Quantificazione dell`RNA dell`HIV-1

Transcript

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test,
version 1.5
HIM
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
Informazioni sugli ordini COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR Test, version 1.5
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
HIM
48 Tests P/N: 21118390 123
ART: 11 1839 0
US: 83369
WB
500 Tests P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
Uso previsto
Il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, versione 1.5 (v1.5) è un test di
amplificazione in vitro dell'acido nucleico, destinato alla quantificazione
dell'RNA del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) nel plasma
umano per mezzo dell'analizzatore COBAS® AMPLICOR®. Il test è in grado di
quantificare l'RNA dell'HIV-1 entro la gamma da 50 a 750.000 copie/ml,
combinando due procedure di preparazione dei campioni, la procedura standard e
quella ultrasensibile.
Il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 non è inteso né come test
di screening della presenza dell'HIV-1 nel sangue e negli emoderivati, né come
test diagnostico per la conferma dell'infezione da HIV-1.
8/2009, Revision 8.0
COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5
1/53
P/N: 03005585 050
Questo test è destinato a fungere, assieme alla presentazione clinica e ad altri
marker di laboratorio, da indicatore della prognosi della malattia, coadiuvando la
gestione clinica dei pazienti infetti da HIV-1. Il test può essere usato sia per
valutare la prognosi dei pazienti, grazie alla misurazione del livello di RNA
dell'HIV-1 di riferimento, che per monitorare gli effetti della terapia
antiretrovirale, espressi come variazione dei livelli dell'RNA dell'HIV-1
plasmatico nel corso del trattamento. I livelli di RNA dell'HIV-1 misurati tramite
PCR (Polymerase Chain Reaction o reazione a catena della polimerasi) hanno
funto da marker surrogati ai fini del processo accelerato di approvazione dell'FDA
statunitense dei farmaci inibitori della proteasi INVIRASE (saquinavir mesilato),
CRIXIVAN® (indinavir solfato), NORVIR® (ritonavir) e FORTOVASE
(saquinavir); dei farmaci non nucleosidi inibitori della transcrittasi inversa
VIRAMUNE® (nevirapina), SUSTIVA® (efavirenz) e ZIAGEN® (abacavir); e del
farmaco inibitore della transcrittasi inversa EPIVIR® (lamivudina).
Riassunto e spiegazione del test
Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) è l'agente eziologico della sindrome
da immunodeficienza acquisita (AIDS)1-3. Il virus può essere trasmesso attraverso
il rapporto sessuale, il contatto con sangue o con emoderivati infetti, oppure da
una madre HIV positiva al feto4. Da tre a sei settimane dopo l'esposizione al virus
HIV, l'infezione si manifesta con sintomi pseudoinfluenzali che caratterizzano la
breve sindrome acuta e che sono accompagnati da alti livelli di viremia nel sangue
periferico5-8. Nella maggior parte dei soggetti infetti da HIV subentra dopo
quattro-sei settimane dall'inizio dei sintomi, una risposta immunitaria specifica nei
confronti del virus che porta ad una diminuzione della viremia plasmatica9,10. Di
solito, dopo la sieroconversione, i soggetti HIV-positivi entrano in una fase clinica
stabile, asintomatica che può durare per anni11-13. Il periodo asintomatico è
caratterizzato da concentrazioni virali plasmatiche persistentemente basse14 e da
una graduale diminuzione dei linfociti CD4+ T, che provoca immunodeficienza
grave, infezioni opportunistiche multiple, tumori maligni e decesso15. Sebbene le
concentrazioni virali nel sangue periferico siano relativamente basse durante la
fase asintomatica dell'infezione, la replica e la clearance virale sembrano costituire
un processo dinamico, nel quale l'elevata velocità di riproduzione virale e di
infezione delle cellule CD4+ è controbilanciata da una velocità altrettanto elevata
di clearance virale, morte delle cellule infettate e sostituzione con nuove cellule
CD4+, producendo livelli relativamente stabili di viremia e cellule CD4+16-18.
Le determinazioni quantitative della viremia da HIV nel sangue periferico
indicano che le concentrazioni virali più elevate sono correlate ad un rischio
maggiore di progressione clinica della malattia, mentre le diminuzioni delle
concentrazioni virali sono associate ad un rischio inferiore19-21. Le concentrazioni
di plasma virali nel sangue periferico possono essere quantificate mediante la
determinazione dell'antigene p24 dell'HIV nel siero, le colture di plasma per la
determinazione quantitativa dell'HIV, oppure la misurazione diretta dell'RNA
virale nel plasma secondo le tecniche di amplificazione dell'acido nucleico o di
amplificazione del segnale22-26.
L'antigene p24 è la proteina principale del core dell'HIV e si trova nel siero in
forma libera oppure legata ad un anticorpo anti-p24. L'antigene p24 libero può
essere misurato tramite test immunoenzimatici (EIA) disponibili in commercio;
tuttavia l'utilità dell'antigene p24 quale marker della carica virale è limitata, in
quanto l'antigene è rilevabile soltanto nel 20% dei pazienti asintomatici e nel
40-50% dei pazienti sintomatici. Le tecniche di dissociazione dei complessi
antigene-anticorpo migliorano la sensibilità dei test per la determinazione
dell'antigene p24, tuttavia questo antigene rimane irrilevabile nella maggior parte
dei pazienti asintomatici22.
L'HIV infettivo nel plasma può essere coltivato inoculandolo in cellule
mononucleate attivate del sangue periferico (PBMC), prelevate da soggetti sani.
La quantificazione si ottiene inoculando in queste cellule diluizioni seriali di
campioni di plasma. L'utilità di queste colture per il monitoraggio delle
concentrazioni virali nei pazienti HIV positivi è limitata, in quanto soltanto una
piccola frazione di particelle virali è infettiva in vitro. Spesso non è possibile
rilevare il virus infettivo in soggetti asintomatici22.
L'RNA dell'HIV nel plasma può essere quantificato mediante le tecniche di
amplificazione dell'acido nucleico, quali la PCR27-29. Il test COBAS®
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 utilizza la tecnica PCR che offre la
massima sensibilità e la massima gamma dinamica di rilevazione quantitativa
dell'RNA dell'HIV-1 nel plasma, anticoagulato con EDTA o ACD24.
2/53
HIV-1 MONITOR
Principio della procedura
Il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 prevede cinque fasi
principali: preparazione dei campioni; trascrizione inversa dell'RNA bersaglio per
generare un DNA complementare (cDNA)30, amplificazione mediante PCR del
cDNA target usando primer complementari specifici all'HIV-130; ibridazione del
prodotto amplificato con sonde oligonucleotidiche specifiche al target; rilevazione
del prodotto amplificato legato alla sonda mediante determinazione colorimetrica.
Il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 svolge contemporaneamente la trascrizione inversa e l'amplificazione mediante PCR dell'RNA virale
dell'HIV-1 e dell'RNA dello standard di quantificazione dell'HIV-1. Il reagente
Master Mix contiene un paio di primer specifici all'acido ribonucleico dell'HIV-1 e
dello standard di quantificazione. Questo reagente è stato sviluppato per ottenere
una quantificazione equivalente dei sottotipi del gruppo M dell'HIV-1. Non sono
state determinate le prestazioni del test per campioni del gruppo O.
La quantificazione dell'RNA dell'HIV-1 si ottiene con lo standard di
quantificazione HIV-1, un RNA trascritto non infettivo, con siti di legame per il
primer identici a quelli della regione target dell'RNA dell'HIV-1 e con una regione
specifica alla sonda che consente di distinguere l'amplicon dello standard di
quantificazione dall'amplicon dell'HIV-1. Un numero noto di copie di RNA dello
standard di quantificazione viene incorporato in ciascun campione singolo e
sottoposto alle fasi di preparazione, trascrizione inversa, amplificazione PCR,
ibridazione e rilevazione del campione assieme all'HIV-1 target ed amplificato
assieme ad esso. L'analizzatore COBAS® AMPLICOR® calcola la concentrazione
di RNA dell'HIV-1 nei campioni mettendo a confronto il segnale dell'HIV-1 e
quello dello standard di quantificazione di ciascun campione.
Lo standard di quantificazione compensa gli effetti dell'inibizione e controlla il
processo di amplificazione in modo da consentire una quantificazione accurata
dell'RNA dell'HIV-1 in ciascun campione.
Preparazione dei
campioni
Il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 può essere usato
indifferentemente con due procedure di preparazione dei campioni, quella standard
o quella ultrasensibile. La preparazione standard dei campioni prevede l'isolamento
diretto dell'RNA dell'HIV-1 dal plasma tramite lisi delle particelle virali con un
agente caotropo e la successiva precipitazione dell'RNA con alcool. La
preparazione ultrasensibile richiede la concentrazione iniziale delle particelle virali
dell'HIV-1 tramite centrifugazione ad alta velocità, seguita dalla lisi delle particelle
stesse con un agente caotropo e la successiva precipitazione dell'RNA dell'HIV-1
con alcool. Ad ogni campione viene addizionato il reagente di lisi e un numero noto
di molecole di RNA dello standard di quantificazione. Lo standard di
quantificazione viene preparato, soggetto a trascrizione inversa, amplificato e
rilevato assieme al campione da analizzare e serve per quantificare l'RNA
dell'HIV-1 presente nel campione.
3/53
Transcrizione inversa
ed amplificazione
mediante PCR
Selezione del target
La scelta di una sequenza target dell'RNA dell'HIV-1 dipende dall'identificazione
di regioni del genoma dell'HIV-1 che presentano il massimo grado di
conservazione di sequenza. Pertanto l'adeguata scelta dei primer e della sonda è
cruciale ai fini dell'identificazione del genotipo dell'HIV-1. Il test AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5 utilizza i primer SK145 e SKCC1B per definire una
sequenza di 155 nucleotidi nella regione altamente conservata del gene gag
dell'HIV-131. La regione gag codifica gli antigeni specifici del gruppo, ovvero le
proteine strutturali del core del virione. I geni gag dell'HIV-1 consistono
generalmente in circa 1500 nucleotidi e sono localizzati nelle posizioni
approssimate 789-2290 del genoma virale. La sequenza nucleotidica dei primer è
stata ottimizzata per poter amplificare in modo equivalente i sottotipi del gruppo
M del virus HIV-1.
Trascrizione inversa
Le reazioni di trascrizione inversa e di amplificazione tramite PCR vengono
svolte tramite polimerasi del DNA dell'enzima ricombinante termostabile
Thermus thermophilus (rTth pol). In presenza di manganese e nelle appropriate
condizioni di tamponatura, la rTth pol induce l'attività sia di trascrittasi inversa
che di polimerasi del DNA30. Ciò consente la trascrizione inversa e
l'amplificazione PCR nella stessa miscela di reazione.
I campioni trattati vengono addizionati alla miscela di amplificazione nelle
provette di amplificazione (provette A) dove ha luogo sia la trascrizione inversa
che la reazione PCR. Il primer a valle o antiparallelo (SKCC1B) e ed il primer a
monte o parallelo (SK145) vengono biotinilati nelle posizioni 5' terminali. La
miscela di reazione viene riscaldata per consentire al primer a valle di appaiarsi in
modo specifico all'RNA dell'HIV-1 sia del target che dello standard di
quantificazione. In presenza di Mn2+ e di un eccesso di trifosfati desossinucleosidi
(dNTP), comprendenti trifosfati di desossiadenosina, desossiguanosina,
desossicitidina, desossiuridina e deossitimidina, l'rTth pol estende il primer
appaiato, formando un filamento di DNA (cDNA) complementare all'RNA target.
Amplificazione del target
Dopo la trascrizione inversa dell'RNA dell'HIV-1 del target e dello standard di
quantificazione, la miscela di reazione viene scaldata per denaturare l'ibrido
RNA:cDNA ed esporre le sequenze target dei primer. Man mano che la miscela si
raffredda, il primer a monte o parallelo (SK145) si appaia in modo specifico al
filamento di cDNA, la rTth pol estende il primer e viene sintetizzato un secondo
filamento di DNA. Ciò completa il primo ciclo della PCR, producendo una copia
di DNA a doppio filamento della regione target dell'RNA dell'HIV-1 e dell'RNA
dello standard di quantificazione. La miscela di reazione viene riscaldata un'altra
volta per separare il risultante DNA a doppio filamento e per esporre le sequenze
target dei primer. Man mano che la miscela si raffredda, i primer SK145 ed
SKCC1B si appaiano al DNA target. La rTth pol, in presenza di Mn2+ e di un
eccesso di dNTP, estende i primer appaiati lungo gli stampi target, producendo
una molecola di DNA a doppio filamento di paia a base 155, detta amplicon.
L'analizzatore COBAS® AMPLICOR® ripete automaticamente questo processo
per un certo numero di cicli; praticamente raddoppiando la quantità di amplicon
ad ogni ciclo. L'amplificazione si verifica solamente nella regione del genoma
dell'HIV-1 delimitata dai primer; senza amplificare l'intero genoma dell'HIV-1.
4/53
HIV-1 MONITOR
Amplificazione selettiva
Il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 consegue l'amplificazione
selettiva dell'acido nucleico target dei campioni grazie all'uso dell'enzima AmpErase
(uracil-N-glicosilasi) e di trifosfato di desossiuridina (dUTP). L'enzima AmpErase
riconosce e catalizza la reazione di distruzione dei filamenti di DNA contenenti
desossiuridina32, ma non del DNA contenente desossitimidina. La desossiuridina
non è presente nel DNA naturale, però è sempre presente nell'amplicon, a causa della
presenza del trifosfato di desossiuridina nel reagente Master Mix. Di conseguenza,
solamente l'amplicon contiene desossiuridina.
La presenza di deossiuridina nell'amplicon contaminante lo rende suscettibile alla
distruzione da parte dell'enzima AmpErase prima dell'amplificazione del DNA
target. L'enzima AmpErase, contenuto nel reagente Master Mix, catalizza la
dissociazione del DNA contenente deossiuridina a livello dei residui di
deossiuridina, aprendo la catena di deossiribosi nella posizione C1. Una volta
riscaldata durante la prima fase del ciclo termico (in presenza del pH alcalino di
Master Mix), la catena di DNA dell'amplicon si spezza in corrispondenza alla
posizione della deossiuridina, rendendo il DNA non amplificabile. L'enzima
AmpErase è inattivo a temperature superiori a 55°C (cioè durante tutte le fasi del
ciclo termico) e perciò non distrugge l'amplicon target.
Dopo l'amplificazione, qualsiasi enzima residuo viene denaturato tramite addizione
della soluzione di denaturazione, impedendo così la degradazione dell'amplicon
target. L'enzima AmpErase nel test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR,
v1.5 è stato dimostrato capace di disattivare almeno 103 copie di amplicon virale
contenente desossiuridina per ogni reazione PCR.
Reazione di ibridazione
Dopo l'amplificazione mediante PCR, l'analizzatore COBAS® AMPLICOR®
addiziona automaticamente la soluzione di denaturazione nelle provette A per
denaturare chimicamente l'amplicon dell'HIV-1 e dello standard di quantificazione
HIV-1, formando DNA a filamento unico. Per ottenere risultati quantitativi
all'interno di un ampio intervallo dinamico, l'analizzatore COBAS® AMPLICOR®
diluisce in serie l'amplicon denaturato nelle provette di rilevazione (coppette D). Una
sospensione di particelle magnetiche ricoperte con una sonda oligonucleotidica
specifica all'amplicon dell'HIV-1 (SK102) o dello standard di quantificazione HIV-1
(CP35) viene addizionata rispettivamente a ciascuna delle quattro diluizioni
dell'amplicon dell'HIV-1 o a ciascuna delle due diluizioni dell'amplicon dello
standard di quantificazione. L'amplicon marcato con biotina si lega alle particelle
magnetiche tramite ibridazione con le sonde oligonucleotidiche specifiche al target.
Ciascuna determinazione quantitativa richiede quattro misurazioni indipendenti
dell'assorbanza usando la sospensione delle sonde per l'HIV-1 e due misurazioni
dell'assorbanza usando la sospensione delle sonde per lo standard di quantificazione
dell'HIV-1.
Reazione di rilevazione
Dopo la reazione di ibridazione, l'analizzatore COBAS® AMPLICOR® lava le
particelle magnetiche nelle provette di rilevazione (coppetta D) per rimuovere il
materiale non legato e quindi aggiunge un coniugato di avidina-perossidasi di
rafano (Av-HRP). Tale coniugato si lega all'amplicon biotinilato ed ibridato con le
sonde oligonucleotidi specifiche al target, legate alle particelle magnetiche.
L'analizzatore COBAS® AMPLICOR® rimuove il coniugato non legato, lavando
le particelle magnetiche, e poi addiziona in ciascuna coppetta D una soluzione di
substrato contenente acqua ossigenata e 3,3',5,5' tetrametilbenzidina (TMB). In
presenza di acqua ossigenata, la perossidasi di rafano legata alle particelle
catalizza l'ossidazione della TMB, formando un complesso colorato, la cui
assorbanza viene misurata dall'analizzatore COBAS® AMPLICOR® a una
lunghezza d'onda di 660 nm.
