PASTA MADRE: tradizione e modernità.

Università Politecnica delle Marche
Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari ed Ambientali
Scuola dottorale in Alimenti e Salute- XII° ciclo
Tesi di dottorato
PASTA MADRE:
tradizione e modernità.
Caratterizzazioni microbiologiche, aromatiche
e birrificatrici di paste madri naturali
Identificazioni, interazioni microbiche, composti volatili, metabolismo degli
acidi fenolici, EPS, tecnologia della birra
Coordinatore: Chiar.mo Prof. Silverio Ruggieri
Tutore: Chiar.mo Prof. Enrico Berardi
Trienno Accademico 2010-2013
Dottoranda: Dott.ssa Ripari Valery
1
Sommario
ABBREVIAZIONI .......................................................................................................................................................................... 8
Riassunto...................................................................................................................................................................................... 10
Abstract ......................................................................................................................................................................................... 11
Scopo del lavoro ....................................................................................................................................................................... 12
Prefazi one: la P asta Madre ...................................................................................................................................... 13
1.
Pasta Madre manten uta e propag ata artigianalm ente ........................................................ 16
1.1 Premessa: la produzione dei prodotti da forno............................................................................................. 16
1.1.1.
Le fasi del processo .................................................................................................................................. 20
1.1.1.1 La scelta degli ingredienti..................................................................................................................... 20
1.1.1.1.1.
Il tipo di farina .............................................................................................................................. 20
1.1.1.1.2.
Il lievito............................................................................................................................................. 26
1.1.1.1.3.
L’acqua .............................................................................................................................................. 27
1.1.1.1.4.
Il sale alimentare ......................................................................................................................... 28
1.1.1.1.5.
Lo zucchero, il malto e i grassi ............................................................................................. 28
1.1.1.1.6.
Gli additivi ....................................................................................................................................... 29
1.1.1.2.
IMPASTAMENTO ............................................................................................................................. 31
1.1.1.3.
LA LIEVITAZIONE ........................................................................................................................... 33
1.1.1.4.
SPEZZATURA E FORMATURA .................................................................................................. 36
1.1.1.5.
COTTURA............................................................................................................................................. 36
1.2 Il LM come ingrediente nella produzione industriale del pane ........................................................... 39
1.3. Pasta madre: conservazione e uso attraverso la lievitazione naturale in un panificio
artigianale ............................................................................................................................................................................... 42
1.3.1 Pesatura degli ingredienti ............................................................................................................................. 44
1.3.2 Impastamento e lievitazione: ...................................................................................................................... 45
1.3.3 La cottura: .............................................................................................................................................................. 46
1.4 Pasta madre: conservazione e uso mediante lievitazione naturale a uso familiare ................ 48
1.5 In conclusione ................................................................................................................................................................ 51
2.
La caratterizzazione delle popolazioni microbiche in 41 PM marchigiane e umbre. ................ 52
2.1.
Introduzione .......................................................................................................................................................... 52
2
2.1.1.
2.1.1.1.
I lieviti ................................................................................................................................................... 55
2.1.1.2.
I batteri lattici ................................................................................................................................... 57
2.1.1.3.
Interazioni microbiche nella PMN ........................................................................................... 60
2.1.2.
2.2.
La pasta madre ........................................................................................................................................... 52
Qualità apportate al prodotto finito ................................................................................................ 62
2.1.2.1
Digeribilità ............................................................................................................................................... 62
2.1.2.2
Incremento dei valori nutrizionali .............................................................................................. 63
2.1.2.3
Conservabilità strutturale e microbiologica .......................................................................... 66
2.1.2.4
Migliori caratteristiche sensoriali ............................................................................................... 71
Materiali e Metodi ............................................................................................................................................... 76
2.2.1
Materiale chimico e biochimico ......................................................................................................... 76
2.2.1.1
Ceppi ........................................................................................................................................................... 76
2.2.1.2
Terreni di coltura ................................................................................................................................. 76
2.2.1.3
Tipologia di farina................................................................................................................................ 77
2.2.1.4
Enzimi ........................................................................................................................................................ 77
2.2.2
Metodi colturali fisiologici e biochimici......................................................................................... 77
2.2.2.1
Crescita su piastra................................................................................................................................ 77
2.2.2.2
Crescita in liquido ................................................................................................................................ 77
2.2.2.3
Test fisiologici ........................................................................................................................................ 78
2.2.3
Metodi di osservazione cellulare....................................................................................................... 78
2.2.4
Metodi per valutare alcuni parametri tecnologici della pasta madre ............................ 78
2.2.4.1 Test di lievitazione ................................................................................................................................... 78
2.2.4.2 Analisi del pH .............................................................................................................................................. 78
2.2.5
Collezione dei campioni di pasta madre........................................................................................ 78
2.2.6
Identificazione microbica...................................................................................................................... 79
2.2.6.1
Partendo dal DNA totale estratto dai campioni –DGGE ................................................... 79
2.2.6.1.1 Estrazione del DNA totale ............................................................................................................ 79
2.2.6.1.2Amplificazione del DNA ................................................................................................................. 80
2.2.6.1.3 Analisi DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)......................................... 81
2.2.6.2
A partire dalle colture pure degli isolati .................................................................................. 81
3
2.2.6.2.1
Isolamenti ........................................................................................................................................ 81
2.2.6.2.2
Estrazione del DNA ..................................................................................................................... 82
2.2.6.2.3
Analisi RAPD- Random Amplification of Polymorphic DNA..................................... 83
2.2.6.2.4
Amplificazione del 16S batterico ......................................................................................... 84
2.2.6.2.5
Lieviti: analisi RFLP della regione ITS ............................................................................... 85
2.2.6.2.6
Amplificazione del DNA fungino impiegando i primer P1-P2 .................................. 86
2.2.6.2.7
Purificazione del DNA amplificato ...................................................................................... 87
2.2.6.2.8
Analisi quantitativa del DNA .................................................................................................. 87
2.2.6.2.9
Preparazione dei campioni per il sequenziamento e analisi delle sequenze 87
2.2.7
Analisi dei componenti volatili........................................................................................................... 88
2.2.7.1 Preparazione dei campioni .................................................................................................................. 88
2.2.7.2 Analisi gascromatografica dello spazio di testa (HS-SPME -GC-MS) ............................... 88
2.3.
Risultati..................................................................................................................................................................... 89
2.3.1.
La collezione ..................................................................................................................................................... 89
2.3.2.
Parametri fisico chimico tecnologici .................................................................................................... 92
2.3.3.
DGGE ..................................................................................................................................................................... 93
2.3.4.
Identificazioni molecolare ......................................................................................................................... 97
2.3.4.1 Isolamenti (Isolamento di batteri acetici) e conte microbiche ......................................... 97
2.3.4.2 Tipizzazione attraverso RAPD ........................................................................................................... 97
2.3.4.3 Identificazioni molecolari mediante amplificazioni di regioni ribosomiali ............... 98
2.3.5.
Screening per l’identificazione di ceppi Eps+ ................................................................................ 104
2.3.6.
Profili aromatici di alcune PMT............................................................................................................. 105
2.3.7.
Profili aromatici di alcune PM monoceppo .................................................................................... 109
2.4 DISCUSSIONE ............................................................................................................................................................. 112
3.
Il metabolismo di alcuni acidi fenolici in impasti modello.................................................................... 114
3.1.
Introduzione ....................................................................................................................................................... 114
3.1.1.
Gli acidi fenolici ....................................................................................................................................... 114
3.1.2.
Metabolismo microbico degli acidi fenolici .............................................................................. 116
3.2.
Materiali e Metodi ............................................................................................................................................ 119
3.2.1 Materiale biologico ......................................................................................................................................... 119
4
3.2.1.1
Ceppi utilizzati:................................................................................................................................... 119
3.2.2 Materiale chimico e biochimico ............................................................................................................... 119
3.2.2.1
Terreni di coltura .............................................................................................................................. 119
3.2.2.2
Reagenti chimici utilizzati e soluzioni .................................................................................... 119
3.2.2.3
Farine utilizzate ................................................................................................................................. 119
3.2.3 Batteri e presunta capacità di metabolizzare acidi fenolici: screening molecolare ...... 119
3.2.4 Fermentazioni in terreno sintetico (mMRS + FA) .......................................................................... 120
3.2.5 Fermantazioni in impasti modello ......................................................................................................... 121
3.2.5.1 Impasti modello ...................................................................................................................................... 121
3.2.5.2
Analisi pH e UFC/gr ......................................................................................................................... 122
3.2.5.3
Estrazione degli acidi organici e dei monosaccaridi -analisi HPLC......................... 122
3.2.5.4
Estrazione degli acidi fenolici liberi ........................................................................................ 122
3.2.5.5
Estrazione degli acidi fenolici coniugati................................................................................ 123
3.2.5.6
Estrazione degli acidi fenolici legati ........................................................................................ 123
3.2.6 Analisi e quantificazione degli PA .......................................................................................................... 124
3.3.
Risultati.................................................................................................................................................................. 126
3.3.1.
Indagine preliminare sulle decarbossilasi degli acidi fenolici (identificazione di
ceppi pdc+) ..................................................................................................................................................................... 126
3.3.2.
Analisi dei metaboliti prodotti a partire dall’ acido ferulico ........................................... 128
3.3.3.
Fermentazioni monoceppo in PM modello e analisi UPLC degli acidi fenolici....... 131
3.3.4.
Cofermentazioni Rel+ - Deg+ in PM modello ................................................................................... 135
3.4 Discussione ................................................................................................................................................................. 137
4.
Messa a punto di PM naturali, originate ex-novo........................................................................................ 138
4.1.
Introduzione ....................................................................................................................................................... 138
4.1.1.
Fattori ecologici influenzanti l’ecologia microbica ............................................................... 138
4.1.1.1.
Fattori esogeni ............................................................................................................................... 138
4.1.1.2.
Fattori endogeni ........................................................................................................................... 140
4.1.1.3.
La fermentazione spontanea nella PM .............................................................................. 142
4.1.1.2 Il MICROBIOTA nei cereali ................................................................................................................ 142
4.1.1.3 Fattori influenzanti l’adattabilit{ microbica ............................................................................ 143
4.1.2
HRMqPCR ................................................................................................................................................... 144
5
4.2.
Materiali e metodi ............................................................................................................................................ 146
4.2.1
Materiale chimico e biochimico ...................................................................................................... 146
4.2.1.1
Sorgente microbica natural (SNM) .......................................................................................... 146
4.2.1.2
Tipologia di farina............................................................................................................................. 146
4.2.1.3
Terreni di coltura .............................................................................................................................. 146
4.2.2
Campioni ex novo e metodo di campionamento..................................................................... 146
4.2.3
Identificazioni a partire dal DNA dei ceppi isolati ............................................................... 146
4.2.4
Campioni di PM modello..................................................................................................................... 147
4.2.5
Determinazione dell’evoluzione microbica nel tempo attraverso HRMqPCR ........ 147
4.2.5.1
Estrazione DNA totale..................................................................................................................... 147
4.2.5.2
Popolazione dei batteri e dei lieviti ......................................................................................... 148
4.3.
Risultati.................................................................................................................................................................. 149
4.3.1.
La selezione di cenosi batteri-lieviti per usi artigianale o industriali .............................. 149
4.3.2.
Isolamenti e identificazioni molecolari dei batteri e dei lieviti ........................................... 150
4.3.3.
qPCR)
Evoluzione della popolazione batterica fino al raggiungimento della stabilità (HRM
153
4.3.4.
Co-fermentazioni lattiche........................................................................................................................ 157
4.3.5.
Messa a punto di un metodo HRMqPCR per analizzare l’evoluzione della popolazione
fungina 159
4.3.6.
Aromi nelle PMEN ......................................................................................................................................... 163
DISCUSSIONE ..................................................................................................................................................................... 164
5
Birre acide inoculate con PM ................................................................................................................................ 166
5.1
Introduzione ....................................................................................................................................................... 166
5.1.1 La birra e i suoi legami con la pasta madre ....................................................................................... 166
5.1.2 I microrganismi nella birra ........................................................................................................................ 168
5.1.2.1 I lieviti: ......................................................................................................................................................... 168
5.1.2.2 I batteri ........................................................................................................................................................ 169
5.1.3 Birre a fermentazione spontanea - birre acide - la Lambic ....................................................... 171
5.1.
Materiali e metodi ............................................................................................................................................ 173
5.2.1
Conte e identificazioni microbiche nei campioni di pasta madre ................................. 173
5.2.2
Preparazione dei campioni di PM e inoculo nel mosto ..................................................... 173
6
5.2.3 Nuova ricetta per ottenere birre acide a partire da pasta madre .......................................... 173
5.2.4
Parametri tecnologici: la densità e il pH ......................................................................................... 173
5.2.5
Analisi HS-GC-MS........................................................................................................................................ 174
5.2.
Risultati.................................................................................................................................................................. 175
5.3.1.
Birra ottenuta con la pasta madre tradizionale “K” .................................................................. 175
5.3.2
Birra ottenuta con la pasta madre tradizionale “AA” ............................................................... 177
5.3.3
Birra ottenuta con la pasta madre ex novo “CB” .......................................................................... 179
5.3.4
Birra ottenuta con la pasta madre ex novo “PY” .......................................................................... 180
5.3.5
Evoluzione delle quattro birre a confronto ................................................................................... 182
5.4 Discussione ................................................................................................................................................................. 184
Ringraziamenti ....................................................................................................................................................................... 185
Appendice I- Volantino della Comunità del Cibo della Pasta madre........................................... 187
Appendice II- Evoluzione del volume e del pH dei campioni di PM T.......................................... 188
Appendice III- Profili aromatici di un campione di PMT “AA”......................................................... 189
Appendice IV- Profili aromatici delle birre acide ................................................................................. 190
Appendice V- Ceppi batterici pdc+ ................................................................................................................ 192
Bibliografia ............................................................................................................................................................................... 193
Sitografia ................................................................................................................................................................................... 208
7
ABBREVIAZIONI
°C
Gradi centigradi
ac.
Acido/i
bp
Paia di basi
CO2
Anidride carbonica
DGGE
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
DNA
Acido deossiribonucleico
dNTPs
Deossiribonucleotidi trifosfati
dsDNA
DNA a doppia elica
DY
Resa dell’impasto, letteralmente dough yield
Es.
Esempio
EPS
Esopolisaccaridi
F
Fluorescenza
F°
Grado Francese
FA
Acido ferulico
FQ
Quoziente fermentativo
gg
Giorni
gr
Grammo
H
Ore
H+
Protone
HPLC
Hight performance liquid chromatography
HS/GC/MS Headspace gas chromatography mass spectrometry
IG
Indice glicemico
L
Estensibilit{ dell’impasto
LAB
Batteri lattici
LdB
Lievito di birra o lievito convenzionale
LMN
Lievito madre naturale
LMA
Lievito madre artificiale
n°
Numero
8
NAD(P)H
Nicotinamideadenindinucleotide (fosfato)
o/n
Over night
P
Tenacia dell’impasto
PA
Acidi fenolici
pad o pdc
Gene che codifica per la decarbossilasi degli acidi fenolici
PadR
Repressore del pad
PCR
Reazione a catena della polimerasi (Polimerase chain reaction)
p.m.
Peso molecolare
PMA
Pasta madre artificiale, consorzio microbico creato dall’uomo
PMEN
Pasta madre ex novo, nuovi campioni ottenuti da zero
PMN
Pasta madre naturale, cenosi microbica selezionata naturalmente
PMT
Pasta madre tradizionale, impasto utilizzato seguendo la tradizione per ottenere
pane a lievitazione naturale. Si intendono le PMN campionate.
P/L
Elasticit{ dell’impasto
p/p
Peso su peso
RAPD
Random Amplification of Polymorphic DNA
RS
Rinfreschi selettivi
RO
Rinfreschi operativi
SNM
Sorgente naturale microbica
sp.
Specie
ssDNA
DNA denaturato o a singolo filamento
T
Temperatura
Tamb
Temperatura ambiente
UFC
Unità Formanti Colonia
Uplc
Ultra performance liquid chromatography
W
Capacità panificabile della farina
9
Riassunto
L’uso della pasta madre mostra un continuo interesse in ambito scientifico, commerciale
e privato a causa dei miglioramenti che il suo uso apporta al prodotto finito. L’uso
artigianale della pasta madre naturale è un processo che richiede attenzioni, cure e
passione. Abbiamo avuto l’occasione di seguire processi produttivi di pane artigianale
con l’uso della pasta madre e ne abbiamo potuto apprezzare tutti gli aspetti più
importanti. Inoltre, abbiamo campionato 41 paste madri tradizionali e le abbiamo
caratterizzate microbiologicamente attraverso l’uso di diversi metodi molecolari (DGGE;
sequenziamento del 16S e del 28S). Abbiamo analizzato la popolazione batterica per
verificare se vi fossero ceppi capaci di produrre EPS, oltre che portatori del gene pdc
capace di codificare per l’enzima che decarbossila gli acidi fenolici. La degradazione
degli acidi fenolici nella farina genera fenoli volatili che rendono il pane più appetibile. I
ceppi pdc+ sono stati impiegati in terreni sintetici con aggiunta di acido ferulico e in
impasti modello, per valutare la reale capacità di degradare gli acidi fenolici.
Abbiamo, poi creato da zero, secondo metodi tradizionali, alcune nuove paste madri,
denominate da noi “ex novo”, utilizzando diversi materiali vegetali come fonte di inoculo
iniziale. Abbiamo così potuto valutare come la popolazione microbica si è selezionata nel
tempo e se questa possa essere stata influenzata dal materiale di partenza utilizzato. A
tale scopo, inoltre, abbiamo impiegato una nuova tecnica molecolare (HRMqPCR) e
abbiamo messo a punto il primo metodo HRMqPCR per le analisi di una popolazione
fungina a partire dal DNA totale estratto dalle paste madri ex novo.
Utilizzando 4 paste madri, due delle quali collezionate e le altre due ottenute ex novo,
abbiamo inoculato del mosto d’orzo per ottenere birre acide di tipo Lambic. Di esse
abbiamo monitorato alcuni parametri tecnologici e altri microbiologici.
Le analisi gascromatografiche delle paste madri e delle birre, infine, hanno messo in luce
risultati molto interessanti.
10
Abstract
Interest in sourdoughs has been steadily growing in recent years, whether biologically,
technologically, commercially or family oriented. Handcrafted natural sourdoughs
require care, concern and dedication.
Here we describe handcrafted baking processes, making use of natural sourdoughs,
investigated from a microbiological point of view. After sampling 41 traditional
sourdoughs, we characterized them microbiologically, by different molecular methods
(DGGE; sequencing). We then analyzed our bacterial populations, in order to evaluate if
EPS+ strains, as well as their related pdc genes were present. Phenolic acid degradations
in flour generates volatile phenolic acids, yielding more desirable bread aromas. pdc+
strains have been used in synthetic-media + ferulic acid, and in model-doughs, in order
to evaluate the actual phenolic-acid degrading capacity of each pdc+ strain.
According to traditional methods, various dough samples were prepared from scratch,
and denoted “ex novo” sourdoughs (PMEN), always making use of various plant materials
and organs (natural microbial sources, SNM). We have been able to evaluate microbial
population dynamics, and to reflect on possible relations between SNM and final
populations. A recent quantitative PCR technique (HRMqPCR) has been optimized for
our PMEN microbial populations, possibly for the first time so far.
Utilizing 4 sourdoughs (2 collected and 2 ex novo), we also inoculated some malt barley
must, in order to obtain sour beers. These fermentations, monitored microbiologically
and technologically, showed very interesting results.
11
Scopo del lavoro
Gli scopi del presente lavoro sono molteplici.
1. Approfondimento dei metodi di produzione tradizionale di pane fatto lievitare da lievito
madre naturale (LMN) artigianale, individuando i pregi e le differenze tra questi e i metodi
industriali.
2. Collezionare alcuni campioni di PMN tradizionali provenienti principalmente dalla Regione
Marche per caratterizzarne, attraverso diverse metodologie, la popolazione microbica.
3. Inserire nuovi ceppi nella collezione microbica di laboratorio.
4. Valutare la composizione dei composti volatili presenti nello spazio di testa di vari campioni
di PM tradizionale (PMT) e modello.
5. Individuazione delle PMT contenenti ceppi batterici in grado di produrre esopolissacaridi
(EPS), per esaltare la produzione di pane avente conservabilità migliorate.
6. Analisi della capacità di degradazione degli acidi fenolici (PA) della farina da parte
soprattutto dei LAB isolati e identificati, per esaltare la capacità di tali ceppi di produrre
particolari composti volatili nel prodotto finito.
7. Creazione di nuovi campioni di PM EN (ex novo) per analizzare come la fermentazione
spontanea possa evolvere durante i rinfreschi selettivi (RS) e se, avendo variato tra i
campioni, solo la sorgente naturale di inoculo (SNM) al 1° impasto, tale fermentazione
differisca.
8. Dimostrare che la popolazione microbica si seleziona più facilmente se si utilizza nel 1°
impasto una sorgente di inoculo naturale (nel nostro caso ricca di zucchero (fiori e frutta) o
già fermentata).
9. Messa a punto di un nuovo metodo PCR (HRMqPCR) per l’analisi dell’evoluzione e/o
cambiamento della popolazione fungina nei campioni di PM ex novo.
10. Ottenimento di birre acide a partire da PM.
12
Prefazione: la Pasta Madre
Nella lunga epoca delle primissime civiltà di Homo sapiens (200.000-10.000 anni fa), si
cominciarono a macinare i chicchi dei cereali e a impastare con acqua le farine ottenute
per infornare piccole focacce, da consumarsi insieme agli altri cibi, crudi o cotti. Queste
focacce poterono essere ammorbidite, insaporite e dolcificate, aggiungendo agli impasti
grassi e oli diversi, erbe varie o bevande e frutti. Talvolta, crediamo per puro caso, uno di
questi impasti, fu lasciato riposare per qualche tempo e, inspiegabilmente per le
conoscenze di allora, cominciò a espandersi, a crescere e a sviluppare una moltitudine di
bollicine che sembrarono animarlo di vita propria. Da esso si ottennero focacce più alte,
più morbide e molto più saporite. Era nata la lievitazione e chi la scoprì imparò presto a
conservare un poco di quella pasta viva e a impiegarla come una “madre” per inoculare
gli impasti successivi. A tale pasta diamo ancora oggi il nome di “pasta madre”, o anche
di “madre” o “mamma”. “Sourdough” (inglese), “Sauerteigs” (tedesco), “zuurdesem”
(olandese), cioè “pasta acida” è il termine preferito invece dai popoli anglosassoni e oggi
anche questa denominazione si aggiunge a quelle della tradizione italiana.
Altre denominazioni mediterranee sono quella francese (levain), spagnola (masa madre),
catalana (de massa fermentada), portoghese (fermento natural), sarda (màdrighe,
madrìghe), croata (kiselo tijesto), araba (‫ م تخمرة خم يرة‬al’ejyn almkhmr), ebraica (‫שאור‬
shavr), turca (maya), maltese (morra) e greca (μεταλευτής metaleetes).
La moderna microbiologia ha studiato diverse paste madri e ha scoperto che esse
ospitano interessanti comunità microbiche, variegate e dalle proprietà inaspettate.
All’interno di queste comunit{ si ritrovano di solito lieviti e batteri, ma alcune volte solo
batteri. Queste popolazioni microbiche sono uniche per ogni pasta e, si è scoperto,
conferiscono ad ogni pane caratteristiche organolettiche uniche. Si aggiunga che le
popolazioni microbiche immettono negli impasti, tra gli altri composti, l’acido lattico
che, oltre a insaporire caratteristicamente il pane o il dolce ottenuto, è un conservante
naturale. Anche per questo le pagnotte ottenute dal lievito madre non ammuffiscono e
durano per parecchi giorni. Dopo l’interminabile dominio, dal dopoguerra a oggi, del
lievito di birra (sinonimo per noi di vera omologazione globale dei prodotti lievitati) la
recente riscoperta delle paste madri e dei loro aromi, ha finalmente risvegliato
l’interesse di molti consumatori (e di molti chef) verso questo ingrediente tradizionale,
13
che non finirà di stupirci (da vegan blog; http://www.veganblog.it/2012-10-28-la-pastamadre-2/).
Questa tesi ha per oggetto alcune paste madri naturali (PMN) di due tipi: (i) tradizionali
(PMT), provenienti in prevalenza dalla regione Marche, oppure (ii) ottenute da noi
secondo le modalità della consuetudine (PM ottenute ex novo, PMEN).
Abbiamo impiegato tali PMN in panificazioni domestiche o artigianali, oppure anche per
la produzione di birre acide artigianali.
Nella pratica, le PMN non vengono usate direttamente nelle lievitazioni, ma devono
essere “rinfrescate” per generare il cosiddetto lievito madre (LM), l’ingrediente
lievitativo di questi processi. In altre parole, occorre aumentare - in tutte le PM - il
numero delle cellule microbiche vive e attive, e ciò si ottiene aggiungendo farina e acqua
a una porzione di PMN, e lasciando riposare l’impasto per 2-6 h a temperatura idonea
(rappresentato nel seguente schema).
14
A differenza della legislazione francese, quella italiana non discrimina tra agenti
lievitanti naturali (LMN) e agenti lievitanti industriali (es., lievito convenzionale ottenuto
industrialmente, oppure lievito madre artificiale, LMA).
A nostro avviso, inoltre, occorrerebbe poter discriminare tra LM-naturale e LMartificiale, cioè ottenuto in laboratorio mediante assembramento cenotico di comunità
microbiche acido-lievitanti, per quanto queste siano composte di microrganismi isolati
da PMN (schema seguente).
Da qualche anno assistiamo con piacere a una riscoperta, nel mondo, delle paste madri e
delle lievitazioni “acide”, cioè basate sul lievito madre. Possiamo, a tale proposito,
individuare 3 diverse modalit{ d’impiego della PM: la prima (i) basata su un utilizzo
industriale del LM, per lo più “corretto” o “integrato” con lievito di birra, quantomeno
durante l’ultima lievitazione del pane; in genere, la PM da cui ottenere il LM è
considerata un semplice “ingrediente” e quindi solitamente viene acquistata (es., come
crema o come polvere) da industrie specializzate che offrono tali prodotti microbici in
versione quasi mai “originale”, ma più spesso ottenuta in laboratori di microbiologia
alimentare per unione (generalmente) di un batterio acidificante con un lievito adatto
(spesso, ma non sempre, questi microrganismi sono ottenuti a partire da paste madri
idonee); tali LM sono quindi di tipo “artificiale” (LM A) (ii) la seconda (oggetto precipuo
di questo studio) impiegata in piccole panetterie artigiane che, oltre a curare le lunghe
lievitazioni delle pagnotte, badano anche a una sapente propagazione delle PM, e a
un’altrettanto sapiente preparazione del LM, che possiamo in questo caso senz’altro
considerare un LMN; (iii) la terza modalità è quella di ambito prettamente familiare,
amatoriale, nella quale anche il LM è, in generale, di tipo “naturale”. Quest’ultima
tipologia può anche essere legata ai ristoranti e alle pizzerie, tutte le volte che il LM
impiegato sia di tipo naturale.
15
1. Pasta Madre mantenuta e propagata artigianalmente
1.1 Premessa: la produzione dei prodotti da forno
In Occidente, il metodo più utilizzato per produrre il pane e i prodotti lievitati da forno è
quello cosiddetto discontinuo, cioè quello che mantiene separate la diverse fasi
produttive.
Sono due i principali tipi di processo-discontinuo: quello denominato (i) metodo diretto,
e quello noto come (ii) metodo indiretto.
Nel metodo diretto viene utilizzato il lievito di birra, tutti gli ingredienti vengono
mescolati fra loro e l’impasto così ottenuto viene lasciato lievitare per un tempo di ½ - 3
h (fase di puntata), questa prima fase non ha l’obiettivo di far aumentare di volume
l’impasto, ma quello di indurre alcune modificazioni reologiche all’impasto. L’impasto
viene poi suddiviso in frammenti di dimensioni adeguate per la pagnotta che si desidera
ottenere. Tali frammenti vengono fatti lievitare una seconda volta (es., ca. 1 h): è la fase
di appretto, in cui avviene l’espansione volumetrica della massa. Segue infine la cottura
del prodotto (figura 1.1 (a)).
16
FIGURA 1.1 Processi di panificazione discontinui, (a) diretto o (b’) indiretto, entrambi
facenti uso di lievito di birra. Il processo discontinuo (b’’) è un esempio di metodo indiretto
facente uso di lievito naturale.
17
Il processo indiretto (ii) è così chiamato perché gli ingredienti vengono aggiunti in
diverse fasi del processo (figura 1.1 (b)). La produzione di pane attraverso l’uso della
pasta madre (PM) rappresenta quindi un particolare processo indiretto (figura 1.1-b’’).
Nel caso di un processo discontinuo indiretto in cui si utilizzi il lievito di birra, la prima
fase consiste nell’ottenimento di un primo impasto (pre-impasto) chiamato biga se più
consistente, o polish se più “liquido”.
La biga è formata da circa 1/3 della farina necessaria all’ottenimento del prodotto finito,
lievito compresso e parte dell’acqua (ca. 45% della quantit{ di farina): l’impasto
risulterà piuttosto asciutto.
