Kit per il Radiodosaggio Simultaneo Della

Diagnostic Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, NY 10962
http://www.icndiagnostics.com
Kit per il Radiodosaggio Simultaneo
Della Vitamina B12 [Co57] e del
Folato [I125] - SimulTRAC-S
Catalog No. 06B254819 - 100 Tube
Catalog No. 06B254932 - 200 Tube
RIA HOT LINE USA ONLY: 1-800-431-1237
Customer support and technical information can be obtained at local ICN Pharmaceuticals,
Inc. offices.
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KIT PER IL RADIODOSAGGIO SIMULTANEO DELLA
VITAMINA B12[Co57] E DEL FOLATO [I125]- SIMULTRAC-S
Per la determinazione quantitativa simultanea della Vitamina B12 e del Folato in siero o
plasma.
Generalita' e Metodologia di Dosaggio
Le carenze in Vitamina B12 e Folato costituiscono due delle tre anemie nutrizionali dell'uomo,
essendo la terza dovuta a carenza di ferro1.
L'insufficienza di folato (acido folico) è presente in circa un terzo delle donne gravide, nella
grande maggioranza degli etilisti, nella maggioranza delle persone che rispettano una dieta
priva di frutti freschi e vegetali freschi crudi o succhi di frutta, in molte persone presentanti
danni strutturali o funzionali a livello del terzo superiore dell'intestino nonchè in un certo
numero di altre situazioni 2. La determinazione dei livelli di folato dovrebbe essere eseguita
per tutti quei pazienti che presentano anemia megalo-blastica, cosí come per tutti i pazienti
che presentano anemia, ipersegmentazione dei nuclei granulocitari e contemporaneamente
presentano manifestazioni correlate alla carenza di ferro3,4.
E' consigliabile determinare la vitamina B12 e il folato eritrocitario in aggiunta al folato serico
al fine di accertare che la diagnosi sia carenza in folato per cui l'idoneo trattamento
terapeutico consiste nell'acido folico.
Bassi livelli di folato eritrocitario possono inoltre
significare che il paziente presenta primariamente carenza in vitamina B12 bloccando quindi
la capacità delle cellule di assorbire il folato nel cui caso la terapia opportuna sarebbe la
vitamina B 12 anzichè l'acido folico5.
Le più frequenti cause di carenza in vitamina B12 consistono nel danno gastrico, nel danno
intestinale, nell'anemia perniciosa e nel vegetaria-nismo puro. La determinazione dei livelli
sierici della cobalamina "vera" ad esclu-sione degli analoghi della vitamina B12 costituisce
l'analisi singola più utile per la diagnosi di carenza in vitamina B12 e per la valutazione dei
pazienti presentanti anemia6,7.
Alterazioni morfologiche delle cellule del sangue associate a carenza in vitamina B12 sono
prodotte anche da carenza in acido folico, quindi la determinazione del livello di cobalamina
serica è necessaria per determinare se la megaloblastosi è dovuta a carenza di vitamina B12
o di folato o di entrambe2,4,8-10.
Principio di Dosaggio
Nel dosaggio per competizione di legame proteico, il legante dovrebbe presentare uguale
affinità per la forma standard e per la sostanza presente nel campione. La vitamina B12 o il
folato non marcati competono con le forme marcate per il numero limitato di siti sulle proteine
leganti specifiche, riducendo quindi la quantità di vitamina B 12 o folato marcati legati. Ne
consegue che il livello di radioattività legata è inversamente correlato alla concentrazione nel
campione o nello standard.
Nel kit ICN Pharmaceuticals, Inc. SimulTRAC-S, i livelli di vitamina B12 e folato vengono
simultanemante determinati in una signola provetta.
I traccianti, le proteine leganti e gli
standards sono forniti in forma combinata. L'acido pteroilglut-amico (PGA) è impiegato a pH
9,3 come standard e come tracciante per il dosaggio del folato. A questo pH infatti, sia l'acido
5-metil-tetraidrofolico (MTFA) del campione che il PGA presentano uguale affinità per la
1
proteina legante.11 I due traccianti, [Co5 7] per la vitamina B12 e [I125] per il folato, emettono ad
energie i cui livelli possono essere facilmente distinte in parecchi contatori a due canali in
commercio.
Il kit ICN Pharmaceuticals, Inc. SimulTRAC-S impiega fattore intrinseco purificato.
La
proteina R, è stata fisicamente rimossa tramite cromatografia d'affinità. Una volta rimossa
la proteina R, solo il fattore intrinseco purificato è disponibile per il legame; essendo specifico
per la cobalamina, la determinazione riguarda la cobalamina "vera"6.