5/53
Quantificazione dell'RNA dell'HIV-1
Il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 quantifica l'RNA del
virus HIV-1 grazie all'addizione al campione da analizzare di una seconda
sequenza target (lo standard di quantificazione dell'HIV-1) che viene addizionata
in concentrazione nota. Lo standard di quantificazione dell'HIV-1 è un RNA di
233 nucleotidi, trascritto in vitro, non infettivo e con regioni di legame per i
primer identiche a quelle della sequenza target dell'HIV-1. Lo standard di
quantificazione contiene siti di legame per i primer SK145 e SKCC1B, dando
origine ad un amplificato che è identico all'RNA target dell'HIV-1 sia in termini di
lunghezza (155 basi) che di composizione di basi. La regione dell'amplicon dello
standard di quantificazione che si lega alla sonda è stata modificata per poter
distinguere l'amplicon dello standard di quantificazione da quello dell'HIV-1.
All'interno della gamma lineare del test, l'assorbanza a 660 nm (A660) di ciascuna
provetta di rivelazione è proporzionale alla quantità ivi presente di amplicon
dell'HIV-1 o dello standard di quantificazione. L'analizzatore COBAS®
AMPLICOR® calcola l'assorbanza totale dell'HIV-1 e dello standard,
moltiplicando l'assorbanza della provetta di rivelazione per il fattore di diluizione
dell'amplicon, per poi selezionare la provetta che presenta la massima assorbanza
totale. L'assorbanza totale calcolata è proporzionale alla quantità di RNA
dell'HIV-1 o dello standard presente in ogni reazione di trascrizione
inversa/amplificazione PCR. La quantità di RNA dell'HIV-1 in ciascun campione
viene calcolata in base al rapporto tra l'assorbanza totale dell'HIV-1 e quella dello
standard di quantificazione dell'HIV-1, moltiplicato per il numero di molecole di
RNA dello standard di quantificazione secondo la seguente equazione:
HIV-1
[ A Atotale
totale QS ]
AF
laddove,
6/53
x Copie di QS dell'HIV-1/PCR x Fattore di diluizione del campione = Copie di RNA dell'HIV-1/ml
A totale HIV-1 = Assorbanza totale calcolata per l'amplicon dell'HIV-1
A totale QS = Assorbanza totale calcolata per l'amplicon dello
standard di quantificazione
Copie di QS dell'HIV-1/PCR = Numero di copie dello standard di quantificazione in
ogni reazione; questo dato è specifico ad ogni lotto
Fattore di diluizione del campione = Fattore di conversione delle copie/PCR in copie/ml
AF = Fattore di correzione, usato per standardizzare i risultati
del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR v1.5
in termini di risultati del test AMPLICOR® HIV-1
MONITOR v1.5 (fattore di correzione = 1,11).
Fattore di diluizione del campione = 40 (per la procedura standard di preparazione dei
campioni)
Fattore di diluizione del campione = 4 (per la procedura ultrasensibile di preparazione dei
campioni)
HIV-1 MONITOR
Reagenti
COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR Test,
version 1.5
Reagenti di preparazione
dei campioni
HIM
48 Test P/N: 21118390 123
ART: 11 1839 0
US: 83369
HIM PREP
HIV-1 LYS
(Reagente di lisi HIV-1 MONITOR)
Tampone di tris-HCl
68% Tiocianato di guanidina
3% Ditiotreitolo
< 1% Glicogeno
68% Tiocianato di guanidina (p/p)
+
Xn
4 x 9,0 ml
Nocivo
HIV-1 QS, v1.5
4 x 0,1 ml
(Standard di quantificazione HIV-1 MONITOR, versione 1.5)
< 0,001% RNA (batterico) trascritto in vitro, non infettivo,
contenente sequenze di legame per il primer dell'HIV-1
e una regione specifica di legame con la sonda
< 0,005% Poli rA RNA (di sintesi)
EDTA
0,05% Sodio azide
HIV-1 DIL
(Diluente del campione HIV-1 MONITOR)
Tampone di tris-HCl
EDTA
0,05% Sodio azide
Reagenti di controllo
4 x 4,8 ml
HIM CTL
NHP
4 x 1,6 ml
[Plasma (umano) negativo]
Plasma umano, definito non immunoreattivo mediante test
autorizzati dall'FDA per la determinazione degli anticorpi
anti-HCV, anti-HIV-1/2 e degli antigeni HIV p24 ed HBsAg;
non è stata rilevata la presenza dell'RNA dell'HIV-1,
dell'RNA dell'HCV o del DNA dell'HBV mediante PCR
in gruppi di unità di sangue di donatori; non è stata rilevata
la presenza di anticorpi centrali anti-HBV in gruppi di unità
di sangue di donatori mediante test autorizzati dall'FDA
0,1% conservante ProClin® 300
7/53
4 x 0,05 ml
HIV-1 (–) C
[Controllo HIV-1 (–)]
EDTA
0,05% Sodio azide
HIV-1 L(+)C
4 x 0,05 ml
[Controllo HIV-1 MONITOR (+) basso]
< 0,001% RNA (microbico) trascritto in vitro, non infettivo,
contenente sequenze HIV-1
EDTA
0,05% Sodio azide
HIV-1 H(+)C
4 x 0,05 ml
[Controllo HIV-1 MONITOR (+) alto]
< 0,001% RNA (microbico) trascritto in vitro, non infettivo,
contenente sequenze HIV-1
EDTA
0,05% Sodio azide
Reagenti di amplificazione
HIM AMP
HIV-1 MMX, v1.5
4 x 0,7 ml
(Master Mix HIV-1 MONITOR, versione 1.5)
Tampone di bicina
Glicerolo
< 0,01% Polimerasi del DNA di rTth (rTth pol, batterica)
Acetato di potassio
< 0,07% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP
< 0,001% Primer SKCC1B e SK145, biotinilati
< 0,01% enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasi, batterico)
0,05% Sodio azide
HIV-1 Mn2+, v1.5
(Soluzione di manganese HIV-1 MONITOR, versione 1.5)
< 2% Manganese
Acido acetico
Colorante amaranto
0,05% Sodio azide
Reagenti specifici di rilevazione
HIM DK
AD3
(Reagente di diluizione dell'amplicon)
EDTA
0,8% Idrossido di sodio
2 x 75 Test
0,8% Idrossido di sodio (p/p)
+
Xi
4 x 0,1 ml
Irritante
8/53
HIV-1 MONITOR
IM PS1, v1.5
2 x 100 Test
(Sonda HIV-1 MONITOR, sospensione 1, versione 1.5)
Tampone MES
< 0,01% Sospensione di Dynabeads® (particelle paramagnetiche)
ricoperte con sonda SK102 di cattura oligonucleotidica specifica
all'HIV-1
0,09% Sodio azide
IM4, v1.5
(Sonda HIV-1 MONITOR, sospensione 2, versione 1.5)
Tampone di fosfato di sodio
< 0,2% Detergente
24,9% Tiocianato di sodio
2 x 100 Test
IQ PS1, v1.5
(Sonda dello standard di quantificazione HIV-1
MONITOR, sospensione 1, versione 1.5)
Tampone MES
< 0,01% Sospensione di Dynabeads® (particelle
paramagnetiche) ricoperte con sonda
CP35 di cattura oligonucleotidica specifica allo
standard di quantificazione dell'HIV-1
0,09% Sodio azide
1 x 100 Test
IQ4, v1.5
(Sonda dello standard di quantificazione HIV-1
MONITOR, sospensione 2, versione 1.5)
Tampone di fosfato di sodio
< 0,2% Detergente
24,9% Tiocianato di sodio
1 x 100 Test
Reagenti generici di rilevazione
DK
DN4
(Soluzione di denaturazione)
1,6% Idrossido di sodio
EDTA
Blu di timolo
1,6% Idrossido di sodio (p/p)
+
Xi
1 x 100 Test
Irritante
CN4
(Coniugato di avidina-perossidasi di rafano)
Tampone di tris-HCl
< 0,001% Coniugato di avidina-perossidasi di rafano
Albumina di siero bovino (di mammifero)
Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)
0,1% Fenolo
1% conservante ProClin® 150
SB3
(Substrato A)
Soluzione di citrato
0,01% Acqua ossigenata
3 x 100 Test
5 x 75 Test
9/53
5 x 5 ml
SB
(Substrato B)
0,1% 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB)
40% Dimetilformammide (DMF)
T
40% Dimetilformammide (DMF) (p/p)
Tossico
R: 61-20/21-36
Può danneggiare i bambini non
ancora nati. Nocivo per inalazione e
a contatto con la pelle. Irritante per
gli occhi.
S: 53-45
Evitare l'esposizione - procurarsi
speciali istruzioni prima dell'uso. In
caso di incidente o di malessere
consultare
immediatamente
il
medico (se possibile mostrargli
l'etichetta).
COBAS® AMPLICOR®
WB
Wash Buffer
COBAS® AMPLICOR® Tampone di lavaggio
WB
(Concentrato di lavaggio 10X)
< 2% Tampone di fosfato
< 9% Cloruro di sodio
EDTA
< 2% Detergente
500 Test P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
2 x 250 Test
Avvertenze e precauzioni
Per uso diagnostico in vitro.
Questo test è destinato ad essere usato solamente con siero o plasma umano raccolto in
anticoagulanti EDTA o ACD. È stato dimostrato che l'eparina inibisce la PCR e non
deve essere usata ai fini di questa procedura.
Non pipettare con la bocca.
Non mangiare, bere né fumare nelle aree di lavoro del laboratorio. Indossare guanti
monouso di protezione, camici da laboratorio e protezione oculare durante il maneggio
dei campioni e dei reagenti del kit. Lavarsi bene le mani dopo il maneggio dei campioni
e dei reagenti.
Evitare la contaminazione microbica e da ribonucleasi dei reagenti durante la
rimozione di aliquote dalle bottiglie dei reagenti. Si consiglia di usare pipette sterili
monouso e punte prive di ribonucleasi.
Non combinare reagenti di lotti diversi o di flaconi diversi dello stesso lotto.
Smaltire i reagenti non utilizzati ed i rifiuti in conformità alla normativa vigente.
Non usare il kit dopo la sua data di scadenza.
10/53
HIV-1 MONITOR
Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets = MSDS) sono
disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale.
Il flusso di lavoro di laboratorio deve procedere in modo unidirezionale, cominciando
nell'area di preamplificazione per poi passare all'area di postamplificazione
(amplificazione/rilevazione). Le attività di preamplificazione devono iniziare con la
preparazione dei reagenti e procedere con la preparazione dei reagenti e dei campioni.
Le forniture e le attrezzature devono essere dedicate a ciascuna attività di
preamplificazione e non devono essere usate per altre attività né spostate da un'area
all'altra. Indossare guanti in ciascuna area e cambiarli prima di uscire da tale area. Le
forniture e le attrezzature usate per la preparazione dei reagenti non devono essere usate
per le attività di preparazione dei campioni, per il pipettamento né per il trattamento del
DNA amplificato o di altre fonti di DNA target. Le forniture e le attrezzature di
postamplificazione devono rimanere sempre in tale area.
I campioni devono essere maneggiati come se fossero infettivi, adottando procedure di
sicurezza di laboratorio sul tipo di quelle delineate da Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories33 e nel documento CLSI M29-A334. Pulire e disinfettare
accuratamente tutte le superfici di lavoro con una soluzione fresca allo 0,5% di
ipoclorito di sodio in acqua deionizzata o distillata.
Nota
La candeggina liquida in commercio di solito contiene una concentrazione di
ipoclorito di sodio del 5,25%. Una diluizione 1:10 di candeggina produce una
soluzione allo 0,5% di ipoclorito di sodio.
ATTENZIONE! Questo kit contiene un componente (NHP) derivato da sangue
umano. Il materiale d'origine è stato testato con test approvati dall'FDA
statunitense e riscontrato non reattivo alla presenza degli anticorpi anti-HCV-1/2,
dell'antigene HIV p14 e dell'antigene di superficie dell'apatite B (HBsAg). Inoltre
sono state sottoposte a test unità di sangue miscelate: non è stata rilevata la
presenza dell'RNA dell'HIV-1, dell'RNA dell'HCV o del DNA dell'HBV mediante
PCR in gruppi di unità di sangue di donatori; non è stata rilevata la presenza di
anticorpi centrali anti-HBV in gruppi di unità di sangue di donatori mediante test
autorizzati dall'FDA. Nessun metodo di test conosciuto può garantire
completamente che i prodotti derivati dal sangue umano non trasmettano agenti
infettivi. Di conseguenza, tutti i materiali di provenienza umana devono essere
considerati potenzialmente infettivi. Il plasma negativo umano NHP deve essere
maneggiato come se fosse infettivo adottando prassi sicure di laboratorio sul tipo
di quelle delineate da Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories33 e dal documento CLSI M29-A334. Pulire e disinfettare
accuratamente tutte le superfici di lavoro con una soluzione di ipoclorito di sodio
allo 0,5%. in acqua distillata o deionizzata.
HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn2+, v1.5;
HIV-1 (–) C; HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 e IQ PS1, v1.5
contengono sodio azide. Tale sostanza può reagire con i tubi in piombo ed in rame
formando azoturi metallici altamente esplosivi. Quando vengono smaltite nei
lavelli del laboratorio soluzioni contenenti sodio azide, sciacquare gli scarichi con
abbondanti quantità d'acqua per impedire l'accumulo di azoturi.
Indossare protezione oculare, camici di laboratorio e guanti monouso per
maneggiare l'HIV-1 LYS; HIV-1 MMX, v1.5; DN4; AD3; IM4, v1.5;
IQ4, v1.5; CN4; SB3; SB ed il substrato di lavoro (ottenuto miscelando i reagenti
SB3 ed SB). Evitare il contatto di questi materiali con la pelle, gli occhi o le
mucose. In caso di contatto, lavarsi immediatamente con abbondanti quantità
d'acqua, pena possibili ustioni. Se si verifica la fuoriuscita accidentale di questi
reagenti, diluire con acqua prima di asciugare.
11/53
Evitare il contatto con la pelle o le mucose dello SB o del substrato di lavoro. In caso
di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente con abbondanti quantità d'acqua.
Lo SB ed il substrato di lavoro contengono dimetilformammide, una sostanza di
cui è stata relazionata la tossicità in dosi elevate e la possibile fetotossicità.
Evitare il contatto cutaneo, l'inalazione dei vapori e l'ingestione. In caso di
contatto con la pelle, lavarsi accuratamente con acqua e sapone e richiedere
l'immediato intervento di un medico.
Non permettere che l'HIV-1 LYS, il quale contiene tiocianato di guanidina, o
l'IM4, v1.5 e l'IQ4, v1.5, che contengono tiocianato di sodio, vengano a contatto
con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). Tali miscele producono un
gas molto tossico.
La preparazione dei campioni e dei controlli richiede l'uso di provette con tappo a
vite, in modo da evitare gli spruzzi e la possibile contaminazione crociata del
campioni. Non usare provette con tappo a pressione.
Requisiti di maneggio e conservazione
Non congelare i reagenti.
Conservare l'HIV-1 LYS, l'HIV-1 QS, v1.5 e l'HIV-1 DIL a 2-8°C. Se sigillati,
questi reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Una volta aperti,
gettare via qualsiasi porzione non utilizzata.
Durante la conservazione a 2-8°C, nell'HIV-1 LYS si forma un precipitato. Prima
dell'uso, dissolvere tale precipitato riscaldando il reagente HIV-1 LYS a 25-37°C
per un massimo di 30 minuti. Miscelarlo bene per dissolvere i cristalli. Prima
del'uso, esaminare ciascun flacone di reagente di lisi HIV-1 LYS contro uno
sfondo bianco, alla ricerca di una colorazione gialla o di segni di perdita. Se si
nota una colorazione giallognola o segni di perdite, non usare il flacone per il
test. Richiedere la sostituzione del reagente al rappresentante locale Roche. Una
volta aperti, gettare via qualsiasi porzione non utilizzata. Il reagente di lisi di
lavoro (preparato addizionando l'HIV-1 QS, v1.5 all'HIV-1 LYS) deve essere
conservato a temperatura ambiente ed usato entro 4 ore dalla preparazione.
Conservare l'HIV-1 MMX, v1.5 e l'HIV-1 Mn2+, v1.5 a 2-8ºC. Questi reagenti
sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Una volta aperti, gettare via
qualsiasi porzione non utilizzata. Il Master Mix di lavoro (preparato addizionando
l'HIV-1 Mn2+, v1.5 all'HIV-1 MMX, v1.5) deve essere conservato a 2-8°C ed è
stabile a questa temperatura per 4 ore.
Conservare l'NHP, l'HIV-1 (–) C, l'HIV-1 L(+)C e l'HIV-1 H(+)C a 2-8°C.
Questi reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Una volta aperti,
gettare via qualsiasi porzione non utilizzata.
Conservare l'AD3 a 2-25ºC. Una volta caricato nell'analizzatore COBAS®
AMPLICOR®, l'AD3 è stabile a 2-8°C per 30 giorni o fino alla data di scadenza,
se precedente. L'AD3 può essere usato per un massimo di 4 cicli dello strumento
(24 ore per ciclo) e va conservato a 2-8°C tra un ciclo e quello successivo.