Il polish, come detto è molto liquido, dato che si utilizza un rapporto acqua : farina di 1:1;
la percentuale di lievito varia in base al numero delle ore di lievitazione programmate.
La farina utilizzata per la preparazione del pre-impasto dovrà avere una forza (W)
maggiore di 300 e un rapporto P/L (esistenza/elasticità, cfr. §-1.1.1.1) compreso tra 0,5
e 0,6. La durata della lievitazione del pre-impasto (puntata) è molto variabile (3-20h).
Questa lunga lievitazione è anche chiamata maturazione, e viene utilizzata per
permettere al lievito di adattarsi al nuovo ambiente (impasto) e per consentire alcune
modificazioni reologiche dell’impasto, come gi{ detto.
L’impasto maturo viene mescolato alla restante quantit{ di farina, acqua ed
eventualmente sale (e quant’altro previsto nella ricetta) e solo successivamente
spezzato, modellato e lasciato lievitare in forma per 1 h, prima della cottura.
DIRETTO
METODO
CONTINUO
INDIRETTO- con
prefermento
liquido
Chorleywood
Do-Maker
(senza farina nel
prefermento)
Amflow
(con farina nel
prefermento)
FIGURA 1.2 Rappresentazione schematica dei metodi continui nella panificazione.
Il processo produttivo continuo venne introdotto alla fine degli anni ’50 negli Stati Uniti.
Tali processi sono così chiamati perché il dosaggio degli ingredienti e le successive
operazioni avvengono senza interruzione. Queste ultime tecniche hanno trovato
successo in Gran Bretagna e negli Stati Uniti (Pagani, Manzoni, 2007), si stima che più
del 60% del pane prodotto negli Stati Uniti e in Gran Bretagna sia ottenuto attraverso
questa metodologia.
I principali processi continui (processi Do-Maker 1954 e Amflow 1960) prevedono la
preparazione di un pre-fermento liquido ottenuto in grandi fermentatori, mescolando
zucchero, lievito, acqua, materiale nutritivo per i lieviti ed eventualmente una piccola
percentuale di farina. Tale fase consente di eliminare la lievitazione necessaria
all’adattamento del lievito al sistema impasto. Segue la fase di impastamento di tutti gli
ingredienti ad alta velocità.
Nel caso del metodo Chorleywood, (CBP, metodo continuo e diretto, sviluppato nel 1961)
tutti gli ingredienti sono miscelati insieme. Alla lievitazione biologica viene affiancata
una lievitazione fisica: inglobamento di aria in un impasto fluido, sia per forte azione
meccanica da parte delle impastatrici ad alta velocità sia per insufflamento di aria sotto
pressione nell’impasto. In questo modo la miscelazione degli ingredienti e lo sviluppo
dell’impasto avvengono in pochi minuti nello stesso momento. Attraverso la riduzione di
18
pressione durante la miscelazione degli ingredienti si riesce a ridurre la dimensione
degli alveoli. I prodotti ottenuti attraverso questa metodologia presentano una crosta
sottile e una mollica con alveoli fini e regolari.
In entrambi i casi si assiste a una sostanziale riduzione di tempo e compattezza dei
macchinari, ma la miscelazione ad alta velocità provoca un elevato stress meccanico che
può essere sostenuto dall’impasto solo se alla farina vengono aggiunti additivi
antiossidanti (es., acido ascorbico) utili a rafforzare la struttura proteica (nella
legislazione Europea è vietato l’uso di alcuni di questi). Anche emulsionanti e altre
sostanze grasse sono spesso necessarie per stabilizzare i numerosi alveoli di piccole
dimensioni. I metodi continui mirano quindi a un abbattimento dei costi e dei tempi di
produzione. La riduzione dei tempi di fermentazione comporta l’utilizzo di maggiori
quantità di lievito di birra e di additivi.
19
1.1.1. Le fasi del processo
Ogni processo di panificazione richiede una serie di fasi comprendenti l’impastamento,
la lievitazione, la formatura e la cottura.
1.1.1.1 La scelta degli ingredienti
Gli ingredienti necessari sono la farina (o “le” farine), il lievito, l’acqua e, se previsti, il
sale e gli additivi.
1.1.1.1.1. Il tipo di farina
Le farine sono il prodotto della macinazione (molitura) del chicco di un cereale.
Tipicamente, per gran parte delle panificazioni italiane, i frumenti teneri e duri, nelle
diverse varietà delle specie Triticum aestivum e Triticum durum. Il primo si è diffuso
principalmente nelle aree temperate più fresche e con buona piovosità; il secondo
soprattutto nelle regioni con climi più caldi e tendenzialmente aride del Mediterraneo.
Altre varietà interessanti, seppur meno diffuse, appartengono alla specie Triticum
turgidum (frumento orientale o grano grosso).
Le farine, che si differenziano in base al grado di macinazione del cereale impiegato,
sono costituite principalmente da polisaccaridi, da proteine, da sali minerali, da vitamine
(in tracce: B1, B2, B3, B6), da fibre e da antiossidanti.
Gli zuccheri presenti sono soprattutto gli amidi, i pentosani e la cellulosa; parte di questi
saranno substrato nutritivo per i microrganismi utilizzati come agenti lievitanti.
E’ dai granuli d’amido che si liberer{ il substrato carbonico ed energetico per le
fermentazioni microbiche panarie. Il granulo d’amido è costituito da una macromolecola
di amilosio e da una di amilopectina. Benché entrambe queste macromolecole siano
costituite da unit{ di glucosio, l’amilosio è un polimero lineare (500-6000 U, p.m. 1001000 kDa) caratterizzato da legami α-(1,4), mentre l’amilopectina (p.m. 105 kDa) è
ramificata, formata da qualche decina di migliaia di unità di glucosio unite da legami α(1,4) e, nei punti di ramificazione, da legami α-(1,6).
Nel frumento la proporzione di amilopectina e amilosio è in genere di 3:1.
20
Le proteine principali delle farine di frumento sono le gliadine (prolammine1 solubili in
soluzioni alcoliche ma non in acqua, non coagulantisi al calore) e le glutenine2 (insolubili
in acqua ma in soluzioni acide, coagulantisi al calore). Si ritrovano inoltre anche le
albumine (solubili in acqua), le globuline (solubili in soluzioni saline) e diversi enzimi,
soprattutto proteasici e amilasici che, idratati e attivati, danno origine a peptidi o ad
amminoacidi-liberi, ma anche a destrine, maltosio e glucosio. Altri enzimi degni di nota
sono infine le lipasi e le fitasi.
E’ interessante notare che la cosiddetta attitudine fermentativa di una farina si determini
in base alla quantità degli enzimi presenti, e in particolare delle amilasi.
La normativa italiana distingue, per le farine di grano tenero, cinque tipi diversi,
denominati 00, 0, 1, 2, e integrale in base al grado di abburattamento 3. Le farine più
raffinate (minor tasso di abburattamento), più fini e bianche (esempio la 00) sono quelle
che contengono meno ceneri e sono più ricche di amido, ma sono povere di proteine e
sali minerali. Le farine meno raffinate (fino all'integrale, 100% di estrazione), che
contengono più residui di endosperma e crusca sono quindi più ricche di fibre e minerali
(tra cui Fe, P, K, Mg e Na).
Più elevato il tasso di estrazione, maggiore il contenuto proteico, minerale, e vitaminico
(B1 e B2) delle farine, e minore sarà il loro tenore percentuale glucidico e lipidico.
% sulla sostanza secca
Tipo e
denominazione
Farina 00
Farina 0
Farina 1
Farina 2
Farina
integrale
ceneri
min.
1.30
max.
0.55
0.65
0.80
0.95
1.70
proteine
(N x 5.7)
min.
9.0
11.0
12.0
12.0
12.0
TABELLA 1.1 Classificazione delle farine in base al grado di abburattamento.
Sono proteine tipiche dei semi dei cereali, che hanno elevati contenuti di prolina e di glutammina. Oltre
alle gliadine, sono prolammine anche la zeina del mais, l’ordeina dell’orzo, la secalina della segale e
l’avenalina dell’avena.
2 Assieme alle gliadine costituisce il glutine.
3 E’ il processo di setacciatura mediante buratto: consente di ottenere, mediante setacci con diametri
sempre più sottili, le farine con diverso grado di finezza. Le farine non abburattate sono denominate
integrali, e contengono ogni parte del chicco macinato, crusca e germe compresi.
1
21
Una delle caratteristiche tecnologiche principali per la panificazione, è la cosiddetta
Forza della farina, che dipende soprattutto dalla quantità di glutine presente (gliadine +
glutenine). Vi sono sistemi tecnologici in grado di determinare tale Forza (Alveografi), a
partire dal cosiddetto fattore di panificabilità, o doppia-vu (W), rappresentato dall’area
di un tracciato disegnato dall’alveografo, nel quale è stato inserito un impasto, e che
riporta i valori misurati della Resistenza (P, ordinate) e dall'Elasticità (L, ascisse).
(a)
(b)
FIGURA 1.2 Due alveogrammi: W, il fattore di panificabilità, coincide con l’area delimitata
dalla curva. La relazione tra P (tenacia dell’impasto) ed L (estensione dell’impasto) in (a)
con una farina “forte”: grande W e adatta per pani a lunga lievitazione (elevati P, bassi L e
alta elasticità, cioè rapporto P/L). In (b) con una farina “debole”: adatta per biscotti (bassi
valori di P ed elevati valori di L originano bassi rapporti P/L, e quindi piccole W).
La prevalenza di gliadine porta a maggiori estensibilità dell’impasto (L). La prevalenza
di glutenine determina invece la cosiddetta tenacia dell’impasto (P). Il rapporto P/L
viene indicato anche come elasticità. P/L elevato indica farine molto resistenti (talvolta
troppo resistenti) e poco estendibili, quindi di difficile lavorazione. P/L con valori bassi o
molto bassi indica invece farine poco resistenti ed esageratamente estensibili.
TABELLA 1.2 Classificazione delle farine in base all’indice W.
22
Tecnologicamente, le farine possono essere “deboli”
Assorbimento
(W 90-160; Potere di
̴ 50%4), adeguate alla preparazione di biscotti e crostate (prodotti
morbidi e friabili).
Oppure possono essere di forza “medio-bassa” (W160-W250; Potere di Assorbimento
̴ 55 -65%) sono adatte per alcuni tipi di pani, (ciabatte, pani in cassetta) e in pasticceria.
Il loro potere di assorbimento può variare dal 55% al 65% p/p.
Le farine di forza “medio-alta” (W 250-310) sono invece utilizzate per produrre pane
(es. baguette) attraverso il metodo diretto.
Le farine “forti” (W 310-350; Potere di Assorbimento ̴ 65-75%) trovano impiego per
le lunghe lievitazioni (metodo discontinuo indiretto), riguardanti sia la pasticceria
(colombe, panettoni, pandori), sia la panetteria (soffiate, pan brioche). Queste farine
hanno inoltre una capacità assorbente dei lipidi alimentari più elevata.
Le farine “speciali”, infine, (W >350; Potere di Assorbimento ̴ 90%) si utilizzano per
pani e pasticceria che richiedano lavorazioni e lievitazioni più lunghe della norma.
Oltre alla farina di frumento possono essere presenti, nelle ricette, farine diverse,
provenienti o da varietà particolari di frumento, o da altri cereali (tabella 1.3) oppure
infine da farine prive di glutine (tabella 1.4 gluten free).
Il Potere di Assorbimento di una farina indica la quantit{ di acqua necessaria per portare l’impasto ad
una consistenza ottimale (500 Unità Brabender-U.B.), viene espresso in percentuale, a elevato
assorbimento d’acqua corrisponde una farina con forza maggiore.
4
23
cereale
caratteristica
uso
farro
valore nutritivo è pari al grano di frumento
tenero
si adatta anche a terreni poveri e sassosi
ricco di proteine, minerali, vitamine e fibra
bassa presenza di glutine
ottima qualità tecnologica dei suoi sfarinati
(W=300-350)
pani di solo farro-limitata lievitazione
frumento
tenero c.v.
bologna
frumento
tenero
(manitoba)
khorasan a
marchio
®
KAMUT
orzo
segale
avena
elevato assorbimento dell'acqua
deriva da varità di frumenti teneri del Nord
America%(originari
di Manitoba)
elevata
proteica (18%)
elevato assorbimento dell'acqua (>80% del suo
peso)
varietà di frumento coltivate tradizionalmente
nell'Africa settentrionale
marchio “Kamut” registrato nel 1997
le proteine sono il 17,3% contro il 12,3% del
grano comune, gli acidi grassi sono il 2,6%
contiene poco glutine
pani frumento e farro
pane ottenuto da una lunga lievitazione
spesso usata in aggiunta ad altre farine per
aumentare
pani
specialilaeforza
pizzadell'impasto
pane e pasta
in panificazione viene aggiunto come
coadiuvante, mai da solo.
il pane ottenuto sarà leggermente dolce
produzione della birra e whisky
farina debole, poco glutine
pane colore bruno
l'impasto ottenuto è difficile da lavorare perchè spesso usata in aggiunta al frumento
l'impasto si appiccica molto alle mani
ricca di calcio e magnesio;
farina debole, poco glutine
contiene un ormone della crescita chiamato
auxina
in panificazione è usata in aggiunta al frumento
fino al 30%
spesso i chicchi sono aggiunti sulla superficie
del pane
produzione di biscotti, prodotti dietetici e
porrige (prodotto anglossassone)
TABELLA 1.3 Farine ottenute da cereali diversi, con relative caratteristiche e usi principali
(dati ottenuti da TiBioNa Italia).
24
FARINE PRIVE DI GLUTINE (GLUTEN FREE) derivate da cereali
cereale caratteristica
uso
miglio
usato in aggiunta alla farina di frumento
l'aggiunta di farina di miglio al pane lo rende
fragrante e ben digeribile.
ricchi di sostanze minerali (FE, Mg, P,Si)
alto contenuto di acido acetilsalicilico
mais
privo di glutine
contenuto di proteine basso e ridotta presenza
di AA essenziali.
in base al gradi di macinazione si ritrovano
(bramata, fioretto, fumetto, bianca, maizena)
privo di glutine
riso
priva di glutine
per ottenere pane il fioretto è utilizzato in
aggiunta alla farina di frumento
la sua aggiunta conferisce buona friabilità e
gusto leggermente dolce.
il fumetto è usato in pasticceria; la bramata per
la polenta
usata per produtte la pasta di riso
usata anche in panificazione in aggiunta a
farine di forza
conferisce morbidezza al pane
FARINE PRIVE DI GLUTINE (GLUTEN FREE) derivate da tuberi e semi
cereale caratteristica
uso
tapioca
alimenti per l'infanzia
associata ad altre farine per ottenere prodotti
da forno gluten free
produzione di dolci
addensatore (di sughi e salse)
produzione di dolci
deriva dalla manioca, un tubero
privo di glutine
fecola di
patate
soia
derivante dalla patata (tubero)
privo di glutine
dai semi di soia
bassa conservazione a causa della presenza di
oli
ricca di proteine ma senza glutine
i protidi assorbono acqua rendendo il prodotto
privo di glutine
grano
deriva dai semi di Polygonum Fagopyrum
saraceno
ben digeribile e ricco di sali minerali
ottimo equilibrio di AA superiori
tende ad assorbire molta acqua
sapore molto deciso
privo di glutine
amaranto alimento base di Aztechi e Inca
elevato valere proteico (16%)
Quinoa
elevata presenza di lisina
elevato contenuto di fibre
privo di glutine
Derivata dai semi della quinoa (Chenopodium
quinoa )
alimento base delle popolazioni andine, (da
5000 anni)
ricca di fibre, minerali, proteine e grassi
priva di glutine
produzione di prodotti tipici in aggiunta al
frumento (pizzoccheri)
prodotti da forno gluten free
per la produzione della polenta Taragna in
combinazione con la farina di mais (20%)
25
poco conosciuto e non utilizzato in
panificazione
Si può impiegare, in abbinamento alla farina di
frumento, per la preparazione di prodotti da
forno dolci e salati.
si presta per la preparazione del pane etiopico
(injera) e indiano (chapati).
non molto utilizzata
in panificazione si può aggiungere fino al 20%
alla farina di frumento
TABELLA 1.4 Farine prive di glutine ottenute da cereali , pseudocereali, tuberi o semi. Sono
indicate le caratteristiche salienti e i principali usi di ciascuna farina (dati ottenuti da
TiBioNa Italia).
1.1.1.1.2.
Il lievito
Nel nostro Paese (e in generale in Occidente), l’agente lievitante consuetudinario, dagli
anni ’50 in poi, è il cosiddetto Lievito di birra, cioè una coltura in purezza di un ceppo
industriale di Saccharomyces cerevisiae. Le forme commerciali più diffuse sono quelle
“umide” e compresse, con shelf-life limitate (cella frigorifera) e quelle disidratate,
generalmente denominate “secche”, ottenute solitamente per estrusione di pasta di
lievito appena coltivato, poi essiccata con processi di spray-drying (tabella 1.5).
Forma
in crema (fresco) forma semiliquida
compressa (fresco) 0,5-20kg
secco attivo
instantaneo secco (atm.
modificata)
temperatura
tempo
umidità (%)
1-4°C
10-15 gg
80
2-7°C
ambiente
3-4 sett
3-12 mesi
67-72
7-8
ambiente
6-12 mesi
4-6
TABELLA 1.5 Tipologie e caratteristiche del lievito di birra in commercio. Come atteso,
maggiore è l’uminidit{ e minore il tempo di conservazione.
26
In alternativa, si può utilizzare il metodo tradizionale, impiegando cioè la PM (PM N), da
cui originer{ il lievito naturale. Tipicamente, con l’uso della PM N, sia i lieviti di diverse
specie, sia i batteri (specie del gruppo lattico, LAB) contribuiscono attraverso il loro
metabolismo all’ottenimento del prodotto finito (per maggiori dettagli cfr. § 2.1).
Per alcuni prodotti, in particolare dolciari, si possono anche impiegare polveri chimiche,
denominate spesso, nella nostra lingua “lievito chimico”. Questi formulati, reagendo in
soluzione acquosa, generano rapidamente CO 2 , tipicamente per reazioni tra un acido
(es. cremor tartaro = bitartrato di potassio) e il bicarbonato di sodio (formula-1) oppure
per decomposizione di Sali adatti (es. bicarbonato d’ammonio).
(1)
In commercio si trovato lieviti chimici a reazione rapida (immediata) in quanto
sviluppano CO2 non appena immesse nell’impasto, lenta (ritardata) poiché reagiscono
solo a elevate temperature (durante la cottura) o a doppio effetto.
1.1.1.1.3.
L’acqua
L’acqua è un componente fondamentale di tutti gli impasti che, senza essa, non
esisterebbero. Svolge un’azione elasticizzante, dato che ne aumenta la lavorabilit{, la
flessibilit{ e l’estensibilit{. L’acqua potabile è tipicamente una soluzione molto diluita di
sali, che discioglie anche piccole quantità di gas e di sostanze organiche (es., micelle di
composti anfoteri e zuccheri).
Durante la fase di impastamento, le proteine del glutine (gliadine e glutenine) assorbono
l’acqua e cambiano il proprio stato fisico: da vetroso (hard), questo diviene gommoso
(soft; Hoseney et al., 1986). In particolare, a basse temperature e ridotti contenuti di
acqua, le proteine del glutine si trovano in uno stato vetroso, mentre un aumento del
contenuto di acqua o un incremento della temperatura porta allo stato gommoso
(viscoelastico). La maggiore mobilità delle proteine, dovuta alla esatta quantità di acqua
nell’impasto, permette la formazione del glutine.
L’acqua non consente solo l’idratazione dei componenti macro-molecolari, che come
indicato è una tappa indispensabile per la formazione del glutine, ma permette anche la
crescita microbica, regola le attività enzimatiche, idrata i granuli d’amido durante la
cottura (consentendone la gelatinizzazione) e svolge un’azione solvente per altri
ingredienti idrosolubili quali il glucosio, il saccarosio e il sale alimentare (Pagani &
Manzoni, 2007).
Attraverso l’aggiunta di acqua si può anche regolare la temperatura dell’impasto, in
questo modo si influenzano la consistenza e la lavorabilit{ dello stesso e si regola l’avvio
e la rapidità della crescita microbica (Chargelegue et al., 1994).
Si ritiene che le acque con durezza5 media (8-12 F°) siano le più adatte alla
panificazione: esse sembrano possedere una giusta quantità di sali minerali, e di
esercitare quindi un ottimo effetto rafforzante sul glutine. Inoltre, i sali minerali
rappresentano anche importanti fattori di crescita per la fermentazione microbica
(Pyler, 1988). Le acque molto dure (> 54 F°), invece, danno origine a un reticolo
proteico eccessivamente rigido, mentre quelle troppo dolci (< 7 F°) non sono consigliate
La classificazione dell’acqua in base alla durezza è dovuta alla quantit{ di sali di calcio e di magnesio
presenti.
5
27
perché inducono la realizzazione di impasti molli e appiccicosi. Infine, le acque alcaline,
esercitando un forte potere tampone, neutralizzano l’acidit{ dell’impasto e causano forti
rallentamenti alla velocità di lievitazione.
1.1.1.1.4.
Il sale alimentare
Il sale è uno degli ingredienti accessori, non sempre impiegato in ogni ricetta. Quando
viene usato, può esaltare gli aromi del prodotto e può nasconderne eventuali sapori
anomali.
Quando usato (per ragioni di sapidità), il sale assume anche un ruolo di controllo della
velocità di crescita dei microrganismi. Inoltre, grazie alla sua composizione chimica, esso
è in grado di rendere più vigorosa la maglia glutinica, stabilizzando le interazioni
idrofobiche tra le proteine.
Il sale favorisce anche l’imbrunimento della crosta, lo sbiancamento della mollica e
migliora la conservabilità del prodotto finito. E’ necessario regolare la quantit{ di sale
aggiunto, poiché valori superiori al 1,5-2% inibirebbero la crescita microbica a causa
dell’elevata pressione osmotica.
28
1.1.1.1.5.
Lo zucchero, il malto e i grassi
Il pane può essere addizionato di grassi, in particolare di burro, strutto o olio d’oliva. Ciò
dovrà essere indicato in etichetta tutte le volte che la materia grassa rappresenti almeno
il 3% della sostanza secca del prodotto finito.
I grassi aggiunti fungono da (i) lubrificanti, in quanto migliorano lo scorrimento delle
macromolecole del glutine e quindi favoriscono una più rilevante estensibilità
dell’impasto (maggiore sviluppo dell’impasto - Desgrez, 1994); da (ii) stabilizzanti,
poiché favoriscono la formazione di bolle d’aria di piccole-medie dimensioni e
un’alveolatura regolare (Campbell, 2003); da (iii) conservanti, perché rallentano il
raffermamento del prodotto finito (in particolare rallenta la migrazione dell’acqua tra
amido e proteine e le interazioni tra i granuli di amido- Gray & Bemiller, 2003).
La presenza di zuccheri (i) aumenta la consistenza dell’impasto; (ii) favorisce l’attivit{
microbica; (iii) induce l’imbrunimento della crosta durante la cottura; (iv) mantiene la
mollica del pane più a lungo, in condizioni di morbidezza.
L’impiego di estratti di malto o farina di cereali maltati permette di arricchire l’impasto
di enzimi, specialmente α-amilasi, in grado di idrolizzare l’amido in zuccheri
fermentescibili (destrine, maltosio, glucosio), substrato adatto per i lieviti e i batteri
nella fase di fermentazione.
Nondimeno, quantit{ eccessive di malto negli impasti possono provocare un’intensa
azione proteolitica nei confronti di lievito e glutine, con conseguenze negative sia sulla
lievitazione che sulla consistenza dell’impasto stesso. In panificazione, il malto ha quindi
diverse funzioni: (i) apporta zuccheri ed enzimi, permettendo un maggiore sviluppo del
volume del pane e la formazione di alveolature adeguate; (ii) conferisce una colorazione
più intensa alla crosta; (iii) conferisce al pane profumo e sapore migliori.
1.1.1.1.6.
Gli additivi
L’aggiunta di glutine alla farina viene effettuata quando la farina utilizzata è troppo
debole: in questo modo si aumenta la forza dell’impasto e il volume del prodotto finito,
dato che l’impasto sar{ in grado di trattenere una maggiore quantità di gas.
L’impiego di idrocolloidi (gomma, guar, xantani, alginati, pectine ecc.) permette di
ottenere prodotti più stabili nel tempo anche se sottoposti a congelamento, perché
queste sostanze hanno la capacità di trattenere l’acqua e quindi regolano la
distribuzione della stessa.
L’acido ascorbico (E300, vitamina C) è un’agente anti-ossidante e favorisce la
formazione di ponti disolfuro tra le proteine del glutine promuovendo una migliore
ritenzione dei gas (Lucisano, 2005).
29
SIGLA E DENOMINAZIONE
E 200 acido sorbico
quantità
< 2000 mg/kg
E 202 sorbato di potassio
prodotto finito
pane a fette
Preconfezionate
E 203 sorbato di calico
< 2000 mg/kg
pane di segale
E 280 acido propionico
< 3000 mg/kg (espr. come
ac. propionico)
pane a fette preconfezionate
e pane di segale
E 281 propionato di sodio
E 282 propionato di calico
< 2000 mg/Kg (espr.
come ac. propionico)
E 283 propionato di potassio
pane a ridotto contenuto
calorico
pane semicotto
preconfezionato
rolls, buns e pizza
preconfezionati
pane preconfezionato
pane cotto in stampi
alcool etilico
< 20 g/kg
pane a fette o in forma
intera in confezione
Impermeabile
E 326 lattato di potassio
quanto basta
E 327 lattato di calico
quanto basta
E 471 mono- e digliceridi degli ac. grassi
E 472 esteri acetici di mono- e digliceridi degli ac.
grassi
quanto basta
E 472d esteri tartarici di mono- e digliceridi degli
acidi grassi
quanto basta
E 472e esteri mono- e diacetiltartarici di mono- e
digliceridi degli ac. grassi
quanto basta
E 472f esteri misti acetici-tartarici di mono- e
digliceridi degli ac. grassi
quanto basta
E 302 ascorbato di calico
quanto basta
E 304 esteri dell’acido ascorbico con ac. grassi
quanto basta
E 322 lecitine
quanto basta
E 325 lattato di sodio
quanto basta
E 260 acido acetico
quanto basta
E 261 acetato di potassio
quanto basta
E 262 acetato di sodio
quanto basta
E 263 acetato di calcio
quanto basta
E 270 acido lattico
quanto basta
E 300 acido ascorbico
quanto basta
E 301 ascorbato di sodio
quanto basta
quanto basta
TABELLA 1.6 Principali additivi alimentari consentiti nei processi di panificazione
(“miglioratori”). Nella tabella sono rappresentati quelli ammessi secondo i l principio
“quanto basta” e quelli ammessi con dosi stabilite (DM 27 febbraio 1996 n. 209) .
La lecitina di soia (E322) è un fosfolipide isolato dalla soia, il suo uso è indicato per la
panificazione con l’utilizzo di celle di “fermalievitazione” o di abbattitori per la
30
surgelazione del prodotto. Gli emulsionanti (E471, E472a, E472d, E472e, E472f) sono
derivati da mono e digliceridi degli acidi grassi. Hanno la capacità di legare le molecole
idrofobe (grassi) con sostanze idrofile (acqua). Sono utili in panificazione e pasticceria.
Sono usati specialmente per impasti contenenti grassi, in quanto: (i) conferiscono un
ottimo volume e una crosta sottile, friabile e piacevolmente dorata; (ii) interagiscono
con il glutine rendendo gli impasti stabili e di facile lavorazione, e garantiscono una
buona tenuta delle forme; (iii) assicurano mollica morbida e ben alveolata; (iv)
aumentano la conservabilità del prodotto finito.
Possono anche essere aggiunti enzimi (elasticizzanti), a esempio l’aggiunta di amilasi ha
lo scopo di aumentare il rilascio di carboidrati fermentescibili utili alla crescita
microbica, in questo modo si riduce anche la retrogradazione dell’amido e il prodotto è
più conservabile nel tempo. L’aggiunta di proteasi riduce la durata dell’impastamento,
ma rende gli impasti più deboli a causa della rottura dei legami peptidici. Nello stesso
tempo, le proteasi liberano piccoli peptidi utili come fattori di crescita microbici.
1.1.1.2.
IMPASTAMENTO
L’impastamento (preparazione dell’impasto) è la prima tappa nella fabbricazione del
pane. Gli obiettivi di questa fase (tabella 1.7) sono numerosi: distribuire in maniera
omogenea gli ingredienti (anche quelli presenti in piccole quantità), formare una maglia
glutinica uniforme e coerente, includere aria sotto forma di bolle microscopiche (30-100
μm) che aumenteranno di dimensione durante la seguente fase di lievitazione.
(Lucisano, 2005).
La formazione del glutine (figura 1.3) avviene grazie alla presenza di acqua e ai
trattamenti meccanici. Le macromolecole proteiche presenti nella farina (gliadine e
glutenine) a contatto con l’acqua modificano la loro struttura tridimensionale,
esponendo le parti idrofiliche verso il solvente (acqua) e quelle idrofobiche all’interno:
in questo modo le catene proteiche sono in grado di interagire tra loro. Le manipolazioni
meccaniche portano alla formazione di ponti disolfuro tra i residui dell’aminoacido
cisteina e il risultato di tali modificazioni è un reticolo visco-elastico in grado di
associare coesione ed elasticità.