Il fattore intrinseco
purificato ed il legante del folato sono legati covalentemente ad un supporto solido.
Questo kit può essere usato per determinare il folato eritrocitario per confermare carenza in
folato.
Reagenti
Per uso diagnostico in vitro
1.
2.
3.
Soluzione di Ditiotreitolo, Catalogo n° 06B229261.
Contenente ditio-treitolo e
stabilizzante.
Ogni flacone contiene >4 mL, sufficienti per l'allestimento di 100
provette; un flacone per kit da 100 provette; due flaconi per kit da 200 provette.
Conservazione: refrigerare a 2-8°C; mantenere ben chiuso. Stabilità: vedi la data di
scadenza sul flacone.
Tracciante Vitamina B12/Folato, Catalogo n° 06B254827. Ogni flacone contiene < 1,5
µCi (55,5 kBq) di vitamina B 1 2 [Co 5 7] e <3 µCi (111 kBq) di folato [I125I] in tampone
borato con siero albumina umana*, destrano, cianuro di potassio, colorante e conservante. Ogniflacone contiene >100 mL, sufficienti per l'allestimento di 100 provette;
un flacone per kit da 100 provette; due flaconi per kit da 200 provette. Conservazione:
refrigerare a 2-8°C. Proteggere dalla luce. Stabilità: vedi la data di scadenza sul
flacone.
A. Soluzione di Lavoro Tracciante/ DTT. Preparazione: aggiungere il contenuto di un
flacone di soluzione di ditiotreitolo ad un flacone di tracciante vitamina B12/folato.
Questo volume è sufficiente per l'allestimento di 100 provette.
Qualora l'intero
contenuto di un flacone di tracciante non possa essere usato entro due settimane
dalla aggiunta del DTT, diluire una parte di soluzione di ditiotreitolo con 25 parti di
tracciante. Vedi nel procedimento di dosaggio una semplice forma per preparare
la soluzione di lavoro-tracciante. Conservazione: refrigerare a 2-8°C. Proteggere
dalla luce. Stabilità: 1 settimana.
Vitamina B12/Folato-Livelli Standard A-F, pronti per l'uso; formulati in una matrice sintetica
con borato di sodio, cloruro di sodio e conser-vanti. Un flacone di ogni standard per
kit. Conservazione: refrigerare a 2-8°C. Proteggere dalla luce. Stabilità: vedi le date
di scadenza sui flaconi.
2
Standard
A
B
C
D
E
F
Catalogo n°
06B240516
06B242128
06B242217
06B242314
06B242411
06B242519
Volume
8 mL
4 mL
4 mL
4 mL
4 mL
4 mL
Concentrazione
Vitamina B 12
pg/mL
pmol/L
0
0
100
74
200
148
400
296
1000
740
2000
1480
Acido folico
Standard
A
B
C
D
E
F
4.
5.
Catalogo n°
06B240516
06B242128
06B242217
06B242314
06B242411
06B242519
Volume
8 mL
4 mL
4 mL
4 mL
4 mL
4 mL
ng/mL
0
1,0
2,0
4,0
10,0
20,0
nmol/L
0
2,3
4,5
9,1
23
45
Legante in fase solida per vitamina B12/Folato, Catalogo n° 06B254835. Contiene legante
del folato puri-ficato dal latte bovino e fattore intrinseco porcino purificato legati a
supporto solido in soluzione salina con tampone fosfato, coloranti e conservanti. Ogni
flacone contiene > 20 mL ed è sufficiente per l'allestimento di 100 provette; un flacone
per kit da 100 provette, due flaconi per kit da 200 provette. Agitare vigorosamente prima
dell'uso. Conservazione: refrigerare a 2-8°C. Stabilità: vedi la data di scadenza sul
flacone.
Reagente per "bianco", Catalogo n° 06B254843. Contiene supporto solido senza i
leganti, formulato alla stessa concentrazione in fase solida del reagente legante, in
soluzione salina con tampone fosfato, colorante e conservante. Ogni flacone contiene
3 mL; un flacone per kit. Conservazione: refrigerare a 2-8°C. Stabilità: vedi la data di
scadenza sul flacone.
*ATTENZIONE: MANEGGIARE COME SE FOSSE CAPACE DI TRASMETTERE INFEZIONE.
Il materiale da cui e derivato questo prodotto è stato trovato non reattivo per HBsAg e
negativo per l'anticorpo Anti-HIV quando testato con reagenti autorizzati. Nessun test puo
offrire garanzia che i prodotti derivati da sangue umano non siano infettivi. Fare referimento
alla pubblicazione CDC/NIH sulla Biosicurezza nei Laboratori di Microbiologia e Biomedica
(Pubblicazione HHS n. CDC 84-8395).