Conservare l'IM PS1, v1.5 e l'IM4, v1.5 a 2-8°C. Questi reagenti sono stabili fino
alla data di scadenza indicata. Una volta miscelati l'IM PS1, v1.5 e l'IM4, v1.5, il
reagente di lavoro è stabile per 14 giorni a 2-8°C. Il reagente di lavoro può essere
usato per un massimo di 2 cicli dello strumento (24 ore per ciclo) e va conservato
a 2-8°C tra un ciclo e quello successivo.
12/53
HIV-1 MONITOR
Conservare l'IQ PS1, v1.5 e l'IQ4, v1.5 a 2-8°C. Questi reagenti sono stabili fino
alla data di scadenza indicata. Una volta miscelati l'IQ PS1, v1.5 e l'IQ4, v1.5, il
reagente di lavoro è stabile per 30 giorni a 2-8°C. Il reagente di lavoro può essere
usato per un massimo di 4 cicli dello strumento (24 ore per ciclo) e va conservato
a 2-8°C tra un ciclo e quello successivo.
Conservare la DN4 a 2-25°C. La soluzione DN4 è stabile fino alla data di
scadenza indicata. Una volta aperta, la DN4 è stabile per 30 giorni a 2-8°C o fino
alla data di scadenza se precedente. La DN4 può essere usata per un massimo di
4 cicli dello strumento (24 ore per ciclo) e deve essere conservata a 2-8°C tra un
ciclo e quello successivo.
Conservare il CN4 a 2-8°C. Il CN4 è stabile fino alla data di scadenza indicata.
Una volta aperto, il reagente CN4 è stabile per 30 giorni a 2-8°C o fino alla data
di scadenza se precedente. Il CN4 può essere usato per un massimo di 4 cicli dello
strumento (24 ore per ciclo) e deve essere conservato a 2-8°C tra un ciclo e l'altro.
Conservare lo SB3 e lo SB a 2-8°C. Se sigillati, questi reagenti sono stabili fino
alla data di scadenza indicata. Il substrato di lavoro deve essere preparato fresco
ogni giorno, miscelando SB3 ed SB. Il substrato di lavoro è stabile
nell'analizzatore COBAS® AMPLICOR® per 16 ore. Non esporre lo SB3, lo SB o
il substrato di lavoro ai metalli, agli agenti ossidanti o alla luce diretta.
Conservare il WB a 2-30°C. Il WB è stabile fino alla data di scadenza indicata.
Esaminare il WB prima della diluizione e, se necessario, riscaldarlo a 30-37°C
per ridissolvere qualsiasi precipitato. Il tampone di lavoro (1X), preparato
diluendo 1:10 il concentrato di lavaggio WB con acqua distillata o deionizzata,
deve essere conservato a 2-25°C nell'apposito serbatoio COBAS® AMPLICOR®
ed è stabile per 2 settimane a decorrere dalla data di preparazione.
Conservare i reagenti di rilevazione usati parzialmente a 2-8°C tra una serie
strumentale e quella successiva. Controllare la data di scadenza dei reagenti aperti
o di lavoro prima di caricarli nell'analizzatore COBAS® AMPLICOR®.
Materiali forniti
COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR Test,
version 1.5
Reagenti di preparazione
dei campioni
HIM
P/N: 21118390 123
ART: 11 1839 0
US: 83369
HIM PREP
HIV-1 LYS
(Reagente di lisi HIV-1 MONITOR)
HIV-1 QS, v1.5
(Standard di quantificazione HIV-1 MONITOR, versione 1.5)
HIV-1 DIL
(Diluente del campione HIV-1 MONITOR)
13/53
Reagenti di controllo
HIM CTL
NHP
[Plasma (umano) negativo]
HIV-1 (–) C
[Controllo HIV-1 (–)]
HIV-1 L(+)C
[Controllo HIV-1 MONITOR (+) basso]
HIV-1 H(+)C
[Controllo HIV-1 MONITOR (+) alto]
Reagenti di amplificazione
HIM AMP
HIV-1 MMX, v1.5
(Master Mix HIV-1 MONITOR, versione 1.5)
HIV-1 Mn2+, v1.5
(Soluzione di manganese HIV-1 MONITOR, versione 1.5)
Reagenti specifici di rilevazione
HIM DK
AD3
(Reagente di diluizione dell'amplicon)
IM PS1, v1.5
(Sonda HIV-1, sospensione 1, versione 1.5)
IM4, v1.5
(Sonda HIV-1, sospensione 2, versione 1.5)
IQ PS1, v1.5
(Sonda dello standard di quantificazione dell'HIV-1,
sospensione 1, versione 1.5)
IQ4, v1.5
(Sonda dello standard di quantificazione dell'HIV-1,
sospensione 2, versione 1.5)
Reagenti generici di rilevazione
DK
DN4
(Soluzione di denaturazione)
CN4
(Coniugato di avidina-perossidasi di rafano)
SB3
(Substrato A)
SB
(Substrato B)
COBAS® AMPLICOR®
WB
Wash Buffer
COBAS® AMPLICOR® Tampone di lavaggio
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(Concentrato di lavaggio 10X)
14/53
HIV-1 MONITOR
Materiali richiesti ma non forniti
Preamplificazione - preparazione dei reagenti
– Anello A COBAS® AMPLICOR® completo di 12 provette A
– Porta-anello A COBAS® AMPLICOR®
– Pipettatore Eppendorf Multipette® con serbatoio Eppendorf Combitip® da
1,25 ml (sterile, a confezione individuale)
– Pipette automatiche (capacità: 50 μl e 100 μl)* con punte munite di barriera
antiaerosol o ad erogazione positiva, prive di ribonucleasi
– Guanti monouso, senza talco
Preamplificazione - preparazione dei campioni e dei controlli
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Provette da 2,0 ml con tappo a vite, sterili, (Sarstedt 72.694.006 o equivalenti)**
Provette da 1,5 ml con tappo a vite, sterili, (Sarstedt 72.692.105 o equivalenti)**
Rastrelliere portaprovette (Sarstedt 93.1428 o equivalenti)
Etanolo al 95% per biologia molecolare o istologia (miscela preparata fresca
diluendo l'etanolo al 70% con acqua distillata o deionizzata)
Isopropanolo, di qualità reagente
Pipette sterili di trasferimento a punta sottile, prive di ribonucleasi
Pipette sierologiche sterili monouso, in polistirene (5 ml, 10 ml e 25 ml)
Pipette automatiche (capacità: 12,5 μl, 25 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 400 μl,
500 μl, 600 μl, 800 μl e 1000 μl)* con punte a barriera antiaerosol o ad
erogazione positiva, prive di ribonucleasi
Microcentrifuga (max. 16.000 RCF (forza centrifuga relativa) x g, min.
12.500 RCF x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M o equivalente
Ultracentrifuga refrigerata e rotore ad angolo fisso (a 45 gradi, con capacità di
almeno ventiquattro provette da 1,5 ml), da 23.600 RCF x g (Heraeus 17RS con
rotore HFA 22,1, Biofuge 28RS o equivalente)
Vortex
Guanti monouso, senza talco
Postamplificazione - amplificazione/rilevazione
– Analizzatore COBAS® AMPLICOR® e stampante
– Manuale operativo dell'analizzatore COBAS® AMPLICOR®
• Opzionale: Software AMPLILINK comprendente:
– stazione dati per il software AMPLILINK, con stampante
–
–
–
–
–
– manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione 3.2 per l'uso
con lo strumento COBAS® AmpliPrep, l'analizzatore COBAS® TaqMan®,
l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48 e l'analizzatore COBAS®
AMPLICOR® (per l'uso con il software AMPLILINK versione serie 3.2)
oppure Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione 3.3 per
l'uso con lo strumento COBAS® AmpliPrep, l'analizzatore COBAS®
TaqMan®, l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48, l'analizzatore COBAS®
AMPLICOR® e lo strumento cobas p 630 (per l'uso con il software
AMPLILINK versione serie 3.3)
Rastrelliere per coppette D
Acqua distillata o deionizzata
Pipette sierologiche da 5 ml
Vortex
Guanti monouso, senza talco
15/53
* Le pipette automatiche devono essere accurate entro il 3% del volume
dichiarato. Laddove specificato, è necessario usare punte munite di barriera
antiaerosol o punte ad erogazione positiva prive di ribonucleasi, in modo da
evitare la contaminazione crociata del campione e dell'amplicon.
** Usare provette con tappo a vite per la preparazione dei campioni e dei
controlli, in modo da evitare gli schizzi e la potenziale contaminazione
crociata dei campioni. Non usare provette con tappo a pressione.
Prelievo, trasporto e conservazione dei campioni
Nota
Maneggiare tutti i campioni come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi.
Prelievo campioni
Il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 è destinato ad essere
eseguito solamente su campioni di plasma. Il sangue va raccolto in provette sterili
usando quale anticoagulante l'EDTA (tappo viola) o l'ACD (tappo giallo).
I campioni anticoagulati con eparina non sono adatti a questo test. Conservare
il sangue intero a 2-25°C per non più di 6 ore. I campioni anticoagulati con ACD
producono valori inferiori del 15% circa rispetto ai risultati dei campioni
anticoagulati con EDTA, a causa dell'effetto diluente degli 1,5 ml di ACD presenti
nella provetta di prelievo. La Figura 1 illustra l'effetto degli anticoagulanti ACD e
EDTA sull'RNA dell'HIV-1 dei campioni di plasma.
Figura 1
Confronto tra gli anticoagulanti ACD e EDTA*
Campioni con ACD Risultati medi del test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR
(copie dell'RNA dell'HIV/ml di plasma, n= 2)
Risultati del test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR
sui campioni con EDTA ed ACD
10 5
y = 1,4381 * x^(0,93286) R= 0,90097
EDTA = ACD
10 4
10 3
10
3
4
10
10
Campioni con EDTA ®
Risultati medi del test AMPLICOR HIV-1 MONITOR
(copie dell'RNA dell'HIV/ml di plasma, n= 2)
5
* I dati illustrati nella Figura 1 sono stati generati usando il test AMPLICOR® HIV-1
MONITOR con la procedura standard di preparazione dei campioni.
Separare il plasma dal sangue intero entro 6 ore dal prelievo, tramite
centrifugazione a 800-1600 x g per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire
il plasma in una provetta sterile in polipropilene.
Trasporto dei campioni
16/53
Il trasporto di sangue intero o di plasma deve essere conforme alla normativa
vigente in merito agli agenti eziologici35. Il sangue intero deve essere trasportato
a 2-25°C e trattato entro 6 ore dal prelievo. Il plasma deve essere trasportato a
2-8°C o congelato ad una temperatura compresa tra -20°C e -80°C.
HIV-1 MONITOR
Conservazione
dei campioni
I campioni di plasma possono essere conservati a temperatura ambiente per non più
di 1 giorno, a 2-8°C per non più di 5 giorni, oppure congelati ad una temperatura
compresa tra -20°C e -80°C. Si consiglia di conservare i campioni in aliquote da
600-700 μl in provette sterili in polipropilene da 2,0 ml, con tappo a vite (per
esempio le provette Sarstedt 72.694.006) I campioni di plasma possono essere
congelati e scongelati non più di 3 volte. La Figura 2 illustra i risultati degli studi di
congelamento-scongelamento.
Figura 2
Risultati HIV-1 medi di tre gruppi di plasma HIV-1-positivo
dopo 2, 3 e 4 cicli di congelamento/scongelamento *
Copie di RNA dell'HIV-1/ml
normalizzate in funzione
del primo scongelamento
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1
2
3
4
Numero di scongelamenti
* I dati illustrati nella Figura 2 sono stati generati usando il test AMPLICOR® HIV-1
MONITOR con la procedura standard di preparazione dei campioni.
Istruzioni per l'uso
Nota
Per le istruzioni operative e altre indicazioni relative alla stampa dei risultati e
all'interpretazione di avvisi (flag), commenti e messaggi d'errore, consultare (1) il
Manuale operativo dell'analizzatore COBAS® AMPLICOR® e, (2) se si utilizza il
software AMPLILINK versione 3.2, consultare il Manuale operativo del software
AMPLILINK versione 3.2 per l'uso con lo strumento COBAS® AmpliPrep,
l'analizzatore COBAS® TaqMan®, l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48 e
l'analizzatore COBAS® AMPLICOR® oppure, se si utilizza il software
AMPLILINK versione 3.3, consultare il Manuale dell'applicazione - Software
AMPLILINK versione 3.3 per l'uso con lo strumento COBAS® AmpliPrep,
l'analizzatore COBAS® TaqMan®, l'analizzatore COBAS® TaqMan® 48,
l'analizzatore COBAS® AMPLICOR® e lo strumento cobas p 630.
Nota
Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente prima dell'uso.
Esaminare visualmente tutti i reagenti, verificandone la sufficienza del volume,
prima di dare inizio alla procedura di test.
Nota
I campioni di plasma devono essere portati a temperatura ambiente prima
dell'uso. Usare pipette automatiche con puntali dotati di barriera antiaerosol,
oppure ad erogazione positiva laddove specificato. Esercitare estrema cautela
per garantire l'amplificazione selettiva.
Nota
La preparazione dei campioni e dei controlli richiede l'uso di provette con tappo
a vite, in modo da evitare gli spruzzi e la possibile contaminazione crociata del
campioni. Non usare provette con tappo a pressione.
Nota
Il COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test v1.5 deve essere eseguito
esclusivamente in modalità base (Basic mode).
17/53
Dimensioni della serie
Ciascun kit contiene reagenti sufficienti per quattro serie da 12 campioni, che
possono essere eseguite una ad una oppure in due serie da 24 test ciascuna. È
possibile analizzare al massimo 24 campioni (21 campioni + 3 controlli) per ogni
serie di test. Almeno un duplicato ciascuno del controllo negativo AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR (–), del controllo positivo AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (+)
basso e del controllo positivo AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (+) alto deve essere
incluso in ciascuna serie (vedere la sezione “Controllo qualità”).
I reagenti per la preparazione dei campioni e per l'amplificazione sono contenuti in
bottiglie monouso per 12 test. L'uso più efficiente dei reagenti prevede l'impiego di
lotti di reagenti, campioni e controlli in multipli di 12.
Nota
Flusso di lavoro
Il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 può essere completato in
uno o due giorni. Se si completa l'analisi in un'unica giornata lavorativa, seguire
nell'ordine le istruzioni presentate nelle sezioni Preparazione dei reagenti;
Preparazione dei campioni e dei controlli e Trascrizione inversa, amplificazione
e rilevazione. Le analisi possono essere completate in due giorni, cominciando la
preparazione dei campioni e dei controlli il primo giorno ed eseguendo la
preparazione dei reagenti e la trascrizione inversa, amplificazione e rilevazione il
giorno successivo.
Per eseguire la preparazione dei campioni e dei controlli il giorno 1 e la
trascrizione inversa, l'amplificazione e la rilevazione il giorno 2, eseguire la
preparazione standard dei campioni e dei controlli (passi da A.1 ad A.14) oppure
la preparazione ultrasensibile dei campioni e dei controlli (passi da B.1 a B.19) e
conservare i campioni trattati nel modo indicato nel passo A.14 o B.19. Il giorno
2, cominciare con la preparazione dei reagenti e poi scongelare i campioni trattati
ed i controlli, portandoli a temperatura ambiente, per poi continuare con la
preparazione standard dei campioni e dei controlli, passo A.15 o con la
preparazione ultrasensibile dei campioni e dei controlli, passo B.20, concludendo
la procedura con la trascrizione inversa, amplificazione e rilevazione.
Preparazione
dei reagenti
Eseguita nell'area di Preamplificazione - preparazione dei reagenti
18/53
1.
Determinare il numero appropriato di anelli A necessari per l'analisi dei
campioni e dei controlli. Inserire gli anelli A negli appositi porta-anelli.
2.
Preparare il reagente Master Mix di lavoro addizionando 100 μl di
HIV-1 Mn2+, v1.5 in una provetta di HIV-1 MMX, v1.5. Non è necessario
misurare il volume di master Mix. Addizionare 100 μl di HIV-1 Mn2+, v1.5
nell'intea provetta di HIV-1 MMX, v1.5. Ritappare il flacone ed invertirlo
10-15 volte per miscelarne il contenuto. Non agitare al vortex il Master Mix
di lavoro. Il colorante rosa di HIV-1 Mn2+, v1.5 permette di confermare
visualmente l'addizione della soluzione di manganese al Master Mix. Gettare
via l'HIV-1 Mn2+, v1.5 non utilizzata. Il Master Mix di lavoro deve essere
conservato a 2-8°C e va usato entro 4 ore dalla preparazione.
3.
Pipettare 50 μl di Master Mix di lavoro in ciascuna provetta A di
amplificazione, usando una pipetta automatica a ripetizione o munita di
puntale dotato di barriera antiaerosol o ad erogazione positiva. Non chiudere
ancora i tappi delle provette A. Gettare via il Master Mix di lavoro non
utilizzato.
4.