31
FIGURA 1.3 Le principali proteine del frumento e le loro interazioni per formare il glutine.
Il glutine si forma durante la fase d’impasto degli ingredienti.
La durata della lievitazione, l’energia apportata nell’unit{ di tempo e la presenza, o meno
di fasi di riposo, sono parametri che possono variare. Spesso questa fase viene suddivisa
in due sottofasi.
Un primo impastamento a bassa velocità (ca. 5 minuti) durante il quale sono possibili
eventuali correzioni degli ingredienti.
Un secondo impastamento (ad alta velocità) necessario affinché si formi la struttura
glutinica (o glutine). E’ importante regolare la durata di questa fase, in quanto un
eventuale sovra - impastamento porterebbe alla perdita di struttura del reticolo
glutinico (rottura delle fibre proteiche) e l’impasto perderebbe elasticità diventando
colloso.
La fase di impastamento si può ritenere conclusa quando la massa da appiccicosa e
umida, si trasformerà in una pasta priva di collosità, setosa e vellutata al tatto e capace
di formare un film semitrasparente se sottoposta a stiramento (grazie alla formazione
del glutine).
Al termine di questa fase si otterrà una pasta liscia, omogenea, tenace, viscoelastica in
cui sono intrappolate piccole bolle d’aria (l’aria inclusa rappresenta ca. l’8-10% del
volume dell’impasto; Spicher, 1983).
32
Fase
sviluppo dell’impasto
scopo
cambiamenti chimico-fisici
distribuzione omogenea degli
ingredienti
idratazione e solubilizzazione dei
composti solubili in acqua
dare origine a una struttura uniforme
formazione del glutine
inclusione di bolle d’aria
aumento del volume dell'impasto
fermentazione/
lievitazione
formatura
produzione di precursori aromatici
tipici
migliorare le caratteristiche nutrizionali
migliorare la conservabilità
microbiologica, chimica e fisica
suddividere l'impasto in base alla
suddivisione delle bolle di aria e
pezzatura finale desiderata
inclusione di nuove
dare forma all'impasto
diminuire il contenuto d’acqua
stabilizzare l'impasto
cottura
raffreddamento
formazione di gas che viene
inglobato dal glutine
produzione di metaboliti che
influenzano la solubilità e
conformazione di altri composti
presenti
differenziazione crosta-mollica
denaturazione proteine
rendere l'impasto appetibile e digeribile
gelatinizzazione dell'amido
colorare il prodotto
evaporazione di acqua ed etanolo
completare la lievitazione
sviluppo di aroma
aumento di volume (oven-spring)
eventuale confezionamento del
solidificazione dei grassi
prodotto
cambiamento della solubilità degli
zuccheri
TABELLA 1.7 Sono riassunti gli scopi e i cambiamenti chimico-fisici dell’impasto in ogni
fase del processo produttivo.
1.1.1.3.
LA LIEVITAZIONE
La lievitazione è la fase in cui si assiste, nell’impasto, a un incremento di volume, reso
possibile dal lievito e dalla presenza della maglia glutinica che intrappola i gas
(soprattutto CO2) prodotti. Durante questa fase si assiste alla formazione di bolle,
stabilizzate dalle sostanze emulsionanti di origine endogena o esogena (additivi).
33
TABELLA 1.8 Per ogni tipo di lievitazione è indicato l’agente lievitante, la modalità
d’azione e il prodotto finito ottenuto.
Come detto (cfr. § 1.1.1.2) esistono lievitazioni biologiche, chimiche, fisiche e miste
(tabella 1.8). La lievitazione biologica avviene grazie ai gas prodotti dal metabolismo
microbico; quella chimica per liberazione di gas generati da reazioni metaboliche
(comprendenti anche le decomposizioni di sali (es., bicarbonati); quella fisica può
avvenire per evaporazione forzata di vapore dagli impasti, oppure per inglobamento di
aria (azione meccanica). Esistono, infine anche le lievitazioni miste: in esse vengono
associate una lievitazione biologica e una fisica (“aiuto”): come succede quando si
praticano le “laminazioni” ottenute stratificando negli impasti grassi alimentari.
Secondo la normativa italiana vigente, solo la lievitazione biologica può essere utilizzata
in panificazione. Le altre tipologie di lievitazione sono utili in impasti ricchi di zuccheri e
grassi, in cui la lievitazione biologica è inibita o rallentata.
Il tratto distintivo della lievitazione biologica è l’agente lievitante, che è biologico,
appunto. Come precedentemente descritto, tra gli ingredienti del pane lievitato si
possono annoverare sia il lievito di birra (Baker’s yeast) o il lievito naturale (lievito
madre).
Nella tabella 1.9 sono riassunti e messi a confronto il lievito di birra e il lievito naturale
(cfr., anche il capitolo 2).
34
Caratteristiche
lievito naturale (PMN)
lievito di birra (LdB)
lievito chimico
pH
acido lattice
acido acetic
raffermamento
(conservabilità
strutturale)
3.8-4.6
0,4-0,8%
0,10-0,40%
5.3-5.8
0,005-0,04%
0,005-0,04%
lento
rapido
conservazione
microbiologica
protezione contro le
contaminazioni
rilascio di gas
lento e controllato
contributo molto
positivo (variabile al
variare del consorzio
microbico)
incremento della
concentrazione e
biodisponibilità
attività ottimale delle
fitasi e degradazione
dell’acido fitico
(chelante dei cationi)
diminuzione dei valori
di indice glicemico
maggiore digeribilità
del prodotto finito e
maggiore solubilità
della fibra
conversione di
composti tossici
incremento della
concentrazione di
sostanze ad effetto
antiossidante e
vitamine
sensibilità a
contaminazioni
fungine o batteriche
controllato
no variazione
Nullo
Nullo
rapido (effetto
negativo sulle
proprietà del glutine)
sensibilità a
contaminazioni fungine
o batteriche
istantaneo
contributo positivo
nullo o negativo
simile a quella della
farina
simile a quella della
farina
azione ridotta delle
fitasi, effetto
decalcificante
azione ridotta o nulla
delle fitasi, effetto
decalcificante
non rilevante
non rilevante
produzione di
sostanze volatile
amminoacidi liberi
biodisponibilità di
minerali
altri aspetti
nutrizionali
important
35
non rilevante
non rilevante
non rilevante
non rilevante
non rilevante
non rilevante
TABELLA 1.9 Le principali differenze tra il lievito chimico, il lievito di birra e il lievito
naturale.
All’inizio di questa fase, la CO2 prodotta si solubilizza nell’acqua libera presente
nell’impasto e solo dopo saturazione essa viene svolta in forma gassosa esercitando una
pressione interna sul reticolo “impermeabile” del glutine. Poiché, come detto, questo è
caratterizzato da elasticit{ ed estensibilit{, si estende e consente all’impasto di
aumentare il proprio volume, mantenendo la propria struttura (Pagani, 2007).
Le bolle di gas sono circondate da una pellicola (film o lamella) che è formata da
composti tensioattivi, per lo più emulsionanti (lipidi polari, proteine solubili, pentosani,
esopolisaccaridi). Nel caso in cui tale pellicola lipoproteica si rompesse, avverrebbe la
fusione di due bolle adiacenti.
Oltre alla CO2, anche altri gas e composti con punti di ebollizione bassi (composti bassobollenti) possono intervenire nell’espansione del volume durante la fase di cottura (es.,
etanolo, vapore acqueo).
Tipicamente, il metabolismo microbico porta alla formazione di acidi organici che
abbassano il pH dell’impasto. Ciò accade nonostante il forte potere tampone delle
proteine. Grazie al metabolismo microbico si formano poi i precursori degli aromi.
1.1.1.4.
SPEZZATURA E FORMATURA
Queste operazioni conferiscono al prodotto la forma definitiva.
1.1.1.5.
COTTURA
La cottura determina il passaggio di stato da schiuma (impasto) a spugna (prodotto da
forno), e avviene grazie a uno scambio di calore dall’esterno verso l’interno del pane,
accompagnato da uno scambio di materiali dal pane verso l’esterno (composti volatili e
vapore d’acqua).
Il pane può essere cotto in forni elettrici o in forni-a-legna (produzioni artigianali).
FIGURA 1.4 Cambiamenti chimico-fisici del prodotto da forno durante la cottura.
Quest’ultima operazione tecnologica provoca un aumento di volume dell’impasto di ca. il
10 % (oven rise), e di un aumento dell’area superficiale a causa dell’espansione dei gas, e
la solidificazione del film elastico che circonda ogni bolla.
La sua durata è proporzionale alla pezzatura del prodotto. La cottura induce
trasformazioni chimico-fisiche radicali all’impasto lievitato, che si trasforma in
36
“prodotto da forno”. Dalla cottura si definiranno le caratteristiche sensoriali, l’aspetto
del prodotto finito e la sua conservabilità.
Fino a che la temperatura dell’impasto sia inferiore ai 50° C le attivit{ microbiche ed
enzimatiche riescono a proseguire (figura 1.4). Al di sopra di tale temperatura, i gas di
lievitazione si espandono in maniera sempre più vistosa. Questi gas occupano un volume
tanto maggiore quanto più è alta la temperatura di cottura (oven spring), e portano a
un’ulteriore estensione del glutine e quindi dell’impasto. Contemporaneamente, lieviti e
batteri (se presenti), vanno incontro a morte rapida. La gran parte delle attività
enzimatiche si riduce, mentre l’amido inizia a rigonfiarsi e a gelificare. Le proteine della
maglia glutinica cominciano a denaturarsi, perdendo estensibilità, ed è a questo punto
che la forma del pane diviene definitiva, e che la struttura alveolata della mollica
(spugna) si fissa.
Durante questa fase, le reazioni chimiche osservate sono estremamente importanti: a
120 - 140°C la crosta, oltre a solidificare, incomincia a cambiare di colore a causa della
lisi dell’amido che genera destrine. Questo fenomeno spiega il motivo per cui, rispetto
alla mollica, la crosta è maggiormente digeribile.
A 140 - 150°C, invece, comincia il processo di caramellizzazione, nel quale si generano, a
partire dagli zuccheri, le molecole delle pirodestrine (figura 1.5) e vengono liberati
composti volatili diversi (es. aldeidi, chetoni, furfurolo).
FIGURA 1.5 Rappresentazione della struttura di una pirodestrina, con molecole di glucosio
unite da legami α(14) e α(16).
I composti di colore bruno e quelli volatili derivanti dalle reazioni irreversibili tra
proteine e zuccheri (reazione di Maillard o imbrunimento non enzimatico), si ottengono
a temperature superiori ai 150°C.
37
Inoltre, durante la cottura, una parte di acidi e alcoli è coinvolta in reazioni di
esterificazione che rafforzano l’odore della mollica.
Durante la cottura, all’interno della pagnotta, si crea un gradiente di temperatura: in
altre parole, è solo la crosta che subisce temperature vicine a quelle del forno (> 150° C).
All’interno del prodotto si raggiungono invece temperature inferiori (ca. 100° C). Anche
grazie a questo fatto crosta e mollica possono essere differenziate. A fine cottura la
crosta sarà friabile e croccante (umidità < 5%), mentre la mollica apparirà morbida.
Durante la cottura, l’alcool formato nel corso della fermentazione, si vaporizza nell’aria.
Molto spesso, all’inizio della cottura, viene introdotto nel forno del vapore, e questa
pratica è impiegata per rallentare l’evaporazione delle pagnotte, e quindi la perdita di
peso6.
38
Questa pratica aumenta quindi le rese di panificazione, in ottemperanza – naturalmente - alla normativa
Italiana (n° 580, 1967 e modifiche) che fissa i valori massimi di umidità in funzione della pezzatura del
pane.
6
1.2 Il LM come ingrediente nella produzione industriale del pane
I processi industriali hanno come obiettivo le elevate produttività, per le quali - in poco
tempo e con poca manodopera - le rese possano essere massimizzate, e i costi siano
mantenuti al minimo. Si tratta di processi diretti, nei quali ogni discontinuità sia
eliminata.
In un processo industriale di panificazione, le varie fasi sono meccanizzate, e molte di
queste sono raccordate da nastri trasportatori per far procedere gli ingredienti
semilavorati (figura 1.5).
39
FIGURA 1.6 Esempio di un processo produttivo industriale diretto: le varie fasi (continue
per aumentare la resa e diminuire la manodopera), sono velocizzate attraverso la
meccanizzazione.
Le fasi di pesatura degli ingredienti e quella dell’impastamento vengono condotte
mediante impastatrici operanti di solito in-continuo: ad esempio, si possono utilizzare
sistemi impastatori a Carosello che lavorano per cariche successive, e alimentano sistemi
di impasto continui (figura 1.7).
Il “Carosello” può essere gestito da un PC centralizzato. Le fasi di dosaggio degli
ingredienti, l’impastamento, la puntatura, la lievitazione e l’alimentazione della linea di
formatura, sono controllate e automatizzate.
Grazie al controllo del processo di impasto, la qualità del prodotto finito è costante, si
assiste a un’aumentata efficienza produttiva e a una “freschezza” 7 degli impasti sulla
7
Gli impasti vengono immediatamente inseriti nella linea di formatura senza tempi morti.
linea di formatura. E’ un sistema semplice da usare e riduce la possibilit{ di errori umani
durante queste fasi produttive. La compattezza e i ridotti ingombri a terra, permettono
di sfruttare lo spazio in modo ottimale. I macchinari sono sollevati dal suolo per
facilitare la pulizia. Con l’uso del Carosello si ha un risparmio di personale e un aumento
della produttività aziendale.
FIGURA 1.7 Impastatrici con sistema “Carosello” (fonte San Cassiano S.p.A.).
Per la fase di miscelazione degli ingredienti esistono anche robot automatici (figura 1.8).
Gli impianti robotizzati consistono in un numero variabile di vasche, manipolate da una
robusta navetta automatizzata che si muove tra le varie stazioni (dosaggio, impasto,
lievitazione, scarico).
FIGURA 1.8 Robot automatizzati. Fonte Sancassiano spa.
A livello industriale, le operazioni successive all’impastamento sono realizzate con
particolari attrezzature in grado di formare, uno strato di spessore regolare di impasto
che verrà poi porzionato (cilindratrice - spezzatrice, filonatrice - spezzatrice, ecc.). Altri
40
sistemi di porzionatura degli impasti lavorano invece su principi volumetrici. Se
necessario l’impasto formato viene fatto lievitare all’interno di celle di lievitazione per
garantire un risultato finale omogeneo e stabile. Successivamente la cottura avviene in
grandi forni elettrici.
Esistono anche sistemi completamente meccanizzati e continui, in cui il prodotto viene
movimentato da nastri trasportatori (es., figura 1.9).
A livello industriale l’uso della pasta madre o meglio del lievito madre è limitato.
Generalmente l’industria acquista il lievito madre sotto forma di crema o in polvere. Tale
lievito madre è considerato solo uno dei tanti ingredienti da miscelare all’acqua e alla
farina, e spesso è formato da ceppi microbici selezionati. Si tratta di lieviti madre
particolarmente acidi in cui il lievito di birra (LdB) viene aggiunto per rendere rapida la
fase di lievitazione.
Stoccaggio e dosaggio
degli ingredienti
Preparazione
dell’impasto
Fermentazione
Raffreddamento
Affettatrice e
confezionamento
FIGURA 1.9 Gostol: Linea produttiva completamente automatizzata. Metodo diretto
continuo.
Spezzatrice
Modellatrice
Cottura
41
1.3. Pasta madre: conservazione e uso attraverso la lievitazione naturale
in un panificio artigianale
Nel panificio-modello8, presso cui abbiamo operato le nostre analisi di processo, si usano
abitualmente due paste madri (PMN) di diversa origine. Tali PMN
sono usate in
alternanza settimanale, e per ognuna si possono distinguere (i) una settimana di riposo
(nella quale - ogni 2 gg - avviene il rinfresco di mantenimento, RM) senz’altre operazioni,
e (ii) una settimana “operativa” nella quale quotidianamente si ottiene il lievito madre da
usarsi per la panificazione.
(i) Come detto, durante la settimana “di riposo”, la PM N viene rinfrescata ogni 2 gg, e il
metodo di rinfresco differisce da quello della settimana operativa per la quantità di
farina impiegata9 (150% della PMN). La percentuale di acqua utilizzata è sempre del
50%.
L’impasto ottenuto dalla miscelazione degli ingredienti viene schiacciato leggermente e
fatto riposare per qualche minuto da entrambi i lati, successivamente vengono fatte le
cosiddette pieghe10 e l’impasto viene avvolto da un canovaccio pulito e infine legato con
uno spago. Questa pasta viene lasciata rigonfiare a temperatura ambiente per 2-3 h e
solo dopo, riposta a ca. 6°C.
Il pH della PM N dovrà essere di ca. 4, e viene monitorato mediante cartine indicatrici. Nel
caso i valori fossero troppo elevati (pasta madre debole) si effettuano fermentazioni più
lunghe, mentre nel caso contrario (pasta madre forte) si conducono i cosiddetti bagnetti,
nei quali la PM viene immersa in acqua tiepida a pezzetti per ca. 30 min, poi si elimina
l’acqua e si re-impasta.
(ii) Durante la settimana “operativa” la PMN viene rinfrescata e utilizzata
quotidianamente per produrre il lievito madre. Al mattino presto viene effettuato un
primo rinfresco (dose di farina: 100% della PM N, della quale viene utilizzato il cosiddetto
cuore, scartando quindi gli strati più esterni; l’acqua rappresenta invece il 45-50%11). La
quantità di acqua impiegata è un fattore importante per chiunque utilizzi la lievitazione
“Panis Kòmaros” Bio Forno a Legna Numana -AN- via Flaminia n. 46/A di Paola & Osvaldo Maja.
La farina utilizzata per i rinfreschi della PM è sempre una farina di forza (W=300).
10 Le pieghe si effettuano piegando a 3 l’impasto prima da un lato, e successivamente dall’altro.
11 All’elevarsi della temperatura l’operatore diminuisce la percentuale di acqua aggiunta.
8
9
42
naturale senza l’aiuto di celle di lievitazione termostatate, come il panificio di cui stiamo
parlando.
Dopo 5 h a temperatura ambiente (ca. 25°C) la PMN viene divisa in 2 parti uguali.
La prima viene rinfrescata come esposto precedentemente per riottenere la PM N, e poi
riposta in un canovaccio e legata; dopo circa 3 h a temperatura ambiente (tempo
necessario al suo rigonfiamento) viene riposta in frigorifero fino al giorno seguente.
L’altra parte viene utilizzata per ottenere il lievito madre (LM N) e quindi l’impasto del
pane.
Il lievito madre viene ottenuto mescolando alla PM N (liberata dalla parte più esterna) la
farina, in ragione di 5 volte la quantità di PM N, lo 0,5 -1% di sale alimentare e lo 0,5 0,7% di miele*e il 60% di acqua. Il sale viene aggiunto dopo 10 min di miscelazione con
l’impastatrice meccanica, e successivamente l’impasto viene rimescolato per altri 10
min.
Il lievito madre viene riposto in una vaschetta con coperchio, bassa e di plastica
alimentare (dimensioni), per ca. 8 h.
43
FIGURA 1.10 Produzione artigianale di LM N e rinfresco della PM N . (a) PM N durante la fase
di lievitazione; (b) PM N al termine del 2° rinfresco, pronta per la formazione del lievito LM;
(c) ingredienti per il rinfresco della PM N durante la miscelazione nell’impastatrice
meccanica; (d) PM N dopo piegatura; (e) PM N racchiusa e “stretta” in un canovaccio; (f)
miscelazione nell’impastatrice meccanica degli ingredienti necessari alla formazione del
lievito madre; (g) LM N riposto schiacciato nel basso e lungo contenitore precedentemente
oleato; (h) chiusura del contenitore; (i) LM N dopo 8h di lievitazione.
* le percentuali indicate sono riferite alla farina impiegata
FIGURA 1.11 Rappresentazione schematica delle modalità di rinfresco della PM N e della
preparazione del LM N .
1.3.1 Pesatura degli ingredienti
I piccoli panifici artigianali, come quello descritto, ottengono le proprie pagnotte
mescolando fra loro farine di tipo diverso oppure farine pre-miscelate dall’industria
molitoria12.
Gli stessi piccoli panifici artigianali, preferiscono impiegare miscele contenenti una
farina-di-forza (W=350-360), una debole (W=200) e spesso una terza farinacaratterizzante (es. farina integrale di frumento; farina di farro; avena; orzo). Alcuni
panifici aggiungono inoltre malto d’orzo in polvere o crema.
Più breve la lievitazione e minore la forza necessaria nell’impasto. Più lunga la
lievitazione (come di solito avviene nei panifici artigianali utilizzanti PM N) e maggiore la
forza delle miscele. A esempio, per una lievitazione di 10-12 h a 20-22 °C è necessaria
una W di ca. 300.
L’impasto per la panificazione si completa aggiungendo alla miscela di farine il 35-45 %
di lievito naturale e ca. il 60 % di acqua. Altro parametro importante è la temperatura
dell’acqua. Per lievitazioni brevi, essa potr{ essere stimata utilizzando la seguente
formula:
Nel panificio “Panis Kòmaros”, si preferisce creare ricette proprie utilizzando farine biologiche di alta
qualità.
12
44
Se le lievitazioni fossero lunghe, sarà necessario togliere almeno 10°C al valore ottenuto
da tale formula. Per riassumere semplificando: nelle aree litoranee della regione Marche,
molti artigiani usano temperature di ca. 17°C in inverno e di 6°C in estate.
1.3.2 Impastamento e lievitazione:
Questa fase è necessaria per permettere la formazione del glutine.
In alcuni rari laboratori artigianali, gli impasti sono ancora fatti a mano (es., panificio
“Pane e Luna”; campione “PeL”), ma in generale si utilizzano impastatrici meccaniche (a
forcella, a spirale, a bracci tuffanti, ecc.) e si lavora con modalità discontinue.
Il tempo di miscelazione è diverso al differire delle stagioni. Durante questa fase viene
aggiunto il sale alimentare (es., 2% sul peso della farina): l’aggiunta avviene solo dopo
l’incordatura dell’impasto13: in estate, il tempo necessario per l’incordatura è circa 5-6
minuti; in inverno di 7-8 min. Dopo l’aggiunta l’impasto viene ri-miscelato per un tempo
analogo al precedente.
L’impasto viene fatto riposare sotto forma di palla a temperatura ambiente per 30 min o
1 h, a seconda della stagione (più la temperatura è bassa, maggiore dovrà essere il
tempo di riposo).
Si procede con la puntatura, cioè col taglio dell’impasto in pezzi aventi il peso definitivo.
Il prodotto finito subirà un calo di peso del 20-25 %). Si prosegue quindi con la pirlatura
(piegatura dell’impasto fino a formare una palla che viene fatta roteare come una
trottola sulla base). Se la forma finale è quella tonda l’impasto viene riposto in adatti
cestini circolari e mantenuto a temperatura ambiente per ca. 12 h (nel nostro
laboratorio, tutta la notte). Nel caso dei filoni, la “palla” viene lasciata riposare per altri
30-60 min e solo successivamente si formano dei filoncini che vengono riposti in un
apposito cestino ovale. Per formare il filoncino (figura 1.12 -s), la “palla” viene
schiacciata, se ne piegano i bordi e successivamente si chiude pizzicando leggermente la
L’impasto si dice INCORDATO quando è molto elastico e “nervoso” quando tende cioè a formare
“nervature”. Se si usa un’impastatrice, l’impasto sar{ incordato quando inizia a staccarsi dalle pareti della
stessa e forma una specie di corda attorno al gancio.
13
45
cicatrice formatasi e si posa nel cesto. I tagli sulla superficie della forma non sono
strettamente necessari se le cicatrici non vengono chiuse fortemente, servono solo a
scopo decorativo, e sarà proprio a partire dalle cicatrici che i pani si apriranno.
46
FIGURA 1.12 Il processo artigianale per l’ottenimento di pane da LM N . (a) ingredienti
pesati, diversi al differire della ricetta; (b) lievito madre; (c) miscelazione nell’impas tatrice
meccanica; (d) incordatura dell’impasto; (e) veloce piegatu ra a mano;(f) formazione di
porzione sferica; (g) l’impasto viene lasciato riposare ricoperto da un canovaccio umido;
(h) puntatura; (i) pirlatura; (l) cicatrice sulla base; (m) per i prodo tti a forma sferoidale
segue la fase di infarinatura e in (n) lievitazione in cesto tondo; (o) per i filoncini, dopo
pirlatura, le “palline” di impasto vengono lasciate lievitare ricoperte da un telo (p); (q)
“palline” di impasto dopo 30/60 min di riposo; (r) piegatura necessaria alla formatura dei
filoncini; (s) cicatrice nei filoncini.
1.3.3 La cottura:
Dopo circa 12 h di lievitazione le forme del pane vengono cotte in forno14 (230° C).
Le forme vengono introdotte per 25 min; successivamente si apre una valvola sfiatatrice
per far uscire il vapore, si tengono in forno le pagnotte per altri 25 min. Il vapore iniziale
è utile per ottenere una crosta più lucida. Alla fine della cottura la temperatura risulta
essere di ca. 200°C. A seconda della tipologia del pane infornato, il tempo di cottura può
14
Nel panificio modello si utilizza un forno a legna.
differire leggermente (es., pagnotte bianche di 500 gr: 50 min; pagnotte integrali di 500
gr: 55 min). Se il forno-a-legna fosse troppo caldo se ne potrà aprire il coperchio per
generare una correntina d’aria che abbasserà rapidamente la temperatura.
FIGURA 1.13 Fase di cottura del pane (forno a legna). (a) impasti del pane dopo
lievitazione notturna; (b) trasferimento del pane dai cesti al forno; (c) filoncini nel forno
(inizio cottura); (d) filoncini a cottura quasi terminata; (e) prodotto finito.
47
1.4 Pasta madre: conservazione e uso mediante lievitazione naturale a uso
familiare
Anche in diverse famiglie si è ormai cominciato a utilizzare la PM N, e ne esistono perfino
alcune nelle quali questa tradizione non si è mai arrestata. I corsi, i numerosi siti-web e
perfino i programmi della televisione, tutti relativi alla PM N, sono in continuo aumento, e
ciò spinge molti appassionati e curiosi a provare la propria panificazione naturale.
La principale differenza tra le produzioni artigianali e quelle casalinghe è di solito la
minore frequenza di panificazione delle famiglie. Questo fatto si ripercuote sul numero
di rinfreschi che la PMN subisce durante la settimana. Interessante lo “spaccio di pasta
madre”, un’iniziativa dell’associazione nazionale Slow Food con fini divulgativi, operante
in ogni luogo del Paese nel quale vi siano volontari disposti ad adoperarsi. Slow Food
accompagna queste iniziative da istruzioni semplici e rapide, funzionanti più che
discretamente in ogni cucina (figura 1.13).
48
FIGURA 1.13 Volantino “[email protected]” in cui vengono schematizzate, con semplici
indicazioni, le fasi di preparazione e utilizzo delle PM N (cfr.§-allegato-I).
La PMN può essere conservata in forma semi-liquida (“Licoli”) o semi-solida: in vasetti,
legata in un canovaccio a forma di palla o all’interno di una bacinella d’acqua.
Riporto un esempio di preparazione casalinga di pane, ma visitando i numerosi siti
internet si possono individuare numerose ricette e metodologie. L’esempio che
descriverò impiega una PMN semi-solida conservata in un vasetto a temperatura di
frigorifero: i rinfreschi della PMN vengono effettuati quando necessario, la sera prima del
suo utilizzo o al massimo dopo 1 settimana dall’ultimo rinfresco. Tale rinfresco viene
effettuato aggiungendo 50% della PMN e il 50% dell’acqua rispetto alla farina utilizzata.
Dopo una notte di lievitazione si procede con la ricetta per ottenere il pane.
Gli ingredienti necessari all’ottenimento di un filone da ca. 900 gr sono i seguenti:
180 gr. di PMN rinfrescata la sera prima (metabolicamente attiva)
200 gr. di farina di semola rimacinata
200 gr. di farina Manitoba
100 gr. di farina 0
300 gr. acqua tiepida
1 cucchiaino di miele millefiori
1 cucchiaio di olio extravergine di oliva
2 cucchiaini di sale.
49
La farina acquistata nei supermercati o nei negozi biologici non espongoni i valori di W o
P/L, per cui in famiglia di solito non si tiene conto di essi.
Spesso però le ricette contengono farine che hanno W elevati (es., Farina Manitoba).
FIGURA 1.14 Produzione di pane in famiglia. (a) PM N diluita in acqua; aggiunte di (b)
miele; (c) olio; (d) farina; (e)formazione delle pieghe; (f) impasto “a-palla” in un
contenitore oleato chiuso da pellicola e canovaccio per la lievitazione; (g) impasto dopo 4 h
di lievitazione; (h) formatura; (i) tagli superficiali; (l) inizio cottura i n forno con pentolino
di acqua; (m) prodotto finito.
