scarica - Biotecnologie

Manipolazione genetica degli
animali
In mammiferi
Metodi per la produzione/generazione di
mammiferi transgenici
• Introdurre DNA nella linea germinale di topi: basi per la
manipolazione genetica di altri mammiferi
• Mammiferi gen mod sono stati utilizzati per studiare
funzione e regolazione dei geni ma anche come bioreattori
per la produzione su larga scala di proteine ricombinanti
(es. secrezione dal latte)
• Messi a punto svariati metodi per la trasfezione delle linee
germinali che richiedono tutti la rimozione di cellule uovo
fecondate o di embrioni precoci da madri donatrici, la loro
coltivazione per breve tempo in vitro e la successiva
reintroduzione in madri adottive
Riassunto dei metodi per la
produzione di mammiferi
transgenici
Microiniezione nel pronucleo
• Palmiter e Brinster 1986
• Subito dopo la fecondazione, il nucleo delle
cellule uovo (pronucleo femminile, relativamente
piccolo) e quello dello spermatozoo (pronucleo
maschile, più grande) sono distinti l’uno dall’altro.
La scelta del pronucleo maschile come bersaglio
preferenziale della microiniezione deriva dalle sue
maggiori dimensioni. Vengono di norma iniettati
circa 2 pl di soluzione contenente DNA, mentre
l’oocita è mantenuto in posizione con la punta di
una pipetta alla\quale si applica una leggera
suzione
Microiniezione nel pronucleo di un oocita fecondato di topo. Si
vedono i 2 pronuclei e l’oocita è mantenuto in posizione con la
punta di una pipetta alla quale viene applicata una leggera
suzione
Trasfezione di
cellule
ES:derivano
dalla massa
cellulare interna
della blastocisti
di topo e sono
totipotenti
Ceppo 129 pelo aguti
dominante
Ceppo C57BL/6J pelo
nero recessivo
Se le cellule ES introdotte
hanno contribuito anche alla
linea germinale, incrociando
maschi chimerici con
femmine nere, viene una
generazione di eterozigoti
transgenici aguti, conferma
della trasmissione
germinale del DNA esogeno
Il DNA può essere
introdotto x
trasfezione o
trasduzione virale.
Le cellule ES
ricombinanti
vengono introdotte
nel blastocele di un
embrione ricevente
allo stadio di
blastocisti
Gene targeting in cellule ES
I vettori per il targeting sono costrutti
plasmidici specializzati che
promuovono la ricombinazione
omologa una volta introdotti all’interno
delle cellule ES. Grazie all’inclusione di
una regione di omologia con il locus
bersaglio è consentito l’appaiamento del
vettore col DNA esogeno
Gene knockout
• La maggior parte degli esperimenti di gene
targeting effettuati finora è stata condotta
per ottenere l’inattivazione di loci endogeni
rendendo così “nulli” gli alleli bersaglio.
Sono stati sviluppati due tipi di vettori di
targeting: i vettori di inserzione e i vettori di
sostituzione
Struttura e meccanismo di integrazione delle 2 classi più
utilizzate di vettori targeting, a di inserzione e b di sostituzione.
Le regioni di omologia tra i vettori e le sequenze bersaglio sono
indicate dallo stesso numero
a
b
Procedura per l’introduzione di piccole mutazioni utilizzando
a) un vettore di inserzione e b) due vettori di sostituzione. Le
regioni di omologia tra i vettori ed i target sono indicate dallo
stesso numero. La posizione della mutazione puntiforme nel
vettore, che deve essere inserita nel locus bersaglio, è indicata
con un asterisco
Possibili applicazioni dei topi
geneticamente modificati
1981 Brinster et al. mettono a punto un plasmide
in cui il promotore del gene della metallotioneina1 MMT murina viene fuso alla regione
codificante del gene TK di HSV. TK si saggia
facilmente quindi TK è un comodo reporter per la
funzione e l’attività del promotore MMT
Topo transgenico
contenente il
promotore della
metallotioneina
murina fuso al gene
dell’ormone della
crescita di ratto.
Animali sdella
stessa nidiata: a
sinistra transgenico
44 gr; a destra non
transgenico 29 gr. I
topi che esprimono
il transgene di
fusione arrivano a
pesare il triplo del
normale
Tecnologia del trasferimento
nucleare nei mammiferi
• 1952 Briggs e King negli Anfibi
• Gurdon 1986, 1991: trapianto in un uovo
enucleato di nuclei prelevati da una blastula
di Rana pipiens, si ottennero un buon
numero di embrioni
Negli animali la riproduzione avviene per via sessuata, la fecondazione
dell’ovocellula da origine ad una singola cellula da cui deriverà il nuovo
individuo. Durante lo sviluppo dei gameti l’informazione genetica viene,
grazie ad un processo di meiosi, modificata, ciò fa si che ciascuno zigote
possieda un suo unico genoma e dia origine ad un unico individuo. Si
definisce clone una popolazione di cellule o di organismi derivata da un
singolo genoma a seguito di un processo di riproduzione asessuata. In
circostanze naturali può verificarsi che un embrione subisca una divisione
spontanea (splitting) dando origine a due gemelli identici monozigoti. Lo
splitting spontaneo può essere riprodotto artificialmente per ottenere una
discendenza identica.
La possibilità di generare individui biologicamente
identici, ha sempre attratto l'interesse dei ricercatori e già
nel 1936, Hans Spemann pose con i suoi esperimenti, le
basi della clonazione. L'interesse dei ricercatori è stato
immediatamente volto a comprendere se il nucleo di
cellule differenziate di
soggetti adulti conservava, dopo il differenziamento, gli
stessi geni presenti nell'uovo fecondato: si cercava cioè di
comprendere se nuclei di cellule differenziate
conservavano la capacità di essere totipotenti, cioè di dare
origine a tutti i tipi cellulari presenti in un organismo
adulto.