Collocare gli anelli A contenenti il Master Mix di lavoro in un sacchetto di
plastica richiudibile. Chiudere bene il sacchetto e trasferirlo nell'area di
preamplificazione - preparazione dei campioni. Conservare gli anelli A
contenenti il Master Mix di lavoro a 2-8°C nell'area di preamplificazione preparazione dei campioni fino al completamento della preparazione dei
campioni e dei controlli. Conservato in questo modo, il Master Mix di lavoro
è stabile per 4 ore a 2-8°C.
HIV-1 MONITOR
Preparazione dei
campioni e dei controlli
Eseguita nell'area di Preamplificazione - preparazione dei campioni e dei
controlli
Nota
Per amplificare campioni e controlli preparati in precedenza, eseguire per
primi i passi indicati nella sezione “Preparazione dei reagenti”. Portare i
campioni ed i controlli a temperatura ambiente e continuare con il passo A.15
della “Preparazione standard dei campioni e dei controlli” o con il passo B.20
della “Preparazione ultrasensibile dei campioni e dei controlli”.
Nota
Durante la conservazione a 2-8°C, nell'HIV-1 LYS si forma un precipitato.
Prima dell'uso, riscaldare il reagente a 25-37°C e miscelarlo bene per
dissolvere il materiale precipitato.
Nota
Prima del'uso, esaminare ciascun flacone di reagente di lisi HIV-1 LYS contro
uno sfondo bianco, alla ricerca di una colorazione gialla o di segni di perdita.
Se si nota una colorazione giallognola o segni di perdite, non usare il flacone
per il test. Richiedere la sostituzione del reagente al rappresentante locale
Roche.
Preparazione standard
dei campioni e dei controlli
A.1. Preparare la soluzione di etanolo al 70%. Per 12 test, miscelare 11,0 ml di
etanolo al 95% e 4,0 ml di acqua deionizzata o distillata.
A.2. Etichettare una provetta da 2,0 ml con tappo a vite per ciascun campione da
analizzare e tre ulteriori provette per i controlli HIV-1 (–)C, HIV-1 L(+)C ed
HIV-1 H(+)C.
A.3. Preparare il reagente standard di lisi di lavoro. Agitare al vortex l'HIV-1 QS,
v1.5 per almeno 10 secondi prima dell'uso. Per ciascun gruppo di non più di
12 campioni e controlli, addizionare 100 μl di HIV-1 QS, v1.5 in un flacone
di HIV-1 LYS e miscelare bene. Non è necessario misurare il volume del
reagente HIV-1 LYS. La colorazione rosa del reagente HIV-1 QS, v1.5
conferma l'avvenuta addizione del reagente all'HIV-1 LYS. Gettare via il
reagente HIV-1 QS, v1.5 rimasto. Il reagente di lisi è stabile per 4 ore a
temperatura ambiente.
Nota
Quando si usano campioni congelati, portarli a temperatura ambiente ed
agitarli al vortex per 3-5 secondi. Far ruotare brevemente la provetta per
raccogliere il campione sul fondo. Evitare con cura di contaminare i guanti
durante la manipolazione dei campioni.
A.4. Addizionare 600 μl di reagente standard di lisi di lavoro in ciascuna provetta
etichettata. Tappare le provette. Controllare il viraggio al rosa dell'HIV-1
LYS a conferma dell'addizione dell'HIV-1 QS, v1.5 all'HIV-1 LYS.
A.5. Preparare i controlli standard come segue:
–
Agitare con il vortex per 3-5 secondi i controlli NHP, HIV-1 (–) C, HIV-1
L(+)C ed HIV-1 H(+)C.
–
Addizionare 200 μl di NHP in ognuna delle tre provette dei controlli.
Tappare le provette ed agitarle con il vortex per 3-5 secondi.
–
Addizionare 50 μl di HIV-1 (–) C nella provetta etichettata “HIV-1 (–) C”,
contenente il reagente standard di lisi di lavoro e l'NHP. Tappare la provetta
ed agitarla con il vortex per 3-5 secondi.
–
Addizionare 50 μl di HIV-1 L(+)C nella provetta etichettata “HIV-1 L(+)C”,
contenente il reagente standard di lisi di lavoro e l'NHP. Tappare la provetta
ed agitarla con il vortex per 3-5 secondi.
19/53
–
Addizionare 50 μl di HIV-1 H(+)C nella provetta etichettata “HIV-1
H(+)C”, contenente il reagente standard di lisi di lavoro e l'NHP. Tappare la
provetta ed agitarla con il vortex per 3-5 secondi.
A.6. Addizionare 200 μl di ciascun campione dei pazienti nella relativa provetta
opportunamente contrassegnata, contenente il reagente standard di lisi di
lavoro. Tappare le provette ed agitarle con il vortex per 3-5 secondi.
A.7. Incubare le provette dei campioni e dei controlli per 10 minuti a
temperatura ambiente.
A.8. Stappare le provette dei campioni e dei controlli ed addizionare 800 μl di
alcool isopropilico al 100% (a temperatura ambiente) in ciascuna provetta.
Ritappare le provette e agitarle al vortex per 3-5 secondi. Non mantenere
aperta più di una provetta per volta.
A.9. Apporre un segno di orientamento su ciascuna provetta ed inserire le
provette nella microcentrifuga con il segno orientato verso l'esterno, in
modo da allineare a tale segno i materiali solidi postcentrifugazione.
Centrifugare i campioni ed i controlli alla massima velocità (12.50016.000 x g) per 15 minuti a temperatura ambiente.
A.10. Usando una nuova pipetta monouso di trasferimento a punta sottile per
ciascuna provetta, rimuovere attentamente e gettare via il supernatante dalle
provette, facendo attenzione a non disturbare i materiali solidi (che possono
essere invisibili). Rimuovere quanto più liquido sia possibile senza
disturbare i materiali solidi. Aspirare lentamente il supernatante, lasciando
scolare completamente il liquido dalla parete interna della provetta. Non
usare aspirazione a vuoto.
A.11. Addizionare 1,0 ml di etanolo al 70% (a temperatura ambiente) in ciascuna
provetta. Ritappare le provette ed agitarle con il vortex per 3-5 secondi.
A.12. Inserire le provette nella microcentrifuga con i segni di orientamento
orientati verso l'esterno e centrifugare le provette per 5 minuti alla massima
velocità (12.500-16.000 x g) a temperatura ambiente.
A.13. Usando una nuova pipetta monouso di trasferimento a punta sottile per
ciascuna provetta, rimuovere attentamente il supernatante dalle provette
senza disturbare i materiali solidi. In questa fase, i materiali solidi
postcentrifugazione dovrebbero essere chiaramente visibili. Rimuovere
quanto più supernatante sia possibile. I residui di etanolo possono inibire
l'amplificazione.
A.14. Addizionare 400 μl di HIV-1 DIL in ciascuna provetta. Ritappare le
provette. Agitare al vortex vigorosamente per 10 secondi in modo da
risospendere l'RNA estratto. Alcuni residui insolubili possono rimanere tali.
Amplificare i campioni ed i controlli trattati entro 2 ore dalla loro
preparazione. Se l'amplificazione dei campioni non può essere avviata entro
2 ore dalla loro preparazione, è possibile congelare i campioni a non meno
di -20°C per un massimo di una settimana, facendo attenzione a non
scongelarli più di una volta. Non ricongelarli e scongelarli più di una volta,
pena la perdita del numero di copie.
Nota
Se i campioni ed i controlli trattati sono stati congelati prima
dell'amplificazione, portarli a temperatura ambiente ed agitarli al vortex per
5 secondi prima di intraprendere il passo A.15.
A.15. Usando una pipetta automatica munita di puntale con barriera antiaerosol
o ad erogazione positiva, addizionare 50 μl di ciascun campione e controllo
preparati nelle appropriate provette A contenenti il Master Mix di lavoro.
Usare una punta nuova per ciascun campione e controllo. Evitare con cura
di trasferire qualsiasi materiale precipitato non ridisciolto. Tappare le
provette A.
20/53
HIV-1 MONITOR
A.16. Registrare la posizione dei campioni e dei controlli negli anelli A.
L'amplificazione deve iniziare entro 45 minuti dall'addizione dei campioni e
dei controlli trattati nelle provette A contenenti il reagente Master Mix di
lavoro. Trasferire nell'area di amplificazione/rilevazione i campioni ed i
controlli inseriti negli anelli A. La porzione rimanente dei campioni trattati
può essere congelata a non meno di -20°C per un periodo massimo di una
settimana. Non ricongelarli e scongelarli più di una volta, pena la perdita del
numero di copie.
Preparazione ultrasensibile
dei campioni e dei controlli
B.1. Prerefrigerare l'ultracentrifuga ed il rotore a 2-8°C nel modo descritto nelle
istruzioni operative dell'ultracentrifuga.
B.2. Preparare la soluzione di etanolo al 70%. Per 12 test, miscelare 11,0 ml di
etanolo al 95% e 4,0 ml di acqua deionizzata o distillata.
B.3. Etichettare una provetta da 1,5 ml con tappo a vite per ciascun campione da
analizzare e tre ulteriori provette per i controlli HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C ed
HIV-1 H(+)C.
B.4. Preparare il reagente ultrasensibile di lisi di lavoro. Agitare al vortex
l'HIV-1 QS, v1.5 per almeno 10 secondi prima dell'uso. Per ciascun gruppo
di non più di 12 campioni e controlli, addizionare 25 μl di HIV-1 QS, v1.5 in
un flacone di HIV-1 LYS e miscelare bene. Non è necessario misurare il
volume del reagente HIV-1 LYS. La colorazione rosa del reagente
HIV-1 QS, v1.5 conferma l'avvenuta addizione del reagente all'HIV-1 LYS.
Gettare via il reagente HIV-1 QS, v1.5 rimasto. Il reagente ultrasensibile di
lisi di lavoro è stabile per 4 ore a temperatura ambiente.
Nota
Quando si usano campioni congelati, portarli a temperatura ambiente ed
agitarli al vortex per 3-5 secondi. Far ruotare brevemente la provetta per
raccogliere il campione sul fondo. Evitare con cura di contaminare i guanti
durante la manipolazione dei campioni.
B.5. Addizionare 500 μl di campione del paziente in ciascuna provetta
opportunamente etichettata.
B.6. Addizionare 500 μl di NHP in ciascuna provetta di controllo opportunamente
etichettata.
B.7. Apporre un segno di orientamento su ciascuna provetta ed inserire le provette
nell'ultracentrifuga con il segno orientato verso l'esterno, allineato con i
materiali solidi post-centrifugazione. Centrifugare i campioni ed i controlli a
23.600 x g per 60 minuti a 2-8°C.
B.8. Usando una nuova pipetta monouso di trasferimento a punta sottile per
essere invisibili). Rimuovere quanto più liquido sia possibile senza disturbare
i materiali solidi. Aspirare lentamente il supernatante, lasciando scolare
completamente il liquido dalla parete interna della provetta. Non usare
aspirazione a vuoto.
Nota
I materiali solidi virali, ottenuti nel corso del passo B.8 della preparazione
ultrasensibile dei campioni, sono stabili per un massimo di 6 ore a temperatura
ambiente per almeno 14 giorni a non meno di -20°C.
21/53
B.9. Addizionare 600 μl di reagente di lisi di lavoro in ciascuna provetta
contrassegnata. Tappare le provette. Controllare il viraggio al rosa
dell'HIV-1 LYS a conferma dell'addizione dell'HIV-1 QS, v1.5 all'HIV-1
LYS. Centrifugare la provetta al vortex per 3-5 secondi, in modo da
risospendere il materiali solidi.
B.10. Preparare i controlli ultrasensibili come segue:
–
Agitare al vortex per 3-5 secondi i controlli HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C
ed HIV-1 H(+)C.
–
Addizionare 12,5 μl di HIV-1 (–) C nella provetta etichettata
HIV-1 (–) C contenente il reagente ultrasensibile di lisi di lavoro.
Tappare la provetta ed agitarla con il vortex per 3-5 secondi.
–
Addizionare 12,5 μl di HIV-1 L(+)C nella provetta etichettata
HIV-1 L(+)C contenente il reagente ultrasensibile di lisi di lavoro.
–
Addizionare 12,5 μl di HIV-1 H(+)C nella provetta etichettata
HIV-1 H(+)C contenente il reagente ultrasensibile di lisi di lavoro.
B.11. Incubare le provette dei campioni e dei controlli per 10 minuti a temperatura
ambiente.
B.12. Stappare le provette dei campioni e dei controlli ed addizionare 600 μl di
alcool isopropilico al 100% (a temperatura ambiente) in ciascuna provetta.
Ritappare le provette e agitarle al vortex per 3-5 secondi. Non mantenere
aperta più di una provetta per volta.
B.13. Apporre un segno di orientamento su ciascuna provetta ed inserire le provette
nella microcentrifuga con il segno orientato verso l'esterno, in modo da
allineare a tale segno i materiali solidi postcentrifugazione. Centrifugare i
campioni ed i controlli alla massima velocità (12.500-16.000 x g) per
15 minuti a temperatura ambiente.
essere invisibili). Rimuovere quanto più liquido sia possibile senza disturbare
i materiali solidi. Aspirare lentamente il supernatante, lasciando scolare
completamente il liquido dalla parete interna della provetta. Non usare
aspirazione a vuoto.
B.15. Addizionare 1,0 ml di etanolo al 70% (a temperatura ambiente) in ciascuna
provetta. Ritappare le provette ed agitarle con il vortex per 3-5 secondi.
B.16. Inserire le provette nella microcentrifuga con i segni di orientamento
orientati verso l'esterno e centrifugare le provette per 5 minuti alla massima
velocità (12.500-16.000 x g) a temperatura ambiente.
ciascuna provetta, rimuovere attentamente il supernatante dalle provette
senza disturbare i materiali solidi. In questa fase, i materiali solidi
dovrebbero essere chiaramente visibili. Rimuovere quanto più supernatante
sia possibile. I residui di etanolo possono inibire l'amplificazione.
B.18. Ripetere il passo B.17 per rimuovere quanto più possibile il supernatante
rimanente. I residui di etanolo possono inibire l'amplificazione.
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HIV-1 MONITOR
B.19. Addizionare 100 μl di HIV-1 DIL in ciascuna provetta. Ritappare le
provette. Agitare al vortex vigorosamente per 10 secondi in modo da
risospendere l'RNA estratto. Alcuni residui insolubili possono rimanere tali.
Amplificare i campioni ed i controlli trattati entro 2 ore dalla loro
preparazione. Se l'amplificazione dei campioni non può essere avviata entro
2 ore dalla loro preparazione, è possibile congelare i campioni a non meno di
-20°C per un massimo di una settimana, facendo attenzione a non scongelarli
più di una volta. Non ricongelarli e scongelarli più di una volta, pena la
perdita del numero di copie.
Nota
Se i campioni ed i controlli trattati sono stati congelati prima
dell'amplificazione, portarli a temperatura ambiente ed agitarli con il vortex
per 5 secondi prima di intraprendere il passo B.20.
B.20. Usando una pipetta automatica munita di puntale con barriera antiaerosol
o ad erogazione positiva, addizionare 50 μl di ciascun campione e controllo
preparati nelle appropriate provette A contenenti il Master Mix di lavoro.
Usare una punta nuova per ciascun campione e controllo. Evitare con cura
di trasferire qualsiasi materiale precipitato non ridisciolto. Tappare le
provette A.
B.21. Registrare la posizione dei campioni e dei controlli negli anelli A.
L'amplificazione deve iniziare entro 45 minuti dall'addizione dei campioni e
dei controlli trattati nelle provette A contenenti il reagente Master Mix di
lavoro. Trasferire nell'area di amplificazione/rilevazione i campioni ed i
controlli inseriti negli anelli A. La porzione rimanente dei campioni trattati
può essere congelata a non meno di -20°C per un periodo massimo di una
settimana. Non ricongelarli e scongelarli più di una volta, pena la perdita del
numero di copie.
Trascrizione inversa,
amplificazione e
rilevazione
Eseguita nell'area di Postamplificazione - amplificazione/rilevazione
Eseguire la manutenzione giornaliera dello strumento, che comprende:
–
–
–
–
–
–
–
–
Strofinare l'astina di inizializzazione con un panno umido privo di filacce ed
asciugarla.
Strofinare la pinza per coppette D con un panno umido privo di filacce ed
asciugarla.
Controllare il serbatoio del tampone di lavaggio e rabboccarlo a seconda
delle necessità.
Preparare il tampone di lavaggio di lavoro (1X) Esaminare il WB e se
necessario, riscaldarlo a 30-37°C per ridissolvere l'eventuale precipitato.
Addizionare 1 volume di WB in 9 volumi di acqua distillata o deionizzata.
Miscelare bene. Mantenere sempre nel serbatoio un minimo di 3-4 litri di
soluzione di lavaggio di lavoro (1X).
Svuotare il contenitore degli scarti.
Eseguire il priming dell'analizzatore COBAS® AMPLICOR®.
Durante il priming, controllare le siringhe ed i tubi.
Durante il priming, controllare i puntali di trasferimento.
Prima di ciascuna serie:
–
–
–
–
Controllare il contenitore degli scarti e svuotarlo se necessario.