Spesso anche in famiglia vengono utilizzate piccole impastatrici, ma di solito la
miscelazione degli ingredienti è ancora manuale. In questo caso, si fa sciogliere la PM N
con l’acqua tiepida e poi si aggiunge il miele. Dopo aver mescolato tutti gli altri
ingredienti (il sale per ultimo), si effettuano le pieghe e l’impasto sottoforma di palla
viene inserita in una bacinella oleata, racchiusa da pellicola trasparente al di sopra della
quale viene messo uno strofinaccio pulito, quindi in forno spento per 4 h.
Dopo la prima lievitazione si d{ la forma all’impasto, che verr{ lasciato riposare per
un’altra ora, si effettua il taglio e si cuoce in forno, con un pentolino di acqua nella parte
bassa. I primi 20 min a 250°C, quindi si abbassa la temperatura a 200°C per altri 15 min.
A forno spento si lascia il filone sulla grata per 15 min aggiuntivi.
50
1.5 In conclusione
Nei laboratori artigianali e nelle famiglie che ancora utilizzano la PM N si ricerca la
qualità, provando a seguire il più possibile i metodi di produzione tradizionali. La
lievitazione naturale con l’utilizzo della PM N prevede tempi molto lunghi e processi
laboriosi con la necessità di manodopera specializzata. A nostro parere è necessario
incentivare questi processi che fanno parte della nostra storia e garantiscono prodotti
da forno di ottima qualità.
Le industrie, invece, hanno come scopo principale l’elevazione delle rese produttive, e
quindi la massimizzazione delle rese in termini temporali e di mano d’opera (come
inidicato nello schema seguente). Per tale ragione, oltre all’utilizzo del lievito
convenzionale (LdB) e ai processi produttivi sempre più meccanizzati e continui, si è
iniziato a utilizzare le PMA, liquide o semiliquide.
51
E’ necessario preservare i sapori della tradizione panaria, e quindi anche la diversità
microbica delle PMN, favorendo e assistendo le panetterie artigianali che ne conoscono
l’importanza. Anche la qualit{ degli altri ingredienti andrebbe valorizzata, a nostro
avviso. Quando si utilizza la PMN non è necessario aggiungere additivi. La struttura, la
fragranza, la digeribilità, le caratteristiche nutrizionali e sensoriali del pane ottenuto con
l’utilizzo della PMN sono infatti inimitabili (cfr. § 2.1).
2. La caratt erizzazione delle popolazioni microbiche in 41 P M
marchigiane e umbre.
2.1. Introduzione
2.1.1. La pasta madre
La normativa italiana (n. 580 del 4/7/1967) definisce il pane come un “prodotto
ottenuto dalla cottura totale o parziale di una pasta convenientemente lievitata,
preparata con sfarinati di grano, acqua e lievito, con o senza aggiunta di sale comune”. In
essa non esiste una definizione di lievito madre naturale (LMN), né di pasta madre
naturale (PMN).
Nondimeno, con l’ausilio della normativa di altri paesi, oltre che della letteratura
scientifica, la PMN può essere definita come “un impasto costituito da acqua e farina ed
eventualmente sale, fermentato senza l’intervento di microrganismi volontariamente
aggiunti, e ottenuto anche grazie a una serie di rinfreschi successivi che ne hanno
ottimizzato la lievitazione e l’acidificazione. La fermentazione è opera di batteri lattici
(LAB) e lieviti endogeni della farina, ai quali si possono aggiungere quelli derivanti
dall’ambiente” (Gobbetti et al., 2010).
Come detto, nella legislazione di molti paesi Europei (es., Francia, Svizzera, Germania,
Austria) esiste invece la definizione di lievito naturale, considerato unanimemente “un
impasto fermentato da LAB e lieviti (Brandt, 2007)”. In aggiunta, nella definizione
Francese, (Decreto n° 93-1074 art. 4, 1993) viene sottolineata la funzione lievitante del
LMN: “impasto di farina e acqua, eventualmente addizionato di sale, sottoposto a
fermentazione spontanea acidificante così da assicurare un’adeguata capacit{ lievitante. Il
lievito naturale contiene lieviti e una microflora acidificante, costituita sostanzialmente da
batteri lattici. Il lievito per panificazione (S. cerevisiae), può essere aggiunto nell’ultima
fase dell’impastamento, con concentrazione massima dello 0,2% sul peso della farina. Il
lievito naturale può essere essiccato e utilizzato solo se la densità cellulare di batteri lattici
e lieviti, sia rispettivamente di 1 miliardo e di 1-10 milioni per grammo. Dopo la
reidratazione, e l’eventuale aggiunta del lievito per la panificazione, il lievito naturale deve
assicurare un’adeguata lievitazione dell’impasto. Il lievito naturale può anche essere
52
inoculato con microrganismi autorizzati”. Secondo la normativa Francese, il pane
derivato da lievitazione naturale, per essere così chiamato, non dovrà superare pH 4,3 e
dovrà avere un contenuto minimo di acido acetico di 900 ppm.
Interessante constatare che nessuna legislazione metta in luce le differenze intrinseche
tra PMN e PMA che, a nostro avviso è invece rilevante: una PMA, nella quale alcuni
microrganismi vengano riuniti (durante il processo di ricerca & sviluppo) in associazioni
“artificiali” (cioè, “costruite”) deve poter essere distinta da una PMN, nella quale si
sviluppano insiemi interessanti e cruciali di interazioni naturali tra microrganismi che,
sulla base della loro maggiore adattabilità, si sono affermati.
L’utilizzo della PMN (anziché del lievito commerciale per le panificazioni, S. cerevisiae)
permette
di
valorizzare
molte
caratteristiche
merceologiche
(organolettiche,
nutrizionali, aumento del tempo di conservazione, ecc.) dei prodotti da forno. Sono
proprio le attività metaboliche della flora microbica che vi si accresce a determinare
questi miglioramenti, che dipendono non solo dalla composizione del microbiota
presente, ma soprattutto dalle interazioni intercorrenti tra le diverse specie microbiche
e quelle che si instaurano tra le medesime specie e il loro microambiente (es., substrato).
In altre parole, tali miglioramenti dipendono dai diversi aspetti di ecologia microbica
della PMN. Essa è infatti da considerarsi un ecosistema in miniatura, abitato da alcune
(almeno) specie microbiche di natura diversa. L’ecologia microbica dipende
naturalmente da tutte le variabili ambientali che nel nostro caso coincidono in larga
parte con le variabili processuali impiegate (es., temperatura di conservazione e di
fermentazione, natura del substrato, aw dell’impasto, pH della pasta, ecc.; cfr. § 4.1).
La PMN è quindi un complesso sistema microbiologico in cui, sulla base delle
caratteristiche ambientali, si instaurano comunità (associazioni microbiche in
equilibrio) tra lieviti e batteri (solitamente LAB). Tale complesso potrà essere propagato
nel tempo purché si rinnovi in continuazione il substrato.
Tipicamente, nelle PMN il numero di lieviti oscilla tra 105 e 107 UFC/gr, mentre quello dei
batteri lattici è generalmente compreso tra 107 e 109 UFC/gr. Il loro rapporto, in linea di
massima, è quindi uguale a 1:100 (Ortogalli et al., 1996).
53
Da un punto di vista tecnologico, le PMN possono essere classificate in 3 tipologie, che in
questa sede possiamo denominare come segue:
a) paste semisolide (se si vuole, corrispondenti grosso modo al cosiddetto tipo-I di Stolz
(Böker et al., 1995; De Vuyst & Neysens, 2005): sono PMN tradizionali caratterizzate da
rinfreschi continui. Nel 1999, Stolz descrive come questo tipo di impasti possano essere
suddivisi ulteriormente in 3 sotto-categorie: la tipo-Ia ha una composizione microbica
relativamente “semplice”, con cenosi solitamente costituite, oltre a una specie di lievito
(soprattutto Saccharomyces exiguus o Candida humilis; Sugihara et al., 1971)
prevalentemente da ceppi della specie Lactobacillus sanfranciscensis (cenosi batterica
monospecifica). Grazie alla loro elevata acidit{, questi impasti sarebbero più “resistenti”
di altri a eventuali contaminazioni, e vengono infatti generalmente considerati stabili. La
tipo-Ib, invece, è una PMN caratterizzata tipicamente da uno o più lieviti e da più specie
batteriche (cenosi batteriche polispecifica); generalmente, le fermentazioni di queste
PMN sono lunghe (sino a 48h). La tipo-Ic, infine, è una PMN a base di sorgo utilizzata per
impasti tradizionali africani e turchi. Tipicamente, il processo di fermentazione è
caratterizzato da elevate temperature (> di 35°C) e dominato da ceppi di Lactobacillus
fermentum, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus reuteri e di Leuconostoc sp.. La specie
di lievito spesso associata a queste paste, secondo Stolz, sembra essere Issatchenkia
orientalis (o Candida krusei; Hamad et al., 1992).
b) paste liquide (corrispondenti grosso modo al cosiddetto tipo-II di Stolz), sono PM
naturali o artificiali con elevato contenuto d’acqua (impasti semi-liquidi, insomma, cioè
“Licoli”). Nella definizione di Stolz si fa riferimento all’utilizzo industriale e le definisce
paste ottenute mediante un’unica fase di fermentazione della durata di 15-20 h,
generalmente a temperature > 30°C, a cui segue lo stoccaggio per 2-5 gg. Nei processi
industriali viene utilizzata per aumentare l’acidit{ degli impasti lievitanti (pH < di 3,5). A
causa dell’elevato rapporto acqua : farina (DY=200) sono facilmente trasportabili e
trasferibili (es., con pompe adatte). I microrganismi, trovandosi in condizioni
fisiologiche di “tarda fase stazionaria”, sono metabolicamente meno attivi. Si possono
ritrovare anche LAB particolarmente resistenti a valori di acidità elevati (es.,
Lactobacillus panis, Lactobacillus reuteri, L. sanfranciscensis, Lactobacillus pontis). Questa
modalità di impasto, spesso non favorisce lo sviluppo dei lieviti, per cui, soprattutto per
lavorazioni industriali, durante le fasi finali è spesso necessaria l’aggiunta di lievito di
birra.
54
c) paste essiccate (corrispondenti grosso modo, al cosiddetto tipo-III di Stolz), sono
impasti di lievito naturale originati da a) o b) e successivamente essiccati per l’uso. In
esse i batteri prevalenti sono quelli maggiormente resistenti all’essiccamento (es.,
Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis). Anche in questo
caso, soprattutto negli usi industriali, è spesso necessaria l’aggiunta del lievito di birra.
L’uso delle paste madri essiccate rende il processo più semplice, ma il risultato è una
standardizzazione completa dei prodotti da forno finali (Stolz & Böcker, 1996).
2.1.1.1.
I lieviti
Più di 20 differenti specie di lievito, soprattutto appartenenti ai generi Saccharomyces e
Candida, sono state isolate dalle PM (ur-Rehman et al., 2006). Saccharomyces cerevisiae è
la specie più frequentemente isolata, anche se sovente viene ricollegata a possibili
contaminazioni derivanti da lievito convenzionale.
Il ruolo principale è quello di promuovere la lievitazione dell’impasto. Attraverso la
fermentazione alcolica (formula-1): il lievito produce un’elevata quantit{ di CO2 che,
intrappolata nella maglia glutinica, permette l’aumento di volume dell’impasto.
(1) C6H12O6→ 2CO2 + 2 CH3CH2OH + 66.5kJ/mol
La fermentazione alcolica è solo una delle vie metaboliche impiegate nel mondo
microbico per ricavare energia metabolica dai substrati. Nella figura 2.1 ne sono
schematizzate alcune tra le più frequenti, attivate durante la crescita fungina. Si può
osservare come, oltre all’etanolo e all’anidride carbonica, siano prodotti molti altri
composti. La maggior parte di tali composti sono volatili e dall’odore gradevole (es.,
esteri, alcoli superiori); altri sono precursori di composti volatili (es., ac. grassi) che
saranno liberati durante la fase di cottura del pane.
55
FIGURA 2.1 Principali vie metaboliche attive durante la fermentazione di S.
cerevisiae. In arancione sono indicati i principali metaboliti prodotti e secre ti
all’esterno della cellula (riadattata da Gobbetti et al., ).
Wickerhanomyces anomalus (ex Hansenula anomala) è uno dei lieviti isolati negli impasti
acidi; secondo Daniel et al. (2011), nelle PM Belghe risulta essere il lievito
predominante. Questa specie ha ceppi in grado di produrre tossine killer (Polonelli et al.,
1983), di resistere a elevati toni osmotici (basse aw), a bassi pH (Fredlund et al., 2002) e
di vivere in presenza di specie batteriche lattiche (Vrancken et al., 2010). Per queste
ragioni si tratta di un lievito molto competitivo. Kurtzman et al. (1970) hanno isolato
questa specie dal frumento e dalla farina di frumento; ma è associata anche a fiori, frutti,
essudati vegetali, animali e a corpi fruttiferi fungini macroscopici.
Importante nelle PMN sembra anche essere Candida humilis, in alcuni casi essa è la
specie di lievito prevalente (più del 95% dei ceppi isolati appartiene a C. humilis, Gullo
et al., 2003).
Moltissimi ceppi di S. cerevisiae sono spesso impiegati dalla nostra società, che ne trae
vantaggio in diversi ambiti fermentativi (es., Kunkee & Bisson, 1993, Hammond, 1993,
Rose & Vijayalakshmi, 1993). In altre parole, S. cerevisiae è spesso considerato un lievito
“domestico” (es., Mortimer, 2000; Martini, 1993; Naumov, 1996).
Questo lievito sembra essere il più adatto anche per la fermentazione degli impasti
acqua-farina, consentendo loro di lievitare rapidamente. Romano et al. (2008), hanno
dimostrato come alcuni ceppi di S. cerevisiae siano in grado di fermentare tutti gli
zuccheri presenti nell’impasto (glucosio, fruttosio, saccarosio e maltosio), otto volte più
velocemente di a Pichia membranificiens, in grado invece di fermentare il solo glucosio.
56
2.1.1.2.
I batteri lattici
Nelle PMN mature sono state isolate più di 50 specie di batteri lattici diversi (ur-Rehman
al., 2006). I LAB sono eterotrofi, Gram+, non sporigeni, catalasi-negativi e acidotolleranti. Per vivere necessitano di fattori di crescita complessi (es., vitamine e
amminoacidi), sono stati isolati, per questa ragione, in substrati ricchi di composti
nutritivi.
Il gruppo dei LAB comprende circa 20 generi, tra cui, principalmente presenti nelle PM,
Lactobacillus, Weissella, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus e Lactococcus.
Nel gruppo dei LAB si distinguono, sulla base del tipo di metabolismo degli zuccheri, i
LAB omofermentanti (o omolattici), quelli eterofermentanti (o eterolattici) e quelli
eterofermentanti facoltativi.
Nella maggior parte degli alimenti fermentati sono i LAB omofermentanti a essere
maggiormente presenti, mentre nelle PMN (soprattutto se preparate e mantenute
secondo tradizione), si ritrovano più frequentemente i batteri eterofermentanti (Corsetti
et al., 2003; De Vuyst, et al., 2002). La dominanza degli eterofermentanti obbligati è
dovuta, presumibilmente, alla loro maggiore competitività e alla loro miglior capacità di
adattamento negli ecosistemi “pasta madre” e “lievito madre”.
57
58
FIGURA 2.2 Metabolismo del glucosio: (A)omolattico; (B) eterolattico facoltativo; (C)
eterolattico. Le reazioni sono catalizzate dai seguenti enzimi (1) esochinasi, (2)
2,glucosiofosfatoisomerasi, (3) fosfoglucochinasi, (4) fruttosio bifosfato aldolasi, (5) trioso
fosfato isomerasi, (6) gliceralde ide fosfatodeidrogenasi; (7) fosfogliceraldeide chinasi; (8)
fosfoglicerato mutasi; (9) enolasi; (10) piruvato chinasi; (11) lattato deidrogenasi; (12)
piruvato deidrogenasi; (13) piruvato formato liasi; (14) acetaldeide deidrogenasi; (15)
alcol deidrogenasi; (16) fosfotransacetilasi; (17) acetato chinasi; (18) α-acetolattato
sintasi; (19) α-acetolattato decarbossilasi; (20) 2,3 butandiolo deidrogenasi; (21) diacetile
reduttasi; (22) glucosio-6P-deidrogenasi; (23) 6-P-gluconato deidrogenasi; (24) ribulosio5-P-3-epimerasi; (25) D-xilulosio-5P fosfochetolasi (figura modificata da Mayo et al.).
I LAB eterofermentanti obbligati utilizzano la via dei pentosi fosfati (fosfogluconato o
fosfochetolasi 6-PG/PK) per produrre energia metabolica, etanolo e diversi acidi
organici. I batteri omofermentanti non fermentano i pentosi e utilizzano la via EMP.
Producono quasi esclusivamente acido lattico. I LAB eterofermentanti facoltativi
utilizzano invece la via omofermentativa poiché possiedono una fruttosio1,6 difosfato
aldolasi costitutiva (enzima chiave della glicolisi); ma se nell’ambiente scarseggiassero
gli
esosi,
un
corredo
di
enzimi
inducibili
permette
loro
di
realizzare
l’eterofermentazione. A partire dal glucosio, i batteri omolattici producono, come unico
prodotto finale, acido lattico, mentre gli eterolattici producono acido lattico, CO2 etanolo
e acido acetico. In questo modo, generalmente e per lo più, a parità di moli di glucosio
iniziali, i batteri omolattici producono più moli di acido lattico e sono quindi più
acidificanti degli eterolattici. Inoltre, i batteri omolattici utilizzano anche il fruttosio e il
maltosio, ma – come ci si aspetta – solo quando il glucosio del mezzo è terminato.
Lactobacillus sanfranciscensis sembra essere la specie lattica isolata più frequentemente
dalle PMN, e per questo essa è stata considerata da alcuni “la chiave” per analizzare
scientificamente la PMN (Gobbetti & Corsetti, 1997). L. sanfranciscensis è un batterio
eterofermentante obbligato, e preferisce il maltosio come fonte di carbonio in quanto
possiede una maltosio fosforilasi costitutiva. In particolare, il maltosio è internalizzato
attraverso il simporto maltosio/H+ e idrolizzato in glucosio e glucosio-1-fosfato dalla
maltosio fosforilasi (Gobbetti & Corsetti, 1997). Anche Lactobacillus brevis, Lactobacillus
pontis, Lactobacillus reuteri e Lactobacillus fermentum sono LAB eterofermentanti che
mostrano la stessa attività fosforilasica sul maltosio (Stolz et al., 1996). Il glucosio-1-P è
metabolizzato lungo la via dei pentosi fosfati, mentre il glucosio viene escreto fino a che
la concentrazione di questo carboidrato all’esterno della cellula sia abbastanza alta da
indurre l’espressione dell’attivit{ esochinasica (Stolz et al., 1996).
La maggior parte dei batteri eterolattici obbligati, ma non L. sanfranciscensis, sono in
grado di metabolizzare i pentosi: è il caso, per esempio, di L. brevis, L. fermentum, L.
hilgardii. I pentosi sono fosforilati e convertiti a ribulosio-5-fosfato o xilulosio-5-fosfato
attraverso epimerasi o isomerasi e metabolizzate nella via metabolica 6-PG/PK
(Axelsson, 1998). Come gli eterofermentanti obbligati, gli eterofermentanti facoltativi
fermentano i pentosi.
In presenza di accettori di elettroni, l’acetilfosfato è convertito ad acetato con la
produzione di una molecola di ATP addizionale. Nel caso in cui L. sanfranciscensis si
trovasse in assenza di composti nutritivi o in casi di stress iperosmotico sub-letale, esso
è in grado di produrre glicerolo ed eritritolo dal glucosio. In particolare l’eritritolo viene
prodotto solo in assenza di acido pantotenico, in quanto questa vitamina è necessaria
per la produzione del coenzima A, cofattore-chiave nella reazione fosfotransacetilasica.
La maggior parte dei ceppi di L. sanfranciscensis è incapace di usare il fruttosio come
fonte di carbonio, tutti i ceppi riducono il fruttosio a mannitolo attraverso attività
mannitolo deidrogenasica. Nella maggior parte del batteri eterolattici obbligati è stata
individuata la preferenza a utilizzare il fruttosio come accettore di elettroni producendo
mannitolo (von Weymarn et al., 2002). Alcuni batteri eterofermentanti, tra cui L.
59
sanfranciscensis, possono invece usare ossigeno come accettore finale di elettroni. Altri
ancora, come L. pontis, L. fermentum e L. reuteri, non usano ossigeno e vengono inibiti da
condizioni di crescita aerobie. L. sanfranciscensis utilizza anche citrato/malato/fumarato
come accettore di elettroni che vengono così ridotti rispettivamente a lattato/succinato
(Hammes et al., 1995).
2.1.1.3.
Interazioni microbiche nella PM N
Il microbiota della PMN è generalmente composto da una stabile associazione di lieviti e
LAB. In alcune PMN i LAB e i lieviti competono per la disponibilità di composti nutritivi, e
il risultato è una popolazione microbica eterogenea molto sensibile alle variazioni
ambientali. Inoltre, quando viene aggiunto lievito di birra, la popolazione microbica
cambia e conseguentemente anche le proprietà organolettiche del prodotto finito ne
rimangono influenzate (De Vuyst & Neysens, 2005).
Secondo Gobetti e collaboratori, i lieviti contribuiscono alla crescita dei LAB anche
liberando amminoacidi essenziali e vitamine (Gobbetti et al., 1994).
Le interazioni sinergiche o competitive tra i LAB e i lieviti sono soprattutto basate sul
metabolismo dei carboidrati e degli amminoacidi.
Una tipica associazione mutualistica coinvolge L. sanfranciscensis e S. exiguus o C. humilis
(Ortogalli et al., 1996). Il maltosio è la fonte energetica preferita dal batterio, mentre i
due lieviti utilizzano preferibilmente glucosio, saccarosio e fruttosio, poiché non sono in
grado di fermentare il maltosio. Questo zucchero viene continuamente rilasciato dalle
amilasi della farina. Come già spiegato precedentemente, il maltosio viene utilizzato da
L. sanfranciscensis, che libera glucosio all’esterno della cellula, dato che i batteri
eterofermentanti sono privi di attività esochinasica. Il glucosio rilasciato influenza
profondamente l’ecologia microbica di questo ecosistema: per esempio, esso può essere
utilizzato dai lieviti maltosio-.
Se associato a lieviti maltosio+ (es., S. cerevisiae), L. sanfranciscensis rallenta il proprio
metabolismo e cresce più lentamente. La mancanza di competitività tra L.
sanfranciscensis e S. exiguus per il maltosio è fondamentale per la stabilità di questa
associazione.
Il fruttosio nella farina è presente sotto forma di glucofruttosani. Tali composti possono
essere idrolizzati dalle invertasi dei lieviti, che promuovono la liberazione di fruttosio
nell’impasto (Brandt & Hammes, 2001).
60
Paramithiotis et al. (2006) hanno studiato l’acidificazione, la crescita e la produzione di
metaboliti di colture di S. cerevisiae e altri LAB in co-colture (1 lievito + 1 LAB) o in
colture singole in impasti acidi modello. Questo studio ha messo in evidenza che la
popolazione batterica dominante (es., L. sanfranciscensis), e quella minoritaria (es, W.
cibaria), associate a S. cerevisiae, influenza la crescita del lievito e la produzione dei
metaboliti con modalità che variano da specie a specie. Quando associato a uno dei LAB,
S. cerevisiae rallenta la propria crescita, a causa dell’abbassamento del pH generato dai
LAB. Al contrario, la crescita dei batteri (L. sanfranciscensis, L. brevis, Lactobacillus
paralimentarius,
Pediococcus
pentosaceus,
Weissella
cibaria)
viene
esaltata,
probabilmente a causa dell’escrezione - da parte del lievito durante la crescita - di
amminoacidi e piccoli peptidi, oppure come conseguenza di attività autolitiche
accelerate, forse causate dall’aumentata acidit{ del mezzo.
61
2.1.2. Qualità apportate al prodotto finito
La riscoperta e l’uso sempre più frequente delle PMN nella produzione di pane, sono
motivati dai benèfici effetti che essa apporta all’aroma, alla conservabilità, alla
digeribilità, alle proprietà nutrizionali e strutturali del prodotto finito.
FIGURA 2.3 Rappresentazione delle
fermentazione microbica delle PM N .
principali
qualità
del
pane
ottenute
dalla
2.1.2.1 Digeribilità
Grazie al metabolismo microbico, la PMN ha un elevato potenziale di modificazione delle
macromolecole presenti nell’impasto. Questo viene pre-digerito dai microrganismi
presenti, così che, all’aumentare del tempo di fermentazione, si assisterà a un maggiore
grado di modificazione delle macromolecole. Gran parte dell’amido presente nella farina
grazie all’attivazione delle amilasi endogene, e a causa dell’abbassamento del pH, oppure
alla liberazione di amilasi microbiche, viene metabolizzato, con liberazione di acido
lattico, etanolo, CO2, e altri acidi organici. Inoltre, la PMN è anche in grado di ridurre la
digeribilità dell’amido restante.
La disponibilit{ di amido influenza l’indice glicemico15 (IG) del prodotto finito. L’amido
cotto del pane di frumento, genera un rapido innalzamento dei livelli di glucosio nel
sangue. L’uso di tecnologie di pre-fermentazione, come la PMN, o l’aggiunta di fibre
(farine integrali) provoca una riduzione dell’ IG (Fardet et al., 2006).
L’ IG è stato sviluppato per indicare l’effetto dell’alimento sui livelli di glucosio nel sangue. Le tabelle,
indicanti questi valori, sono utili per la scelta degli alimenti di pazienti diabetici od obesi.
15
62
In particolare, gli acidi organici prodotti dal metabolismo lattico, sembrano influenzare
la risposta glicemica post-prandiale16, oltre che la risposta insulinica. L’acido lattico
sembra, invece, diminuire il tasso dell’amido digeribile nel pane (Liljeberg et al., 1995).
L’acido acetico e l’acido propionico accrescono il tasso di svuotamento gastrico
(Liljeberg & Böjrck, 1998).
Östman e collaboratori (2002) osservano come la presenza di acido lattico durante la
cottura favorisca le interazioni chimiche tra l’amido e il glutine, con conseguente
riduzione della biodisponibilit{ dell’amido.
Un altro meccanismo influenzante l’IG è dovuto alla proteolisi, dipendente dal pH, che
normalmente avviene durante la fermentazione della PMN (Gänzle et al., 2008).
L’incremento dei peptidi e degli amminoacidi liberi sembrano avere un ruolo nella
regolazione del metabolismo del glucosio (Nilsson et al., 2007); così come l’incremento
dei livelli di composti fenolici liberi (Solomon & Blannin, 2007).
La capacità proteolitica dei LAB risulta essere importante anche in quanto, alcuni
frammenti dell’α-gliadina risultano allergenici per i celiaci17. Questi frammenti sono
particolarmente ricchi in prolina, e sono quindi difficili da idrolizzare.
Siccome i LAB hanno un sistema proteolitico attivo sul glutine (Ròllan et al., 2005), è
stato proposto che alcuni frammenti allergenici dell’α-gliadina possano essere
detossificati attraverso l’idrolisi batterica. Sebbene sia improbabile che un singolo ceppo
possegga il completo corredo peptidasico necessario per l’idrolisi dei frammenti in cui la
prolina è implicata, alcuni studi sottolineano che l’uso di particolari ceppi batterici
possono metabolizzare il glutine. Di Cagno et al. (2009) dimostrano che il pane prodotto
con farina di frumento idrolizzata durante la fermentazione microbica risulta essere
tollerato dai celiaci per 60 gg dopo la somministrazione.
2.1.2.2 Incremento dei valori nutrizionali
La fermentazione con la PMN può incrementare o far diminuire i livelli di alcuni
composti bioattivi a seconda della natura del composto e del tipo di processo di
fermentazione (Katina et al., 2005). La fermentazione dei lieviti sembra favorire la
La risposta glicemica post-prandiale (Ppg, post-prandial glycemia), è l’andamento dei livelli di glucosio e
insulina nel sangue, dopo il consumo di un alimento o di un pasto dovuta ai carboidrati disponibili in esso.
17 La celiachia è una malattia immunomediata scatenata dall’ingestione di glutine che, in soggetti
geneticamente predisposti, determina un processo infiammatorio nell’intestino tenue e un conseguente
malassorbimento e manifestazioni extraintestinali.
16
63
presenza dei folati (Kariluoto et al., 2004) e della tiamina (Ternes & Freund, 1988).
L’acidificazione dell’impasto dovuta alla fermentazione batterica può incrementare i
livelli di alcuni composti (es., composti fenolici), e diminuire quelli di altri (es., tiamina,
tocofenoli e tocotrienoli; Boskov-Hansen et al., 2002; Liukkonen et al., 2003). Liukkonen,
col proprio gruppo di ricerca, dimostra che durante la fase fermentativa dell’impasto
l’attivit{ antiossidante DPPH18 va aumentando, probabilmente a causa dell’aumento dei
composti fenolici estraibili (Liukkonen et al., 2003).
Nella farina sono presenti dei composti come i tannini e i resorcinoli (presenti in quella
integrale), che inibiscono l’attivit{ degli enzimi digestivi e dell’acido fitico19.
FIGURA 2.4 (A) struttura molecolare dell’acido fitico (mio-inositolo legato a 6 gruppi
fosfato); (B) complesso insolubile tra l’acido fitico e alcuni cationi.