IMPIEGO DI MATERIALE RADIOATTIVO: AVVERTENZE
L'acquisto, la ricezione, la detenzione, l'uso, il trasferimento e lo smaltimento di materiale
radioattivo, sono soggetti ai regolamenti ed ai permessi previsti dalle autorità legislative.
Nella manipolazione di sostanze radioattive devono essere osservate le seguenti precauzioni:
3
Ë Il materiale radioattivo deve essere conservato e manipolato in un'area del laboratorio
specificamente designata a tale uso. Ë L'ambiente di lavoro deve essere ben illuminato e
arieggiato. Ë Le superfici di lavoro devonno essere non porose in modo da ridurre al minimo
la contaminazione dovuta allo spargimento di liquidi radioattivi. Ë Considerata la piccola
radioattività contenuta nel flacone del tracciante (circa 1,5 uCi di vitamina B12 e 3 uCi di
folato), l'uso del kit non pone alcun problema di pericolo di radiazioni. Ë Tuttavia per evitare
inalazione o ingestione di materiale radioattivo è necessario rispettare le buone norme
generali di laboratorio. In particolare si raccomanda di: Ë non pipettare con la bocca soluzioni
radioattive; Ë non mangiare, bere fumare o usare cosmetici nell'area di lavoro designata; Ë
pulire immediata-mente le superfici di lavoro dei materiali radioattivi eventualmente versati;
Ë raccogliere il materiale contaminato solido e liquido in appositi contenitori ed effettuarne lo
smaltimento secondo le procedure previste; Ë lavarsi accuratamente le mani dopo l'uso di
materiale radioattivo.
Attrezzature e reagenti richiesti ma non forniti
1.
2.
3.
4.
5.
Provette ematologiche o provette ematologiche con EDTA.
Grafici lineari o semilogaritmici o logit-logaritmici.
Provette di polipropilene o polistirene (12 x 75 mm).
Portaprovette.
Pipette semiautomatiche in grado di dispensare 100 µl, 200 µl e 1,0 mL.
6.
7.
8.
Bagno termostatico ad acqua o glicerina in grado di mantenere 100 ± 2°C.
Centrifuga multicampione in grado di operare ad almeno 1000xg.
Contatore a scintillazione in grado di determinare le radiazioni di [I125] e [Co57]
simultaneamente o sequenzialmente munito di dispositivo capace di separare i due
spettri di conteggio.
Attrezzature e reagenti per il dosaggio del folato eritrocitario
1.
2.
3.
4.
Acido ascorbico; ICN Pharma-ceuticals, Inc. catalogo n° 06B259110.
Centrifuga per micro-ematocrito.
Capillari per micro-ematocrito eparinati.
Pasta per otturazione capillari.
Raccolta dei Campioni
I campioni dovrebbero essere prelevati da soggetti a digiuno poichè l'ingestione recente di
cibo può aumentare il livello di acido folico. Il laboratorio dovrebbe essere avvisato della
possibile presenza di radioattività nei campioni.
I campioni non dovrebbero essere raccolti in acido ascorbico o in presenza di alte
concentrazioni di fluoruro poichè queste due sostanze sembrano dis-truggere la vitamina B12.
Non usare campioni emolizzati.
4
1.
Preparazione dei campioni per l'analisi:
A.
B.
Siero o plasma.
Raccogliere il sangue in provetta da 5 o 10 mL. Attendere la coagulazione a
temperatura ambiente.
Usare EDTA o eparina qualora si desideri operare su
plasma. Centrifugare per 10 minuti e raccogliere il siero o plasma.
Emolizzato di sangue intero (per il dosaggio del folato eritrocitario).
Raccogliere il sangue in provetta da 5 mL contenente EDTA.
Determinare e registrare il valore dell' ematocrito.
2.
3.
Aggiungere 100 µl di sos-pensione di sangue a 2 mL di soluzione di acido
ascorbico allo 0,2% (p/v). Ciò corrisponde ad una diluizione 1:21.
Mescolare
parecchie volte per inversione; evitare la forma-zione di schiuma.
Mantenere
l'emolizzato a 20-25°C per 90 minuti per l'idrolisi completa dei poliglutamati da
parte della coniugasi endogena. Pro-teggere dalla luce durante questo tempo.
Spedizione dei campioni: I campioni di siero o plasma devono essere spediti o ricevuti
congelati.