Controllare il serbatoio del tampone di lavaggio e rabboccarlo a seconda
delle necessità.
Sostituire le rastrelliere di coppette D usate.
Eseguire il priming dell'analizzatore COBAS® AMPLICOR®.
23/53
Caricamento dell'analizzatore COBAS® AMPLICOR® e funzionamento del
sistema
1.
Esaminare le quantità di reagenti caricati nell'analizzatore COBAS®
AMPLICOR®. Preparare cassette di reagenti sufficienti per completare il
carico di lavoro.
2.
Miscelare bene al vortex l'IM PS1, v1.5. Addizionare 2,5 ml di IM PS1, v1.5
in una cassetta contenente l'IM4, v1.5. Collocare la cassetta sulla rastrelliera
dei reagenti specifici al test. Gettare via il flacone usato di
IM PS1, v1.5. Annotare la data di preparazione dei reagenti sulla cassetta
dell'IM4, v1.5.
3.
Miscelare bene al vortex l'IQ PS1, v1.5. Addizionare 2,5 ml di IQ PS1, v1.5
in una cassetta contenente l'IQ4, v1.5. Collocare la cassetta sulla rastrelliera
dei reagenti specifici al test. Gettare via il flacone usato di IQ PS1, v1.5.
Annotare la data di preparazione dei reagenti sulla cassetta dell'IQ4, v1.5.
4.
Preparare il substrato di lavoro pipettando 5 ml di SB in una cassetta
contenente l'SB3. Pipettare in alto ed in basso per miscelare il substrato.
Smaltire il flacone aperto di SB. Registrare la data di preparazione sulla
cassetta SB3.
5.
Collocare il substrato di lavoro nella rastrelliera dei reagenti generici.
6.
Inserire una cassetta di AD3 nella rastrelliera dei reagenti specifici al test.
Annotare la data di preparazione sulla cassetta di AD3.
7.
Inserire le cassette di DN4 e di CN4 nella rastrelliera dei reagenti generici.
Registrare su ciascuna cassetta la relativa data di apertura.
8.
Identificare le rastrelliere dei reagenti quali generiche o specifiche al test
utilizzando la tastiera o il lettore di codici a barre oppure utilizzando il software
AMPLILINK.
9.
Configurare le rastrelliere dei reagenti immettendo le posizioni ed i numeri di lotto
dei reagenti nell'analizzatore COBAS® AMPLICOR® tramite la tastiera o il lettore
di codici a barre oppure utilizzando il software AMPLILINK.
10. Caricare le rastrelliere dei reagenti nell'analizzatore COBAS® AMPLICOR®
utilizzando la tastiera o il lettore di codici a barre oppure utilizzando il software
AMPLILINK. Verificare che ciascuna cassetta di reagente si trovi nella posizione
ad essa assegnata e che sia ben inserita nella relativa rastrelliera.
11. Collocare la rastrelliera portaprovette di rivelazione sull'apposita
piattaforma. La taratura dell'analizzatore COBAS® AMPLICOR® richiede
sei provette di rilevazione (coppette D) per ciascun campione e controllo e
due provette per ciascuna cassetta di substrato di lavoro.
12. Collocare gli anelli A nei segmenti del termociclatore dell'analizzatore
COBAS® AMPLICOR®.
13. Caricare gli anelli A nell'analizzatore COBAS® AMPLICOR® utilizzando la
tastiera o il lettore di codici a barre oppure utilizzando il software AMPLILINK.
14. Creare un elenco di lavoro degli anelli A.
24/53
HIV-1 MONITOR
Nota
In questa fase, l'operatore deve immettere nell'analizzatore COBAS®
AMPLICOR® il numero di copie specifico al lotto dello standard di
quantificazione e le gamme dei controlli positivi alto e basso riportate sulla
scheda dei valori del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1, v1.5. Immettere le
gamme dei controlli appropriate alla procedura di preparazione dei campioni
utilizzata (standard o ultrasensibile), utilizzando la tastiera, il lettore di codice a
barre o il software AMPLILINK nel corso dell'impostazione dell'elenco di
lavoro degli anelli A.
15. Chiudere bene il coperchio dei segmenti del termociclatore.
16. Avviare l'analizzatore COBAS® AMPLICOR®.
17. Attendere che l'analizzatore COBAS® AMPLICOR® indichi il superamento della
verifica di caricamento.
Nota
Il sistema COBAS® AMPLICOR® permette di eseguire due diverse analisi del
contenuto di ciascuna provetta di amplificazione (provetta A). L'analizzatore
COBAS® AMPLICOR® calcola la quantità necessaria di ciascun reagente di
rilevazione. La verifica di caricamento eseguita all'inizio di ciascuna serie
determina se siano disponibili o meno i reagenti sufficienti per il test richiesti.
18. L'analizzatore COBAS® AMPLICOR® esegue automaticamente la trascrizione
inversa, l'amplificazione, la diluizione dell'amplicon e la rivelazione. I risultati
sono espressi come numero di copie di RNA dell'HIV-1/ml.
Nota
Risultati
Calcolo dei risultati
Per ciascun campione e controllo, l'analizzatore COBAS® AMPLICOR® effettua
automaticamente le seguenti operazioni:
•
Seleziona tutte le diluizioni dell'amplicon dell'HIV-1 e dello standard di
quantificazione comprese nella gamma lineare di assorbanza del test
(0,15 - 2,0 A660). Per il calcolo del risultato occorre che almeno una
diluizione dell'amplicon dell'HIV-1 ed una dell'amplicon dello standard di
quantificazione rientrino in tale gamma.
•
Corregge tutti i valori selezionati di assorbanza in funzione dell’assorbanza
di sfondo.
•
Determina l'accettabilità del valore A660 dell'HIV-1 QS, confermando la
buona esecuzione delle fasi di preparazione del campione, trascrizione
inversa, amplificazione e rivelazione
•
Determina se tutte le diluizioni target di HIV-1 (–) C abbiano o meno una
assorbanza ≤ 0,099 A660.
•
Stabilisce l'assorbanza totale dell'HIV-1 e dello standard di quantificazione
QS e calcola i valori delle copie dei controlli HIV-1 L(+)C ed
HIV-1 H(+)C e di ogni campione, usando il valore della massima assorbanza
totale.
•
Determina se il numero calcolato di copie dei controlli HIV-1 L(+)C ed
HIV-1 H(+)C rientri o meno nella gamma assegnata.
•
Stampa i valori di assorbanza A660 di tutte le diluizioni dell'HIV-1 e dello standard
di quantificazione ed il numero calcolato di copie (copie di RNA dell'HIV-1/ml)
di ciascun campione e controllo. Il numero di copie compare sullo stampato del
risultato in notazione scientifica sotto l'identificazione del campione.
25/53
Nota
A discrezione dell'utente, i risultati del test possono essere convertiti
manualmente da copie/ml ad unità internazionali (UI/ml).
Sulla base di uno studio collaborativo, il fattore di conversione per il primo
standard internazionale per l'RNA dell'HIV-1 è 0, 51 copie di RNA dell'HIV-1
per unità internazionali (UI).36
Convalida della serie
Controllare lo stampato alla ricerca di avvisi e di commenti, verificando la
validità della serie. La serie non è valida se uno dei seguenti avvisi o commenti
appare in relazione ai controlli HIV-1 MONITOR.
Avviso
_Q_
Commento
QS_INVALID
_N_
_H_
_L_
NC_INVALID
HPC_INVALID
LPC_INVALID
OD_SEQUENCE
Interpretazione
Il valore di A660 dell'HIV -1 QS di un qualsiasi controllo non rientra nella
gamma prevista.
Il valore di A660 dell'HIV-1 (–) C supera il limite accettabile (> 0,099).
Il numero di copie dell'HIV -1 H(+)C non rientra nella gamma assegnata.
Il numero di copie dell'HIV -1 L(+)C non rientra nella gamma assegnata.
Indica un valore target A660 fuori sequenza. Non verrà calcolato alcun
risultato. Ripetere l'intera procedura di test, compresa la preparazione,
amplificazione e rilevazione del campione e dei controlli.
Indica un valore QS A660 fuori sequenza. Non verrà calcolato alcun risultato.
Ripetere l'intera procedura di test, compresa la preparazione, amplificazione e
rilevazione del campione e dei controlli.
Tutti i valori target di densità ottica sono superiori al massimo dell'intervallo
specificato. Se questo flag è associato a un controllo positivo basso o alto,
l'analizzatore COBAS® AMPLICOR® non calcola un titolo. In assenza di un titolo
calcolato, il risultato del relativo controllo e la serie di test non saranno validi.
Tutti i valori target di densità ottica sono inferiori al minimo dell'intervallo
specificato. Se questo flag è associato a un controllo positivo basso o alto,
l'analizzatore COBAS® AMPLICOR® non calcola un titolo. In assenza di un titolo
calcolato, il risultato del relativo controllo e la serie di test non saranno validi.
Almeno un valore target di densità ottica è inferiore e uno è superiore all'intervallo
specificato, ma nessuno rientra nell'intervallo specificato. Se questo flag è associato
a un controllo positivo basso o alto, l'analizzatore COBAS® AMPLICOR® non
calcola un titolo. In assenza di un titolo calcolato, il risultato del relativo controllo
e la serie di test non saranno validi.
QS_SEQUENCE
TARGETOD_HI
TARGETOD_LO
TARG_RANGE
•
Revisione dei dati
Se la serie non è valida, ripetere l'intero test (preparazione del campione e del
controllo, trascrizione inversa, amplificazione e rivelazione).
L'analizzatore COBAS® AMPLICOR® fornisce uno stampato dei risultati A660
unitamente al numero di copie calcolate per ciascun campione e controllo. I valori
A660 per la diluizione in serie dell'amplicon target e dell'amplicon del QS dovrebbero
diminuire man mano che aumenta il fattore di diluizione, ad eccezione delle
diluizioni i cui valori A660 eccedano la gamma lineare del test (campioni a titolo alto)
o si avvicinino allo sfondo (campioni a titolo basso).
Diluizioni dell'amplicon dell'HIV-1
Le diluizioni in serie dell'HIV-1 no 1, 2, 3 e 4 sono pari rispettivamente all'amplicon
puro ed a diluizioni 1:9, 1:81 e 1:729 dell'amplicon del HIV-1. I valori di assorbanza
dovrebbero diminuire con l'aumentare della diluizione, con l'A660 più alta per ciascun
campione o controllo prodotta dalla prima diluizione (Diluizione no 1) e con l'A660 più
bassa rilevata nell'ultima diluizione (Diluizione no 4). Se i valori A660 dell'HIV-1 non
sono in sequenza, viene visualizzato un messaggio di errore OD_SEQUENCE relativo
al campione o al controllo in questione.
26/53
HIV-1 MONITOR
Diluizioni dell'amplicon dell'HIV-1 QS
Le diluizioni dello standard di quantificazione dell'HIV-1 no 1 e no 2 contengono
rispettivamente amplicon puro ed una diluizione 1:9 dell'amplicon QS dell'HIV-1. Se il
valore A660 della diluizione no 2 supera quello della diluizione no 1, si è verificato un
errore e viene visualizzato il messaggio QS_SEQUENCE. Il risultato non è valido.
Ripetere l'intera procedura di test (comprendente la preparazione, l'amplificazione e la
rilevazione) del campione o del controllo in questione.
Interpretazione dei risultati con valori A660 fuori sequenza
•
I valori A660 delle diluizioni dell'amplicon HIV-1 dovrebbero presentare un
andamento decrescente, inversamente proporzionale al fattore di diluizione,
ad eccezione delle diluizioni sature o con valori A660 di sfondo.
•
Nelle reazioni esibenti un alto numero di copie dell'RNA dell'HIV-1 per ml,
le diluizioni no 1, 2 e 3 possono divenire sature, producendo un valore ridotto
di assorbanza A660 (vedere l'esempio 1 nella Tabella 1). Questi risultati sono
validi, sebbene le diluizioni dell'HIV-1 non abbiano valori A660 decrescenti
dalla no 1 alla no 4.
•
Nelle reazioni che producono un basso numero di copie/ml dell'RNA
dell'HIV-1, le diluizioni no 2, 3 e 4 possono generare valori A660 di sfondo
(vedere l'esempio 2 nella Tabella 1) Questi risultati sono validi, sebbene le
diluizioni dell'HIV-1 non abbiano valori A660 decrescenti dalla no 1 alla no 4.
•
Tutte le diluizioni con valori A660 tra 0,15 e 2,0 dovrebbero presentare un
andamento decrescente, inversamente proporzionale alle diluizioni dalla no 1
alla no 4. Se i valori di assorbanza compresi tra A660 0,15 e 2,0 non seguono
andamento decrescente dalla diluizione no 1 alla no 4, si è verificato un
errore (vedere gli esempi 3, 4 e 5 nella Tabella 1). I risultati non sono validi.
Ripetere l'intero procedimento di test (compresa la preparazione,
l'amplificazione e la rilevazione) per tale campione o controllo.
Tabella 1
Esempi di risultati A660 fuori sequenza
A660 target
(Fattore di diluzione)
*
Esempio 1
1:1
2,578
1:9
3,603
1:81
3,201
1:729
*0,700
A660 del QS
(Fattore di
diluzione)
1:1
1:9
2,618 *0,397
Esempio 2
*0,216
0,004
0,016
0,007
3,236
*0,743
Esempio 3
0,002
0,007
0,004
0,339
4,218
*0,883
Esempio 4
3,052
1,597
3,384
2,887
1,357
*0,158
Esempio 5
0,016
0,267
0,007
0,004
3,612
*0,793
Risultati dell’interpretazione
VALIDO: titlolo esemplare alto A660
sopra alla gamma di assorbanza lineare.
VALIDO: titolo esemplare basso A660
al livello di rilevazione o vicino.
Viene visualizzato il messaggio
NON VALIDO: OD_SEQUENCE
Denota il valore A660 scelto dall'analizzatore COBAS® AMPLICOR® per il calcolo del risultato, come indicato nello stampato. Non
viene selezionato alcun risultato per i campioni con valori A660 fuori sequenza.
27/53
Interpretazione
dei risultati
Per determinare la validità della serie, controllare la presenza di avvisi o del
campione commenti sullo stampato dei risultati di ciascun campione: Interpretare
i risultati come segue:
Nota
L'analizzatore COBAS® AMPLICOR® è stato programmato per segnalare gli
errori ed i risultati inconsistenti più comuni. Tuttavia, ai fini del processo di
valutazione dei dati di routine di ciascun laboratorio, si suggerisce di
controllare i valori A660 per garantire la massima integrità dei risultati.
•
Nel caso di campioni privi di avvisi o commenti, relazionare i risultati stampati.
•
Una serie valida può comprendere risultati sia validi che non validi a seconda degli
avvisi e/o commenti relativi ai singoli campioni.
•
I campioni contraddistinti da avvisi e/o commenti vanno interpretati come segue:
Avviso
Commento
_Q_
QS_INVALID
Nessuna diluizione del QS presenta un valore A660 rientrante nella gamma lineare
di assorbanza del saggio. Il risultato relativo a questo campione non è valido. I
campioni i cui risultati non siano validi vanno rianalizzati, ripetendo la preparazione
dei campioni e dei controlli, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rilevazione.
TARGETOD_LO
Il valore A660 di tutte le diluizioni di HIV-1 è inferiore al limite minimo di linearità
del saggio. Relazionare i risultati come “RNA dell'HIV-1 non rilevato (inferiore a
400 copie di RNA dell’HIV-1/ml)” quando si usa la procedura standard, oppure
come “RNA dell'HIV-1 non rilevato (inferiore a 50 copie/ml)” quando si usa la
procedura ultrasensibile di preparazione dei campioni.
TARGETOD_HI
Il valore A660 di tutte le diluizioni di HIV-1 è superiore al limite massimo di
linearità del saggio. Relazionare i risultati come “Non determinato”. Quando si usa
la procedura standard di preparazione dei campioni, preparare una diluizione del
campione originale con plasma umano HIV-negativo e ripetere il test usando la
procedura di preparazione standard. Moltiplicare il risultato relazionato per il fattore
di diluizione. Quando si usa la procedura ultrasensibile di preparazione dei
campioni, rianalizzare il campione originale di plasma usando la procedura
standard.
RESULT_LO
Le copie/ml calcolate sono inferiori al limite minimo di linearità del test. Nel caso
della procedura standard di preparazione dei campioni, relazionare i risultati come
“RNA dell'HIV-1 rilevato, inferiore a 400 copie di RNA dell'HIV-1/ml”. Per
ottenere risultati quantitativi, rianalizzare il campione originale di plasma adottando
la procedura ultrasensibile di preparazione. Nel caso della procedura ultrasensibile
di preparazione dei campioni, relazionare i risultati come “RNA dell'HIV-1 rilevato,
inferiore a 50 copie di RNA dell'HIV-1/ml”.