L’ acido fitico (figura 2.3) è considerato un composto antinutrizionale a causa della sua
struttura molecolare nella quale sono presenti sei gruppi fosfato che in completa
dissociazione presentano un totale di dodici cariche negative, in grado di intrappolare
cationi, e di formare complessi insolubili che ne impediscono l’assorbimento (figura 2.3b).
L’acido fitico lega vari cationi mono-, di- e tri- valenti, e forma complessi insolubili
contenenti soprattutto potassio e magnesio; in piccole quantità calcio, zinco, ferro o
rame. La solubilità e la stabilità di tali complessi diminuisce quando il numero dei
residui di fosfato sull’anello del mio-inositolo è calato. Quindi, la rimozione di tali residui
comporta una maggiore disponibilità dei minerali essenziali (Sandberg et al., 1999;
Corsetti & Settani, 2007).
Il difenilpicrilidrazile è radicale libero stabile ed è cromoforo, viene utilizzato per determinare il
potenziale antiossidante.
19 che interferisce con l’assorbimento dei cationi bivalenti.
18
64
Le fitasi sono enzimi endogeni della farina e la loro azione consiste nella defosforilazione
del fitato e nella formazione di fosfato inorganico e di esteri dell’inositolo-fosfato (minor
capacità di influenzare la biodisponibilità dei cationi). L’attivit{ fitasica dipende da
numerosi fattori tra cui la temperatura, il contenuto in acqua, il tempo di fermentazione
e il pH (De Angelis et al., 2003).
L’azione fitasica è favorita in ambienti acidi (pHop 4.5; Fretzdorff & Brummer, 1992), per
cui il metabolismo lattico provoca un’aumentata biodisponibilit{ dei minerali (cationi
bivalenti) incrementando l’idrolisi dell’acido fitico. Inoltre, alcuni LAB e lieviti
possiedono attività fitasica. Aggiunta a quella naturale, normalmente presente nella
farina, tale attività microbica aumenta la biodisponibilità dei minerali (Lopez et al.,
2000; Turk et al., 2000). Chaoui et al. (2003) hanno dimostrato che è possibile
aumentare i livelli di biodegradazione del fitato, con conseguente aumento della
biodisponibilità dei cationi, e con combinazione di lieviti e LAB: S. cerevisiae, L.
plantarum e L. mesenteroides.
65
FIGURA 2.5 Variazioni nella biobisponibiltà o nella struttura molecolare dei principali
composti chimici presenti nella farina e nel pane , dovute all’utilizzo della PM N . Le
modificazioni riportate influenzano in modo positivo la qualità del prodotto finito
(modificata da Poutanen et al., 2009).
Gli studi relativi agli aspetti nutrizionali del pane ottenuto attraverso l’utilizzo della PMN
hanno mostrato la presenza di componenti antiossidanti e antiipertensivi. La pronil-Llisina è un antiossidante prodotto dalla reazione di Maillard durante la cottura nella
crosta del pane. Questo composto agisce come un induttore monofunzionale della
glutatione-S-transferasi, che è un parametro funzionale dell’attivit{ antiossidante
chemiopreventiva20 in vitro. La quantità di questo antiossidante è risultata essere
maggiore nel pane ottenuto da PMN rispetto a quello ottenuto dalla sola fermentazione
con lievito di birra, in quanto strettamente collegata con il pH (Lindenmeier & Hofmann,
2004).
L’enzima che converte l’angiotensina I (ACE) è responsabile dell’incremento della
pressione sanguigna nell’uomo. Sono stati trovati numerosi biopeptidi con effetto
inibitorio sull’ACE, specialmente in formaggi e prodotti caseari. Alcuni LAB usati durante
la fermentazione di impasti, soprattutto con l’utilizzo di farine integrali, possono
sintetizzare peptidi ACE-inibitori e acido γ-amminobutirrico. Ciò sembra sortire effetti
antiipertensivi (Rizzello et al., 2010).
2.1.2.3 Conservabilità strutturale e microbiologica
La conservabilità strutturale del pane viene persa quando avviene quel deterioramento
fisiochimico denominato raffermamento: il risultato è una pasta dura e la perdita di
sapore.
Durante la fermentazione, i LAB producono una serie di metaboliti (acidi organici,
enzimi ed esopolisaccaridi) con effetti positivi sulla tessitura, sul raffermamento, e
sull’allungamento della shelf-life del prodotto.
La presenza di acidi organici, dovuta al metabolismo lattico, e la presenza o meno di sale,
dimostra influenze considerevoli sulle propriet{ reologiche dell’impasto, e quindi sulla
conservabilità del prodotto finito. L’acidificazione della PMN, e la parziale acidificazione
dell’impasto, influiranno su composti come il glutine, l’amido e gli arabinoxilani, che
contribuiscono alla struttura del prodotto finito. E’ stato dimostrato che la capacit{ di
trattenere l’acqua e la consistenza dell’impasto aumentano se vengono aggiunti acidi
organici (Tanaka et al., 1967; Maher Galal et al., 1978). Inoltre, poiché in ambiente acido
ci sono una cariche positive in abbondanza, esse fanno aumentare la solubilità proteica.
La presenza di acidi organici, inoltre, diminuisce in modo sostanziale il tempo di
miscelazione (Maher Galal et al., 1978). A pH inferiori a 4, aumenta la repulsione
elettrostatica tra le proteine. In questo modo, la possibilità di formazione di nuovi
Gli agenti chemiopreventivi possono modulare l’apoptosi cellulare, sono anche capaci di regolare lo
stadio proliferativo delle cellule, e per tali ragioni possono essere utilizzati nella cura e nella terapia del
cancro.
20
66
legami viene impedita (Clarke et al., 2004), e si assiste quindi a un indebolimento della
struttura proteica e a una spiccata sofficità nel prodotto finito.
Schober et al. (2003), inoltre, dimostrano che la presenza di acido aumenta la sofficità e
l’elasticit{ dell’impasto.
L’abbassamento di pH causa un incremento nell’attivit{ proteasica e amilasica con una
riduzione del fenomeno di raffermamento. La solubilizzazione degli arabinoxilani
durante la fermentazione e la presenza di pentosani prevengono le interazioni amidoglutine responsabili del raffermamento (Sadeghi, 2008).
In aggiunta, alcuni LAB che si selezionano nelle PM, hanno la capacità di produrre
esopolisaccaridi (EPS): tali composti migliorano le proprietà reologiche (Decock &
Capelle, 2005), quelle fisiche (umidità, volume, consistenza, colore della crosta del
pane) e quelle sensoriali dell’impasto (De Vuyst et al., 2001). Questi EPS sono
comunemente utilizzati come additivi nell’industria della panificazione, con lo scopo di
aumentare la conservabilità strutturale del prodotto finito.
I LAB possono produrre gli EPS associati alla parete cellulare (capsule), oppure possono
secernerli nell’ambiente extracellulare. Gli EPS proteggono la cellula dall’essiccamento,
dalle fagocitosi, dall’attacco di fagi, dagli antibiotici, e ne favoriscono l’adesione alle
superfici solide (formazione di biofilm). Esistono diversi tipi di EPS: questi possono
differire per dimensione, struttura, composizione chimica, organizzazione molecolare, e
tipo di gene coinvolto nella biosintesi. Gli EPS possono essere distinti in due grandi
gruppi: (i) gli omopolisaccaridi (con solo un tipo di monosaccaride), sintetizzati
nell’ambiente extracellulare (enzimi extracellulari o legati alla parete) e (ii) gli
eteropolisaccaridi (con diverse unità monosaccaridiche, ripetute in modo regolare o
irregolare), sintetizzati nell’ambiente intracellulare, sotto forma di zuccheri precursori
(unità ripetute di 3-8 carboidrati), successivamente secreti e polimerizzati. Gli enzimi
coinvolti nella biosintesi possono essere transglicosilasi o glicosil-trasferasi (GTF).
Alcuni EPS hanno effetti benèfici sulla salute umana, e dimostrano la capacità di
abbassare la colesterolemia, diverse attività antitumorali, immunomodulanti, oltre che
interessantissimi effetti probiotici, in quanto in grado di stimolare la crescita di ceppi
appartenenti al genere Bifidobacterium (Tieking et al., 2003). Avere a disposizione ceppi
capaci di produrre EPS in una PMN può rendere non necessario l’uso industriale di
additivi derivanti dalle piante (idrocolloidi come l’amido, la pectina, la cellulosa, gli
xilani), spesso utilizzati per migliorare le proprietà tissutali degli alimenti fermentati.
67
Diversi studi trattano della capacità dei LAB di produrre omopolisaccaridi che possono
contenere unicamente D-glucosio o D-fruttosio, rispettivamente con il nome di glucani
(es., destrano, α-1-6; mutano, α-1-3; reuterano α-1-4, α-1-6) e fruttani (es., levano, β-2-6;
inulina, β-2-1). Tali enzimi impiegano come substrato zuccherino, solitamente, il
saccarosio (glucosio-fruttosio). L’unit{ monosaccaridica viene polimerizzata per
intervento di transglicosilasi denominate glucansaccarasi o fruttansaccarasi 21, in
relazione al corrispondente omopolisaccaride sintetizzato. Avendo una scarsa selettività,
tali enzimi catalizzano la biosintesi di oligosaccaridi a basso peso molecolare (ruolo prebiotico): gluco-oligosaccaridi e frutto-oligosaccaridi (GOS e FOS).
(a)
(b)
FIGURA 2.6 (a)un eteropolisaccaride e (b) un omopolisaccaride del glucosio: il destrano
(Monsan et al., 2001).
La capacità prebiotica dei prodotti lievitati da forno associata agli EPS non è stata ancora
del tutto dimostrata, ma potrebbe essere interessante dal punto di vista funzionale e
nutrizionale. I LAB capaci di produrre omopolisaccaridi sono ceppi del genere
Lactobacillus, Weissella e Leuconostoc; l’EPS più studiato in relazione ai LAB è il
destrano.
La conservabilità microbiologica del prodotto finito viene persa quando inizia a
deteriorare, la prima causa è l’ammuffimento che avviene quando cellule di Aspergillus
sp. (muffa verde), Rhizopus nigricans (punti neri), Neurospora sitophila (“pane rosso”) o
Penicillium sp. (muffa verde) riescono ad “attecchire” e a moltiplicarvisi (Forsythe,
2010).
Oltre alla perdita economica dovuta a una contaminazione di questa natura, esiste anche
il problema della possibile produzione, da parte di alcune muffe, di aflatossine22, che
Le glucan o fruttan-saccarasi catalizzano la conversione del saccarosio negli zuccheri semplici di cui è
composto (funzione di invertasi) e determinano anche la formazione del polimero (funzione di
transferasi).
22 Sono metaboliti secondati di alcune specie fungine che colonizzano gli alimenti, sono tossici per gli
animali e per l’uomo.
21
68
potrebbero causare problemi di salute pubblica (Sadeghi, 2008). La PM è in grado di
inibire e controllare lo sviluppo delle muffe in differenti modi, specialmente attraverso
l’abbassamento del pH. L. plantarum e L. sanfranciscensis producono particolari acidi
organici (rispettivamente, 3-fenil-L-acido lattico e acido caproico) dalle proprietà
antifungine (Corsetti et al., 1998; Ström et al., 2002; Lavermicocca et al., 2003). Dal Bello
et al. (2007) dimostrano come l’aggiunta di un ceppo di L. plantarum inibisca la crescita
di Fusarium spp., attraverso la produzione di acido lattico, acido fenillattico e di due
dipeptidi ciclici: ciclo (L-Leu-L-Pro) e ciclo (L-Phe-trans-4-OH-L-Pro).
L’attivit{ antifungina dei LAB è molto complessa e specifica per ogni ceppo (de Muynck
et al., 2004). In generale, oltre ad alcuni acidi organici (che contribuiscono all’inibizione
fungina) vi sono anche le molecole simil-antibiotiche (es., reuterina), gli acidi grassi
idrossilici; i composti di natura proteica; i dipeptidi ciclici; il diacetile e il perossido
d’idrogeno (Clarke & Arendt, 2005; Simsek et al., 2006).
La reuterina (3-idrossi-propanale) a esempio, è un composto antimicrobico prodotto da
alcuni ceppi di L. reuteri, e rappresenta il maggior metabolita derivante dal metabolismo
del glicerolo. La reuterina agisce contro una grande varietà di batteri Gram+ e Gram(Vogel et al., 2002), di lieviti e di muffe (Schnürer & Magnusson, 2005; es., Aspergillus sp.
e Fusarium sp., Chung et al., 1989).
Interessante lo studio di Zhang et al. (2010) nel quale si sottolinea l’importanza
dell’interazione tra due ceppi di LAB isolati all’interno di PM (Lactobacillus diolivorans e
Lactobacillus buchneri). In particolare L. buchneri produce l’1,2 propandiolo, il quale
viene poi trasformato in ac. propionico da L. diolivorans; si assiste a un’attivit{
antifungina combinata, infatti soltanto attraverso l’interazione dei due ceppi si ha la
formazione dell’acido organico dalle capacità antifungine (figura 2.7).
69
FIGURA 2.7 L’associazione dei LAB L. buchneri e L. diolivorans permette la produzione di
propionato, esso è un acido organico in grado di inibire lo sviluppo fungino (Zhang et al.,
2010).
L’alterazione denominata “pane filante”, è la seconda causa di deterioramento dei
prodotti da forno. Essa si verifica generalmente a causa della crescita di Bacillus sp., (B.
subtilis e B. licheniformis; Rock, 1996). Questa contaminazione, provoca odori sgradevoli
nel prodotto finito; seguita da perdita di colore e da pane appiccicoso con crosta
morbida, a causa della degradazione dell’amido e delle proteine, attraverso amilasi e
proteasi microbiche; e dalla produzione di esopolisaccaridi. Un mezzo efficace nel
limitare la germinazione e la crescita dei batteri che daranno origine al pane “filante” è
l’aumento dell’acidità che dà origine a un ambiente sfavorevole alla sopravvivenza delle
endospore. Gli acidi organici più efficaci a tale scopo sono l’acido propionico e l’acido
acetico. Alcuni LAB sono, inoltre, in grado di produrre composti antibatterici, le
batteriocine. Si tratta di piccoli peptidi: un esempio tipico è la nisina che ha un grande
effetto inibente sulla germinazione di Bacillus sp. (Sadeghi, 2008).
L’attivit{ antimicrobica della PM deriva essenzialmente dalla presenza di LAB. In alcune
PM sono presenti anche lieviti dalla capacità antifungina, per esempio Wickerhamomyces
anomalus (Coda et al., 2011). E’ stato dimostrato che W. anomalus è in grado di inibire la
crescita di funghi sui grani di cereali (Petersson & Schnurer 1995). Coda et al. (2011)
sfruttano l’importante capacità antagonistica di W. anomalus in associazione con L.
plantarum, per dimostrare che il pane ottenuto da questo consorzio microbico ha una
prolungata shelf life.
70
2.1.2.4 Migliori caratteristiche sensoriali
Le caratteristiche sensoriali del pane prodotto con l’uso della PM, possono essere
influenzate da molteplici fattori: (i) gli aromi della farina (Czemy & Schieberle, 2002);
(ii) le fermentazioni microbiche; (iii) gli enzimi endogeni della farina; (iv) la dispersione
degli aromi durante la fermentazione; (v) la cottura (Vermeulen et al., 2007).
L’utilizzo della PM migliora le qualità sensoriali del prodotto finito. Fermentando, i
microrganismi possono influenzare la composizione aromatica del prodotto finito a
causa dell’incremento dei componenti desiderati e della degradazione di quelli
indesiderati, ma anche a causa della liberazione di precursori aromatici che, durante la
cottura, genereranno composti volatili diversi (Czemy & Schieberle, 2002).
71
TABELLA 2.1Alcuni composti volatili presenti nella crosta e nella mollica del pane, per
ognuno è indicato il precursone e l’odore corrispondente ( modificato da Schieberle, 1996).
I composti che influenzano maggiormente aroma e sapore del pane sono gli acidi
organici, gli alcoli, gli esteri e i carbonili (Hoffmann & Schieberle, 2000; Röcken et al.,
2005).
Il rapporto lattato/acetato (FQ) è un importante fattore nella determinazione delle
proprietà sensoriali del pane. Quando il valore del rapporto FQ è tra 2 e 2,7, si
percepisce un aroma del pane giudicato in genere gradevole (Thiele et al., 2002).
Per generare un sufficiente quantitativo di composti volatili, il processo di
fermentazione necessita di varie fasi della durata di 12- 24 h; quando si usa solo il lievito
commerciale, invece, in poche ore la fermentazione è completa (Hansen & Schieberle,
2005), e ciò inficia la possibilità di arricchire le pagnotte di composti aromatici
secondari.
Il metabolismo dei lieviti e dei LAB (soprattutto di quelli eterofermentanti) genera
composti volatili di basso peso molecolare, che contribuiranno in maniera significativa
alle caratteristiche organolettiche del prodotto finito. Kirchoff e Schieberle (2002)
hanno osservato che, nelle PM lievitate anche da LAB eterofermentanti, la quantità di
aldeidi è inferiore rispetto alle PM in cui i LAB eterofermentanti sono assenti. Il
contenuto di etilacetato e di esilacetato, invece, è più elevato. Le aldeidi vengono ridotte
dai LAB eterofermentanti, nei corrispettivi alcoli (es., 2- e 3-metilbutanale in 2- e 3metilbutanolo; Kaseleht et al., 2011). Al contrario, gli omofermentanti, invece di
degradare le aldeidi, ne producono altre (es., 2-pentenale, nonanale) e producono meno
1-esanolo. Questo differente metabolismo è probabilmente dovuto alla più spiccata
attività alcoldeidrogenasica e/o a una più alta necessità di potere riducente (NAD(P)H)
durante la crescita eterofermentante (Kaseleht et al., 2011).
Le PM fermentate dai LAB, decisamente più riducenti, contengono infatti anche esanolo
ed eptanolo (Vermeulen et al., 2007). E’ verosimile che i LAB usino le aldeidi come
accettori di elettroni nelle reazioni alcoldeidrogenasiche, al fine di ossidare il NADH
prodotto in eccesso durante la crescita.
Inoltre, i batteri eterofermentanti, producono una maggiore quantità di CO 2, di etanolo e
di acido acetico, anche a causa dell’utilizzo della via metabolica dalla fosfochetolasi.
Anche la produzione di esteri è da attribuire alla popolazione eterolattica (es.,
etilacetato, isopentilacetato, etilesanoato), proprio perché tale popolazione genera
quantità più significative di etanolo e di acetato, tipici precursori degli esteri (Kaseleht et
al., 2011).
Così come i lieviti, anche i batteri omofermentanti producono il diacetile (2,3butandione; El Gendy et al., 1983; Torner et al., 1992). I batteri eterofermentanti, invece,
non sono in grado di produrre il diacetile, soprattutto per la mancanza della via
metabolica attraverso cui si assiste alla sintesi del diacetile, oltre che per il fatto che il
potenziale redox è così alto, che l’ossidazione dell’acetoino è preclusa.
L’etil-n-propionato, il butilacetato e l’n-pentilacetato, vengono prodotti solo in PM
contenenti anche una qualche specie di lievito (Hansen & Hansen, 1994).
Nelle pagnotte di frumento ottenute dalla fermentazione dei soli lieviti, si riscontrano in
abbondanza l’acetaldeide, l’acetone, l’etilacetato, l’etanolo, l’esanale, l’alcol isobutilico e
72
il propanolo. Nalle PM contenenti solo LAB, si riscontra una minore concentrazione di
alcoli, esteri e composti carbonilici (etanolo, metilpropanolo, 2-3-metilbutanolo,
etilacetato, diacetile; Damiani et al., 1996).
Diversi ceppi di L. sanfranciscensis mostrano un profilo volatile omogeneo che differisce
notevolmente da quello di altre specie eterolattiche (Damiani et al., 1996). In
particolare, tra i principali composti prodotti da L. sanfranciscensis si ritrovano
l’etilacetato (meno che con altre specie), gli alcoli (etanolo, 1-propanolo, 2-metil-1pentanolo, 1 eptanolo, 1-ottanolo), le aldeidi (3-metil-1-butanale, eptanale, trans-2eptanale, ottanale e nonanale), e l’acido acetico (Schieberle & Grosch, 1994). Alcuni di
questi composti tra cui il 3-metil-1-butanale e il nonanale sono considerati degli aromi
molto marcati nei prodotti da forno ottenuti da PMN (Hansen et al., 1989).
Quando L. sanfranciscensis e S. cerevisiae sono associati, è stata osservata una
concentrazione dei prodotti della fermentazione alcolica piuttosto marcata (es., 1propanolo, 2-metil-1-propanolo, e 3-metil-1-butanolo), oltre che quantitativi di
metaboliti batterici più modesti (Gobbetti et al., 1995; Damiani et al., 1996).
Anche le proteolisi (principalmente batteriche) che avvengono durante la fermentazione
sono di fondamentale importanza per la generazione degli aromi e per lo sviluppo delle
caratteristiche sensoriali del pane (Hansen et al., 1989). Numerose indagini descrivono
l’importanza della conversione degli amminoacidi in composti volatili (Zotta et al., 2006;
Smit et al., 2000). La formazione di metaboliti dagli amminoacidi da parte di lieviti e LAB
è strettamente dipendente dal ceppo e dalle specie presenti (Helinck et al., 2004).
La generazione di composti volatili aromatici aumenta quando negli impasti siano
aggiunti amminoacidi (es., l’ornitina, la leucina, la fenilalanina; Gassenmeier &
Schieberle, 1995). Nelle PM, i ceppi proteolitici di LAB possono favorire l’aumento degli
amminoacidi nell’impasto, anche se la principale causa della degradazione proteica nella
PMN è l’attivazione delle proteasi endogene alla farina (dipendente, peraltro, dall’acidit{
dell’impasto; Loponen et al., 2004; Thiele et al., 2004).
Con indagini apposite, è stato dimostrato che la capacit{ di metabolizzare l’arginina da
parte di L. pontis e di L. sanfranciscensis incide significativamente sul sapore del pane
(Thiele et al., 2002; De Angelis et al., 2002). Alcuni LAB, appartenenti al genere
Lactobacillus o Pediococcus, sono inoltre in grado di ridurre il glutine, sia degradandone
i composti allergenici, sia incrementando la concentrazione degli amminoacidi liberi
73
(soprattutto ornitina) nei terreni di coltura liquidi (Gerez et al., 2006). L’ornitina è il
precursore del 2-acetil-l-pirrolidina (Thiele et al., 2002), un importante composto
volatile della crosta, prodotto durante la cottura del pane e responsabile dell’aroma
cosiddetto “roasty” (Schieberle, 1996). L’ornitina può derivare anche dalla biomassa
fungina o dal metabolismo dell’arginina da parte dei LAB attraverso l’uso dell’enzima
arginina deaminasi (ADI; Hammes & Hertel, 2003). La via metabolica ADI contribuisce
all’omeostasi e alla tolleranza dell’acidit{ dei LAB in quanto, mediante tale via, vengono
consumati due protoni (H+; Ròllan et al., 2003).
Il catabolismo della fenilalanina e della leucina sono state analizzate in dettaglio con
ceppi di Lactobacillus sakei e di Lactobacillus plantarum (Larrouture et al., 2000; Groot
& de Bont, 1998); la valina e l’isoleucina sono invece degradate attraverso una via
metabolica del tutto simile. L. plantarum è in grado di produrre la benzaldeide a partire
dalla fenilalanina (Groot & De Bont, 1998).
A partire dalla leucina e dalla fenilalanina, L. sakei e L. plantarum sono in grado di
produrre l’idrossi-isocaproato e il fenil-lattato (L. sakei), oppure il 3-metil-butirrato e il
fenil-acetato (L. plantarum). Sempre a partire da questi due amminoacidi, è stat
riscontrata anche la generazione di piccole concentrazioni di 3-metilbutanolo o 3metilbutanale, oltre che di feniletanolo o fenilacetaldeide. Tali genearazioni sembrano
dipendere dal ceppo batterico impiegato (Larrouture et al., 2000; Groot & de Bont,
1998).
La produzione di benzaldeide a partire dalla fenilalanina è tipica di alcuni ceppi di LAB
(es., L. plantarum, L. helveticus).
Essendo la glutammina l’amminoacido maggiormente presente nelle proteine del
frumento, il suo metabolismo risulta per noi particolarmente interessante. L. reuteri e L.
sanfranciscensis accumulano glutammato a partire dalla glutammina, e molta della
glutammina liberata dalle proteine del glutine durante la fermentazione nella PMN è
convertita quindi in glutammato da L. sanfranciscensis. Alcuni ceppi di LAB hanno la
capacità di deidrogenare il glutammato. Tale enzima catalizza il riciclo del glutammato
ad α-ketoglutarato, con una reazione dipendente dal NAD(P)H. L’ α-ketoglutarato, poi,
agisce come amminoaccettore, nelle reazioni di transaminazione a carico di numerosi
amminoacidi (es., leucina). Per ordine d’importanza, tali reazioni di transamminazione
costituiscono per i LAB un interessante metodo di conversione degli amminoacidi in
composti aromatici, in ordine di importanza secondo solo alle deaminazioni (Tanous et
al., 2002). L’aumento di α-ketoglutarato, incrementa la reazione di transaminazione e
74
quindi la conversione degli amminoacidi (Rijnen et al., 2000). Anche gli alcoli possono
essere formati dalla transaminazione di alcuni amminoacidi, seguita da reazioni di
decarbossilazione e dall’ottenimento di aldeidi, seguito infine dalla loro riduzione ad
alcoli (Schieberle, 1996).
La cistationina liasi (Cxl) è l’enzima-chiave del metabolismo della cisteina e della
metionina. L’attivit{ Cxl di alcuni LAB contribuisce allo sviluppo degli aromi durante la
maturazione del formaggio (Weimer et al., 1999), mentre il possibile ruolo funzionale
del metabolismo della cisteina e della metionina nella PMN rimane ancora da
determinare.
Gli amminoacidi liberi sono i precursori degli isoalcoli (Gobbetti et al., 1995), e
contribuiscono direttamente al sapore del pane durante la fermentazione e la cottura
dell’impasto.
I composti volatili come lo (E,E)-2,4-decadienale e lo (E)-2-nonenale (dal caratteristico
tratto aromatico di-grasso, o fatty note), sono i costituenti aromatici chiave della crosta
del pane (Schieberle, 1996). Queste aldeidi insature, sono generate dall’ossidazione
dell’acido linoleico durante la conservazione della farina, la miscelazione dell’impasto e
la fermentazione microbica. La formazione di perossido di idrogeno (H2O2) da parte di
alcuni LAB e lieviti può aumentare l’ossidazione lipidica, in questo modo aumenta anche
la concentrazione delle aldeidi insature. I LAB eterofermentanti riducono rapidamente
le aldeidi in alcoli. Anche S. cerevisiae è in grado, sebbene più lentamente, di ridurre
alcune aldeidi e il doppio legame tra gli atomi di carbonio delle aldeidi insature
(Vermeulen et al., 2007).
Durante la cottura del pane, l’impasto è sottoposto a elevate temperature, che
favoriscono la reazione di Maillard. Durante queste reazioni chimiche si formano: le
pirazine, i pirroli, i furani, i composti contenenti solfuri e avviene la degradazione dei
lipidi con formazione di alcanali (Parker et al., 2000).
75
2.2. Materiali e Metodi
2.2.1 Materiale chimico e biochimico
2.2.1.1 Ceppi
- Saccharomyces cerevisiae (ceppo DBVPG 6500)
- Lievito di birra commerciale in panetto (Lievital, Lesaffre Italia Spa, Parma).
2.2.1.2 Terreni di coltura
I terreni sono stati sterilizzati in autoclave per 20 min a 121°C; per ottenere terreni
solidi è stato aggiunto agar all’1,8% (15,0-20,0 g/L).
Sigla
terreno
MRS
Nome
Impiego
Composizione (g/L)
Man Rogosa
Sharpe
Recupero
indiscriminato di
tutti i batteri lattici
Peptone 10,0
Sodio acetato x 3H2O 5,0
Estratto lievito 5,0
Citrato diammonico 2,0
Estratto carne 10,0
Soluzione A 5
Tween 80 1
Glucosio 20,0
K2HPO4 2,0
pH 6,6
Triptone 10
Estratto di lievito 5
Glucosio 10
Tween 80 1
Citrato di sodio 5
MgSO4 x 7 H2O 0,80
NaCl 5
MnCl2 x 4 H2O 0,14
FeSO4 x 7 H2O 0,04
K2HPO4 x 3H2O 5
pH 7
Estratto di lievito 10
Peptone 20
Glucosio 20
pH 4,5
APT
All purpose
tween
Idoneo per
l’isolamento di
lattobacilli
(Evans e Niven,
1951)
YPD
acido
Acid Peptone
Dextrose Yeast
Recupero di tutti i
funghi
TABELLA 2.2 I terreni di coltura impiegati per gli isolamenti e le colture (agarizzabili con 15,020,0 g/L).
76
Per ottenere il terreno di coltura mMRS5%SACCagar alla composizione del terreno MRS
abbiamo privato la componente zuccherina e aggiunto il 5% di saccarosio. Tale terreno
di coltura è stato utilizzato per indagare la capacità batterica di produrre EPS.
