di fauna selvatica protetta
1.2.6 ENTE ATTUATORE
Regione Puglia
Area Politiche per lo sviluppo rurale
Assessorato Risorse Agroalimentari
Servizio Caccia e Pesca
Osservatorio Faunistico Regionale
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Azione B.2
1.3.1 Azione B del Progetto
1.3.1.1 Il Lanario (note di biologia e status)
II Lanario (Falco biarmicus feldeggii) è tra le specie del genere Falco meno conosciute in Europa.
E’ una specie particolarmente minacciata e salvaguardata da varie convenzioni e direttive
internazionali, in particolare è classificato ‘Minacciato’ in Europa ed è incluso nel livello SPEC 3
(Tucker & Heath 1994). E’ inserito come specie prioritaria nell’Annesso I nella Direttiva 79/409
Uccelli della Unione Europea e in Appendice II nella Convenzione di Bonn, in Appendice II nella
Convenzione di Berna e infine in Appendice II nella CITES.
In Italia la specie è classificata ‘In Pericolo’ nel Libro Rosso degli Animali d’Italia (WWF, 1998)
La popolazione italiana di Lanario è rappresentata dalla sottospecie europea Falco biarmicus
feldeggii. ed è particolarmente importante in Europa per la conservazione di questa specie
rappresentando, con 170-200 coppie, circa il 70% dell’intera popolazione europea. Si riproduce
prevalentemente su pareti rocciose in ambienti aridi di media bassa collina.
1.3.1.2 Il Capovaccaio (note di biologia e status)
Il Capovaccaio (Neophron percnopterus) è un piccolo avvoltoio migratore che nidifica in Europa
meridionale tra marzo ed agosto e sverna in Africa a sud del Sahara. La specie è monogama. I
giovani individui effettuano la migrazione verso gli areali africani a fine estate e ritornano nei siti
europei (filopatria), generalmente dopo alcuni anni, per la riproduzione (Ferguson-Lees, J. &
Christie D. A., 2001) (Meyburg, B.U. et al., 2004). Attualmente il capovaccaio è considerato specie
‘prioritaria di conservazione’ SPEC 3 (Species of European Conservation Concern), con uno status
sfavorevole di conservazione che merita un’attenzione particolare e specie minacciata di estinzione
a livello globale (categoria endangered - IUCN Red List) (Birdlife International, 2009). I nuclei
riproduttivi che raggiungono in primavera l’Europa meridionale, ad eccezione della Penisola Iberica
(1.000 coppie circa), sono ormai ridotti a poche decine di individui concentrati in areali circoscritti
(BirdLife International, 2004). In Italia peninsulare il capovaccaio presentava una popolazione, in
base ad una analisi recente, stabilizzata attorno a 9 coppie in due aree meridionali di nidificazione
(Calabria: area Ionica; Puglia-Basilicata: comprensorio Pollino-Gravine) con previsione di ulteriore
declino ed estinzione della specie, nel territorio nazionale, entro il 2015 (Ceccolini G. et al., 2006).
1.3.1.3 Abstract
Le azioni previste di conservazione del Lanario e del Capovaccaio sono coerenti con i Piani di
Azione nazionali ed internazionali redatti da organismi di referenza come, rispettivamente, l’ISPRA
ex-INFS (L’Istituto Superiore per la Protezione e Ricerca Ambientale) per il Ministero
dell’Ambiente, ed il BirdLife International per la Commissione europea, finalizzati ad individuare
minacce e fattori limitanti che gravano sulla popolazione italiana e a definire una serie di azioni
funzionali a garantirne la conservazione.
Le attività relative al ripopolamento delle specie prioritarie, in particolare del Lanario e del
Capovaccaio, si prevede che vengano, pertanto, sottoposte all’attenzione ed alla valutazione da
parte dell’Istituto Superiore per la Protezione e Ricerca Ambientale (ex-INFS) organismo nazionale
di riferimento per questi progetti.
ll Centro per la riproduzione dei Rapaci minacciati (Lanario e Capovaccaio), attrezzato con le
strutture e dotato delle professionalità necessarie (voliere, personale, veterinario, ecc), verrà
realizzato presso una struttura pubblica già esistente che svolge attività similari a quella in oggetto
dotandolo del personale necessario, cioè presso l’Osservatorio Faunistico Regionale in Bitetto (Ba).