RESULT_HI
Le copie/ml calcolate superano il limite massimo di linearità del test. Nel caso della
procedura standard di preparazione dei campioni, relazionare i risultati come
“Superiori a 7,5 x 105 copie di RNA dell'HIV-1/ml.” Per ottenere risultati quantitativi,
rianalizzare il campione originale di plasma dopo averlo diluito con plasma umano
HIV-1-negativo. Moltiplicare il risultato ottenuto per il fattore di diluizione. Nel caso
della procedura ultrasensibile di preparazione dei campioni, relazionare i risultati
come “Superiori a 1,0 x 105 copie di RNA dell'HIV-1/ml.”. Rianalizzare il campione
originale per ottenere risultati quantitativi.
TARG_RANGE
Non tutti i valori target A660 rientrano nella gamma lineare del test. Relazionare
i risultati come “Non determinati”. Ritestare il campione originale ripetendo la
preparazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rilevazione del
campione.
OD_SEQUENCE
Indica un valore target A660 fuori sequenza. Non verrà calcolato alcun
risultato. Ripetere l'intera procedura di test, compresa la preparazione,
amplificazione e rilevazione del campione e dei controlli.
QS_SEQUENCE
Indica un valore QS A660 fuori sequenza. Non verrà calcolato alcun risultato.
Ripetere l'intera procedura di test, compresa la preparazione, amplificazione e
rilevazione dei campioni e dei controlli.
28/53
Interpretazione
HIV-1 MONITOR
Controllo qualità
Includere in ogni serie di test un duplicato del controllo AMPLICOR® HIV-1
MONITOR(–), uno del controllo AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (+) basso ed
uno del controllo AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (+) alto. Com'è il caso con
qualsiasi procedura nuova di laboratorio, i nuovi operatori dovrebbero
considerare l'uso di ulteriori controlli positivi e negativi ogni volta che eseguono
il test e finché non conseguono un elevato livello di fiducia nelle proprie capacità
di svolgimento corretto della procedura. La posizione dei controlli negli anelli A è
del tutto facoltativa.
Controllare lo stampato alla ricerca di avvisi e di commenti, verificando la
validità della serie.
Controllo negativo
Il controllo negativo HIV-1 (–) deve produrre un risultato “HIV-1 RNA Not
Detected”, ovvero tutti i valori di assorbanza A660 dell'HIV-1 devono essere
≤ 0,099. Se il controllo negativo non soddisfa i criteri, è necessario rifiutare l'intera
sequenza Ripetere l'intera procedura (preparazione dei campioni e dei controlli,
trascrizione inversa, amplificazione e rilevazione). Se l'assorbanza del controllo
HIV-1 (–) è costantemente superiore a 0,099, rivolgersi all'ufficio locale di
assistenza tecnica Roche.
Controlli positivi
La gamma assegnata ai controlli AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (+) basso e (+)
alto è specifica di ciascun lotto di controlli, a seconda del metodo di preparazione
dei campioni utilizzato (standard o ultrasensibile) ed è riportata sulla scheda dei
dati del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 fornita assieme al kit.
Tali gamme vengono immesse nell'analizzatore COBAS® AMPLICOR® per
mezzo della tastiera, del lettore di codici a barre o del software AMPLILINK
durante l'impostazione dell'elenco di lavoro degli anelli A.
Il numero di copie di RNA dell'HIV-1/ml per entrambi i controlli HIV-1
MONITOR (+) basso ed HIV-1 MONITOR (+) alto deve rientrare nella gamma
indicata sulla scheda dei dati del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR,
v1.5. Se uno o entrambi i controlli positivi non soddisfano questi criteri, l'intera
serie va considerata non valida. Ripetere l'intera procedura (preparazione dei
campioni e dei controlli, trascrizione inversa, amplificazione e rilevazione). Se il
numero di copie di RNA dell'HIV-1/ml di uno o entrambi i controlli positivi
HIV-1 MONITOR (+) eccede costantemente la gamma assegnata, rivolgersi
all'ufficio locale di assistenza tecnica Roche.
Precauzioni procedurali
Il flusso di lavoro di laboratorio deve procedere in modo unidirezionale,
cominciando nell'area di preamplificazione per poi passare all'area di
postamplificazione (amplificazione/rilevazione). Le attività di preamplificazione
devono iniziare con la preparazione del reagente e procedere con la preparazione
del campione. Le forniture e le attrezzature devono essere dedicate a ciascuna
attività di preamplificazione e non devono essere usate per altre attività né
spostate da un'area all'altra. Indossare guanti in ciascuna area e cambiarli prima di
uscire da tale area. Le forniture e le attrezzature usate per la preparazione dei
reagenti non devono essere usate per le attività di preparazione dei campioni, per
il pipettamento né per il trattamento del DNA amplificato o di altre fonti di DNA
target. Le forniture e le attrezzature di postamplificazione devono rimanere
sempre in tale area.
29/53
Com'è il caso con qualsiasi procedura di test, è essenziale osservare una buona
prassi di laboratorio per eseguire questa analisi. Vista l'elevata sensibilità analitica
di questo test, esercitare estrema cautela nel preservare la purezza dei reagenti del
kit e delle miscele di amplificazione. È necessario monitorare attentamente la
purezza di tutti i reagenti. Gettare via qualsiasi reagente sospetto.
Limiti della procedura
Questo test è stato convalidato per l'uso solamente con plasma umano e raccolto
in anticoagulanti EDTA o ACD. L'analisi di altri tipi di campione può produrre
risultati falsonegativi o falsopositivi. L'eparina inibisce la PCR; i campioni
raccolti usando eparina quale anticoagulante non devono essere sottoposti al
test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5.
Il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 è stato ottimizzato per i
sottotipi A-H del gruppo M dell'HIV-1. Il rendimento del test COBAS®
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 con il gruppo O dell'HIV-1 e con l'HIV-2
sono sconosciute. Non usare questo test per la gestione clinica di pazienti infetti
dal virus dell'HIV-2 o dal virus del gruppo O dell'HIV-1.
L'affidabilità dei risultati dipende dall'adeguatezza delle procedure di prelievo,
trasporto, conservazione e trattamento dei campioni.
La presenza di AmpErase nell'AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Master Mix, v1.5
riduce il rischio di contaminazione dell'amplicon. Comunque, la contaminazione
da controlli HIV-1-positivi e da campioni clinici HIV-1-positivi può essere evitata
solamente grazie ad una buona prassi di laboratorio ed all'attenta osservanza delle
procedure specificate in questo manuale metodologico.
L'uso di questo prodotto è limitato al personale specializzato nelle tecniche di
PCR.
Questo prodotto può essere usato solamente assieme all'analizzatore COBAS®
AMPLICOR®.
L'identificazione dell'RNA dell'HIV-1 dipende dal numero di particelle virali
presenti nel campione e può essere influenzata dal metodo di prelievo del
campione e da fattori legati al paziente (ad esempio età, presenza di sintomi e/o
stadio dell'infezione).
Anche se rare, le mutazioni della regione altamente conservata del genoma virale
coperta dai primer e/o dalla sonda del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, v1.5 possono dare luogo a risultati sottostimati o alla mancata
identificazione del virus.
A causa delle differenze intrinseche tra le tecnologie, è consigliabile che gli
utenti, prima di passare da una tecnologia a un’altra, svolgano studi sulla
correlazione tra i metodi nei propri laboratori alla scopo di quantificare tali
differenze.
30/53
HIV-1 MONITOR
Direttive procedurali
La scelta della procedura standard o ultrasensibile di preparazione dei campioni
dipende dalla popolazione di pazienti servita dal laboratorio. Si consiglia a
ciascun laboratorio di valutare le caratteristiche della popolazione dei pazienti per
stabilire la miglior procedura iniziale di analisi ed i criteri determinanti l'utilizzo
della procedura alternativa di preparazione dei campioni. Per esempio, se la
popolazione dei pazienti non comprende pazienti in fase precoce di trattamento
oppure se tutti i pazienti sono soggetti a terapia antiretrovirale, il laboratorio può
decidere di usare la procedura ultrasensibile quale metodo di preparazione di
routine dei campioni, per ripiegare sulla procedura standard quando i risultati del
carico virale superano le 100.000 copie/ml. Se non si conosce la terapia a cui è
sottoposta la popolazione dei pazienti o i risultati di riferimento del relativo carico
virale, il laboratorio può adottare la preparazione standard quale procedura di
routine ed utilizzare la procedura ultrasensibile di preparazione dei campioni solo
quando si ottengono risultati di carico virale inferiori a 400 copie/ml.
Sostanze interferenti
L'eparina inibisce la PCR. Non usare campioni eparinati.
È stato dimostrato che la presenza nei campioni di livelli elevati di lipidi,
bilirubina ed emoglobina non interferisce con la quantificazione dell'RNA
dell'HIV-1 per mezzo di questo test.
È stato dimostrato che i seguenti farmaci non interferiscono con la
quantificazione dell'RNA dell'HIV-1 per mezzo del test AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, v1.5:
Inibitori della proteasi dell'HIV
• indinavir
• ritonavir
• nelfinavir
• saquinavir
Inibitori della trascrittasi
inversa non nucleosidica
• HBY 097
• nevirapina
• delavirdina
Inibitori della trascrittasi
inversa nucleosidica dell'HIV
• zidovudina
• didanosina
• zalcitabina
• stavudina
• lamivudina
Composti di trattamento
CMV
• ganciclovir
• ganciclovir valinato
31/53
Valutazione del rendimento non clinico
Descrizione dello studio
Il limite di quantificazione, la precisione e la gamma lineare del test COBAS®
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 sono state determinate analizzando uno
stock di colture ben caratterizzate di HIV-1, diluito in serie in plasma umano HIVnegativo. Lo stock virale è stato fornito dal Virology Quality Assurance (VQA)
Laboratory dell'AIDS Clinical Trials Group (ACTG), Division of AIDS, National
Institutes of Health di Bethesda, MD, USA. La concentrazione di RNA virale
dello stock è stata stimata mediante microscopia elettronica, determinazione del
titolo di antigene p24, test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 e analisi del
DNA ramificato. Tutti i metodi hanno prodotto risultati paragonabili37. La
preparazione e l'analisi dei campioni con il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, v1.5 sono state eseguite presso la Roche Diagnostics. Il pannello di
diluizioni seriali è stato analizzato quotidianamente per 12 giorni usando le
procedure standard ed ultrasensibile con due lotti di test COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5.
Limite di quantificazione Gli studi descritti sopra hanno dimostrato che il test COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5 può rilevare con un tasso di positività superiore al 95%
una concentrazione minima di 50 copie/ml di RNA dell'HIV-1 plasmatico
associato al virione usando la procedura ultrasensibile di trattamento dei campioni
ed una concentrazione minima di 400 copie di RNA/ml usando la procedura
standard (Tabella 2), purché la DO della coppetta D selezionata rientri nella
gamma specificata (da 0,15 a 2,00).
Tabella 2
Limite di quantificazione del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
Preparazione standard dei campioni
Conteggio
nominale
Numero
(copie di RNA di duplicati
dell'HIV-1/ml)
850.000
750.000
650.000
500.000
350.000
100.000
35.000
7.000
2.000
600
500
400
250
175
32/53
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
48
36
36
36
Numero
di positivi
36
36
36
36
36
36
36
36
36
36
46
36
29
27
Preparazione ultrasensibile dei campioni
Conteggio
Tasso
nominale
Numero
di positività (copie di RNA di duplicati
dell'HIV-1/ml)
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
96%
100%
81%
75%
100.000
75.000
50.000
35.000
25.000
5.000
1.000
400
100
80
60
50
40
25
36
36
36
36
35
35
36
32
36
36
36
36
36
36
Numero
di positivi
Tasso
di positività
36
36
36
36
35
35
36
32
36
36
35
35
32
29
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
97%
97%
89%
81%
HIV-1 MONITOR
Precisione
La precisione nella serie e la precisione totale sono state valutate con i metodi
definiti nelle direttive del CLSI EP5-T2, “Evaluation of Precision Performance
of Clinical Chemistry Devices”. Questa procedura permette di determinare la
precisione nella serie e la precisione totale nel corso di un unico studio svolto in
diversi giorni e da operatori diversi. Una serie, composta da 3 duplicati di ciascun
campione è stata eseguita ogni giorno per 12 giorni. Ciascun campione è stato
sottoposto all'intera procedura del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, v1.5, comprendente la preparazione del campione, la trascrizione
inversa, l'amplificazione e la rilevazione. Pertanto, la precisione qui riportata
tiene conto di tutti gli aspetti della procedura analitica. I risultati di questo studio
di precisione sono illustrati nelle Tabelle 3 e 4.
Tabella 3
Precisione del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
Procedura standard di preparazione dei campioni
Campione
Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4
Numero tot. di duplicati
36
36
36
36
Titolo medio di RNA
705
10.056
162.119
535.083
dell'HIV-1(copie/ml)
Nella serie
Deviazione standard
341
3.082
44.188
148.708
CV
48%
31%
27%
28%
Totale
Deviazione standard
340
2.916
53.556
190.702
CV
48%
29%
33%
36%
Tabella 4
Precisione del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
Procedura ultrasensibile di preparazione dei campioni
Campione
Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4
Numero tot. di duplicati
36
36
35*
36
Titolo medio di RNA
84
1.045
5.578
39.825
dell'HIV-1(copie/ml)
Nella serie
Deviazione standard
44
331
823
12.451
CV
52%
32%
15%
31%
Totale
Deviazione standard
39
382
1350
12.074
CV
47%
37%
24%
30%
* Un risultato non valido dello standard di quantificazione, ottenuto con il campione 3,
non è stato incluso nel calcolo della precisione.
33/53
Gamma lineare
Come illustrato nella Figura 3, è stato riscontrato che il test COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5 fornisce una risposta lineare da 50 (log10 = 1,70) copie di
RNA dell'HIV-1/ml ad almeno 100.000 (log10 = 5,00) copie di RNA dell'HIV-1/ml
utilizzando la procedura ultrasensibile di preparazione dei campioni e da
400 (log10 = 2,60) copie di RNA dell'HIV-1/ml ad almeno 750.000 (log10 = 5,87) copie
di RNA dell'HIV-1/ml utilizzando la procedura standard. Inoltre è stata evidenziata
una forte correlazione tra la procedura ultrasensibile e quella standard di preparazione
dei campioni all'interno della gamma lineare comune del test COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5, ovvero da 400 a 100.000 copie/ml.
7,0
Preparazione standard dei campioni
y = -0,16731 + 1,06x R=0,99912
Preparazione ultrasensibile dei campioni
y = -0,18823 + 1,0465x R=0,99946
6,0
5,0
4,0
3,0
10
Risultati del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
Log (copie di RNA dell'HIV-1/ml)
Figura 3
Linearità del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
Preparazione standard ed ultrasensibile dei campioni
2,0
1,0
Barre di errore = 1 deviazione standard
N = 27 a 36
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Concentrazione nominale
Log (copie di RNA dell'HIV-1/ml)
Inclusività
10
(prestazioni del test con
i sottotipi del gruppo M) Gli isolati di HIV-1 raccolti in tutto mondo evidenziano una considerevole
diversità genetica e possono essere classificati in gruppi filogeneticamente
correlati in base alla sequenza nucleotidica38,39. Il gruppo M (o Major) comprende
la vasta maggioranza di isolati HIV-1, il gruppo O (o Outlier) rappresenta un
piccolo numero di isolati, provenienti in maggioranza dal Camerun e dal Gabon.
Il gruppo M può essere ulteriormente suddiviso in almeno 9 sottotipi (o cladi)
denominati con le lettere da A ad I.
Il rendimento del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 nei
confronti dei sottotipi del gruppo M è stato valutato analizzando colture di
30 isolati ben caratterizzati, rappresentanti i sottotipi da A a G (vedere la
Tabella 5). Ciascun isolato è stato colturato in vitro. Ciascun isolato è stato
colturato in vitro. Le concentrazioni degli stock virali sono state stimate mediante
conteggio delle particelle al microscopio elettronico secondo il metodo di Layne et
al40. Ciascuno stock virale è stato diluito in plasma umano negativo fino ad
ottenere una concentrazione di circa 12.500 e 1.250 particelle virali/ml. Ciascuna
diluizione dello stock virale è stata successivamente analizzata presso la Roche
Diagnostics, usando sia la procedura ultrasensibile di preparazione dei campioni
che quella standard. Visto che ciascuna particella virale contiene due genomi virali,
era prevista una concentrazione di RNA dell'HIV rispettivamente pari a circa
25.000 e 2.500 copie virali/ml.
34/53
HIV-1 MONITOR
I risultati dell'analisi eseguita sui 30 isolati con il test COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5 sono risultati concordi tra loro e con il conteggio previsto
delle particelle virali (vedere la Figura 4). Nel caso dei campioni da
25.000 copi/ml, il risultato medio della procedura standard di preparazione dei
campioni è stato pari a 43.906 copie/ml, con una gamma di variazione compresa
tra 18.567 e 82.917 copie/ml (4,5 volte) e quello della procedura ultrasensibile di
preparazione dei campioni si è attestato su 29.019 copie/ml, con una gamma di
variazione compresa tra 12.233 e 77.250 copie/ml (6,3 volte). Nel caso dei
campioni da 2.500 copie/ml, il risultato medio della procedura standard di
preparazione dei campioni è stato pari a 4.045 copie/ml, con una gamma di
variazione compresa tra 1.379 e 8.807 copie/ml (6,4 volte) e quello della
procedura ultrasensibile di preparazione dei campioni si è attestato su
3.710 copie/ml, con una gamma di variazione compresa tra 1.390 e 7.977 copie/ml
(5,7 volte). Questi risultati dimostrano la forte correlazione esistente tra la
procedura standard e quella ultrasensibile di preparazione dei campioni.