I terreni mMRS5%FRU e mMRS5%GLU sono stati ottenuti aggiungendo al terreno MRS,
privato della componente zuccherina, il 5% di fruttosio nel primo, o il 5% di glucosio nel
secondo.
2.2.1.3 Tipologia di farina
La farina di frumento 00, utilizzata per ottenere gli impasti-modello, proviene dal Mulino
Bianchi, Osimo.
2.2.1.4 Enzimi
I principali enzimi utilizzati sono riassunti nella seguente tabella.
Enzimi
Ditta fornitrice
Taq polimerasi
Proteinasi K
Invitrogen/Sigma
Quiagen
Quiagen
Fermentas
Fermentas
Fermentas
RNAsi
Hae III
Hinf I
Cfo I
2.2.2 Metodi colturali fisiologici e biochimici
I batteri sono stati coltivati in o su mMRS e APT a una temperature di 30°C; i lieviti in o
su YPD a una temperatura variabile da 25 a 30°C.
2.2.2.1 Crescita su piastra
La crescita su piastra è stata utilizzata per gli isolamenti microbici, per ottenere coloniepure di ogni isolato, per effettuare i test fisiologici di selezione. Nel caso dei batteri, le
piastre sono state anche inserite in giare per simulare le condizioni di anaerobiosi o
meglio microaerobiosi dell’ambiente PMN.
2.2.2.2 Crescita in liquido
La crescita in terreno liquido è stata utilizzata per effettuare delle precolture dei ceppi.
Le precolture sono state effettuate inoculando 1-2 colonie della coltura pura in 10 ml di
terreno. Il tubo contenente il terreno inoculato è stato posto in stufa a incubare a 30°C
77
(12-18 h) per la notte. Non è stata necessaria l’agitazione orbitale, dato che si tratta di
microrganismi capaci di crescere anche in assenza o in presenza di piccole quantità di
ossigeno (microaerobi).
2.2.2.3 Test fisiologici

Produzione di EPS
I batteri identificati sono stati strisciati su terreno di coltura mMRS5%SACC-agar, le
piastre sono state poste a incubare a 30°C per 4-5 giorni. La capacità di produrre
esopolisaccaridi è stata valutata attraverso controllo visivo (slimy= viscido) e con l`uso
di stecchini sterili (ropy=filante). I batteri positivi al fenotipo filante (ropy) sono stati
successivamente strisciati sui terreni mMRS5%FRU e mMRS5%GLU.
2.2.3 Metodi di osservazione cellulare
Le cellule dei batteri e dei lieviti isolati sono state periodicamente osservate al
microscopio ottico con obiettivo 40x (o 100x a immersione). Lo strumento usato è un
microscopio Wild Leitz GMBH-Biomed.
2.2.4 Metodi per valutare alcuni parametri tecnologici della pasta madre
2.2.4.1 Test di lievitazione
La capacità lievitante dei campioni è stata valutata inserendo 40gr di campione appena
rinfrescato in un cilindro graduato, precedentemente sterilizzato in autoclave, e
osservando ogni ora la variazione di volume dell’impasto.
2.2.4.2 Analisi del pH
La capacità acidificante dei campioni è stata valutata monitorando il pH utilizzando la
sonda del pHmetro digitale Crison, pH-meter Basic 20, in 10 gr di campione (PM)
disciolto in 90 ml di acqua deionizzata.
2.2.5 Collezione dei campioni di pasta madre
I campioni di PMT utilizzati in questo studio, sono stati collezionati da diversi panifici
artigianali, ristoranti, agriturismi e privati; si tratta di campioni di PM naturali, ai quali
non è mai stato aggiunto lievito di birra commerciale o alcuno starter liofilizzato.
78
2.2.6 Identificazione microbica
La popolazione microbica presente in qualsiasi campione può essere determinata
attraverso diverse procedure analitiche. I metodi possono essere distinti in due tipologie
a seconda del modo in cui si procede:

Con l’uso del DNA totale estratto dal campione (Independent culture approach):
tecnica molecolare che prevede l’amplificazione di una porzione del DNA totale
estratto da una matrice. Il DNA amplificato viene poi analizzato con l’uso di
metodologie che permettono la discriminazione dei frammenti di DNA diversi,
per cui appartenenti a specie diverse.

A partire dalle colture pure degli isolati (Dependent culture approach): questa
tecnica prevede l’isolamento microbico e la successiva identificazione dei singoli
isolati purificati. Le identificazioni possono essere effettuate attraverso metodi
fenotipici o genotipici.
2.2.6.1 Partendo dal DNA totale estratto dai campioni –DGGE
Le analisi DGGE prevedono numerose fasi che sono riassunte nel seguente schema:
2.2.6.1.1 Estrazione del DNA totale
Inizialmente, il DNA totale dei campioni di PM è stato estratto utilizzando il metodo
Promega Wizard magnetic DNA purification System for food (200 prep), tale metodo
sembra non essere idoneo per la caratteristica viscosit{ dell’impasto acqua farina.
Abbiamo quindi deciso di utilizzare il kit “QIAamp DNA Stool Mini” per cui, 250mg di
79
ogni campione di PMT congelato sono stati sottoposti a estrazione del DNA utilizzando la
procedura descritta nel kit.
2.2.6.1.2Amplificazione del DNA
Sono stati utilizzati primer specifici per la popolazione batterica (Lac1 e Lac2 *; Hda1* e
Hda2), e altri per la popolazione fungina (U1 * e U2; Liev-f* e Liev-r), le caratteristiche di
tali primer sono riassunte nella seguente tabella.
Primer
1
2
Hda1
GC
Hda2
Posizione
339  369
539  547
Lac1
GC
Lac2
GC
353
651
Lunghezza
Prodotto
PCR
Target
16S
V2-V3
208bp
16S
V3-V4
28S
Riferimento
bibliografico
Applicazione
Batteri
Walter et al.
(2000)
Tratto digestivo di polli
340bp
LAB
Walter et al.
(2001)
260bp
Lieviti
Pasta madre
403  422
U1
3
U2
Sandhu, et
al. (1995)
Fluidi corporei
645  662
GC
4
Regione
Liev-f
Liev-r
346
544
26S
dominio D2
214bp
Lieviti
Gatto &
Torriani
(2001)
Pasta madre
I vari componenti della miscela di reazione sono stati utilizzati alle seguenti
concentrazioni:
Componenti
Taq polimerasi
tampone di reazione
MgCl2
dNTPs
GC
Hda1
Hda2
Lac1
GC
Lac2
GC
U1
U2
Lievr
GC
Lievf
DNA tot. estratto
*
Concentrazione
finale (1)
Concentrazione
finale (2)
Concentrazione
finale (3)
Concentrazione
finale (4)
1,25U
1x
2,5 mM
200 µM
1 μM
1 μM
1,25U
1x
2,5 mM
200 µM
1,25U
1x
1,6 mM
200 µM
1,25U
1x
1,5 mM
200 µM
1,25 μM
1,25 μM
0,5 μM
0,5 μM
0,5 μM
0,5 μM
3 µl
GC clump= catena di guanine e citosine
3 µl
2 µl
2 µl
80
Condizioni di amplificazione:
Cicli di amplificazione
(1) Hda
(2) Lac
1X
Predenaturazione
Denaturazione
40 X Annealing
Estensione
1 X Estensione finale
1 X Raffreddamento
94°C
94°C
58°C
68°C
68°C
4°C
4 min
30 sec
30sec
30 sec
7 min
∞
94°C
94°C
61°C
72°C
72°C
4°C
5 min
30 sec
1 min
1 min
7 min
∞
(3) U
94°C
94°C
60°C
72°C
72°C
4°C
4 min
30 sec
1 min
30 sec
7 min
∞
(4) Liev
94°C
94°C
51°C
72°C
72°C
4°C
5 min
20 sec
30 sec
40 sec
7 min
∞
2.2.6.1.3 Analisi DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
Le condizioni impiegate per l’analisi su gel elettroforetico denaturante sono riassunte
nella seguente tabella.
(1) Hda
(2) Lac
(3) U
(4) Liev
Gradiente Urea-formammide 40-60% 40-55% 40-60% 40-60%
18h
18h
18h
18h
Tempo
60°C
60°C
60°C
60°C
Temperatura
80 Volt 80 Volt 80 Volt 80 Volt
Voltaggio
Dopo la corsa elettroforetica nel gel denaturante, abbiamo colorato il gel con l’utilizzo
del sibr green, quindi abbiamo osservato le bande e abbiamo scelto le più significative.
Gli ampliconi delle bande scelte sono stati eluiti, riamplificati con gli stessi primer e le
stesse condizioni di amplificazione. Dopo aver quantificato il DNA ottenuto, i campioni
opportunatamente preparati sono stati inviati per il sequenziamento. Le sequenze
ottenute sono state, poi, comparate con la banca dati per l’identificazione.
2.2.6.2 A partire dalle colture pure degli isolati
2.2.6.2.1 Isolamenti
L’isolamento dei lieviti e dei batteri consta di una serie di fasi. La prima fase consiste
nelle diluizioni seriali (figura 2.7) del campione da effettuare in una soluzione salepeptone (0,85% NaCl e 0,1% di peptone in acqua distillata) al fine di recuperare anche
eventuali cellule osmosensibili.
81
FIGURA 2.8 Diluizioni seriali per preparare gli isolamenti.
Le diluizioni normalmente scelte sono la diluizione 10-5 e la 10-6 per i lieviti (su YPD
acido), mentre la -7 e la -8 per i batteri (su MRS e APT). Per ogni diluizione sono state
seminate 2 o 3 piastre al fine di calcolare il n° di cellule con un risultato più attendibile. Il
metodo di semina utilizzato è la distribuzione superficiale dell’inoculo su substrato
solido (Spread plate-100µl).
Le piastre sono incubate a 28-30°C fino alla comparsa delle colonie che vengono contate
in modo da risalire al n° di cellule di lieviti e di batteri presenti nel campione.
Le colonie che presentano diversità osservabili a occhio nudo vengono strisciate su
nuovi terreni. Le colonie isolate sono osservate al microscopio ottico per valutarne
differenze in forma e grandezza delle cellule. Ogni isolato purificato è stato classificato
con una sigla e un numero progressivo, la sigla indica l’appartenenza a un determinato
campione di PMT. Tutti i ceppi dei batteri e dei lieviti li abbiamo conservato a - 80°C in
una soluzione crioconservante (glicerolo+terreno di coltura liquido).
2.2.6.2.2 Estrazione del DNA
Abbiamo utilizzato diverse metodologie per estrarre il DNA dalle cellule fungine e
batteriche isolate.

Estrazione da colonia: si risospende una puntina di cellule provenienti da piastra
(coltura fresca di massimo 2-3gg) in 30 µl di microlysis buffer (labogen).
L’estrazione viene effettuata con l’utilizzo del termociclatore impostato con il
seguente ciclo:
65°C
5min
96°C
2 min
65°C
4min
96°C
1 min
96°C
65°C 30 sec
1min
2 cicli
20 °C
7min
4°C
∞
82

Estrazione da colture liquide di lieviti e di batteri: eseguita seguendo il protocollo
del kit DNeasy Blood & Tissue, in Canada ho utilizzanto l`estrattore automatico di
DNA (automated extractor machine QIAcube-figura).
FIGURA 2.9 QIAcube (230 V), apparecchio automatico in grado di estrarre il DNA da 12
campioni per volta ( http://www.qiagen.com).
2.2.6.2.3
Analisi RAPD- Random Amplification of Polymorphic DNA
Il primer utilizzato è M13: 5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’ (Huey & Hall, 1989)
Le reazioni di amplificazione, a partire dal DNA estratto dai singoli ceppi isolati, sono
state condotte in un volume finale di 25 μl. I vari componenti della miscela di reazione
sono stati utilizzati alle seguenti concentrazioni:
Componenti
Concentrazione finale
Taq polimerasi
tampone di reazione
MgCl2
DNTPs
primer M13
templato
1U
1x
3,5 mM
200 µM
1 μM
3 µl
Il protocollo termico utilizzato è riportato di seguito:
Ciclo di amplificazione
1X
40 X
1X
1X
Predenaturazione
Denaturazione
Annealing
Estensione
Estensione finale
Raffreddamento
94°C
94°C
45°C
72°C
72°C
4°C
5 min
1 min
20 sec
2 min
7 min
∞
83
I risultati sono stati visualizzati attraverso corsa elettroforetica su gel di agarosio (2,5%
agarosio in TrisAcetatoEDTA, colorazione con Etidio Bromuro o Sibr Green); la
dimensione dei frammenti amplificati è stata stimata utilizzando marker di peso
molecolare (ladder 1Kbplus, Roche).
2.2.6.2.4 Amplificazione del 16S batterico
Sequenze dei primer:
Primer
Regione
P0
P6
Posizione
Lunghezza
Prodotto
PCR
Target
27f
1468bp
batteri
16S
1495r
Lunghezza
Sequenza (5'-3')
21 bp
GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG
20 bp
CTACGGCTACCTTGTTACGA
Riferimento
bibliografico
Di Cello et
al., 1999
Le reazioni di amplificazione sono state condotte in un volume finale di 25 μl. I vari
componenti della miscela di reazione sono stati utilizzati alle seguenti concentrazioni:
Componenti
Concentrazione finale
Taq polimerasi
tampone di reazione
MgCl2
dNTPs
primer P0
primer P6
templato
1U
1x
2.5 mM
200 µM
0.4 µM
0.4 µM
2 µl
Protocollo di amplificazione:
Ciclo di amplificazione
1X
35 X
1X
1X
Predenaturazione
Denaturazione
Annealing
Estensione
Estensione finale
Raffreddamento
94°C
94°C
58°C
72°C
72°C
4°C
4 min
30 sec
30 sec
2 min
7 min
∞
I risultati sono stati visualizzati attraverso corsa elettroforetica su gel di agarosio (1%
agarosio in TrisAcetatoEDTA, colorazione con Etidio Bromuro); la dimensione dei
frammenti amplificati è stata stimata utilizzando marker di peso molecolare (ladder
1Kbplus, Roche).
84
2.2.6.2.5 Lieviti: analisi RFLP della regione ITS
L’analisi RFLP consta di due importanti fasi: l’amplificazione della regione ITS2 e la
restrizione enzimatica.

Amplificazione della regione ITS2:
I primer utilizzati sono riportati di seguito:
Primer
ITS1
ITS4
Regione
ITS1ITS1ITS2
5SITS2
Target
funghi
Lunghezza
Prodotto PCR
variabile
Lunghezza
Sequenza (5'-3')
Riferimento
bibliografico
19 bp
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
20 bp
TCCTCCGCTTATTGATATGC
White T.J.
et al.,1990
L’amplificazione della regione ITS2 è stata effettuata in un volume finale di 100 µl.
I vari componenti della miscela di reazione sono stati utilizzati alle seguenti
concentrazioni finali:
Componenti
Concentrazione finale
Taq polimerasi
tampone di reazione
MgCl2
dNTPs
primer ITS1
primer ITS4
templato
1U
1X
1,5 Mm
200 µM
0,5 µM
0,5 µM
5 µl
Al termine dell’amplificazione si è osservato il risultato dopo elettroforesi in gel di
agarosio all’1%. La dimensione delle bande viene stimata attraverso comparazione con
un marker (100bp DNA ladder GeneRulerTM).
Il protocollo termico utilizzato per amplificare la regione ITS2 è riportato nella seguente
tabella:
Ciclo di amplificazione
1X
35 X
1X
1X
Predenaturazione
Denaturazione
Appaiamento
Estensione
Estensione finale
Raffreddamento
95°C
94°C
55,5°C
72°C
72°C
4°C
5 min
1 min
2 min
2 min
10 min
∞
85

Restrizione dell’amplificato ITS2:
La digestione viene effettuato su 10 µl di amplificato (o approssimativamente 0,5-1,0 µg)
con i seguenti enzimi di restrizione: CfoI; HaeIII; Hinf I e i relativi buffer (Roche
Diagnostics).
Enzima 5U/reazione; Buffer 1x volume finale 30 µl. La digestione è stata ottenuta
attraverso l`incubazione in termostato a 37°C per circa 1 ora. I frammenti prodotti sono
stati separati in gel di agarosio al 2,5%. Dopo elettroforesi il gel viene visualizzato e
fotografato. La dimensione delle bande viene stimata attraverso comparazione con un
marker (50 bp DNA ladder, GeneRuler
TM).
In ciascun pozzetto è stato caricato l’intero
volume della reazione.
2.2.6.2.6 Amplificazione del DNA fungino impiegando i primer P1-P2
I primer utilizzati sono riportati di seguito:
Primer
P1
P2
Regione
28SrRNA
fungino
Posizione
Target
Lunghezza
Prodotto
PCR
funghi
799 bp
45-64
825-843
Lunghezza
20 bp
19 bp
Sequenza (5'-3')
ATCAATAAGCGGAGGAAAAG
CTCTGGCTTCACCCTATTC
Riferimento
bibliografico
Sandhu.
et al.,1995
L’amplificazione del 28SrRNA è stata effettuata in un volume finale di 25 µl.
I vari componenti della miscela di reazione sono stati utilizzati alle seguenti
concentrazioni finali:
Componenti
Concentrazione finale
Taq polimerasi
tampone di reazione
MgCl2
dNTPs
primer ITS1
primer ITS4
templato
1U
1X
1.5mM
0.2mM
0,4µM
0,4µM
1 µl
86
Il protocollo termico di amplificazione è indicato nella tabella seguente.
1X
50 X
1X
1X
Ciclo di amplificazione
94°C
Predenaturazione
94°C
Denaturazione
50°C
Appaiamento
72°C
Estensione
72°C
Estensione finale
4°C
Raffreddamento
5 min
30 sec
1 min
2 min
7 min
∞
Al termine dell’amplificazione si è osservato il risultato dopo elettroforesi in gel di
agarosio all’1%. La dimensione delle bande viene stimata attraverso comparazione con
un marker (1kp plus DNA ladder GeneRulerTM).
2.2.6.2.7 Purificazione del DNA amplificato
I prodotti di amplificazione necessitano di essere purificati prima di essere sottoposti a
sequenziamento in modo tale da eliminare completamente i primer non incorporati e gli
altri reagenti che interferirebbero con le successive reazioni. La purificazione è stata
realizzata seguendo il protocollo del kit “High Pure PCR Product Purification” (QIAGEN)
Il DNA purificato così ottenuto può essere conservato a -20°C.
2.2.6.2.8 Analisi quantitativa del DNA
La quantità di acido nucleico in soluzione è stata determinata attraverso due metodi:

il confronto dell’intensit{ della fluorescenza emessa dall’etidio bromuro dopo
elettroforesi su gel di agarosio con un marker (MassRuler)

l’uso del nanodrop, che analizzando solo 1-2μl di amplificato è in grado di
calcolare la concentrazione del DNA presente nel campione.
2.2.6.2.9 Preparazione dei campioni per il sequenziamento e analisi delle sequenze
La quantità di DNA necessaria per il sequenziamento varia in base al numero di paia di
basi (pb) del frammento amplificato e a seconda della ditta che viene scelta per tale
servizio (es., MWG-Biotech Milano).
I risultati del sequenziamento sono stati controllati manualmente sui cromatogrammi di
sequenza mediante il programma BioEdit e sono state comparate con le sequenze
presenti nelle banche
dati attraverso i principali software disponibili su internet
(http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
87
2.2.7 Analisi dei componenti volatili
2.2.7.1 Preparazione dei campioni
I campioni sono stati rinfrescati utilizzando farina 00 e DY pari a 180. 1gr del campione
lasciato fermentare per 24 h a temperatura ambiente è stato posto all’interno di una
fialetta di vetro apposita (vial da 5 ml) munita di tappo di gomma perforabile. Due
impasti modello sono stati ottenuti utilizzando cellule del ceppo S. cerevisiae isolato nel
campione di PMT UPR e un panetto di lievito di birra sono stati utilizzati come confronto.
2.2.7.2 Analisi gascromatografica dello spazio di testa (HS-SPME -GC-MS)
Abbiamo utilizzato il gas cromatografo HP-Hewlett Packard G1800 GCD, System Series II
dell’Istituto Tecnico Industriale “E. Fermi”, utilizzando la colonna HP-5MS (30m x 0.25
mm I. D. x 0.25 µm -Hewlett-Packard).
La fibra HS–SPME (Supelco Company -Bellefonte, PA) usata per l’estrazione dei composti
volatili
è
composta
da
divinylbenzene/
carboxen/
polydimethylsiloxane
(DVB/CAR/PDMS) 50/30 μm. La fibra DVB/CAR/PDMS è stata esposta allo spazio di
testa di ogni campione a 30°C per 2 h. All’estrazione segue l’iniezione, sottoponendo la
fibra a desorbimento nel GC. Il gas carrier utilizzato è l’elio con flusso costante di 1
ml/min. L’identificazione dei composti è basata sulla comparazione attraverso un
software con banche dati (NIST 1998).
In assenza dello standard commerciale è necessario l’identit{ dello spettro almeno del
95% (Kumar et al., 2011).
88
2.3. Risultati
2.3.1. La collezione
Scopo di questa parte del lavoro è stato l’assemblamento di una collezione di paste
madri naturali provenienti dalla regione Marche, ed eventualmente dalle regioni
limitrofe.
Tali paste ci avrebbero consentito innanzitutto di condurre studi microbiologici,
generali e tecnologici su ingredienti tradizionali così importanti per la preparazione di
pane secondo i dettami della tradizione. Inoltre, la creazione di questa teca avrebbe
consentito, in futuro, di disporre di materiali tradizionali e unici per condurre indagini
microbiologiche di natura diversa.
La collezione comprende oggi 41 campioni di PMT è impiegata artigianalmente o per usi
familiari. Tutti questi campioni sono stati ottenuti rigorosamente senza l’aggiunta di
lieviti o batteri industriali.
89
Dopo un’accurata ricerca telefonica, ci siamo recati presso i diversi titolari e abbiamo
raccolto ciascun campione appena rinfrescato. Inoltre, abbiamo chiesto a ciascun titolare
di compilare un nostro piccolo questionario volto all’ottenimento di informazioni
necessarie alla schedatura dei campioni.
Eccettuate 2 PM umbre, le altre sono tutte di origine marchigiana (figura 2.10). Ciascun
campione, staccato con guanti sterili a partire da un impasto messoci a disposizione dai
diversi titolari, è stato portato nei nostri laboratori e propagato-conservato come
indicato (cfr. § 2.2.5).
Questi 41 campioni, provenienti da panifici artigianali (71%), agriturismi (15%),
pasticcerie (2%) e privati (12%), proviene per il 49% dalla provincia di Macerata, per il
27% dalla provincia di Ancona e per il resto dalle rimanenti province delle Marche e dai
comuni Umbri limitrofi (figura 2.10).
FIGURA 2.10 (a) Origine dei campioni (in %), (b) n° dei campioni, suddivisi sulla base della
provincia di origine.
Ogni campione è stato etichettato utilizzando una sigla univoca, che fa riferimento alla
sua origine (tabella 2.3).
90
Campioni di paste madri
n° sigla
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
VA
MA
PeL
Mont
M
VM
FA
PP
CFA
CFB
GF
GFR
AC
PA
CVP
L
C
NSP
G
LBP
AM
LM
FLM
PM
AS
SP
UPR
AA
LA
SGL
AV
MPR
LF
T
VB
BP
CA
CP
LR1
LR2
EC
Proprietario
Tipologia
luogo
Impasto di privati Filottrano
"Il Moro degli Alpaca"
"Pane e Luna"
"Forno di campagna"
"Il magia"
"Panificio Valentini"
Francesca Ancona
"Pistori"
"Il Certello" A [= liquido]
"Il Certello" B
"Gran Forno"
Gran forno rinfrescato con farina 0
Agriturismo coroncina
Panificio artigianale
C'era una volta il pane
Lattanzi
Corallini
Non solo pane
Giansanti
La bottega del pane
Moretti
La Marca
Forno a legna la macina
Moresco
Forno Antichi sapori
Sordini Paolo
Punto macrobiotico Porto Recanati
Privato
Leonardi Antonella
Sapori del Grano L
Alfredo Vantaggi
Montarice
Luciani
Tamburrini
Venenzangeli Bruno
Bellardinelli Paolo
Istituto Alberghiero
Casa del pane
Romagnoli
Romagnoli
Privato
Privato
Agriturismo
Panificio
Panificio
Agriturismo
Panificio
Privato
Panificio
Panificio
Panificio
Pasticceria
Panificio
Agriturismo
Panificio
Panificio
Panificio
Panificio
Panificio
Panificio
Panificio
Agriturismo
Agriturismo
Panificio
Panificio
Panificio
Panificio
Ristorante
Privato
Panificio
Panificio
Panificio
Panificio
Panificio
Panificio
Panificio
Panificio
Privato
Panificio
Panificio
Panificio
Privato
Filottrano (AN)
Filottrano (AN)
Montelupone (AN)
Montelupone (AN)
Civitanova Alta (MC)
Macerata
Ancona
Pesaro
Frontino (PU)
Frontino (PU)
Altidona (FM)
Altidona (FM)
Belforte (MC)
Agugliano (AN)
S. Severino Marche (MC)
Civitanova Marche (MC)
Civitanova Marche (MC)
Ancona
Ancona
Porto Recanati (MC)
Macerata
Camerino (MC)
Pollenza (MC)
Moresco (FM)
Serravalle del Chienti (MC)
Camerino (MC)
Porto Recanati (MC)
Ancona
Montebibico (Spoleto)
Ancona
Strettura (PG)
Porto Recanati (MC)
Fermo
Macerata
Macerata
Ancona
Ancona
Fermo
Villa potenza MC
Villa potenza MC
Tutta italia
TABELLA 2.3 Lista delle PM N collezionate.
91
2.3.2. Parametri fisico chimico tecnologici
La lievitazione e l’acidificazione dell’impasto sono aspetti tecnologici indispensabili per
ottenere un prodotto da forno a partire da PMT.
Il monitoraggio del pH e della lievitazione per 10 h a 30 °C (cfr. § 2.2.4) ha confermato
che, durante la fermentazione dell’impasto, all’aumentare del volume si riscontra un
aumento dell’acidit{, probabilmente generata dal metabolismo lattico. La variazione di
questi parametri nel tempo è diversa per ogni campione (figura 2.11 e appendice II).
Analizzando allo stesso modo un campione ottenuto con la sola aggiunta di lievito di
birra si osserva un rapido aumento di volume, che in 3 h raddoppia, mentre il pH rimane
per lo più costante a un valore di circa 5,5 (figura 2.11).
92
FIGURA 2.11Evoluzione del volume (∎) e del pH(⧫) nel tempo (8h) in 5 campioni, e nel
controllo LdB.
Portando l’attenzione ai valori riscontrati dopo 8 h di lievitazione, è possibile
suddividere i campioni in 5 gruppi differenti (figura 2.12). Per quanto riguarda la
capacità lievitante, la maggior parte dei campioni è in grado di raggiungere il raddoppio
di volume; tra questi, alcuni campioni raggiungono variazioni di pH maggiori di 1,
mentre altri non superano il delta di 0,6.
FIGURA 2.12 Mettendo in relazione i campioni sulla base dei valori di ∆-pH e ∆-volume
dopo 8 h di fermentazione è possibile suddividerli in 5 gruppi diversi. Il valore ∆-volume =
40ml rappresenta il momento in cui – nei nostri esperimenti - la pasta ha raddoppiato il
proprio volume.
2.3.3. DGGE
Uno degli obbiettivi di questa fase ha riguardato l’individuazione e il confronto delle
popolazioni microbiche presenti nei vari campioni.
Uno dei metodi impiegati ricorre ad analisi elettroforetiche denaturanti (DGGE,
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), già ampiamente utilizzate per le PM (Van der
Meulen, et al., 2007; Minervini et al., 2010; Garofalo et al., 2008). Tali procedure
consentono di avere un’idea del numero di specie microbiche presenti in una data PM, e
di confrontare le popolazioni di campioni diversi, senza la necessità di effettuare
isolamenti, poiché si opera sul DNA totale del campione.
Dopo l’estrazione del DNA dal campione di PMT congelato (cfr. § 2.2.6.1), è stato
necessario effettuare l’amplificazione del DNA (PCR; figura 2.13), e solo dopo la
conferma dell’avvenuta amplificazione, è stato possibile procedere con migrazioni
elettroforetiche in gel con gradiente - denaturante (DGGE; figura 2.14). E’ cruciale, per
tali esperimenti, la scelta della porzione di DNA da amplificare. Sulla base di quanto
appreso da altri esperimenti analoghi, abbiamo deciso di scegliere due porzioni diverse
di DNA per i batteri (amplificate con l’ausilio dei primer Hda1/Hda2 e Lac1/Lac2) e due
per i lieviti (amplificate con l’ausilio dei primer U1/U2 e Liev-r/Liev-f).
Dopo un analisi-preliminare DGGE (effettuata su un numero ristretto di campioni; figura
2.14), abbiamo scelto di operare come segue: (1) nel caso della popolazione batterica i
primer Lac1/Lac2 (LAB; Walter et al., 2001), nel caso della popolazione fungina i primer
93
LievR/LievF (Gatto & Torriani, 2001; cfr. § 2.2.6.1.2); la selezione di queste coppie
oligonucleotidiche, è stata determinata dal fatto che esse hanno dato origine a gel DGGE
meglio definiti (cioè, con migliore separazione delle bande; figura 2.14).