Conservazione dei campioni: La conservazione dei campioni prima dell'analisi può
essere effettuata refrigerando a 2-8°C. Se il tempo di attesa prima del dosaggio
supera le 4 ore, il campione deve essere conservato ad almeno -20°C. I campioni
sono stabili per 6-8 settimane a questa temperatura. Non conservare i campioni in
freezer provvisti di sistemi di sbrinamento automatico al fine di evitare congelamenti
e scongela-menti ripetuti.
Procedimento
Se il contatore dispone di due o più canali, esso dovrebbe essere calibrato per contare lo [125I]
in canale e il Cobalto 57 in un altro canale. Se il contatore dispone di un solo canale, sarà
necessario contare le provette due volte, una per ogni isotopo.
Tutti i reagenti ed i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell'uso
ma non devono essere mantenuti a questa temperatura più del tempo necessario. Non usare
reagenti diversi da quelli forniti in questo kit.
ATTENZIONE:
la vitamina B12 e il folato sono fotosensibili e dovrebbero essere esposti
soltanto a luce diffusa per il minor tempo possibile. Si consiglia di coprire il portaprovette sia
durante l'estrazione che durante l'incubazione.
Si consiglia di eseguire le analisi in duplicato. L'allestimento delle provette dei campioni e
degli standard, così come dei controlli deve essere effettuato simultaneamente.
I sieri di
controllo dovrebbero essere allestiti contempor-aneamente ai campioni.Preparazione dei
reagenti
5
1.
Se l'intero contenuto di un flacone di tracciante non può essere usato entro 1
settimane, usare la seguente equazione per calcolare la quantità di DTT da aggiungere
al tracciante/tampone:
mL tracciante richiesto x 4 = mL di DTT da aggiungere
100
Per esempio:
35 mL di tracciante richiesto x 4 = 1,4
100
quindi 0,4 mL di DTT devono essere aggiunti a 35 mL di tracciante/tampone prima di
iniziare il dosaggio.
Procedimento di Dosaggio
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Numerare 16 provette per gli standard. Cominciando da 17 numerare due provette per
ogni campione.
Aggiungere standard e campioni secondo lo schema che segue.
Aggiungere 1000 µl di soluzione di lavoro tracciante/tampone a tutte le provette incluse
le provette dell'Attività Totale (1 e 2). Tenere da parte le provette 1 e 2 fino al
passaggio 12.
Mescolare delicatamente e ricoprire tutte le provette (escluse 1 e 2) con un foglio di
alluminio.
Riscaldare tutte le provette (escluse 1 e 2) in bagno termostatico ad acqua o glicerina
a 100°C per 15 minuti; non iniziare il tempo sino a che il bagno sia a 100°C.
Proteggere dalla luce.
Togliere tutte le provette dal bagno a 100°C. Raffreddare sino a 18-25°C in acqua
corrente. Non seguitare il dosaggio sino a ché le provette non hanno raggiunto tale
temperatura. Scoprire tutte le provette.
Mescolare il flacone del reagente per bianco. Aggiungere 200 µl di reagente per
bianco alle provette 3 e 4. Agitare.
Mescolare il flacone dei leganti in fase solida.
Attenzione deve essere agitato
vigorosamente. Aggiungere 200 µl di legante alle provette 5-16 e alle provette dei
campioni. Mescolare.
Incubare le provette 3-16 e tutte le provette dei campioni a temperatura ambiente (1825°C) per 60 minuti dal momento dell'ultima aggiunta dei leganti.
Coprire i
portaprovette con un foglio di alluminio per riparare dalla luce oppure mantenere al
buio.
Centrifugare ad almeno 1000 x g per 10 minuti, preferibilmente a freddo.
Decantare delicatamente e scartare tutti i surnatanti.
Rimuovere la goccia residua
toccando il bordo su carta assorbente.
Determinare la radioattività dei precipitati e delle provette 1 e 2 in sequenza per un
minuto in un contatore gamma. Il conteggio totale per minuto per le provette 1 e 2 per
il [Co57] dovrebbe essere compreso fra 10.000 e 20.000 e per [I125] dovrebbe essere
compreso fra 15.000 e 35.000 a seconda dello strumento e della freschezza del
tracciante. Un minore tempo di conteggio può essere usato purchè i conteggi delle
provette 1 e 2 siano almeno 10,000 (conta totale).
6
RADIODOSAGGIO SimulTRAC-S
Provette
1, 2
3, 4
5, 6
7, 8
9,10
11,12
13,14
15,16
Campione
Standard
(µl)
Campione
(µl)
Soluzione
tracciante
di
lavoro(µl)
--200A
200A
200B
200C
200D
200E
200F
-----------------
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
---
200
1000
Incubazion
e
Mescolare
delicatame
. Incubare
tutte le
provette a
100°C per
15 minuti.