Nell’ambito delle azioni complementari del Progetto, saranno realizzate le attività di monitoraggio e
di hacking, coordinate da un responsabile scientifico e svolte da personale con competenze
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Azione B.2
specifiche ed opportunamente formato. In questo ambito si prevede particolare attenzione nel
reperimento dello stock di riproduttori che devono appartenere, per il Lanario, alla sottospecie
autoctona Falco biarmicus feldeggii, e provenienti dalla popolazione italiana, non esistendo in base
alle attuali conoscenze scientifiche metapopolazioni di questa specie a livello nazionale,
verificandone la disponibilità presso centri di recupero e/o riproduzione pubblici e/o privati. Nella
scelta dei siti dove operare l’hacking si prevede inoltre la possibilità di considerare oltre che siti
naturali, anche siti artificiali su adeguate strutture antropiche. L’utilizzo di strutture antropiche è
infatti molto sviluppato in altre sottospecie di Lanario (F.biarmicus erlangeri e tanypterus), e può
attraverso un condizionamento culturale aumentare la popolazione nidificante della specie nelle
aree protette in oggetto. Un fattore limitante per l’areale di distribuzione del Lanario in Puglia è,
infatti, l’assenza di adeguati siti rupicoli a fronte di numerose superfici di ambienti trofici.
1.4 Sottoazione B.2
1.4.1 Durata prevista (agg.)
2 anni (2011-2013)
1.4.2 Parole chiave
Lanario, Capovaccaio, altre specie prioritarie di rapaci (diurni e notturni), voliere da riproduzione,
conservazione ex situ, riproduzione assistita, GnRH, sessaggio genetico, inseminazione artificiale,
assistenza pediatrica.
1.4.3 Abstract
I programmi di conservazione integrata per le specie prioritarie dell’avifauna selvatica protetta, in
corso in diversi paesi, prevedono azioni che mirano a realizzare una migliore tutela degli habitat e a
salvaguardia delle popolazioni naturali, secondo mirati progetti scientifici (conservazione in situ).
Per alcune delle specie minacciate di estinzione ad alto rischio (Extinct in the Wild, Critically
Endangered, Endangered, Vulnerable della Red List IUCN), i protocolli operativi possono
prevedere lo sviluppo di progetti per la riproduzione assistita in ambiente controllato (conservazione
ex situ), con rilascio di individui idonei (captive-born) in habitat naturale, per l’incremento delle
residue popolazioni autoctone (restocking) e/o la reintroduzione negli areali storici, nell’ambito di
specifici Piani di Azione nazionali ed internazionali (PdA) (Gariboldi et al., 2004; Butchart et al.,
2005; Andreotti & Leonardi, 2009). Sono interventi che richiedono di solito un’istruttoria tecnica
complessa, sinergie di competenze ad alto profilo tecnico-scientifico, una cospicua copertura
finanziaria e soprattutto tempi di realizzazione piuttosto lunghi in quanto il tasso di fertilità delle
specie prioritarie è frequentemente basso e le tecniche di allevamento in ambiente controllato
(captive breeding), nonostante l’adeguata gestione dell’allevamento, dell’alimentazione e dello
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Azione B.2
stato sanitario, non sempre garantiscono il pieno successo riproduttivo. La possibilità di individuare
e definire nuove metodiche biotecnologiche diagnostiche e terapeutiche di condizionamento e
controllo della riproduzione (breeding management) degli uccelli con aumento del tasso di fertilità
e nascita di pulli vivi e vitali ha portato, nell’ultimo ventennio, allo sviluppo di specifici programmi
di ricerca di grande impegno. Il Progetto mira a sviluppare, nell’ambito della sottoazione B2, una
serie di attività e studi sulle tecniche di allevamento in ambiente controllato e sulla biologia
riproduttiva del Lanario (Falco biarmicus feldeggi) e di altri rapaci, in particolare del Capovaccaio
(Neophron percnopterus), e nell’ambito di questi programmi, si prevedono attività di ricerca
applicata per la individuazione e definizione specie-specifica di innovative metodiche di
allevamento e tecnologie di riproduzione assistita, sia a livello diagnostico che terapeutico, efficaci
e di agile applicazione in campo per il programma di conservazione ex situ delle specie prioritarie.