In Zootecnia i primi successi sono stati ottenuti a partire
da cellule embrionali: in pratica, è possibile dissociare i
blastomeri di embrioni di mammifero in stadi di sviluppo
che precedono l'impianto nell'utero, morula precoce,
massimizzando il numero di cellule disponibili.
Queste cellule sono iniettate nello spazio perivitellino di
ovociti enucleati e tramite uno stimolo elettrico si ottiene
la fusione della parete della cellula embrionale con quella
dell'ovocita che consente la ripresa, l'attivazione, dello
sviluppo e cioè la segmentazione a partire dalla cellula
embrione.
Ulteriori importanti successi si sono
ottenuti nel 1986 con la creazione della
pecora Dolly, ottenuta per trasferimento
nucleare da una cellula somatica, anche
se gli animali ottenuti con questa tecnica
sono uguali geneticamente, pur non
essendo propriamente cloni: le
ovocellule utilizzate in questo caso come
citoplasti, riceventi di materiale genetico
estraneo, provengono da femmine
diverse e quindi il citoplasma trasmette
patrimonio differente.
La tecnica prevede che un
ovocita in metafase II (M II),
prelevato tramite
aspirazione dai follicoli
ovarici sia maturato in vitro,
enucleato con tecnica
microchirurgica e sostituito
con materiale genetico
proveniente dallacellula
donatrice; tale pratica è
ampiamente utilizzata in
zootecnia per amplificare la
progenie da animali di "elite".
Nel 1995 i successi ottenuti con il trasferimento nucleare erano limitati ai
casi in cui come donatore di materiale genetico si utilizzavano embrioni ai
primi stadi di sviluppo. Nelle cellule dell’embrione precoce i nuclei, sono
più efficienti nel generare individui, ma l’embrione precoce ha un
numero di cellule ridotto e permette di produrre pochi individui. Inoltre
con questo sistema si clona un genotipo di cui non si conosce il fenotipo,
poiché è l’embrione ad essere clonato e quindi non si ha conferma delle
capacità produttive del soggetto che andiamo a generare.
Successivamente si e’ poi mirato a utilizzare come donatrici di nuclei,
cellule coltivate in laboratorio, che mantenessero la pluripotenza: cellule
staminali embrionali.
Meg e Morag, primi ovini prodotti
mediante trasferimento nucleare da
colture cellulari
Dolly e il suo
agnellino
Bonnie. Dolly
= I°
mammifero
generato
mediante
trasferimento
nucleare da una
cellula adulta
Trasferimento di DNA in altri
Vertebrati
Oociti di Xenopus come sistemi di
clonaggio mediante espressione
fuzionale
PESCI GM
In acquacoltura, esperimenti di trasferimento genico o transgenesi sono
iniziati sui pesci sin dal 1985. Nel 95% dei casi, si è impiegato un transgene
o costrutto genico codificante per l’ormone della crescita (GH) allo scopo di
ottenere ceppi a crescita rapida complessivamente in 15 specie di teleostei
d’allevamento. Nel restante 5%, la ricerca ha riguardato invece transgeni per
proteine antigelo, onde consentire la sopravvivenza di salmoni in acque
molto fredde, e transgeni per il lisozima, proteina battericida, per migliorare
la resistenza alle malattie. I pesci transgenici per il GH hanno fornito i
risultati più interessanti. Ad esempio, il tasso di crescita è stato aumentato di
4 volte (400%) nella tilapia nilotica, Oreochromis niloticus, di 7 volte nella
carpa comune, Cyprinus carpio, e di ben 11 volte nel salmone coho,
Oncorhynchus kisutch. Nonostante il miglioramento della qualità delle carni e
l’indubbio vantaggio economico di poter ridurre così drasticamente i tempi,
notoriamente lunghi, dell’allevamento ittico, la produzione di pesci
transgenici a rapida crescita è rimasta limitata alla scala sperimentale e non
è mai arrivata sui mercati (tranne a Cuba).
Visto l’andamento dell’aspra disputa sugli OGM vegetali, combattuta
politicamente e legalmente sulla contrapposizione tra forti valenze
economiche da una parte e fondamentalismi ideologici dall’altra,
sarebbe stato davvero un atto di eroica ingenuità l’introdurre sul
mercato dei pesci transgenici presentandoli come il primo alimento
geneticamente modificato di origine animale.
È pertanto comprensibile sia l’atteggiamento prudenziale delle
associazioni dei piscicoltori riguardo ai pesci transgenici, sia la
moratoria sulla loro commercializzazione in attesa che le
organizzazioni internazionali che si occupano del problema degli
OGM, tra cui la FAO , le Nazioni Unite, il Dipartimento dell’Agricoltura
degli Stati Uniti, il Consiglio Europeo, la Convenzione sulla
Diversità Biologica (CBD) ed il Consiglio Internazionale per
l’Esplorazione del Mare (ICES) approvino direttive e suggeriscano
codici di condotta e misure cautelative sul come produrre,
trasportare e rilasciare nell’ambiente gli OGM. Dovranno inoltre
essere affrontate a livello dell’Organizzazione Mondiale del
Commercio (WTO) le problematiche relative alla brevettabilità degli
OGM, i relativi diritti di proprietà e di licenza, nonché l’obbligo di
certificazioni e contrassegni che informino i consumatori sulla
presenza o meno di OGM.