Raffreddar
ea
(18-25°C)
Reagente
per
bianco
(µl)
Leganti
(µl)
Incubazion
e
Centrifugazione
--200
-------------
----200
200
200
200
200
200
Mescolare.
Incubare
tutte le
provette a
temp. amb.
(18-25°C)
per 60 min.
--Centrifugare tutte
le provette
(eccetto 1
e 2) a
1000 x g
per 10
minuti.
---
200
Dopo la centrifugazione, decantare il surnatante e contàre la radioattivitá nel pellet.
il calcolo. Tracciàre la curva standard e determinare i valori dei pazienti.
Esequire
Calcolo dei Risultati
A.
Vitamina B 12 e Folato serici o plasmatici
La curva della vitamina B12 e i valori sono calcolati sulla base dei dati ottenuti contando
[Co57]; la curva del folato e i valori sono calcolati sulla base dei dati ottenuti contando
[I125].
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Mediare i conteggi delle provette 3 e 4, provette del "bianco". Sottrarre il bianco
da tutti gli altri conteggi così da ottenere i conteggi corretti. Utilizzare soltanto i
conteggi corretti nei calcoli. Nota: l'unità di tempo deve essere costante per tutte
le provette contate.
Mediare i conteggi corretti per le provette 1 e 2 così da ottenere "l'Attività Totale
corretta".
Dividere la media dei conteggi corretti delle provette 5 e 6 per l'Attività Totale
corretta così da ottenere la capacità legante Bo. Questo valore dovrebbe essere
superiore al 35%.
Dividere i conteggi di ogni provetta per la media dei conteggi corretti delle provette
5 e 6 così da ottenere la percentuale di legame per ogni provetta.
La curva standard può essere riportata su grafico come segue: utilizzando un
grafico in coordinate logit-log, riportare la percentuale di legame in ordinate in
funzione di pg/mL di vitamina B12 standard o ng/mL di folato standard sulla scala
logaritmica. In Tabella 1, è riportata una tabella di dati tipici di conteggio e calcolo.
Le curve standard ricavate da questi dati sono illustrate in Figura 1. In pratica,
è consigliabile riportare ogni curva su un foglio separato al fine di evitare
confusione.
La concentrazione di vitamina B12 o di folato nel siero o plasma è determinata per
interpolazione sulle curve standard dei valori delle percentuali di legame in
funzione dei pg/mL di vitamina B 12 o ng/mL di folato (Figura 1).
Esempio: l'esempio seguente riguarda un campione di folato.
Lo stesso
procedimento di calcolo deve essere usato nel caso della vitamina B 12.
7
Bianco
= cont. prov. 3 + cont. prov. 4 = 755 + 728 = 742
2
2
Attività Totale corretta
= (cont. prov. 1 - Bianco) + (cont. prov. 2 - Bianco)
2
= (31951 - 742) + (31779 - 742) = 31123
2
Capacità Legante = media conteggi corretti provette 5 e 6 x 100
Attività Totale corretta
= 16074 x 100 = 51,6%
31123
percentuale di legame (calcolo per la provetta n° 7)
=
(cont. prov. 7 - Bianco) x 100
media conteggi corretti prov. 5 e 6
= (12098 - 742) x 100 = 70,6%
16074
Esempio di calcolo per un campione:
Conteggio (trovato)
Bianco
= 10796
= 742
Percentuale di legame = 10796 - 742 x 100 = 62,5%
10674
La curva standard in coordinate logit-log di figura 1 mostra che 62,5% corrispone ad una
concentrazione di folato di 1,49 ng/mL.
La media fra questo valore ed il valore del duplicato è riportata in termini di concentrazione
di folato in ng/mL per il campione.
B.
Folato eritrocitario
1.
2.
3.
4.
Dividere i conteggi corretti per l'emolisato per la media dei conteggi corretti per i
tubi 5 e 6 per dare la % di legame del tracciante per l'emolisato.
Calcolare la concentrazione di folato per interpolazione sulla curva standard.
Moltiplicare la concentrazione di folato per 21 [una
diluizione 1:21 del sangue
intero era stata eseguita durante la preparazione del campione. In questo modo,
si ottiene la concentrazione di folato in ng/mL di sangue intero.
Dividere la concentrazione di folato di sangue intero per l'ematocrito espresso
come decimale. Si ottiene così la concentrazione eritrocitaria di folato in ng/mL.
8
ng/mL (concentrazione)
eritrocitaria
= (ng/mL di emolisato) x 21
% ematocrito/100
Esempio di calcolo per il folato eritrocitario:
Conteggio (trovato)
Bianco
Percentuale di legame
= 6368
= 742
= 35,0%
La curva standard in coordinate logit-log (figura 1) mostra che 35,0% corrisponde ad
una concentrazione di folato di 4,8 ng/mL.