(a)
(b)
(c)
(d)
FIGURA 2.13 Gel d’agarosio preparative alla DGGE. Ampliconi 16S o 28S dal DNA delle
nostre PM N : (a) primer Hda1/Hda2; in (b) Liev-r/Liev-f; in (c) Lac1/Lac2; in(d) U1/U2.
Sono riportati solo alcuni esempi.
(a)
(b)
(c)
(d)
FIGURA 2.14 DGGE. Analisi preliminari volte all’individuazione delle coppia di primer più
adatte. (a)Lac1/Lac2; (b) Hda1/Hda2; (c) LievF/LievR; (d) U1/U2.
Nel gel DGGE dei lieviti, e coi metodi descritti (cfr § 2.2.6.1.2), abbiamo individuato la
presenza di S. cerevisiae (presente in tutti i campioni analizzati) e C. umilis (presente in
soli 12 campioni).
94
Rispetto alla popolazione fungina, quella lattica presenta un più ampio numero di bande,
per cui – presumibilmente – una più elevata diversità di specie.
Infine, per la popolazione lattica, abbiamo scelto di identificare 34 bande, presenti ad
altezze differenti nel gel. Nella figura 2.15 riportiamo un esempio di gel DGGE
(amplificato utilizzando i primer ribosomiali Lac1 e Lac2): le bande cerchiate sono state
scelte e identificate (cfr. § 2.2.6.1.3). Dai risultati ottenuti possiamo affermare che, anche
bande che si trovino ad altezze differenti, possono talvolta far riferimento alla stessa
specie. Questo è, purtroppo, uno dei limiti di questa tecnica, e la spiegazione è dovuta al
fatto che alcuni ceppi sono dotati di più operoni per l’rDNA (Nubel et al., 1997): per tale
ragione due o più ampliconi (“bande”) possono avere sequenze differenti anche se
appartenenti alla stessa specie.
95
FIGURA 2.15 Gel di DGGE. I cerchi colorati evidenziano le bande scelte per le
identificazioni (stesso colore = stessa specie).
I risultati ottenuti attraverso le analisi DGGE, possono essere schematizzati anche dai
grafici che seguono. Sulla base del numero di bande (corrispondenti a specie diverse)
presente in ogni campione, possiamo affermare che, in media vi siano circa 5-6 specie
lattiche diverse, con un massimo di 14 e un minimo di 2 (figura 2.16).
FIGURA 2.16 Numero di specie lattiche nei vari campioni.
Il LAB maggiormente presente nei campioni è L. sanfranciscensis, ma è interessante
notare che sono presenti specie appartenenti a diversi generi del gruppo - LAB
(Weissella, Leuconostoc, Lactobacillus, Pediococcus).
96
FIGURA 2.17 Frequenza delle specie lattiche nei campioni analizzati (identificazione
mediante sequenziamento ampliconi da DGGE) .
2.3.4. Identificazioni molecolare
E’ stato anche possibile individuare e identificare i ceppi delle nostre PM, anche
utilizzando metodi tradizionali: esso necessita di isolare alcune colonie pure, e di
identificarle mediante coltivazione e applicazione di test fenotipici (nutrizionali,
biochimici, ecc.).
Infine, dopo l’estrazione del DNA dai ceppi desiderati, è stato possibile amplificare, e poi
sequenziare, gli ampliconi del 16S (batteri) o del 28S (lieviti), che come impronte
digitali, consentono di identificare senza ambiguità qualsiasi specie vivente del nostro
Pianeta.
2.3.4.1 Isolamenti (Isolamento di batteri acetici) e conte microbiche
Dagli isolamenti effettuati, abbiamo osservato la presenza di batteri e di lieviti, e in tutti i
casi di un più alto numero batterico (mediamente 100 volte maggiore di quello dei
lieviti), tale dato è in accordo con quanto già largamente riportato in letteratura: infatti,
il rapporto tra lieviti e batteri della PMN si aggira in generale tra 1:50 e 1:100 (Lönner &
Ahrné, 1995). Le conte batteriche si aggirano tra 1x10 6 e 1x1010 UFC/gr, mentre quelle
dei lieviti tra 1x105 e 1x107 UFC/gr (tabella 2.2). In media si osserva anche un maggior
numero di colonie visibilmente differenti nella popolazione batterica (in media 3-4
colonie).
(a) batteri
terreno di
coltura
APT e
mMRS
(b) lieviti
conte (UFC/gr)
min
max
1x106
1x1010
numero di
colonie
diverse
media
1,6x109
3/4
terreno
di coltura
YPD ac.
conte (UFC/gr)
min
max
media
1x105 1,6x107 1x107
numero di
colonie diverse
2
TABELLA 2.4 (a) Conte batteriche su APT e su mMRS. (b) Conte fungine su YPDac.
(UFC/gr).
Ogni ceppo isolato è stato contraddistinto dalla sigla della PM seguita da un numero
progressivo (es., campione PeL; gli isolati sono = PeL1, PeL2 ecc.).
2.3.4.2 Tipizzazione attraverso RAPD
Utilizzando un primer - universale abbiamo poi amplificato il DNA genomico degli isolati
fungini e batterici (ca. 250), e individuato, dopo una corsa elettroforetica, i ceppi aventi
profili RAPD differenti.
97
Nella figura 2.18, si possono osservare alcuni esempi di profili RAPD di batteri e di
lieviti: sulla base del numero di bande, e della loro diversa capacità migratoria, abbiamo
individuato i ceppi diversi, che sono stati scelti per le fasi successive necessarie
all’identificazione molecolare (cfr. § 2.2.6.2.3). E’ interessante notare che il primer
utilizzato (M13) è in grado di operare correttamente con DNA genomico batterico e
fungino.
FIGURA 2.18 Tipizzazione RAPD: (1) batterica e (2) fungina. Profili elettroforetici diversi
= ceppi diversi.
2.3.4.3 Identificazioni molecolari mediante amplificazioni di regioni ribosomiali
Per oltre 100 ceppi batterici e 25 fungini, abbiamo sottoposto ad amplificazione la
porzione di DNA ribosomiale 16S (o 28S), adatta ad attribuire ciascun ceppo all’una o
all’altra specie microbica.
Nel caso dei lieviti, inizialmente abbiamo usato la tecnica RFLP dell’ITS (cfr. § 2.2.6.2.5;
figura 2.19). Tuttavia, questa tecnica è abbastanza laboriosa e non sempre permette di
giungere all’identificazione della specie. Abbiamo quindi deciso di utilizzare il metodo di
sequenziamento, considerandolo più rapido, più economico e dai risultato non ambigui.
98
FIGURA 2.19 Analisi RFLP di 3 ceppi di lievito sconosciuti e di uno conosciuto ( S.
cerevisiae, controllo positivo). La comparazione dei profili fa desumere che i ceppi MA e A
appartengano a una medesima specie e siano identici al controllo. Dati i profili di
restrizione differenti di B, si desume invece che esso appartenga a una specie differente .
Nel caso dei batteri è stato amplificato quasi interamente il 16 S (cfr. § 2.2.6.2.4), nel
caso dei lieviti è stata scelta una porzione del 28 S, in entrambi i casi si tratta di porzioni
di DNA in cui sono presenti regioni che variano al variare della specie, per cui
conoscendone la sequenza nucleotidica è possibile risalire alla specie.
Nella figura 2.20 si possono osservare foto di gel d’agarosio per la conferma
dell’avvenuta amplificazione del frammento interessato, nel caso dei batteri la lunghezza
è di 1468bp, nel caso dei lieviti di 799bp.
(a)
(b)
FIGURA 2.20 Gel d’agarosio illustranti alcuni ampliconi derivanti da (a) 16S amplificato
coi primer p0/p6, o da (b) 28S ottenuto coi primer P1/P2.
99
PMT
1-LA
2-BP
3-CA
4-LF
5-MA
6-UPR
7-FC
9-AM
10-FA
11-AA
12-LR1
13-PP
14-M
15-CFA
16-PV
17-LBP
18-AS
19-PA
ceppo isolato
LA1
LA2
BP2
BP5
CA1
CA4
CA7
CA3
LF3
LF1
MAXIII
MAXXVIII
UPRA
UPRF
FC6
FC2
FC1
AM1
AM2
FA9
FA5
AA4
AA3
AA1
LR21
LR15
LR11
LR12
PP1
PP4
PP6
M7
M2
CFA2
CFA10
CFA4
CFA1
PV7
PV2
PV3
LBP3
LBP2
AS5
AS3
AS2
AS7
AS1
PA13
PA6
PA12
PA7
PA2
Identificazione
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
Pediococcus pentosaceus
Lactobacillus brevis
Lactobacillus rossiae
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
P. pentosaceus
L. brevis
Lactobacillus spicheri
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
P. pentosaceus
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
Lactobacillus sanfranciscensis
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
Acetobacter cerevisiae
Pediococcus pentosaceus
L. sanfranciscensis
Lactobacillus graminis
P. pentosaceus
Lactobacillus rossiae
P. pentosaceus
L. brevis
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
P. pentosaceus
Weissella cibaria
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
A. cerevisiae
Leuc. holzapfelii
Leuc. mesenteroides
P. pentosaceus
L. rossiae
L. sanfranciscensis
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
P. pentosaceus
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
P. pentosaceus
Leuc holzapfelii
L. kimchii
L. sanfranciscensis
W. cibaria
L. holzapfelii
Pediococcus pentosaceus
L. brevis
P.pentosaceus
L. brevis
L. sanfranciscensis
Leuc. holzapfelii
L. sakei
L. sanfranciscensis
Leuc. holzapfelii
Leuc. mesenteroides
L. kimchii
W. confusa
100
20-FLM
21-AV
22-PeL
23-G
24-LM
25-SGL
26-MRP
27-PM
28-SP
29-AC
30-CVP
31-GF
32-CP
33-EC
FLM3
FLM1
FLM10
FLM12
AV12
AV3
AV1
AV7
PeL1
PeL6
PeL2
G2
G12
2G4
2G5
G1
G4
G8
2G7
LM01
LM4
LM0
LM5
SGL3
SGL1
SGL10
MRP7
MRP2
PM4
PM10
PM8
SP7
SP5
SP1
SP9
AC1
AC4
AC3
AC11
CVP2
CVP5
CVP6
GF1
GF5
CP4
CP2
CP7
EC9
EC1
Pediococcus pentosaceus
W. cibaria
L. holzapfelii
Leuc. mesenteroides
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. paracasei
L. rossiae
Leuc. mesenteroides
P. pentosaceus
L. brevis
L. curvatus
L. brevis
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. rossiae
A. cerevisiae
W. cibaria
Leuc. holzapfelii
Leuc. pseudomesenteroides
Lactobacillus kimchii
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
P. pentosaceus
A. cerevisiae
L. sakei
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. rossiae
L. crustorum
L. brevis
L. graminis
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. rossiae
Leuc. mesenteroides
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. rossiae
Leuc. holzapfelii
Lactobacillus guizhouensis
L. brevis
A. cerevisiae
L. graminis
L. sakei
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
Leuc. holzapfelii
Leuc. mesenteroides
P. pentosaceus
L. graminis
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. spicheri
Leuc. holzapfelii
P.pentosaceus
L. graminis
TABELLA 2.5 Identificazione e origine dei ceppi batterici isolati dalle diverse PM N.
101
Il batterio isolato più frequentemente nei nostri campioni, è Pediococcus parvulus
seguito da Lactobacillus plantarum (figura 2.21).
In 5 campioni (G, LM, AC, LR1, UPR) abbiamo isolato e identificato ceppi di Acetobacter
cerevisiae, che è un batterio strettamente aerobio e – da quanto sembra – non ancora
isolato fin’ora in campioni di PMN (Scheirlinck et al., 2008).
Nei campioni ritroviamo mediamente 3 specie batteriche diverse, e in nessun caso meno
di 2 (figura 2.22).
20
18
n° di campioni
16
14
12
10
8
6
4
2
0
FIGURA 2.21 Frequenza delle specie batteriche identificate nei campioni analizzati. In
rosso, specie etero-fermentanti obbligate, in verde, etero-fermentanti facoltative, in blu,
omo-fermentanti, in giallo, batteri acetici.
102
n° specie
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
LA
BP
LF
MA
UPR
AM
FA
M
LBP
MRP
GF
EC
FC
AA
PP
PV
PeL
SGL
PM
CVP
CP
CA
LR1
CFA
FLM
LM
SP
AC
AV
AS
PA
G
0
FIGURA 2.21 Frequenza delle specie microbiche isolate in questo studio. Barre verdi, n° di
specie batteriche in ogni PM. Barre gialle, n° di specie di lievito. Più di 2/3 dei campioni
ospitano almeno 4 specie microbiche diverse.
oltre ad alcuni ceppi di Saccharomyces cerevisiae presente in tutti i campioni, abbiamo
identificato i seguenti lieviti: Torulaspora delbrueckii, Wickerhamomyces anomalus,
Saccharomyces unisporus e Saccharomyces barnettii.
La popolazione microbica dei campioni varia da un minimo di 3 specie a un massimo di
9, va sottolineato che i 2/3 dei campioni presentano almeno 4 specie microbiche.
103
2.3.5. Screening per l’identificazione di ceppi E ps +
I diversi ceppi identificati sono stati poi coltivati su Mmrs5%SACCagar per verificare
l’eventuale capacit{ degli stessi di produrre esopolisaccaridi (cfr. § 2.2.2.3).
Nel caso in cui il ceppo fosse in grado di produrre omo-polisaccaridi, le colonie mostrano
capacità “filanti” (ropy).
Invece, se si trattasse di ceppi produttori di etero-polisaccaridi, la coltura su piastra
presenterebbe un caratteristico aspetto viscoso e lucido (slimy; figura 2.23).
FIGURA 2.22 Quattro ceppi batterici Eps + (per etero-esopolisaccaridi). In tutti i casi si
osserva la caratteristica viscosità e lucidità di queste colonie, oltre che la mancata
separazione tra le stesse.
Sulla base di queste differenze visive, abbiamo classificato i ceppi in positivi (+) o
negativi (-), sia per gli OPS, sia per gli EPS.
Dai risultati ottenuti si evince che in più del 91% dei campioni analizzati è presente
almeno un ceppo capace di produrre EPS. Tra i produttori di EPS ritroviamo diverse
specie del genere Leuconostoc, Weissella e Acetobacter. Tra i produttori di omopolisaccaridi specie diverse del genere Lactobacillus o Pediococcus. Questi risultati sono
in accordo con altri dati già presenti in letteratura (Di Cagno et al., 2006; Monsan et al.,
2001; Chawla et al., 2009). I ceppi positivi per la produzione di omopolissacaridi sono
stati strisciati sui terreni mMRS5%FRU e mMRS5%GLU per verificare se fossero in
grado di produrre omopolisaccaridi del fruttosio o del glucosio. Alcuni ceppi mostrano la
capacità di filare sia su fruttosio che su glucosio: tale risultato indica che tali ceppi sono
in grado di produrre omo-polisaccaridi a partire da entrambi i monosaccaridi.
104
2.3.6. Profili aromatici di alcune PM T
Per alcuni campioni abbiamo analizzato i composti volatili attraverso analisi gascromatografiche (GC-MS) dello spazio di testa (cfr. § 2.2.7).
batteri lattici
eterofermentanti
obbligati
batteri lattici
eterofermentanti
facoltativi
batteri lattici
omofermentanti
lieviti
S. cerevisiae
0
0
0
S. cerevisiae
LdB
0
0
0
S. cerevisiae
GFR
0
L. graminis
P. pentosaceus
S. cerevisiae
VA
L. sanfranciscensis
L. plantarum
0
S. cerevisiae
M
0
L.plantarum
P. pentosaceus
S.cerevisiae
AA
Weissella cibaria
L. plantarum
P. pentosaceus
S. cerevisiae
campione
S. barnetti
W. Anomalus
CP
L. spicheri
L. plantarum
0
S. cerevisiae
L. sakei
P. pentosaceus
S. cerevisiae
0
P. pentosaceus
S. cerevisiae
L. holzapfelii
AS
L. brevis
L. sanfranciscensis
L. holzapfelii
AM
L. rossiae
TABELLA 2.6 PM T impiegate per le analisi gascromatografiche dello spazio di testa: specie
microbiche presenti.
I campioni scelti differiscono per le cenosi microbiche che li caratterizzano (numero di
cellule, varietà delle specie e dei ceppi; tabella 2.6); oltre ai campioni di PMT abbiamo
analizzato due controlli: in uno abbiamo impiegato un ceppo industriale di S. cerevisiae
per la panificazione (LdB); nell’altro, un ceppo di S. cerevisiae isolato dai nostri campioni.
I campioni contenenti LAB eterofermentanti mostrano gas-cromatogrammi con un
numero maggiore di composti volatili; nei campioni in cui è presente solo il lievito si
originano solo pochi composti volatili (figura 2.24).
Abbiamo potuto notare, inoltre, come alcuni composti siano comuni a tutti i campioni,
mentre altri (normalmente presenti a piccole concentrazioni) variano col campione. Tra
i composti comuni segnaliamo l’etanolo e l’etilacetato, tipici del metabolismo dei lieviti e
dei LAB eterofermentanti; il butanolo-3-metil-estere tipico invece del metabolismo
fungino.
105
FIGURA 2.24 Frequenza dei composti volatili individuati nelle PM. Controlli: (i) LdB =
pasta di controllo con lievito di birra; (ii) S. cerevisiae = ceppo di S. cerevisiae isolato da
uno dei nostri campioni.
Analizzando i risultati più nel dettaglio, rileviamo che S. cerevisiae è in grado di produrre
soprattutto alcoli ed esteri (tabella 2.7). Nel caso dei nostri campioni, a causa della
presenza dei LAB, si osserva – generalmente - una maggiore quantità di alcoli e di esteri,
e si osserva la produzione di altri composti volatili: alcani, alcheni e, in alcuni casi,
aldeidi e chetoni. In tutti i campioni di PMT si osserva la presenza di esteri dell’acido
acetico, non presenti nel controllo. Importante osservare come in alcuni casi (AS, AM,
AA) in cui è presente P. pentosaceus, specie omofermentante, vi sia la presenza di aldeidi
come l’esanale, il decanale e il nonanale.
In alcuni casi, nei campioni di PMT si riscontrano terpeni: questi possono essere stati
liberati dalla farina grazie a esterasi batteriche o fungine che li idrolizzano da composti
che li contengono, oppure possono essere produzioni primarie dei microrganismi. La
capacità di produrre terpeni da alcuni ceppi di lievito associati al vino è già stata
dimostrata (Carrau et al., 2005). Recentemente, inoltre, Belviso e collaboratori hanno
messo in luce la capacità di alcuni batteri lattici (origine casearia) di produrre alcuni
terpeni, e soprattutto il geraniolo (Belviso et al., 2011).
Interessante notare la presenza, in alcuni casi, di alcoli superiori. Questi composti
derivano dalla riduzione di aldeidi insature che probabilmente sono generate
dall’ossidazione enzimatica dell’acido linoleico (Vermeulen et al, 2007).
106
campione
alcoli
esteri aldeidi alcani chetoni alcheni
composto
alcheni
alcool
carbonile terpene eterociclico
ciclici secondario
aromatico
?
TOTALE
S. cerevisiae
4
4
0
1
0
0
0
0
1
0
0
0
10
LdB
6
4
0
1
0
0
0
1
1
0
0
0
13
GFR
4
8
0
2
1
0
0
0
0
0
0
0
15
VA
6
8
0
1
0
0
0
1
0
1
0
1
18
M
8
9
0
3
0
1
0
2
0
0
1
0
24
AA
8
10
2
2
1
1
0
1
0
1
1
0
27
CP
6
9
0
11
0
0
0
1
1
0
0
0
28
AS
8
8
3
1
1
0
2
4
0
2
1
2
32
AM
8
10
1
3
2
0
1
2
0
0
2
4
33
TABELLA 2.7 I picchi identificati per ogni campione, e la distribuzione dei corrispondenti
aromi nelle categorie strutturali principali .
La figura 2.25 mette in evidenzia come l’impasto di controllo (S. cerevisiae) differisca dai
campioni di PMT, infatti, nel controllo sono prodotti unicamente 4 diversi gruppi di
composti, mentre nel campione CP, abbiamo osservato un’elevata percentuale di alcani
(eptano, ottano, decano e altri alcani ciclici). Nel campione AS, si osserva invece una
maggiore eterogeneità dei composti volatili, forse in virtù del fatto che la sua cenosi sia
composta da 6 diverse specie microbiche.
107
40
(a) S. cerevisiae
35
30
%
25
20
15
10
5
0
alcoli
esteri
aldeidi
alcani
chetoni
40
alcheni
alcheni ciclici
alcool secondario
carbonile
terpene
composto
aromomatico
?
(b)CP
35
30
%
25
20
15
10
5
108
0
alcoli
esteri
aldeidi
alcani
chetoni
40
alcheni
alcheni ciclici
alcool
secondario
carbonile
terpene
composto
aromomatico
?
(c) AS
35
30
%
25
20
15
10
5
0
alcoli
esteri
aldeidi
alcani
chetoni
alcheni
alcheni ciclici
alcool
secondario
carbonile
terpene
composto
aromomatico
?
FIGURA 2.25 Frequenza dei composti volatili identificati (% sul totale dei composti
presenti in ogni campione). In (a) controllo (ceppo di S. cerevisiae selvatico); in (b) pasta
madre CP, con elevata percentuale di alcani; in (c) pasta madre AS, una delle più eterogenee
per composizione microbica e per abbondanza di composti volatili.
2.3.7. Profili aromatici di alcune PM monoceppo
Abbiamo anche analizzato i composti volatili generati da 6 ceppi batterici (isolati dai
campioni di PMT ) in PM monoceppo. Per tali esperimenti abbiamo deciso di utilizzare
ceppi di diverse specie, isolati da PM diverse e con diverso metabolismo microbico.
Acetobacter cerevisiae (AC4) un ceppo acetico; Lactocacillus crustorum (SGL10) un ceppo
omofermentante obbligato; Weissella cibaria (PA2) e Leuc. holzapfelii (SP1) entrambi
eterofermentanti obbligati; L. spicheri e L. plantarum entrambi eterofermentanti
facoltativi.
Abbiamo esposto la fibra del gascromatografo allo spazio di testa di ogni campione, per
due tempi diversi (2h e 12h).
Come si osserva dalla figura 2.26, lasciando la fibra esposta allo spazio di testa per più
tempo, si ottengono profili con più (o molti più) picchi aromatici.
E’ interessante notare anche che il batterio lattico dal cromatogramma più complesso ed
eterogeneo (dopo 2 h e dopo 12h) è stato L. plantarum, etero-fermentante facoltativo.
Acetobacter cerevisiae AC4 sembra invece il ceppo che – nelle condizioni fermentative
impiegate – genera meno composti volatili.
FIGURA 2.26 Numero dei composti volatili dei campioni mono-ceppo descritti: 2h di
esposizione, azzurro; 12h, verde (tempo di esposizione della fibra allo spazio di testa del
campione).
Oltre agli alcoli, agli esteri, e agli alcani (spesso tipici anche dei metabolismi fungini)
sono presenti numerosi altri tipi di composti acidi, alchenici, chetonici, alcolici-superiori,
109
e aldeidici. Il profilo aromatico dei batteri lattici appare quindi molto più complesso di
quello dei lieviti.
tipo di
tempo di
SP1=(E)
AC4=(A)
SGL10=(O) CP2=(FE)
L.
PA2=(E)
CA1=(FE)
Leuc.
composto esposizione
A.cerevisiae L.crustorum
spicheri
W. confusa L. plantarum
holzapfelii
volatile della fibra
2h
2
4
4
4
4
6
ALCOLI
12h
3
7
9
7
9
7
ESTERI
2h
0
2
4
2
0
4
12h
3
0
8
5
5
4
ACIDI
2h
2
1
0
0
0
5
12h
3
6
1
1
1
9
ALCANI
2h
1
1
0
1
1
2
12h
1
2
1
5
3
6
ALCHENI
2h
0
1
0
0
3
5
12h
1
2
2
3
4
5
CHETONI
2h
0
0
0
0
1
3
12h
1
2
0
2
1
3
2h
0
3
2
2
1
4
ALCOLI
12h
0
6
8
7
9
8
superiori
ALDEIDI
2h
0
4
0
4
3
5
12h
1
12
3
11
9
13
TABELLA 2.8 Numero dei principali composti volatili (es., chetonici, aldeidici, alcolici,
acidi) presenti in ogni campione al variare del tempo di esposizione della fibra allo spazio
di testa.
110
Nel campione ottenuto con la monocoltura di AC4 e SGL10, non è mai stata riscontrata la
presenza di etanolo: questo, probabilmente a causa del metabolismo di questi ceppi
(fermentazione omolattica e acetica). Nel caso di AC4 si osservano pochi composti
volatili, la maggior parte sono acidi o esteri (acido pentanoico, acido acetico, acido
acetico-butil-estere, acido butanoico) dal tipico sentore acetico e tra gli alcoli l’1-esanolo
(tabella 2.8).
Solo nelle paste madri con eterofermentanti facoltativi (CP2 e CA1) si osserva la
presenza del fenossi-etil-isobutirrato. I chetoni come l’undecano e il 3-ottanone (terroso,
erbaceo), sembrano essere tipici del ceppo CA1 di L. plantarum.
L’1-pentanolo, dal tipico sentore di fermentato, di pane e di lievito, è – sembrerebbe –
prodotto da tutti i ceppi lattici utilizzati in questo esperimento, ma non nel campione
ottenuto col ceppo acetico AC4. Anche l’etil acetato, dal tipico sapore dolce e fruttato, è
caratteristico dei soli ceppi lattici impiegati in questo esperimento.
Sebbene Groot & de Bont (1998) hanno riportato la capacità di L. plantarum di produrre
benzaldeide a partire dalla fenilalanina, il nostro ceppo-CA1 di L. plantarum non la
produce. Interessante notare che Leuconostoc e Weissella sembrano essere in grado di
produrre la benzaldeide. Tale composto contribuisce all’aroma di mandorle amare.
Interessante notare che la generazione di alcoli superiori è tipica solo dei ceppi lattici:
tra di essi si ritrova l’1-ottan-3-olo, dal tipico sapore di lavanda e rosa.
Anche il mentolo sembra essere presente, dopo 12 ore di assorbimento della fibra, dello
spazio di testa di tutti i campioni, con l’eccezione di L. plantarum-CA1 .
In tutti i campioni, eccetto il controllo, abbiamo osservato la presenza del 2-pentilfurano
dal sentore fruttato.
L’ottil-estere dell’acido formico, dal caratteristico odore fruttato e di rosa (fruttato, di
rosa, ceroso, rafano), sembra essere tipico solo di alcuni dei ceppi lattici (es., SGL10;
CP2).
Nonostante alcuni composti siano presenti in tutti i campioni, i gascromatogrammi si
differenziano sempre per la presenza di alcuni composti tipici.
Il 2-pentil furano è invece presente in tutti i campioni: il suo aroma viene descritto come
fruttato o anche fragranza verde.
111
2.4 DISCUSSIONE
La collezione dei campioni di PMT ci ha consentito di conoscere e valutare la popolazione
microbica tipica della nostra zona. Gli isolamenti e la crioconservazione delle colture
pure dei ceppi ci ha permesso di studiare più in dettaglio alcune delle loro importanti
caratteristiche.
Il campionamento delle PMT ha rilevato l’abbondanza e la variet{ di PMT nella nostra
regione. La gran parte degli utilizzatori si è rivelata competente e legata alle tradizioni
artigianali e alle metodiche di propagazione delle PMT, e di produzione del pane a
lievitazione naturale.
Analizzando i risultati riguardanti l’identificazione microbica dei campioni di pasta
madre raccolti, attraverso le analisi delle sequenza rilevanti dei ceppi isolati, si può
dedurre un’elevata diversit{ delle specie batteriche. Tra i batteri lattici infatti, si osserva
la presenza di una sola specie appartenente al genere Pediococcus, dodici specie
differenti appartenenti al genere Lactobacillus, tre specie appartenenti al genere
Leuconostoc e infine tre specie appartenenti al genere Weissella.
Molto interessante l’individuazione – in cinque diversi campioni, e per la prima volta in
PMT – di alcuni ceppi appartenenti al gruppo dei batteri acetici (Acetobacter cerevisiae),
strettamente aerobi. I batteri acetici si trovano spesso associati ai lieviti o ai LAB, come
dimostrano numerose altre fermentazioni (es., aceto di riso-Nanda et al., 2001; vinoSilva et al., 2006; cacao- Hoynak et al., 1941; Drysdale et al., 1988). Da notare che
Scheirlinck et al. (2008), hanno descritto la presenza di una specie acetica (Acetobacter
sp.) in un campione di PM, rilevando tale specie con metodi molecolari (analisi-DGGE),
ma senza riuscire a isolarla. La PM è un habitat microaerobio, nel quale è quindi
presente l’O2, ma in piccole quantità. Nelle cinque PMT in questione, tali tenori
d’ossigeno sono quindi adeguati alla crescita di A. cerevisiae.