Gli isolati del gruppo O non sono stati analizzati. Il rendimento del test COBAS®
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR v1.5 nei confronti del gruppo O e ignoto.
Tabella 5
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
Analisi dell'inclusività dei sottotipi
Isolati HIV-1 analizzati
Sottotipi
Riferimento
No di accesso
GenBank
Isolato
Nazione di
isolamento
UG273
Uganda
A
43
L22957
DJ258
Gibuti
A
41, 43
L11763, L22939
DJ263
Gibuti
A
43, 47
AF063223, L22941
US1
USA
B
44
L14573
US2
USA
B
44
L14574
US3
USA
B
44
L14575
US4
USA
B
44
L14576
CM237
Tailandia
B
44
L14570
BK132
Tailandia
B
45
L03696, L03697
BZ167
Brasile
B
41, 42
L11752, L22087
ZAM18
Zambia
C
43, 46, 50
L03705, L22945
UG268
Uganda
C
41, 43, 46
L11799, L22948
ETH2220
Etiopia
C
46, 52
U46016
SE364
Senegal
C
43
L22944
SM145
Somalia
C
41, 43
L11803, L22946
L11797, L22945
SE365
Senegal
D
41, 43
UG270
Uganda
D
41
L11800
UG274
Uganda
D
41, 43, 46
L11801, L22950
CM235
Tailandia
E
45
L03698
CM238
Tailandia
E
41, 44
L11760, L14571
CM240
Tailandia
E
41, 44, 48
U54771, L11761, L14572
CM243
Tailandia
E
45
L03702, L03703
POC30506
Tailandia
E
46, 49
U48272
ID12
Indonesia
E
46, 51
U68193
ID17
Indonesia
E
46, 51
U68191
NP1465
Tailandia
E
46
Non incluso nella GenBank
BZ126
Brasile
F
42
L22083, L22082
BZ162
Brasile
F
41, 42
L11751, L22084
BZ163
Brasile
F
42
L22086, L22085
HH8793
Kenya
G
46, 47
AF061640
35/53
10
7
10
6
10
5
10
4
10
3
10
2
10
1
Ultrasensibile - 2,500 copie/ml
Ultrasensibile - 25,000 copie/ml
Standard - 2,500 copie/ml
Standard - 25,000 copie/ml
UG273 / A
DJ258 / A
DJ263 / A
US1 / B
US2 / B
US3 / B
US4 / B
CM237 / B
BK132 / B
BZ167 / B
ZAM18 / C
UG268 / C
ETH2220 / C
SE364 / C
SM145 / C
SE365 / D
UG270 / D
UG274 / D
CM235 / E
CM238 / E
CM240 / E
CM243 / E
POC30506 / E
ID12 / E
ID17 / E
NP1465 / E
BZ126 / F
BZ162 / F
BZ163 / F
HH8793 / G
Risultati del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
(copie di RNA dell'HIV-1/ml)
Figura 4
Linearità del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
nei confronti dei sottotipi di HIV-1 da A a G
Isolati e sottotipi
Specificità clinica
La specificità clinica del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
è stata determinata analizzando la presenza di anticorpi anti-HIV-1 nel sangue
prelevato da donatori HIV-1-negativi. 507 campioni in totale, anticoagulati con
EDTA (267) o con ACD (240), sono stati analizzati secondo la procedura standard
di preparazione dei campioni e 504 campioni, anticoagulati con EDTA (307) o
con ACD (197), sono stati analizzati secondo la procedura ultrasensibile.
In questo studio sono stati usati tre lotti del test COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5. Tutti i campioni sono risultati negativi all'RNA
dell'HIV-1 usando la procedura standard, come pure 503 campioni su 504 usando
la procedura ultrasensibile. L'unico campione risultato positivo all'RNA dell'HIV-1
secondo la procedura ultrasensibile di preparazione dei campioni ha evidenziato
una assorbanza HIV A660 della coppetta D contenente campione non diluito pari a
0,156 (vedere la Tabella 6). La rianalisi del campione in duplicato, usando la
procedura ultrasensibile, ha prodotto un risultato negativo identico per entrambi i
duplicati (HIV A660 nella coppetta D con duplicato non diluito = 0,002 e 0,002).
Assumendo che la prevalenza di infezione da virus HIV-1 nei donatori
sieronegativi sia pari a zero, la specificità clinica del test COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5 è pari al 100% con la procedura standard di preparazione
dei campioni ed al 99,8% con quella ultrasensibile.
Tabella 6
Specificità clinica del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
Donatori risultati negativi per la presenza di anticorpi anti-HIV
Procedura di
preparazione
dei campioni
Standard
Ultrasensibile
36/53
Numero
507
504
Copie di RNA
dell'HIV-1/ml
Non rilevato
507
503
Positivo
0
1
HIV-1 A660
(diluizione pura nella coppetta D)
Minima
0,000
0,000
Media
0,004
0,005
Massima
0,082
0,156
DS
0,006
0,010
HIV-1 MONITOR
Specificità analitica
La specificità analitica del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 è
stata valutata addizionando a plasma umano HIV-negativo (in conformità al passo
A.6. delle “Istruzioni per l'uso”) cellule o virus in coltura, oppure acido nucleico
purificato dei microrganismi o virus sottoelencati (Tabella 7). Ciascun campione è
stato analizzato usando il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
secondo la procedura standard di preparazione dei campioni. Nessuno dei
microrganismi, virus non HIV o acidi nucleici purificati si è dimostrato reattivo
all'RNA dell'HIV-1. Due dei quattro isolati di HIV-2 analizzati (7824A e 60415K)
hanno dato risultati positivi; tuttavia ciò non assevera la capacità specifica di questo
test di amplificare isolati di HIV-2.
Tabella 7
Campioni per specificità analitica
Adenovirus tipo 2
Adenovirus tipo 3
Adenovirus tipo 7
Citomegalovirus AD-169
Citomegalovirus Davis
Citomegalovirus Towne
Virus di Epstein-Barr P-3
(linfoma di Burkitt)
Virus di Epstein-Barr HR1
(linfoma di Burkitt)
Virus di Epstein-Barr
(linfoma di RAJI - Burkitt)
Varicella-Zoster Ellen
Varicella Oka
Virus dell'epatite B
Virus dell'epatite C genotipo 1a
Virus dell'epatite C genotipo 1b
Virus dell'epatite C genotipo 2b
Virus dell'epatite C genotipo 3a
Virus dell'epatite C genotipo 4c
HIV-2 BEN
HIV-2, sottotipo A/B (isolato 7312A)
HIV-2 sottotipo A/B (isolato 7824A)
HIV-2 sottotipo A/B (isolato 60415K)
Virus Herpes 6 umano
Virus Herpes 7 umano
Herpes simplex tipo 1, F
Herpes simplex tipo 1, HF
Herpes simplex tipo 1, MacIntyre
Herpes simplex tipo 2, G
Herpes simplex tipo 2, MS
Virus Papilloma umano 6b
Virus Papilloma umano 11
Cellule HTLV-I MT-2
Cellule HTLV-II MoT
Mycobacterium avium
Pneumocystis carinii
Propionibacterium acnes
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Performance comparata
al test AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5
Il rendimento del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 è stato
paragonato a quello del test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, analizzando
campioni di plasma di soggetti HIV-1-positivi, ottenuti presso la Biochemical
Partners, Inc. (Franklin, MA). Tali campioni non erano stati analizzati in
precedenza con il test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 e si presupponeva
appartenessero al sottotipo B. Sono stati messi a confronto 289 campioni
sottoposti alla procedura standard di preparazione dei campioni e 332 campioni
sottoposti alla procedura ultrasensibile. La correlazione è stata determinata
usando campioni quantificati sia con il test COBAS® AMPLICOR® che con il test
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (225 campioni sottoposti a preparazione
standard e 259 soggetti sottoposti a preparazione ultrasensibile). L'analisi della
regressione lineare di tali campioni ha prodotto risultati rientranti nella gamma
lineare della procedura standard di preparazione dei campioni (400-750.000
copie/ml), come illustrato nella Figura 5, e nella gamma lineare della procedura
ultrasensibile di preparazione dei campioni (50-100.000 copie/ml), come
illustrato nella Figura 6. I risultati del test COBAS® AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, v1.5 e quelli del test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
presentano una elevatissima correlazione per entrambe le procedure di
preparazione.
37/53
7,0
y = 0,33206 + 0,95588x R=0,93668
6,0
5,0
4,0
3,0
10
Log delle copie di RNA dell'HIV-1/ml
Figura 5
Correlazione tra il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 ed
il test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 in base all'analisi di
campioni di plasma prelevati da pazienti HIV-1-positivi
Procedura standard di preparazione dei campioni
2,0
1,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
10
Figura 6
Correlazione tra il test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 ed
il test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 in base all'analisi
di campioni di plasma prelevati da pazienti HIV-1-positivi
Procedura ultrasensibile di preparazione dei campioni
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
10
y = 0,27412 + 0,93427x R=0,91887
1,0
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
10
38/53
HIV-1 MONITOR
Rendimento clinico
Negli studi seguenti, la carica virale è stata analizzata con il test AMPLICOR® HIV1 MONITOR. Gli studi sono stati condotti negli Stati Uniti e tutti i partecipanti erano
presunti positivi al sottotipo B dell'HIV-1. Questi studi hanno permesso di
determinare le prestazioni cliniche del test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5,
in quanto è stato dimostrato che le due versioni dell'AMPLICOR® HIV-1
MONITOR hanno rendimenti equivalenti (ad eccezione dei sottotipi non B) e
producono risultati equivalenti con i campioni del sottotipo B.
Prognosi
L'impiego del test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR per pronosticare il rischio di
progressione della malattia nei soggetti HIV-positivi è stato valutato negli studi ACTG
116A e 116B/117. I dati ottenuti in questi studi sono stati analizzati mediante il
modello di rischio proporzionale di Cox (Cox Proportional Hazards Model) per
valutare la frequenza di progressione della malattia in funzione del livello di RNA
dell'HIV-1. Lo studio ACTG 116A in doppio cieco, ha messo a confronto l'efficacia
clinica della zidovudina (ZDV), somministrata in associazione a due dosi di 2',3'dideossiinosina (ddI) in pazienti con infezione avanzata da HIV, trattati in precedenza
con zidovudina per un massimo di 16 settimane. Lo studio 116B/117 ha messo a
confronto l'efficacia terapeutica della 2',3'-dideossiinosina (ddI) e della zidovudina in
pazienti infetti da HIV e trattati in precedenza con ZDV per più di 16 settimane.
A ciascuno di questi studi hanno partecipato pazienti con diagnosi iniziale di AIDS,
di ARC e pazienti asintomatici. La progressione della malattia era definita come
progressione verso l'AIDS, emersione di un nuovo evento clinico indicativo di AIDS
oppure decesso.
Lo studio sull'RNA dell'HIV-1, subordinato all'ACTG 116A, ha interessato
186 pazienti, partecipanti allo studio clinico, dai quali erano stati prelevati all'inizio
dello studio campioni di plasma e di cellule mononucleate del sangue periferico
(PBMC). Questi campioni sono stati adeguatamente conservati e resi disponibili per
le analisi. Lo studio dell'RNA dell'HIV-1 subordinato all'ACTG 116B/117, ha
coinvolto 99 pazienti scelti a caso tra i partecipanti allo studio, dai quali erano stati
prelevati all'inizio dello studio campioni di plasma. Tali campioni sono stati
adeguatamente conservati e resi disponibili per le analisi.
I rischi relativi bilanciati e non bilanciati di progressione della malattia, misurati in
termini di livelli di riferimento dell'RNA dell'HIV-1, di variazione dei livelli di RNA
dell'HIV-1 nel corso di otto settimane e di conteggio delle cellule CD4+, sono stati
valutati con il modello di rischio proporzionale di Cox. Il rischio relativo non
bilanciato rappresenta il rischio conferito dalla sola variabile, mentre il rischio relativo
bilanciato rappresenta il rischio conferito da tale variabile dopo il controllo delle altre
variabili considerate nel modello. Queste analisi statistiche hanno determinato
l'eventuale incremento di rischio di progressione della malattia associato alle variabili
incluse nel modello. Le analisi sono state eseguite stabilendo i rischi relativi ad una
differenza quintupla della variabile in esame. I risultati sono presentati nelle
Tabelle 8 - 11 e dimostrano che, in una popolazione di pazienti affetti da HIV in fase
avanzata e soggetti a terapia con inibitori specifici alla trascrittasi inversa, un aumento
di 5 volte del livello di riferimento del RNA dell'HIV-1 è associato ad un aumento del
rischio di progressione della malattia. Nei pazienti trattati con ZDV per più di
16 settimane (partecipanti allo studio ACTG 116B/117), livelli di RNA dell'HIV-1
quintupli rispetto a quelli di riferimento non hanno evidenziato un valore predittivo
statisticamente significativo. Per i pazienti precedentemente non trattati con ZDV o
trattati soltanto per 16 settimane o meno, una variazione di 5 volte tra i livelli di RNA
di riferimento e quelli rilevati nel corso dell'ottava settimana ha dimostrato un valore
predittivo statisticamente significativo. Nel caso dei pazienti in terapia con ZDV per
più di 16 settimane, non è emersa la significatività statistica del valore predittivo di
una variazione di 5 volte tra i livelli di RNA di riferimento e quelli riscontrati durante
la settimana 8.
39/53
Per ciascuno studio è stata anche analizzata la frequenza della progressione della
malattia, dividendo ciascuna popolazione di pazienti in decili, in ordine di rango
rispetto al livello di riferimento dell'RNA dell'HIV-1. I decili sono stati valutati per
determinare la frequenza di progressione della malattia. Ciascuno studio ha
evidenziato una frequenza di progressione della malattia pari o superiore al 60% per
tutti i pazienti con livelli di riferimento di RNA dell'HIV-1 superiori a 250.000
copie/ml. Nello studio 116A, è emersa una frequenza di progressione della malattia di
circa il 35% nei pazienti dei primi quattro decili (< 11.912, < 34.661, < 72.438 e
< 103.806 copie di RNA dell'HIV-1 /ml). La frequenza di progressione della malattia
è stata pari al 40% - 50% nei tre decili seguenti (< 15.695, < 194.312 e < 247.229).
Negli ultimi tre decili, con livelli di RNA virale superiori a 250.000 copie/ml, la
frequenza di progressione della malattia ha superato il 60%. Nello studio 116B/117,
anche se la frequenza di progressione ha evidenziato una maggiore variabilità, è stata
comunque osservata una tendenza generale all'incremento della frequenza di
progressione della malattia proporzionale all'innalzamento dei livelli di RNA
dell'HIV-1. In questo studio, per i primi 6 decili (< 11.571, < 31.292, < 49.743,
< 62.132, < 97.781 e < 150.866 copie di RNA dell'HIV-1/ml), la frequenza media di
progressione della malattia è risultata pari al 30% (gamma = 10% - 60%). Nei due
decili successivi (< 251.627 e < 403.146 copie di RNA dell'HIV-1/ml) la frequenza di
progressione della malattia ha raggiunto rispettivamente il 50% ed il 60%. Per gli
ultimi due decili (< 794.027 e < 1.456.302), esibenti livelli di RNA dell'HIV-1
superiori a 403.000, la frequenza di progressione della malattia ha superato l'80%.
I risultati di queste analisi sono illustrati nelle Figure 7 e 8 sotto forma di tabelle
riassuntive e di istogrammi.
Determinazione della
risposta alla terapia
antiretrovirale
L'impiego del test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR per misurare gli effetti della
terapia antiretrovirale è stato valutato in uno studio clinico di farmaci antiretrovirali
comprendenti l'inibitore della trascrittasi inversa zalcitabina (ddC, marca
commerciale: HIVID), l'inibitore della proteasi saquinavir (SAQ, marca commerciale:
INVIRASE) e le combinazioni di questi due farmaci. Lo studio (denominato
NV14256) di fase III, casualizzato ed in doppio cieco, ha avuto per scopo principale la
valutazione, in base ai risultati clinici di riferimento, della sicurezza, tollerabilità ed
efficacia di tre trattamenti (ddC, SAQ e combinazione di SAQ e ddC) in pazienti che
avevano interrotto l'assunzione della ziduvidina o ZDV (o che non potevano
assumerla), mettendo a confronto la sopravvivenza nei tre gruppi di trattamento
[compreso il decesso a seguito di un evento indicativo di AIDS (ADE o AIDS
Defining Event) o la tossicità dose-limitante].