L’azione del Progetto ha come obiettivo la definizione, nelle specie allevate, di schemi posologici
specifici di originali preparazioni farmacologiche di condizionamento neuroendocrino dell’attività
riproduttiva che sono risultate, in studi preliminari su specie modello, innocue ed efficaci, con
risultati positivi, anche su specie di elevato pregio biologico, per l’induzione della produzione di
gameti, sia nel maschio che nella femmina, con ripristino di regolare ovodeposizione,
fertilizzazione e nascita di pulli vivi e vitali, nell’ambito di interventi di restocking. La definizione
delle tecniche incruente di sessaggio genetico (PCR, PCR-RFLP) da DNA (piuma e/o uovomembrana testacea) su Lanario, Capovaccaio ed altri rapaci di interesse conservazionistico
prioritario, in associazione alle indagini diagnostiche non invasive di riproduzione assistita
(ecografia gonadica, titolazione steroidi fecali), alle tecniche di inseminazione artificiale (IA) e di
crioconservazione del liquido seminale (banca del seme) fa intravedere, inoltre, la possibilità di
nuovi e concreti strumenti operativi e sviluppo di professionalità di alto profilo tecnico-scientifico
per ulteriori programmi nazionali e internazionali di conservazione della biodiversità a favore delle
specie avifaunistiche autoctone minacciate presenti nelle aree protette della Regione Puglia.
1.4.4 Obiettivi
a. attività in campo, di ricerca e cooperazione nel settore della conservazione di specie
avifaunistiche prioritarie (Rapaci), in particolare Capovaccaio e Lanario, per la valorizzazione di
beni ambientali della Regione Puglia;
b. conservazione ex situ: progettazione e realizzazione di voliere, definizione di tecniche di
allevamento (captive breeding) e biotecnologie per programmi di riproduzione assistita (Lanario,
Capovaccaio ed altre specie prioritarie di rapaci diurni e notturni);
c. sinergie tecnico-scientifiche di alto profilo per piani di tutela ambientale e conservazione
integrata della biodiversità.
1.4.5 Strategie
1.4.5.1 Introduzione – Un’analisi recente dell’autorevole BirdLife International rivela che
attualmente, delle 9895 specie viventi dell’avifauna selvatica, il 12,5% è minacciato di estinzione
entro la fine di questo secolo, pari a 1240 specie, e di queste circa 190 specie sono considerate ad
alto rischio di estinzione entro il prossimo decennio (Red List IUCN, 2010). Si tratta di una grave
crisi ecologica a livello planetario. I mezzi a disposizione dell’Uomo per proteggere le specie
minacciate possono essere molteplici, ma i programmi di conservazione della biodiversità mirano
fondamentalmente a salvare l’ambiente ed a favorire la riproduzione delle popolazioni naturali. Per
le specie giunte sull’orlo dell’estinzione, i progetti di riproduzione in ambiente controllato (captive
breeding), nell’ambito di specifici Piani di Azione e mediante protocolli tecnico-scientifici
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sperimentati e finalizzati alla conservazione ex situ, si sono dimostrati efficaci e determinanti per la
realizzazione di programmi di incremento delle popolazioni in natura (restocking) e di
reintroduzione negli areali storici. La riproduzione in ambiente controllato, ad opera di staff tecnici
ad alta specializzazione, può permettere, infatti, di realizzare, per ciascuna specie a rischio di
estinzione, una “riserva biologica di sicurezza” di esemplari (captive born), con un ruolo potenziale,
e talora determinante, nella conservazione integrata delle specifiche popolazioni naturali. Sono
interventi che richiedono la sinergia di numerose competenze tecnico-scientifiche, notevole
impegno economico e tempi di realizzazione piuttosto lunghi anche per il basso tasso di fertilità
delle specie minacciate, come ad esempio, per le specie prioritarie di rapaci come il Lanario ed il
Capovaccaio.