Ematocrito del paziente
= 42%
ng/mL (concentrazione)
eritrocitaria
= 4,8 x 21 = 240 ng/mL
0,42
La media fra questo valore ed il valore del duplicato è riportata in termini di
concentrazione eritrocitaria di folato in ng/mL.
Nota: non è solitamente necessario correggere per il folato serico o plasma-tico
poichè
questo
valore
è
molto piccolo rispetto a quello del folato eritrocitario. Occasionalmente
possono presentarsi livelli di folato plasmatico o serico elevati.
Se la concentrazione del
folato serico o plasmatico è maggiore del 10% del folato eritrocitario è possibile operare la
seguente correzione:
ng/mL (concentrazione eritrocitaria) =
= (ng/mL x 21) - [folato serico (1 - % ematocrito/100)]
% ematocrito/100
Calcolo per un campione:
1.
Concentrazione di folato serico o plasmatico = 32 ng/mL
2.
Concentrazione di folato dell'emolisato = 3,0 ng/mL
3.
Ematocrito del paziente = 30%
4.
Concentrazione non corretta di folato eritrocitario:
3,0 ng/mL x 21 = 210 ng/mL
,30
poichè 32 ng/mL è maggiore del 10% di 210 ng/mL, la concentrazione di folato
eritrocitario deve essere corretta come segue:
= (3,0 ng/mL x 21) - [32 ng/mL (1 - 0,3)]
0,30
concentrazione eritrocitaria corretta = 135 ng/mL
9
Limitazioni Procedurali
1.
2.
3.
Le metodologie di radiodosaggio per la determinazione della vitamina B12 possono
fornire, per popolazioni a rischio, valori diversi dai valori ottenuti impiegando specifiche
metodologie microbiologiche, poichè ogni metodo presenta propri range di riferimento.
Valori attesi e sieri di controllo determinati in
accordo
ad un metodo possono non
essere identici a quelli determinati impiegando un metodo alternativo.
L'appropriato impiego del kit SimulTRAC dipende dalla capacità del contatore gamma
di dis-criminare fra le radiazioni di I125 e di Co57.
Le finestre dovrebbero essere
impostate in modo da minimizzare l'interferenza reciproca delle due radiazioni. Al fine
di determinare l'interferenza si può usare il seguente metodo:
a.
b.
c.
4.
impostare il contatore gamma per il conteggio [I125]
1.
contare una sorgente [I125]
=A
2.
contare una sorgente [Co57] nel canale [I125]
=B
impostare il contatore gamma per il conteggio [Co57]
1
contare una sorgente [Co57]
=C
2.
contare una sorgente [I125] nel canale [Co57]
=D
calcolare l'interferenza
1.
di [Co57] su [I125]
= (B/C) x 100
2.
di [I125] su [Co57]
= (D/A) x 100
L'interferenza non dovrebbe superare il 3% per ogni canale.
Qualora l'interferenza
superi il 3%, le finestre dovrebbero essere ristrette oppure dovrebbe essere applicato
un metodo di correzione matematica. A richiesta sono disponibili sorgenti di Co 57.
La scelta dei sieri di controllo di origine commerciale per il dosaggio del folato deve
essere molto attenta.
Alcuni controlli possono essere stati preparati con 5-metiltetraidrofolato (MTFA) instabile originando quindi sottostima dei valori.
Altri sieri
preparati con acido pteroilglutamico ma analizzati a pH 7,4 utilizzando standard MTFA
possono originare una sottostima rispetto ai valori indicati dal produttore.
Valori Attesi
Ogni laboratorio dovrebbe definire i propri parametri di interpretazione dei risultati.
intervalli attesi qui riportati servono unicamente come guida.
Gli
L'intervallo di normalità per il folato serico è stato determinato sulla base dei valori ottenuti
per una popolazione normale (1,8 - 14 ng/mL) al 95%. I campioni erano stati prelevati a 122
volontari ematologicamente normali secondo criteri laboratoristici standard.
I valori attesi per il folato eritrocitario sono stati determinati dosando emoliz-zati di sangue
intero di 120 volontari sani. L'intervallo calcolato al 95% della distribuzione di tutti i normali
è risultato compreso fra 110 e 700 ng/mL.