Lo studio NV14256 ha assunto quale criterio di inclusione il trattamento precedente
con ZDV. La maggior parte dei pazienti partecipanti allo studio era stata trattata
precedentemente con ZDV per più di un anno. Allo studio NV14256 hanno
partecipato 970 pazienti in totale, presso 49 siti clinici. I pazienti sono stati suddivisi in
tre gruppi di trattamento: ddC (325), Saquinavir (327) e SAQ + ddC (318). In base alle
caratteristiche demografiche e cliniche iniziali, i pazienti partecipanti a questo studio
hanno costituito una popolazione eterogenea di pazienti con infezione da
HIV-1 avanzata e con precedenti molto diversi di terapia antiretrovirale.
L'utilità del test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR per determinare l'evoluzione
temporale degli effetti del trattamento è stato valutata analizzando la variazione delle
mediane rispetto all'inizio dello studio e la DTM [differenza temporale media ovvero
la variazione media dai livelli iniziali in un periodo t (settimane)]. Per valutare la
capacità dell'AMPLICOR® HIV-1 MONITOR di rilevare le variazione dei livelli di
RNA dell'HIV-1 a seguito della terapia, in ogni studio sono state analizzate per
ciascun gruppo di trattamento le mediane della variazione nel tempo rispetto ai livelli
di riferimento. La Figura 9 illustra le variazioni delle mediane rispetto ai livelli di
riferimento durante un periodo di 48 settimane emerse dallo studio NV14256. Il test
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR ha evidenziato riduzioni misurabili e sostenute dei
livelli di RNA virale. Le variazioni mediane più ampie e sostenute dei livelli di RNA
dell'HIV-1 sono state osservate nel gruppo di pazienti in terapia di associazione
(SAQ + ddC).
40/53
HIV-1 MONITOR
È stata inoltre esaminata l'utilità delle misurazioni seriali dell'RNA dell'HIV-1 ai fini
della valutazione della risposta virale al trattamento antiretrovirale, usando il modello
di rischio proporzionale di Cox (Cox Proportional Hazards Model). Ai fini di questa
analisi, i tre gruppi di trattamento sono stati combinati ed è stato elaborato un modello
di Cox stratificato per gruppo di trattamento, usando le seguenti covariabili quali
termini lineari: log10(RNA dell'HIV-1 di riferimento), log10(RNA finale dell'HIV-1),
conteggio di riferimento della cellule CD4 e conteggio CD4 finale. Il rapporto di
rischio di questo modello è stato definito come un aumento decuplo dell'RNA
dell'HIV-1 o una diminuzione di 100 del conteggio CD4. Come illustrato nella
Tabella 12, il coefficiente del termine log10(RNA finale dell'HIV-1) di questo modello
è statisticamente significativo e positivo fino a tutta la settimana 40. Di conseguenza,
i rapporti di pericolosità dell'RNA dell'HIV-1 fino alla settimana 40 indicano che i
livelli di RNA virale in ciascuna tappa temporale sono statisticamente significativi ed
hanno continuo valore predittivo.
L'associazione esistente tra sopravvivenza e livelli di RNA dell'HIV-1 è stata valutata
da un'analisi parallela dei dati. A questo fine, la sopravvivenza è stata definita come il
lasso di tempo allo studio durante il quale i pazienti non decedono né presentano
eventi indicativi di AIDS (ADE). L'analisi ha previsto la costruzione di curve di
sopravvivenza di Kaplan-Meier per ciascun gruppo di trattamento, dividendo la
popolazione dei pazienti in terzi a seconda dei livelli di RNA dell'HIV-1, ovvero in
terzi inferiore, medio e superiore. Le curve di sopravvivenza sono state tracciate in
funzione della percentuale di sopravvivenza ADE per gruppo di trattamento
(inferiore, medio e superiore) per un numero di settimane successive all'ottava.
L'analisi della sopravvivenza stimata di Kaplan-Meier ha evidenziato che i pazienti
con livelli bassi di RNA dell'HIV-1 (terzo inferiore) hanno maggiori probabilità di
sopravvivenza senza ADE per un periodo più lungo dei pazienti presentanti livelli
elevati di RNA dell'HIV-1. Le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier per ciascun
gruppo allo studio sono illustrate nelle Figure 10, 11 e 12.
Il rischio di ADE o di decesso dei pazienti in funzione del livello rilevato per ultimo
(più recente) di RNA dell'HIV-1 nel corso del lasso di settimane allo studio è stato
valutato da un'analisi dei dati separata dallo studio NV14256. In particolare, è stato
valutato l'impatto dell'ultima misurazione di RNA dell'HIV-1 sul rischio di sviluppo
del primo episodio ADE o di decesso (basato sugli ulteriori eventi clinici emersi nel
corso dello studio). L'analisi è stata condotta secondo il modello di rischio
proporzionale di Cox, usando le seguenti covariabili: log10 (RNA dell'HIV-1 di
riferimento), log10 (RNA finale dell'HIV-1), conteggio di riferimento della cellule
CD4 e conteggio CD4 finale. Questo modello è una funzione lineare delle covariabili
predicenti il logaritmo (rapporto) del rischio di ADE. La funzione lineare è stata poi
impiegata per determinare un indice di rischio per tutti i pazienti partecipanti allo
studio. In base al relativo indice di rischio, i pazienti sopravvissuti senza alcun ADE
fino alla quarta settimana dello studio sono stati inclusi, nel primo 25% dei pazienti
compresi nel gruppo “a basso rischio”, mentre i pazienti rimanenti sono stati suddivisi
in modo uguale in sei gruppi separati. Successivamente, ognuno dei sei gruppi è stato
confrontato con il gruppo a basso rischio, usando un modello di sopravvivenza ed è
stato tracciato il livello medio di RNA dell'HIV-1 di ciascun gruppo confrontandolo
con il rapporto calcolato di rischio di ADE, usando un modello esponenziale
composito. Le Figure 13 e 14 illustrano i rapporti di rischio per l'intervallo
intercorrente prima della prima manifestazione di ADE rispetto al log10 (RNA finale
dell'HIV-1), rispettivamente per i pazienti sopravvissuti senza ADE fino alla quarta
settimana e fino alla settimana 16. Questi dati hanno dimostrato come, entro la
settimana 4, un partecipante allo studio che presenti un livello di RNA dell'HIV-1 pari
a 100.000 copie/ml (log10=5,0) abbia il sestuplo di probabilità in più di sviluppare un
ADE o di morire di quanto non sia il caso con un paziente il cui livello di RNA
dell'HIV-1 sia pari a 8.000 copie/ml. Similmente, alla settimana 16, un paziente con
un livello di RNA virale di 1.000.000 copie/ml (log10=6,0) presenta probabilità di
sviluppo di un ADE o di decesso 20 volte superiori a quelle di un altro paziente con un
livello di RNA dell'HIV-1 di 8.000 copie/ml.
41/53
I dati qui presentati sull'utilità clinica e l'uso del test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR
per il monitoraggio degli effetti della terapia antiretrovirale sono stati derivati da un solo
studio clinico che ha messo a confronto due farmaci e tre regimi terapeutici per un
gruppo specifico di pazienti. Visto che un unico studio clinico può non dimostrare
adeguatamente l'utilità clinica di un test quantitativo dell'RNA dell'HIV-1 in tutte le
popolazioni dei pazienti, in tutte le situazioni cliniche o in relazione a tutte le terapie
antiretrovirali, è opportuno esercitare la dovuta cautela prima di estendere
l'interpretazione dei dati qui illustrati a specifici casi individuali. Com'è il caso con tutti
i test diagnostici, i risultati del test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR devono essere
interpretati alla luce di tutte le risultanze cliniche e di laboratorio di ciascun paziente.
Tabella 8
Associazione tra le variabili di riferimento allo studio ed il decorso della malattia
Studio ACTG 116A
(N = 153 pazienti, 73 eventi ADE)
Rischio relativo non bilanciato
(IC del 95%)
Rischio relativo bilanciato
(IC del 95%)
Valore p2
Variabile
Log del numero di copie di
RNA dell'HIV-1/ml1
Log del conteggio
delle cellule CD4+1
Diagnosi iniziale di AIDS
Trattamento con ddl
1,58 (1,20 - 2,09)
1,44 (1,07 - 1,93)
0,02
0,39 (0,28 - 0,54)
2,00 (1,22 - 3,27)
0,95 (0,59 - 1,53)
0,45 (0,31 - 0,64)
1,39 (0,82 - 2,37)
1,12 (0,68 - 1,84)
0,0001
0,22
0,66
1 - Il rischio relativo è il quoziente di rischio risultante da un aumento di 5 volte dell'RNA
dell'HIV-1 oppure dalla riduzione delle cellule CD4+
2 - I valori p corrispondono ai rischi relativi bilanciati
Tabella 9
Associazione tra il decorso della malattia e la variazione
dei livelli di RNA dell'HIV-1 iniziali e dopo la settimana 8
Studio ACTG 116A
(IC del 95%)
(IC del 95%)
Valore p2
Variabile
RNA dell'HIV-1/ml1
Log della variazione di
RNA dell'HIV-1
dall'inizio dello studio
all'ottava settimana1
Log del conteggio delle
cellule CD4+1
Trattamento con ddl
1,46 (1,11 - 1,93)
1,63 (1,16 - 2,28)
0,0005
1,18 (0,93 - 1,48)
1,54 (1,09 - 2,16)
0,013
0,43 (0,30 - 0,62)
1,83 (1,09 - 3,09)
0,76 (0,45 - 1,27)
0,50 (0,34 - 0,73)
1,28 (0,74 - 2,21)
0,87 (0,51 - 1,49)
0,0004
0,38
0,61
1 - Il rischio relativo corrisponde al rischio derivante da un aumento quintuplo dell'RNA dell'HIV-1 o
dalla pari diminuzione del conteggio delle cellule CD4+
2 - I valori 2 p sono riferiti ai rischi relativi bilanciati
Tabella 10
Associazione tra le variabili di riferimento allo studio ed il decorso della malattia
Studio ACTG 116B/117
(IC del 95%)
(IC del 95%)
Valore p2
Variabile
RNA dell'HIV-1/ml1
Log del conteggio
delle cellule CD4+1
Trattamento con ddl
1,90 (1,28 - 2,82)
1,25 (0,81 - 1,94)
0,32
0,28 (0,16 - 0,48)
3,13 (1,66 - 5,92)
0,89 (0,47 - 1,69)
0,33 (0,18 - 0,62)
2,38 (1,24 - 4,58)
0,88 (0,46 - 1,71)
0,0006
0,01
0,71
42/53
HIV-1 MONITOR
Tabella 11
Associazione tra il decorso della malattia e la variazione
dei livelli di RNA dell'HIV-1 iniziali e dopo la settimana 8
Studio ACTG 116B/117
(IC del 95%)
(IC del 95%)
Valore p2
Variabile
RNA dell'HIV-1/ml1
Log della variazione
di RNA dell'HIV-1
dall'inizio dello studio
all'ottava settimana1
Log del conteggio
delle cellule CD4+1
Trattamento con ddl
2,10 (1,32 -3,34)
1,58 (0,93 - 2,69)
0,09
1,41 (0,71 - 2,79)
1,58 (0,68 - 3,68)
0,29
0,25 (0,13 - 0,46)
2,43 (1,17 - 5,05)
1,07 (0,51 - 2,27)
0,29 (0,14 - 0,60)
1,87 (0,88 - 3,97)
0,98 (0,39 - 2,48)
0,001
0,10
0,96
Figura 7
Frequenza di progresso della malattia a seconda del livello di riferimento dell'RNA dell'HIV-1
Studio 116A
No di casi
Decile
n=
No di progressioni
No di progressioni
in AIDS o decessi
%
18
36
54
72
90
108
126
144
162
179
<11912
<34661
<72438
<103806
<150695
<194312
<247229
<417316
<775841
<2162193
18
18
18
18
18
18
18
18
18
17
15
14
17
14
16
16
14
16
17
14
5
5
6
5
7
8
6
10
12
9
33,33
35,71
35,29
35,71
43,75
50,00
42,86
62,50
70,59
64,29
43/53
Figura 8
Frequenza di progresso della malattia a seconda del livello di riferimento dell'RNA dell'HIV-1
Studio 116B/117
No di casi
Decile
n=
No di progressioni
No di progressioni
in AIDS o decessi
%
10
20
30
40
50
60
70
80
90
96
<11571
<31292
<49743
<62132
<97781
<150866
<251627
<403146
<794027
<1456302
10
10
10
10
10
10
10
10
10
6
10
10
10
10
10
10
10
10
10
6
4
2
3
6
1
3
5
6
9
5
40,00
20,00
30,00
60,00
10,00
30,00
50,00
60,00
90,00
83,33
Figura 9
Mediane delle variazioni di RNA dell'HIV-1 nel corso di 48 settimane
Studio NV14256
Sett. 4
n1=98
n2=91
n3=92
Sett. 8 Sett. 12 Sett. 16
n1=90 n1=89 n1=93
n2=85 n2=88 n2=81
n3=91 n3=85 n3=86
Sett.24
n1=86
n2=83
n3=84
Sett.32
n1=71
n2=73
n3=79
Sett.40
n1=63
n2=71
n3=69
Sett. 24
Sett. 32
Sett. 40
Sett.48
n1=52
n2=62
n3=56
0,4
0,2
0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
Sett. 4
Sett. 8
Sett. 12
ZDV+ddC
44/53
Sett.16
SAQ 600mg+ZDV
Sett. 48
SAQ 600mg +ZDV+ddC
HIV-1 MONITOR
Tabella 12
Confronto tra il rischio di ADE ed il log10 (ultimo RNA) ed altre covariabili, in base alla probabilità
di sopravvivenza di un paziente durante la settimana di studio indicata
Sommario dei risultati del modello di Cox - Modello stratificato a seconda dei gruppi di trattamento
Studio NV14256
Settimana di studio
4
8
16
24
32
40
48
56
64
Variabile
Coefficiente del modello di Cox
Rapporto di rischio*
Valore p
log10(RNA di riferimento)
log10(RNA finale)
Conteggio CD4 di riferimento
Conteggio CD4 finale
log10(RNA finale)
log10(RNA finale)
log10(RNA finale)
log10(RNA finale)
log10(RNA finale)
log10(RNA finale)
log10(RNA finale)
log10(RNA finale)
0,798
0,4197
-0,0009
-0,0040
0,8096
0,4186
-0,0019
-0,0049
0,8714
0,5385
-0,0015
-0,0049
0,6910
0,7135
-0,0003
-0,0064
0,5926
0,9000
-0,0040
-0,0023
0,8003
0,7086
-0,0030
-0,0031
0,5993
0,5631
-0,0011
-0,0079
1,0917
0,0835
-0,0022
-0,0072
1,2803
-0,2500
0,0006
-0,0085
2,22
1,52
0,91
0,67
2,25
1,52
0,83
0,62
2,39
1,71
0,87
0,62
2,00
2,04
0,97
0,53
1,81
2,46
0,67
0,79
2,23
2,03
0,74
0,73
1,82
1,76
0,89
0,45
2,98
1,09
0,80
0,49
3,60
0,78
1,07
0,43
0,0012
0,0219
0,5806
0,0084
0,0004
0,0138
0,2107
0,0006
0,005
0,0046
0,3510
0,0010
0,0136
0,0017
0,8667
0,0001
0,0492
0,0003
0,0252
0,1523
0,0159
0,0096
0,1282
0,0955
0,0978
0,0629
0,6168
0,0016
0,0127
0,8025
0,4560
0,0201
0,0135
0,4988
0,8531
0,0213
* Rapporto di rischio dovuto ad un aumento decuplo dell'RNA dell'HIV-1 o ad una diminuzione di 100 del conteggio CD4.
45/53
Figura 10
Sopravvivenza stimata di Kaplan-Meier - Gruppo di trattamento: SAQ 600 mg
Studio NV14256
Pazienti sopravvissuti senza ADE fino alla settimana 8
Sopravvivenza senza ADE (%)
100
90
80
70
60
Ultimo livello di RNA:
settimana 8
Terzo inferiore
Terzo medio
Terzo inferiore
50
0
8
16
24
32
40
48
56
64
Settimane dopo l'ottava
Figura 11
Sopravvivenza stimata di Kaplan-Meier - Gruppo di trattamento: ddC
Studio NV14256
100
90
80
70
60
settimana 8
Terzo inferiore
Terzo medio
Terzo inferiore
50
0
8
16
24
32
40
48
56
64
46/53
HIV-1 MONITOR
Figura 12
Sopravvivenza stimata di Kaplan-Meier - Gruppo di trattamento: ddC + SAQ 600 mg
Studio NV14256
100
90
80
70
60
settimana 8
Terzo inferiore
Terzo medio
Terzo inferiore
50
0
8
16
24
32
40
48
56
64
Figura 13
Rapporto di rischio nel tempo del primo ADE - Pazienti sopravvissuti senza ADE fino alla settimana 4
Studio NV14256
Rapporto di rischio
21
16
11
6
1
3,8
4,2
4,6
5,0
5,4
5,8
Log10 (ultimo RNA)
47/53
Figura 14
Rapporto di rischio nel tempo del primo ADE - Pazienti sopravvissuti senza ADE fino alla settimana 16
Studio NV14256
Rapporto di rischio
21
16
11
6
1
3,8
4,2
4,6
5,0
5,4
5,8
Log10 (ultimo RNA)
48/53
HIV-1 MONITOR
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HIV-1 MONITOR
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