1.4.5.2 Sessaggio genetico da piuma e/o uovo-membrana testacea (DNA) - Per la conservazione
delle specie minacciate, la definizione del sesso è determinante per lo studio della sex ratio delle
popolazioni naturali (conservazione in situ) e per la precoce scelta dei riproduttori nell’ambito dei
programmi di riproduzione in ambiente controllato (conservazione ex situ). In alternativa alla
determinazione del sesso basata sulla valutazione, non sempre attendibile, di elementi morfologici
e comportamentali ed alle tecniche chirurgiche, non prive di rischi per la salute dei volatili e di non
pratica realizzazione in pulli ancora presenti nel nido o in specie di piccola taglia, sono stati
sviluppati specifici protocolli di ricerca per la definizione di metodiche non invasive, da DNA
estratto da piuma, di sessaggio genetico degli uccelli monomorfici e dimorfici immaturi, efficaci e
di agile applicazione nella pratica clinica corrente.
La metodica di base che prevede l’estrazione e l’amplificazione del DNA dal calamo di 2-3 piume
(regione pettorale), mediante l’impiego di una PCR (Polymerase Chain Reaction) con primers
universali per il gene CHD-1 (Chromobox Helicase DNA binding domain) dei cromosomi sessuali,
è stata applicata in centinaia di specie dell’avifauna protetta autoctona ed alloctona di numerosi
ordini, come Falconiformi, Accipitriformi, Strigiformi, Galliformi, Passeriformi e Psittaciformi. La
conservazione dei campioni di piume è stata realizzata per mesi, ed in alcune specie come l’Aquila
reale (Aquila chrysaetos), anche per anni, a temperatura ambiente. L’estrazione del DNA viene
effettuata over night mediante una digestione tissutale propedeutica a 55°C in medium di lisi con
proteinasi K (kit GenEluteTM Mammalian Genomic DNA miniprep - Sigma, Milano). Le
condizioni di reazione standardizzate per l’amplificazione del DNA, mediante l’ausilio di una
coppia di primers P2e P8 in un mix di buffer, nucleotidi e Taq polimerasi (Eppendorf, Milano),
sono usualmente di 94°C per 120 s e 35 cicli a 94°C per 45 s (denaturazione), 48°C per 45 s
(annealing) e 72°C per 45 s, con un ciclo finale a 72°C per 5 min (estensione) utilizzando il
termociclatore Mastercycler Personal (Eppendorf, Milano). Nel test viene regolarmente incluso un
controllo negativo per escludere contaminazioni da DNA esogeno, in quanto il gene CHD-1 è
presente anche nell’uomo (Griffith et al., 1998). Il prodotto di amplificazione viene quindi
analizzato, mediante elettroforesi su gel di agarosio al 3%, e l’immagine acquisita con il sistema
GelDoc 2000 (Bio Rad, Milano). La determinazione del sesso viene realizzata con evidenziazione
di due bande (frammenti di amplificazione), nei soggetti femminili, e di una banda, nei soggetti
maschili, con dimensioni che variavano dalle 250 alle 420 paia di basi a seconda della specie
(Guaricci et al., 2005; Costantini et al., 2006a; Costantini et al., 2008a).
Per le specie non responsive, come Rapaci diurni e notturni, ed alcuni Avvoltoi, come il Grifone
(Gyps fulvus), è stata definita una metodica alternativa di sessaggio genetico, la PCR-RFLP, da
DNA estratto da piuma e, nell’ambito di ricerche preliminari in specie modello, come la Quaglia
giapponese (Coturnix japonica) (Costantini et al., 2008b), da membrana testacea dell’uovo (cellule
ematiche della rete vascolare embrionale), dopo la schiusa. La metodica genetica alternativa
prevede l’associazione della PCR di base alla tecnica dell’analisi del polimorfismo in lunghezza dei
frammenti di restrizione (RFLP) con l’enzima HaeIII, che riconosce un proprio sito bersaglio
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Azione B.2
soltanto sul prodotto di amplificazione derivante dal cromosoma sessuale Z, e l’enzima Asp700, che
ha un sito di restrizione sul prodotto di amplificazione del cromosoma sessuale W. I prodotti di
PCR, dopo preliminare lettura elettroforetica, vengono digeriti con un enzima per volta
(HaeIII=5U; Asp700=2,5U) in un volume finale di 20 µl contenenti 17,5 µl di prodotto di
amplificazione. Dopo 3 ore di incubazione, a 37°C, viene effettuata la lettura dei campioni,
mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2%, colorazione con Etidio Bromuro e visualizzazione in
luce UV.