Interpretazione
Basso
Normale
Folato serico,
ng/mL
<1,8
>1,8
10
Folato
eritrocitario,
ng/mL
<110
>110
Per la determinazione dei valori attesi di vitamina B12 (cobalamina "vera") sono stati studiati
due gruppi. Il primo gruppo consisteva in 39 soggetti con diagnosi confermata di anemia
perniciosa, danno gastrico o intestinale o malattie associate a carenze in vitamina B12 Il 95
percentile di questo gruppo ha fornito il limite superiore dell'intervallo di carenza.
Il
secondo gruppo comprendeva
122 volontari sani, maschi e femmine, di età compresa
fra 19 e 60 anni con normali abitudini alimentari.
Tutti questi soggetti sono risultati
ematologicamente normali secondo criteri laboratoristici standard.
L'intervallo di normalità
è stato definito al 95% dei valori di questo gruppo. L'intervallo di indeterminazione risulta
definito come intervallo di valori fra popolazione normale e carente.
Interpretazione
Basso
Indeterminato
Normale
Alto
Vitamina B 12 pg/mL
<130
130 - 200
200 - 900
>900
I risultati in vitamina B 1 2 ottenuti per questi due gruppi sono stati confrontati con i risultati
ottenuti tramite dosaggio microbiologico (Euglena gracilis). Vedi fig. 2.
Livelli di vitamina B12 serica superiori a 1000 pg/mL sono indicativi sia di malattia epatica sia
di manifestazioni mieloproliferative quali la policitemia vera, metaplasia mieloide o leucemia
granulocitaria cronica.
Livelli maggiori di 4000 pg/mL non sono solitamente imputabili a
malattia epatica ma si ritrovano comunemente in caso di disordini mieloproliferativi 8,9,12,13.
QUALORA IL DATO LABORA-TORISTICO RISULTI IN DISACCORDO CON IL RISULTATO CLINICO,
QUEST'ULTIMO DOVREBBE ESSERE SEGUITO E DOVREBBERO ESSERE PREDISPOSTE
ALTRE INDAGINI.Caratteristiche del controllo di qualita'
Accuratezza:
1.
2.
Il confronto fra i dati ottenuti per la vitamina B12 utilizzando questo kit (y) e il kit
SimulTRAC (x) per il radiodosaggio della cobalamina vera (cat. n° 06B242039) ha dato
i seguenti risultati:
Numero di campioni
= 116
Coefficiente di correlazione
= 0,98
Pendenza
= 1,07
Ordinata all'origine
= -15
Il confronto fra i risultati ottenuti per la vitamina B12 con questo kit ed i valori ottenuti
con il dosaggio microbiologico14 (Euglena gracilis), ha dato i seguenti risultati: x =
dosaggio microbiologico; y = SimulTRAC-S vitamina B 12
Numero di campioni
= 132
Coefficiente di correlazione
= 0,97
Pendenza
= 1,23
Ordinata all'origine
= -22
39 dei 132 campioni provenivano da pazienti diagnosticati come affetti da anemia
perniciosa ed altre malattie associate a carenza in vitamina B 12.
11
3.
Il confronto dei risultati ottenuti per il folato con questo kit ed i risultati ottenuti con il kit
SimulTRAC, ha dato i seguenti risultati: (x = SimulTRAC, y = SimulTRAC-S)
Numero di campioni
= 11
Coefficiente di correlazione
= 0,95
Pendenza
= 0,79
Ordinata all'origine
= 0,44
Precisione:
1.
Variazione "nel saggio"
A.
Vitamina B 12
N
Media, pg/mL
D.S.
C.V. %
B.
Contr. 2
Contr. 3
Contr. 4
Pool di sieri
20
168
14
8,3
19
388
21,7
5,6
20
529
29
5,5
20
1016
44
4,3
18
99,6
7,1
7,1
Contr. 1
Contr. 2
Contr. 3
Contr. 4
Pool di sieri
20
0,46
0,064
13,9
19
0,98
0,095
9,7
20
4,93
0,225
9,7
Folato
N
Media, ng/mL
D.S.
C.V. %
2.
Contr. 1
20
11,4
0,58
5,1
18
3,55
0,17
4,8
Variazione "fra i saggi"
La precisione fra i saggi è stata determinata dosando cinque sieri di controllo ed un
pool di sieri a basso contenuto in B 12
A.
Vitamina B 12
Pool di sieri
N
Media,
pg/mL
D.S.
C.V. %
Contr. 1
20
158
18
11,4
Contr. 2
34
390
29
7,4
Contr. 3
20
529
34
6,4
12
Contr. 4
34
592
33
5,6
Contr. 5
34
950
48
5,1
13
108
16
14,8
B.
Folato
Pool di sieri
N
Media,
ng/mL
D.S.