Con la metodica PCR-RFLP la diagnosi di sesso risulta agevole in quanto, dopo separazione dei
digeriti su gel di agarosio, vengono ottenuti nel caso dei soggetti di sesso femminile, con entrambi
gli enzimi, tre bande con dimensioni comprese, nelle diverse specie, tra 370/400 paia di basi (bp)
(banda grande), 310/340 bp (banda media) e 50/80 bp (banda piccola). Nei soggetti di sesso
maschile, invece, si ottengono due bande con dimensioni comprese tra 310/340 paia di basi (bp)
(banda grande) e 50/80 bp (banda piccola) nelle specie sensibili all’enzima HaeIII, ed una banda
(370/400 bp), nelle specie sensibili all’enzima Asp700.
Con l’enzima HaeIII possono essere sessati, mediante PCR-RFLP, ad esempio, esemplari di Aquila
reale (Aquila chrysaetos), Aquila rapace (Aquila rapax rapax), Aquila di mare codabianca
(Haliaeetus albicilla albicilla), Gufo reale (Bubo bubo), Gufo comune (Asio otus), Gufo della
Virginia (Bubo virginianus subarticus), Poiana di Harris (Parabuteo unicinctus) e Nibbio reale
(Milvus milvus), mentre con l’enzima Asp700 possono essere sessati soggetti di Civetta (Athene
noctua) e di Grillaio (Falco naumanni). Nel corso dei protocolli specie-specifici di ricerca per la
definizione e la validazione delle metodiche genetiche di sessaggio da piuma e/o membrana
testacea, preliminari e propedeutici all’applicazione in campo, per tutti gli individui (Gruppi
Controllo) c’è stata concordanza tra i risultati relativi al sesso determinato mediante
l’amplificazione del DNA e le peculiarità morfofunzionali riproduttive individuali (Costantini et al.,
2006b; Costantini et al., 2007; Costantini et al., 2008b; Costantini et al., 2009a, Costantini et al.,
2009b, Costantini et al., 2009c). L’attivazione di una banca operativa del DNA, estratto dai
campioni di piuma, è stata definita in funzione di possibili ulteriori applicazioni biotecnologiche
genetiche (stima della consanguineità, analisi di paternità). In indagini preliminari di sessaggio
genetico da piuma, il Capovaccaio (n=15) (Costantini et al., 2009b,c) è risultato responsivo alla
metodica di base (PCR).
Si prevedono pertanto nelle specie prioritarie di rapaci, in funzione degli obiettivi dell’azione B2
del Progetto, in particolare Capovaccaio e Lanario, ulteriori attività di ricerca per la definizione
delle metodiche genetiche di sessaggio genetico da piuma, con comparazione dei risultati ottenuti
nel Capovaccaio ed in altre specie di Avvoltoi del Vecchio Mondo, e da membrana testacea (uovo)
per la determinazione neonatale del sesso nei pulli a partire dal primo giorno di vita, al fine di
rendere operativo in queste specie prioritarie il nuovo strumento diagnostico in funzione della
adeguata formazione delle coppie di riproduttori e della possibilità di una determinazione molto
precoce del sesso, a partire dalla prima settimana di vita, per tecniche differenziate e mirate di
assistenza pediatrica dei giovani esemplari (captive born).
I risultati positivi ottenuti inoltre fanno intavedere la possibilità dell’inserimento in una banca
specie-specifica del DNA estratto, da campioni di piume e/o membrana testacea durante la fase
esecutiva della sottoazione e nel corso delle attività in campo sul sessaggio genetico, nella
prospettiva di ulteriori applicazioni biotecnologiche genetiche (stima della consanguineità, analisi
di paternità, filogenesi molecolare). Le tecniche chirurgiche e le indagini collaterali non invasive
(ecografia gonadica, titolazione steroidi fecali), potranno trovare eventuale applicazione, nel corso
del programma di allevamento e riproduzione assistita delle specie prioritarie indicate, in entrambi i
sessi, per la diagnosi di infertilità o ipofertilità in base a valutazione clinica individuale.
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Azione B.2
1.4.5.3 Infertilità da stress - Nell’ambito della sottoazione B.2 il Progetto prevede la possibilità di
applicare in campo e definire terapie farmacologiche mirate e posologie specifiche, per le specie
prioritarie in allevamento (captive brreding), della infertilità da stress con deficit neuroendocrino.
Nelle specie protette dell’avifauna selvatica allevate in ambiente controllato fattori stressogeni
multifattoriali possono interferire negativamente con la funzionalità riproduttiva determinando
infertilità e/o ipofertilità sia maschile che femminile (impotentia generandi), con blocco della
deposizione di uova o, comunque, con nascita di un numero molto ridotto di pulli,.
In allevamento, dunque, pur ottimizzando la gestione dell’ambiente, dell’alimentazione e lo stato
sanitario, lo stress da cattività può interferire significativamente sulla attività riproduttiva soprattutto
in individui con imprinting regolare (wild born), ed il successo riproduttivo non sempre è ottenuto.
Le metodiche di selezione genetica che hanno permesso, nelle specie avicole di interesse zootecnico
(galline ovaiole, tacchini, anatre, oche), di aumentare la produttività con una più elevata
deposizione di uova non trovano ovviamente applicazione nella riproduzione dell’avifauna selvatica
protetta. Nei mammiferi domestici e nell’Uomo il condizionamento farmacologico riproduttivo è
una realtà ormai ben consolidata, mentre attualmente non sono ancora registrati farmaci specifici
per l’induzione, in ambiente controllato, della riproduzione dell’avifauna selvatica e/o per la terapia
della infertilità da deficit ipotalamico (infertilità sine materia).
Da oltre un venticinquennio, presso l’Università degli Studi di Bari, sono in corso studi sulla
biologia riproduttiva di varie specie dell’avifauna selvatica protetta indigena ed esotica con la
individuazione di una nuova ed originale metodica farmacologica in grado di indurre il ripristino
della attività gonadica, sia nel maschio che nella femmina, quiescenti dal punto di vista riproduttivo,
per stress o comunque per deficit neuroendocrino di origine ipotalamica, con ripristino della
gametogenesi in entrambi i sessi, deposizione di uova e nascita di pulli vivi e vitali. Le prime
ricerche realizzate a partire dagli anni ’80 evidenziarono la possibilità di ottenere, in numerose
specie di Fasianidi, il ripristino della attività gonadica e la deposizione di uova con nascita di pulli
vivi e vitali anche al di fuori della stagione naturale di riproduzione, durante l’intervallo di pausa
fisiologica (autunno-inverno), mediante la somministrazione di analoghi del GnRH, il fattore
ipotalamico di liberazione delle gonadotropine ipofisarie, in associazione all’aumento artificiale del
fotoperiodo. Nei primi studi la somministrazione di GnRH esogeno (per via intramuscolare,
endovenosa o endonasale) veniva ripetuta nei soggetti più volte al giorno per garantire le
concentrazioni terapeutiche efficaci del farmaco ed ottenere gli effetti desiderati relativi alla attività
riproduttiva. La metodica iniziale ha trovato diffusione limitata in campo in quanto di non agile
applicazione, sia per gli operatori che per le specie di alto pregio biologico particolarmente sensibili
allo stress da ripetuto contenimento.