C.V. %
Contr. 1
20
0.52
0.09
17.3
Contr. 2
34
1,02
0,12
11,8
Contr. 3
20
4,94
0,27
5,5
Contr. 4
34
3,81
0,23
6,0
Contr. 5
34
10,77
0,75
7,0
13
3,84
0,34
8,9
Recupero:
Un campione di siero è stato arricchito con cianocobalamina ed uno con MTFA.
sono stati calcolati come:
I recuperi
trovato - endogeno x 100
aggiunto
Vitamina B 12
Aggiunto
0
200
400
1000
Trovato
339
547
714
1312
Atteso
--539
739
1339
MFTA
%
Recupero
--104
94
97
Aggiunto
0
1.2
4.8
12.0
Trovato
0,5
1,79
5,95
12,48
Atteso
--1,7
5,3
12,5
%
Recupero
--108
114
100
Specificità:
L'acido 5-metiltetraidrofolico e l'acido pteroilglutamico presentano uguale affinità per il legante
in questo dosaggio11. Il fattore intrinseco porcino usato in questo kit è stato purificato per
cromatografia d'affinità e contiene meno del 5% in proteina R. La purezza è stata stabilita
secondo i criteri proposti dal National Committee for Clinical Laboratory Standards15.
Il kit ICN Pharmaceuticals, Inc. SimulTRAC-S contiene fattore intrinseco purificato che rileva
10.000 pg/mL di cobinamide (un analogo della Vitamina B12) come 75 pg/mL, letto su di una
curva di taratura costruita con standard di cobalamina. Inoltre, il legante per la vitamina B12
è inibito per più del 95% da anticorpi specifici anti-fattore intrinseco.
Ulteriori studi hanno confermato che, usando il kit ICN Pharmaceuticals, Inc. SimulTRAC-S,
la cobinamide (un analogo della vitamina B12) presenta reazione crociata inferiore allo 0,02%.
Sensibilità:
La sensibilità definita come concentrazione al 90% della percentuale di legame è 60 pg/mL
per la vitamina B 12 e 0,25 ng/mL per il folato.
13
TABLE 1
SimulTRAC-S SOLID PHASE RADIOASSAY KIT:
TABULATED DATA*
Vitamin B 12 [57Co] Data
Tube
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Sample
17
18
cpm
Corrected
cpm
Average
cpm
20012
20289
479
464
9154
9173
7571
7587
6506
6278
5048
5085
3358
3505
2453
2388
19540
19817
----8683
8702
7100
7116
6035
5807
4577
4614
2887
3034
1982
1917
19679
6499
6523
6027
6051
% Bound
% Trace
Binding
472
8693
44.2
81.7
81.9
69.4
66.8
52.7
53.1
33.2
34.9
22.8
22.0
69.3
69.6
14
Vitamin B 12
pg/mL pmol/L
Blank
Blank
Trace
Trace
100
100
200
200
400
400
1000
1000
2000
2000
Blank
Blank
Trace
Trace
74
74
148
148
296
296
740
740
1480
1480
197
195
145
144
TABLE 1
SimulTRAC-S SOLID PHASE RADIOASSAY KIT:
TABULATED DATA*
Folate [125I] Data
Tube
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Sample
17
18
cpm
Corrected
cpm
Average
cpm
31951
31779
755
728
16641
16991
12098
12385
9699
9721
6887
6646
4001
4185
2644
2590
31209
31037
----15899
16249
11356
11643
8957
8979
6145
5904
3259
3443
1902
1848
31123
10924
10668
10182
9926
% Bound
% Trace
Binding
742
16074
70.6
72.4
55.7
55.9
38.2
36.7
20.3
21.4
11.8
11.5
Blank
Blank
Trace
Trace
1.0
1.0
2.0
2.0
4.0
4.0
10.0
10.0
20.0
20.0
Blank
Blank
Trace
Trace
2.3
2.3
4.5
4.5
9.1
9.1
23
23
45
45
63.3
61.8
1.44
1.54
3.3
3.3
51.6
15
Folate
ng/mL nmol/L
FIGURE 1
SimulTRAC-S VITAMIN B 12/FOLATE RADIOASSAY
TYPICAL STANDARD CURVES WITH LOGIT-LOG TRANSFORMATION
16
FIGURE 2
17
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
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National Committee for Clinical
Laboratory Standards, March 1980.
18
Manufactured by:
ICN Pharmaceuticals, Diagnostics Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, New York 10962-1294
Customer Service
Fax:
Technical Service:
(800) 888-7008
(949) 260-1079
(800) 437-1705
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Distribué par:
Distribuito da:
Distrubuido por:
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37269 Eschwege
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Auftragsannahme:
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FAX 0800 629 67337
06B58572-R13
QER Q01-243
4/02
19