I programmi di ricerca hanno portato, nel decennio scorso, ad una evoluzione della metodica
farmacologica con la possibilità, mediante somministrazione unica o una tantum e posologia
specie-specifica, di una nuova ed originale preparazione farmacologica di GnRH a lento rilascio
(GnRH slow-release) in grado di indurre, in ambiente controllato, il ripristino della attività gonadica
in soggetti in quiescenza riproduttiva, fisiologica o patologica, con regolare deposizione di uova,
nascita di pulli vivi e vitali e cure parentali tipiche di specie. I risultati relativi ad innocuità ed
efficacia sono stati ottenuti, mediante la nuova preparazione farmacologica, in soggetti in pausa
riproduttiva nel corso di programmi di ricerca realizzati, in fase preliminare, su specie modello
come il Pappagallino ondulato (Melopsittacus undulatus), presso il Dipartimento di Produzione
Animale dell’Università deglu Studi di Bari, e il Fagiano colchico (Phasianus colchicus), presso
l’Osservatorio Faunistico Regionale a Bitetto della Regione Puglia. Le esperienze sono state estese
successivamente presso ulteriori Centri di riproduzione pubblici e privati anche in specie prioritarie
di Falconiformi, Psittaciformi e Passeriformi con risultati positivi e ripristino della normale
gametogenesi in soggetti, sia maschi che femmine, in quiescenza riproduttiva patologica
diagnosticata da preliminari indagini non invasive (ecografia gonadica).
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Azione B.2
Il Progetto prevede, in fase esecutiva nell’ambito della sottoazione B.2, la possibilità di interventi di
condizionamento farmacologico con la nuova ed originale preparazione farmacologica di GnRH in
individui di specie ‘modello’ mirate, in pausa riproduttiva, in funzione di test di innocuità ed
efficacia delle specie prioritarie ‘target’ (Lanario, Capovaccaio ed altri Rapaci), in eventuale
condizione di infertilità persistente sine materia nonostante la ottimizzazione dell’ambiente
(voliere), dell’alimentazione e dello stato sanitario, per la definizione di schemi posologici speciespecifici. La formulazione di GnRH a lento rilascio (GnRH slow-release) messa a punto e preparata
fa intravedere, pertanto, nell’ambito delle attività progettuali previste di conservazione ex situ e di
riproduzione assistita delle specie avifaunistiche protette, rilevanti prospettive e possibilità
applicative per la terapia di forme di infertilità da deficit ipotalamico sia nella femmina che nel
maschio (impotentia generandi).
1.4.5.4 Infertilità da assenza di accoppiamento – Il Progetto prevede, nell’ambito della
sottoazione B.2, attività clinica e di ricerca sulla definizione specie-specifica di metodiche
diagnostiche e terapeutiche innovative per alcune forme di infertilità della coppia caratterizzate da
impossibilità o incapacità di accoppiamento, nonostante la presenza, in entrambi i sessi, di una
regolare attività gametogenetica con produzione adeguata di gameti (spermatozoi, uova).
La impotentia coeundi di soggetti adulti di specie dell’avifauna selvatica nati in cattività è
multifattoriale e spesso legata a patologie comportamentali causate da una non idonea gestione del
processo di imprinting, durante lo svezzamento, nelle prime settimane dopo la nascita, mentre le
gravi patologie biomeccaniche (ali, zampe) possono interferire negativamente sul successo
dell’accoppiamento negli esemplari wild-born. In questi casi la riproduzione assistita mediante
tecniche di inseminazione artificiale (AI) può essere risolutoria. Da tempo sono in corso programmi
di ricerca ed attività in campo per uno studio della biologia riproduttiva del maschio in specie
avifaunistiche modello e prioritarie (Rapaci), in funzione della definizione di efficaci tecniche di
inseminazione artificiale e crioconservazione del liquido seminale, a temperatura di
refrigerazione e di congelamento. In collaborazione con Enti pubblici e privati recenti ricerche
hanno permesso di ottenere risultati positivi con la nascita di pulli vivi e vitali mediante tecniche di
raccolta, valutazione del liquido seminale e inseminazione artificiale nel Fagiano colchico
(Phasianus colchicus) e nel Colombo viaggiatore (Columba livia). Le esperienze maturate e
consolidate nell’ambito delle ricerche su queste specie modello hanno reso possibile, mediante le
tecniche di riproduzione assistita, la nascita di pulli vivi e vitali anche in specie di maggiore pregio
biologico come la Maina (Gracula religiosa), nota ai pochi allevatori specializzati presenti a livello
internazionale, per i frequenti problemi di infertilità e ipofertilità che la specie presenta in ambiente
controllato.
Si prevede, nel corso del Progetto in fase esecutiva, l’applicazione di tecniche di prelievo e
valutazione quali-quantitativa di liquido seminale, anche eventualmente di tipo computerizzato
(Computer Aided Sperm Analyzer), e la possibilità di metodiche di di crioconservazione
(refrigerazione, congelamento) ed inseminazione artificiale, con extenders innovativi, in specie
‘modello’ funzionali rispetto a specie ‘prioritarie’ in allevamento ((Lanario, Capovaccaio ed altri
Rapaci) nella prospettiva di realizzare una banca del seme specie-specifica per ulteriori programmi
di conservazione ex situ in collaborazione con Centri di Specie Minacciate nazionali e
internazionali.
1.4.5.6 Tecniche di incubazione artificiale e di assistenza pediatrica (pulli)
Nei piani di conservazione integrata dell’avifauna selvatica protetta le metodiche di incubazione
artificiale delle uova, assistenza pediatrica dei pulli e rilascio in natura (hacking, direct fostering,
cross fostering) di giovani individui nati in ambiente controllato sono risultate efficaci per alcune
specie ‘prioritarie’ di Falconiformi (Frey & Walter, 1989) Ceccolini et al., 2007). Nell’ambito di
indagini preliminari di ricerca sulle tecniche di assistenza neonatale e rilascio del Grillaio (Falco
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Programma di attività scientifica di ricerca
Azione B.2
naumanni) in Puglia, pulli nati mediante incubazione artificiale di uova raccolte da nidi naturali
privi di cure parentali (Osservatorio Faunistico in Bitetto - Ba, Regione Puglia), sono stati adottati
da coppie adulte naturali (direct fostering), in nidi artificiali. Allevati da operatori (hand-rearing),
sin dalla schiusa, in Unità di Terapia Intensiva, i pulli, sono stati trasferiti, all’età di 13-15 giorni,
muniti di anelli di identificazione, nei siti di rilascio dell’areale storico della Murgia barese
(Gravina in Puglia, Altamura), in nidi artificiali (LIPU) con nidiate compatibili per numero, peso ed
età dei pulli. Gli interventi di rilascio, monitorati anche mediante videocontrollo, hanno avuto esito
positivo con attività comportamentali ed involo dei pulli, all’età di 34-35 giorni, tipici degli Grillai
selvatici. La sensibilizzazione delle popolazioni locali alle tematiche di conservazione delle specie
prioritarie, ha contribuito in Puglia, nel periodo 2007-2008, al recupero ed alla riabilitazione di pulli
(n=376) di Grillaio, nati nei centri urbani in ambiente naturale (wild-hatched) e di età compresa tra i
15-20 giorni, in difficoltà in quanto privi di cure parentali e in diversificato stato di iponutrizione,
presumibilmente per ridotta disponibilità trofica ambientale. I giovani sono stati allevati ed
alimentati (captive-reared), presso l’Osservatorio Faunistico Regionale, evitando ripetuti contatti
diretti con gli operatori e nel rispetto delle peculiarità sanitarie e bioetologiche specie-specifiche,
con rilascio all’età di 45-60 giorni in areali storici della specie, ad autonomia alimentare ed
attitudine all’involo acquisiti, per l’incremento di nuclei di popolazione naturale a bassa densità
(Costantini & Lacalandra, 2009). In base ai risultati preliminari degli interventi di rilascio del
Grillaio in Puglia ad esito positivo si prevedono, nell’ambito della sottoazione B.2 del Progetto,
ulteriori attività di ricerca applicata di incubazione artificiale ed assistenza pediatrica in specie
modello e specie prioritarie di rapaci diurni e notturni per la validazione delle metodiche speciespecifiche di riproduzione assistita (parent rearing, hand rearing, puppet rearing) in funzione del
rilascio in ambiente naturale (hacking, fostering) e monitoraggio mirato degli esemplari liberati per
lo sviluppo di studi sull’autonomia alimentare post-involo, sull’attitudine alla migrazione verso gli
areali di svernamento e di ritorno nei siti di rilascio, ed eventualmte sulla performance riproduttiva
degli esemplari captive-born in ambiente naturale.
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