La popolazione lievitiforme possiede invece caratteristiche simili anche tra campioni
diversi. In tutti le PMT, abbiamo osservato la presenza di almeno un ceppo di S.
cerevisiae, e tale dato è in accordo con altri risultati ottenuti analizzando diverse altre
PMT italiane. Il motivo di tale risultato è stato talvolta collegato al fatto che nella nostra
società si faccia largo uso del lievito convenzionale (LdB), e quindi vi sono autori che
112
hanno creduto in un’origine “contaminante” dei S. cerevisiae (Vrancken et al., 2010) nelle
PMT. Sappiamo tuttavia, che in natura vi sono molti diversi ceppi di S. cerevisiae, e tale
specie è stata già largamente considerata una delle più capaci di lievitare gli impasti-dapane. Da un punto di vista delle caratterizzazioni, occorrerà però attendere metodi
molecolari e dati genomici in quantità, che ci consentano di discriminare – in S.
cerevisiae – tra ceppi di LdB selezionati e propagati industrialmente, e ceppi selvatici. E’
interessante segnalare che le nostre analisi RAPD hanno spesso evidenziato pattern
molecolari diversi da ceppo a ceppo di S. cerevisae (almeno 8), il che suggerisce una
diversità biologica, nei diversi campioni, della specie considerata.
Le analisi DGGE delle nostre PMT, non hanno sempre evidenziato risultati confrontabili
con quelli ottenuti dai sequenziamenti 16S e 28S. E’ gi{ stato notato, infatti, che,
attraverso le analisi DGGE, si tende a sovrastimare la popolazione, dato che a essere
amplificato è anche il DNA dei ceppi metabolicamente inattivi. C’è poi da considerare il
fatto (non marginale, crediamo) che talvolta bande-DGGE visivamente identiche non
appartengono alla stessa specie.
Molto interessante, poi, il risultato riguardante la capacità dei ceppi batterici isolati di
produrre EPS. Quasi tutti i campioni (91%), infatti, sembrano contenerne almeno un
ceppo. Quando prodotti durante la fermentazione nel lievito madre, questi EPS si
mantengono nel pane, e riescono a prevenire la retrogradazione dell’amido (cfr. §
2.1.2.3), aumentando la shelf life del prodotto.
L’analisi dei composti volatili generati, durante la fermentazione dei campioni di pasta
madre, a confronto con un campione fermentato dal solo lievito S. cerevisiae, ha
sottolineato l’importanza dell’utilizzo della PMN in panificazione per ottenere prodotti
da forno dal sapore e dall’aroma particolare. Infatti, i gascromatogrammi delle PM N
risultano essere molto più complessi (cioè ricchi di composti volatili) rispetto a quelli
ottenuti con l’aggiunta del solo lievito o addirittura privati anche del LdB (solo acqua e
farina). Ogni PMN presenta un insieme di composti volatili differenti, a causa della
differente popolazione microbica che la abita.
113
3. Il metabolismo di alcuni acidi fenolici in impasti modello.
3.1. Introduzione
3.1.1. Gli acidi fenolici
Gli acidi fenolici (PA) sono metaboliti secondari presenti nelle piante, che li utilizzano
come agenti di difesa nei confronti dei cosiddetti “patogeni” e delle radiazioni
ultraviolette (figura 3.1).
Essi appartengono al gruppo dei “composti fenolici”, che comprende centinaia di
molecole aventi una struttura-base formata da un anello benzenico sostituito da almeno
1 gruppo idrossilico. Tra i composti fenolici, si ritrovano anche i flavonoidi, gli stilbeni e
le lignine (Rodriguez et al., 2009). I flavonoidi sono poi suddivisi nei flavonoli, nei
flavoni, negli isoflavoni, nei flavononi, nelle antocianidine e nei flavanoli (catechine e
pro-antocianidine).
In particolare il termine “acidi fenolici” raggruppa quei composti aventi un gruppo
114
carbossilico sul gruppo fenolico.
Per
molto
tempo,
questi
composti
sono
stati
considerati
nutrizionalmente
indesiderabili, dato che – negli alimenti – essi possono promuovere la precipitazione
proteica, inibire gli enzimi digestivi, influenzare l’utilizzo delle vitamine e dei sali
minerali, riducendone così la biodisponibilità. Le recenti scoperte riguardanti le loro
proprietà antiossidanti, hanno incentrato gli studi riguardanti la loro capacità
chemiopreventiva contro carcinomi e mutagenesi. Gli effetti benèfici di questi composti
dipendono dalla quantit{ degli stessi nell’alimento e dalla loro biodisponibilit{ (Chung et
al., 1998; Lodovici et al., 2001).
I composti fenolici e quindi anche i PA vengono spesso associati al colore, alle qualità
sensoriali, nutrizionali e agli antiossidanti degli alimenti (Shaidi & Naczk, 2003). Il
contributo dei composti fenolici all’aroma è principalmente dovuto alla presenza dei
fenoli volatili, che possono derivare dall’idrolisi di alcoli superiori o dal metabolismo
microbico (lieviti e LAB; Rodriguez et al., 2009).
(a)
(b)
FIGURA 3.1 Acidi fenolici (PA): (a) struttura chimica degli acidi idrossibenzoici (es., acido
protocatecuico, acido gallico); (b) acidi idrossibenzoici (es., acido ferulico, acido caffeico e
acido cumarico).
I PA possono essere classificati in due categorie: (1) quelli derivati dall’acido benzoico e
(2) quelli che originano dall’acido cinnamico. Gli acidi idrossibenzoici sono componenti
di strutture complesse, come i tannini idrolizzabili (es., gallo tannini; Rodriguez et al.,
2008), e sono generalmente presenti in basse concentrazioni nelle piante edibili con
l’eccezione dei frutti rossi, della cipolla, del radicchio nero. In tali frutti si possono
raggiungere concentrazioni di molte decine di milligrammi/Kg di peso fresco (Shahidi &
Naczk, 1995). Gli acidi idrossicinnamici sono più comuni, e i più importanti sono l’acido
caffeico, l’acido p-cumarico, l’acido ferulico e l’acido sinapico, e generalmente sono
presenti sottoforma legata (Lempereur et al., 1997). L’acido caffeico è il PA più
abbondante nella maggior parte della frutta (75-100% degli acidi idrossicinnamici della
frutta; Shahidi & Naczk, 2003). L’acido ferulico, invece, è il più abbondante acido fenolico
presente nel grano dei cereali. L’acido ferulico contenuto nel grano di frumento è di circa
0.8-2 g/Kg di peso secco, che rappresenta più del 90 % del contenuto di polifenoli totale
(Sosulski et al., 1982). L’acido ferulico, come gli altri PA, può influire sul colore, sulle
propriet{ sensoriali e sulla qualit{ nutrizionale dell’alimento in cui è, o non è, presente
(Shahidi & Naczk, 2000).
I PA sono composti che conferiscono i sentori amari e astringenti23 agli alimenti che li
contengono. Essendo anche degli ottimi composti antiossidanti, in alcuni alimenti come
l’olio d’oliva essi sono ben apprezzati; nel caso dei prodotti da forno, poi, alcuni fenoli
(fenoli volatili), ottenuti per degradazione dei PA, sono considerati composti-chiave e
conferiscono al pane ottime caratteristiche sensoriali (Gänzle et al., 2010).
Con astringenza si intende la capacità di un composto di far precipitare le proteine della saliva (Lea &
Arnold, 1978).
23
115
3.1.2. Metabolismo microbico degli acidi fenolici
I PA liberi sono tossici per i batteri (Vismanath et al., 2009). Diversi LAB sono capaci di
trasformare alcuni PA (es., acido ferulico) attraverso diverse vie metaboliche. A esempio
l’acido ferulico (FA) può essere (i) ridotto ad acido di-idroferulico; (ii) decarbossilato a
4-vinil-guaiacolo24; oppure (iii) decarbossilato-e-ridotto a 4-etil-guaiacolo (Beek &
Priest, 2000).
In particolare, la tolleranza ai PA varia da ceppo a ceppo (Campos et al., 2003). L’attivit{
antimicrobica dei metaboliti derivanti dagli PA è generalmente minore rispetto a quella
derivata dai substrati originali (Sànchez Maldonado et al., 2011). Se aumenta aumenta il
numero di gruppi idrossilici, i PA idrossibenzoici diminuiscono la propria attività
antibatterica, e ciò è correlato con la loro lipofilicit{. L’attivit{ antimicrobica dei PA
idrossicinnamici, non dipende molto dalle sostituzioni presenti sull’anello aromatico,
bensì dai doppi legami presenti sulla catena legata all’anello aromatico (S{nchez
Maldonado et al., 2011). Il metabolismo dei PA mediante decarbossilazione e/o
riduzione da parte dei LAB è il principale meccanismo di detossificazione dei composti
presenti nei substrati vegetali.
Le specie di Lactobacillus sembrano essere più resistenti ai PA rispetto a quelle di altri
gruppi batterici (es., Clostridium e Bacillus; Lee et al., 2006).
Come detto, i LAB possono metabolizzare i PA attraverso reazioni di decarbossilazione o
di riduzione che risultano variare da ceppo a ceppo (De las Rivas et al., 2009).
FIGURA 3.2 Vie degradative degli acidi idrossicinnamici in alcuni batteri lattici (modificato
da Cavin et al., 1997).
24
È un composto volatile dal tipico sentore speziato (Smoky, spicy)
116
L. plantarum è il LAB maggiormente isolato all’interno dei consorzi fermentativi di
origine vegetale, ricchi di acidi fenolici come le olive da tavola (Ruìz-Barba et al., 1994), i
crauti (Plengvidhya et al., 2007), i cetrioli (Tamminen et al., 2004) e le melanzane
(Seseña & Palop, 2007). La capacità degradativa degli PA da parte di L. plantarum è stata,
per tale ragione, oggetto di numerosi studi scientifici. A oggi, gran parte del metabolismo
degli acidi fenolici rimane sconosciuto, così come la sua induzione o repressione dovuta
alla presenza di diverse fonti di carbonio (Muscariello et al., 2001).
Focalizzando l’attenzione sulla degradazione degli acidi idrossicinnamici (es., l’acido pcumarico e l’acido ferulico), è importante ribadire che alcuni composti che ne derivano
sono importanti composti volatili. La decarbossilazione porta alla formazione di
vinilguaiacolo o vinilfenolo, che sono spesso utilizzati anche come additivi alimentari. La
riduzione porta alla formazione dell’etilguaiacolo o dell’etilfenolo. Tali composti fenolici
volatili sono i principali composti aromatici della salsa di soia (Yokotsuka, 1986),
mentre, durante la produzione di vino, essi sono considerati odori sgradevoli (Chatonnet
et al., 1992).
L. plantarum possiede due decarbossilasi dei PA inducibili. La decarbossilasi dei PA (pdc
o PAD) conduce la decarbossilazione dell’acido p-cumarico, dell’acido ferulico e
dell’acido caffeico. Si genera il corrisponente vinilderivato (figura 3.2). L’eliminazione
del gene padA (o pdc) in L. plantarum rivela la presenza di un secondo enzima capace di
decarbossilare i PA, indotta ancora più profondamente con l’acido ferulico, piuttosto che
con l’acido p-cumarico (Barthelmebs et al., 2000). Tale decarbossilasi secondaria non è
stata ancora caratterizzata. L. plantarum, inoltre, possiede un’attivit{ reduttasica
inducibile dei PA (anche questa non è stata fin’ora caratterizzata) e che è in grado di
ridurre i vinilderivati in etilderivati, e di ridurre l’acido p-cumarico in acido floretico. E’
stato ipotizzato che l’induzione alla sintesi di questi particolari enzimi possa essere una
risposta agli stress chimici che consenta di sopravvivere alla tossicità dovuta alla
presenza dei PA (Gury et al., 2004). La capacità di degradare i PA sembra quindi essere
un vantaggio selettivo per molti microrganismi, soprattutto per quelli che abitano,
durante la fermentazione, in substrati composti anche dai PA. La decarbossilasi degli
acidi fenolici (PAD o pdc) di L. plantarum e il suo repressore trascrizionale (PadR) sono
stati clonati in E. coli e caratterizzati dal punto di vista molecolare (Gury et al, 2004). In
assenza di PA il PadR blocca la trascrizione di padA (o pdc). Quando l’acido p-cumarico,
l’acido ferulico o l’acido caffeico sono aggiunti al terreno di coltura in cui viene inoculato
117
L. plantarum, PadR è inattivato attraverso un meccanismo non ancora totalmente
conosciuto. In questo modo, inizia a prodursi l’enzima PAD che, rapidamente, catalizza la
decarbossilazione dei PA presenti, ed eliminando lo stress causato da questi.
118
3.2. Materiali e Metodi
3.2.1 Materiale biologico
3.2.1.1 Ceppi utilizzati:
Lactobacillus plantarum TMW 1460, Lactobacillus hammesii DSM 16381 e Candida humilis
FUA (ceppi della collezione dell`università dell`Alberta in Canada). Tutti i ceppi batterici e,
tra i ceppi fungini, Saccharomyces cerevisiae FA1 isolati e identificati durante questo lavoro
di dottorato.
3.2.2 Materiale chimico e biochimico
3.2.2.1 Terreni di coltura
I terreni di coltura utilizzati sono mMRS per i batteri e YPD per i lieviti. Il terreno
mMRSFA è ottenuto aggiungendo al terreno mMRS l’acido ferulico alla concentrazione
finale di 1mmol.
3.2.2.2 Reagenti chimici utilizzati e soluzioni
I principali composti chimici utilizzati sono: l’acido ferulico e il 3,5-Dichloro-4hydroxybenzoacid ottenuti da Extrasynthese (Genay,France), il 4-Vinil-guaiacolo (2Methoxy-4-Vinylphenol); il 4-ethil-guaiacolo; l’acido siringico; l’acido sinapico; l’acido
vanillico da Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, USA).
3.2.2.3 Farine utilizzate
Per effettuare gli impasti modello abbiamo utilizzato diverse tipologie di farine
acquistate presso i supermercati della città di Edmonton AB-CA. La farina di frumento
integrale e la 00 appartengono alla marca “Robin Hood” (Safeway, Edmonton, Canada). Il
malto di segale è stato importato dalla Svezia.
3.2.3 Batteri e presunta capacità di metabolizzare acidi fenolici: screening molecolare
Il DNA dei batteri identificati, per la maggior parte LAB, è stato amplificato con primer
degenerati per valutare la presenza del gene che codifica per l`enzima che decarbossila i
PA (pdc gene).
119
Primer
49
50
Regione
Target
pdc
gene
Batteri
con pdc
gene
Lunghezza Prodotto
PCR
310 bp
Lunghezza
20 bp
19 bp
Sequenza (5'-3')
Riferimento
Bibliografico
GANAAYGGNTGGGARTAYGA
GGRTANGTNGCRTAYTTYT
Sandhu.
et al.,1995
L’amplificazione del gene che codifica per la decarbossilasi degli acidi fenolici (pdc) è
stata effettuata in un volume finale di 25 µl.
I vari componenti della miscela di reazione sono stati utilizzati alle seguenti
concentrazioni finali:
Componenti
Concentrazione finale
taq polimerasi
tampone di reazione
MgCl2
dNTPs
primer 49
primer 50
Templato
1U
1X
2.5-2 mM
0.2mM
1-0,8µM
1-0,8µM
1-2 µl
Il protocollo termico utilizzato è il seguente:
120
Ciclo di amplificazione
1X
30 X
1X
1X
predenaturazione
denaturazione
appaiamento
estensione
estensione finale
raffreddamento
94°C
94°C
50-60°C
72°C
72°C
4°C
5 min
1 min
1 min
30 sec
7 min
∞
Al termine dell’amplificazione si è osservato il risultato dopo elettroforesi in gel di
agarosio al 2%. La dimensione delle bande viene stimata attraverso comparazione con
un marker (1kp plus DNA ladder GeneRulerTM).
3.2.4 Fermentazioni in terreno sintetico (mMRS + FA)
Il metodo utilizzato per analizzare i metaboliti prodotti a partire dall’acido ferulico dai
ceppi di LAB scelti è riassunto in 4 fasi:
a. Preparazione di colture (o/n) di ogni ceppo scelto, inoculando 1 o 2 colonie in 10 ml
di mMRS liquido. Dopo incubazione per 24 h (30°C). Aggiungere 1ml di questa
coltura a 10 ml di mMRS. Incubare per 18h e usare questa sospensione per
l`esperimento.
b. Preparazione delle soluzioni degli acidi fenolici scelti. Dissolvere gli standard in una
soluzione di 50% metanolo e 50% buffer. I composti fenolici dovranno avere una
concentrazione finale nel terreno di 1 mmol/L.
c. Preparazione del terreno di coltura e fermentazione dopo aver inoculato i ceppi. In
un tubo da 2 ml sterile si aggiungono a 850 µl di terreno (mMRS), 100 µl della
soluzione precedentemente preparata (sterilizzata tramite filtrazione). Abbiamo,
quindi, aggiunto 50 µl di ogni coltura o/n preparata come spiegato al punto (a) e
abbiamo incubato per 24h, a 30°C.
d. Estrazione degli acidi fenolici e metaboliti. Abbiamo centrifugato i tubi a 8000rpm
per 10 min, trasferito poi il surnatante in un nuovo tubo da 2 ml e aggiunto 80 µl di
HCl (25% in acqua) per arrivare a pH 1,5. Abbiamo anche aggiunto 500 µl di etil
acetato, e mescolato per un minuto ogni 10 min per 30 min. Segue la centrifugazione
a 8000 rpm per 5 min. Abbiamo trasferito il surnatante in una nuova eppendorf e
ripetuto l`estrazione con altri 500 µl di etil acetato. I surnatanti collezionati (fase
superiore – etil acetato) e sono stati posti in vials per analisi Uplc (dopo filtrazione
con filtri 0,2 µm). I campioni così preparati sono stati sottoposti ad analisi UPLC per
la quantificazione e UPLC-MS per l’identificazione di alcuni composti.
3.2.5 Fermantazioni in impasti modello
3.2.5.1 Impasti modello
Gli impasti sono realizzati mescolando 10 gr di farina integrale di frumento o malto di
segale, con 10 ml di acqua di rubinetto precedentemente sterilizzata in cui sono state
risospese le cellule coltivate in liquido come precedentemente descritto (DY 25=200).
L`inoculo iniziale di batteri e` di ca. 1x108 UFC/gr, per i lieviti di ca. 1x106 UFC/gr.
Nel caso delle co-fermentazioni è stata aggiunta la stessa quantità di entrambi i batteri
scelti. Gli impasti sono stati collocati tubi sterili, e posti ad incubare (30°C) per 24 ore.
Gli impasti in cui è stato inoculato un ceppo di lievito sono stati precedentemente
acidificati a pH inferiore o uguale a 4 con l`utilizzo di acido lattico e acido acetico (4:1),
questo per sfavorire i batteri (fermentazione spontanea) che potrebbero contaminare
25
DY = (W1 /W2 ) ×100; W1 farina sommata agli altri ingredienti in gr., W2 farina in gr.
121
l`impasto. Per entrambi i tipi di farina utilizzati un controllo acidificato con gli acidi
organici prima citati sono stati collezionati dopo 24°C alle stesse condizioni, anche per
valutare l`attività degli enzimi insiti nella farina.
3.2.5.2 Analisi pH e UFC/gr
Dopo 24 ore di fermentazione una parte dei campioni è stata conservata in congelatore
per le successive estrazioni, 1gr di impasto è stato aggiunto a 9 ml di acqua deionizzata
per la misurazione del pH, un altro grammo in 9 ml di soluzione tamponata (acquapeptone) per effettuare le diluizioni seriali, la semina su piastra e, dopo incubazione a
30°C per 3 gg., la conta microbica e il controllo morfologico delle colonie cresciute per
valutare la presenza di eventuali contaminazioni.
3.2.5.3 Estrazione degli acidi organici e dei monosaccaridi -analisi HPLC
Dopo 24 h di fermentazione 200-500 mg di impasto sono stati inseriti all`interno di un
tubo da 1,5 ml. Al campione è stata aggiunta la stessa quantità di acido percloridico 7%
v/v in acqua per Hplc. Dopo aver miscelato e risospeso l`impasto nella soluzione
aggiunta, i tubi sono stati posti in cella fredda (ca. 4°C) una notte (o/n).
Segue una centrifugazione a 13000 rpm per 5 min, il surnatante e` stato trasferito in un
nuovo tubo da 1,5 ml e diluito 1:5 volte. I campioni così preparati sono stati posti
all`interno di flaconcini per Hplc puliti, pronte per l`analisi Hplc (possono essere
conservate a -20°C fino al momento dell`utilizzo).
L’analisi Hplc è stata effettuata con l’uso di Agilent Technologies 1200 Series (serial no.
DE60556092) e una colonna BioRad Aminex 87, utilizzando RI e il detector UV-Vis.
Come fase mobile è stato utilizzato acido sulfuric 5mM (5%) in acqua per HPLC. Gli acidi
organici, i monosaccaridi e l’etanolo sono stati quantificati attraverso comparazione con
curve di calibrazioni, dei rispettivi standard, aventi un coefficiente di correlazione ≥0.98.
3.2.5.4 Estrazione degli acidi fenolici liberi
Il protocollo è riassunto nella figura 3.3-a.
5 µl dello standard interno (S2) sono stati aggiunti a 250 mg di campione pesato
precedentemente all`interno di un tubo da 2 ml, e successivamente risospeso (con
l`utilizzo del vortex) in 1 ml di etanolo 80% v/v in acqua. Dopo sonicazione per 10 min
con l`utilizzo del i campioni sono stati centrifugati per 15 min a 5000 rpm, il pellet è
stato utilizzato per una successiva estrazione in etanolo, mentre il surnatante è stato
122
posto in provette di vetro e fatto evaporare (N 2, 40°C). Una volta che i surnatanti
combinati sono evaporati si aggiungono 500 µl di acido acetico 2% v/v in acqua e 2 µl di
HCl 12 M per ottenere un pH prossimo a 2.
A questo punto 500 µl di etil acetato sono stati aggiunti, segue centrifugazione a 13200
rpm per 5 min la fase superiore viene posta in un nuovo tubo di vetro per un`ulteriore
evaporazione (N2, 40°C). I campioni sono stati risospesi in acido formico 0,1% v/v in
metanolo e quindi filtrati (filtri 0,22µm) e trasferiti in vials pulite per Hplc.
3.2.5.5 Estrazione degli acidi fenolici coniugati
Il protocollo è riassunto nella figura 3.3-b.
10 µl dello standard interno (S2) sono stati aggiunti a 250 mg di campione pesato
precedentemente all`interno di un tubo da 2 ml, e successivamente risospeso (con
l`utilizzo del vortex) in 1 ml di etanolo 80% v/v in acqua. Dopo sonicazione per 10 min i
campioni sono stati centrifugati per 15 min a 5000 rpm, il pellet è stato utilizzato per
una successiva estrazione in etanolo (80%), mentre il surnatante è stato posto in
provette di vetro e fatto evaporare (N2, 40°C). Una volta che i surnatanti combinati sono
evaporati si aggiungono
400µl di NaOH 2M si mescola leggermente utilizzando il vortex e si lascia il campione al
buio per 4 h questo permetterà l`idrolisi da parte dell`idrossido di sodio.
Segue una fase di acidificazione con l`aggiunta di 153.6 µl HCl 12 M per arrivare ad un
pH prossimo a 2.
A questo punto 500 µl di etil acetato sono stati aggiunti, segue centrifugazione a 13200
rpm per 5 min la fase superiore viene posta in un nuovo tubo di vetro per un`ulteriore
evaporazione (N2, 40°C). I campioni sono stati risospesi in acido formico 0,1% v/v in
metanolo e quindi filtrati (filtri 0,22µm) e trasferiti in vials pulite per Hplc.
3.2.5.6 Estrazione degli acidi fenolici legati
Il protocollo è schematizzato nella figura 3.3-c
250 mg di campione, pesato precedentemente all`interno di un tubo da 2 ml, sono stati
risospesi (con l`utilizzo del vortex) in 1 ml di etanolo 80% v/v in acqua. Dopo
sonicazione per 10 min i campioni sono stati centrifugati per 15 min a 5000 rpm, il pellet
è stato utilizzato per una successiva estrazione in etanolo (80%), mentre il surnatante
viene eliminato. Al pellet si aggiungono 10 μl dello standard interno (S1) e quindi è stato
idrolizzato aggiungendo 400µl di NaOH 2M, mescolando e lasciando il campione al buio
per 4 h.
123
Dopo centrifugazione 13000 rpm il surnatante viene posto in un nuovo tubo da 1,5 ml e
vengono aggiunti 120 µl di HCl 12 M per arrivare ad un pH prossimo a 2.
A questo punto 800 µl di etil acetato sono stati aggiunti, segue centrifugazione a 13200
rpm per 5 min la fase superiore viene posta in un nuovo tubo di vetro per essere
evaporato (N2, 40°C). I campioni sono stati risospesi in acido formico 0,1% v/v in
metanolo e quindi filtrati (filtri 0,22 µm) e trasferiti in vials pulite per Hplc.
(a)
(b)
(c)
124
FIGURA 3.3 Estrazione degli acidi fenolici liberi (a), coniugati (b) e legati (c).
3.2.6 Analisi e quantificazione degli PA
I campioni sono stati analizzati attraverso analisi UPLC utilizzando lo strumento
Shimadzu UPLC e la colonna Kinetex PFP (100 · 3,0 mm, 2,6 μm) e photodiode array
(PDA) con il detector W2. La fase mobile costituita dai solventi (A) 0,1% (v/v) acido
formico in acqua e (B) 0.1% acido formico in acqua:acetonitrile (10:90, v/v). Il gradiente
utilizzato è stato il seguente: 0–2% B (2 min), 2-5% B (2 min), 5- 10% B (4 min), 10-18%
B (2 min), 18-20% B (4 min), 20-28% B (1 min), 28-32% B (5 min), 32- 90% B (2.5 min),
90-90% B (0.5 min) and 90-0% B (6 min). Il tempo totale ogni una corsa è stato di 29
min, il volume di iniezione di 5μl e il flusso di 0.9 ml/min. Gli analiti sono stati
quantificati alla γ 280 nm, mantenendo costante la temperatura della colonna a 35°C.
Tutti gli standard sono stati preparati in soluzioni stock da 1000mg/kg in etanolo:acqua
(80:20) e mantenuti al buio a -20 °C.
Gli acidi fenolici sono stati quantificati attraverso analisi UPLC attraverso comparazione
con curve di calibrazioni aventi un coefficiente di correlazione ≥0.98.
L’acido di-idroferulico fa eccezione, in quanto, non avendo lo standard abbiamo
utilizzato la curva di calibrazione dell’acido ferulico effettuando così una quantificazione
relativa. I risultati sono riportati come
±
deviazione standard di esperimenti in
triplicato indipendenti fra loro.
125
3.3. Risultati
3.3.1. Indagine preliminare sulle decarbossilasi degli acidi fenolici
(identificazione di ceppi pdc+)
Descriviamo qui le indagini relative alla capacità potenziale di produrre fenoli volatili a
partire dagli acidi idrossicinnamici dei LAB isolati e identificati dai nostri campioni di
PMT.
Abbiamo analizzato la presenza del gene pdc (pad) nei ceppi di L. plantarum, e anche
quella di possibili omologhi in altre specie LAB. Per far questo, abbiamo progettato 2
primer degenerati (“49” e “50”; vide de las Rivas et al., 2009). In L. plantarum,
l’amplicone è un frammento di 321 bp, facente parte della regione codificante di pdc.
Utilizzando la procedura di amplificazione descritta da de las Rivas et al. (2009), il DNA
di quasi tutti i ceppi ha presentano un amplicone di 321bp, come atteso, accompagnato
da diverse bande aspecifiche (figura 3.4).
Abbiamo deciso, pertanto, di affinare la procedura descritta per riuscire ad amplificare
solo gli ampliconi descritti, senza bande aspecifiche. Aumentando la temperatura di
annealing (da 50 a 60°C) e la quantità di MgCl2 (da 2 a 2.5), siamo riusciti a ottenere
quanto avevamo desiderato (figura 3.4c).
(a)
(c)
(b)
(d)
FIGURA 3.4 Gel d’agarosio dell’amplicone pdc ottenuto coi primer 49/50 con diverse
temperature di annealing: (a) 57°C; (b) 58°C; (c) 59°C; (d) 60°C. Riportati solo alcuni
esempi.
126
Tra i ceppi microbici risultati pdc+, abbiamo rinvenuto, oltre ad alcuni ceppi di L.
plantarum, anche ceppi di Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus rossiae,
Lactobacillus brevis, Lactobacillus pentosus, Leuconostoc holzapfelii, Lactobacillus sakei,
Lactobacillus guizhouensis (allegato-V). Per concludere, nel 57,6% delle PM T è presente
almeno un ceppo pdc+.
127
3.3.2. Analisi dei metaboliti prodotti a partire dall’ acido ferulico
I batteri pdc+, sono stati coltivati in terreno sintetico (mMRS) con aggiunta di acido
ferulico (FA) per 24h a 30°C (cfr. § 3.2.4). In maniera analoga abbiamo coltivato il ceppo
PeL di Lactobacillus curvatus, pdc -, che è servito da controllo.
Subito dopo, con adatte diluizioni seriali, abbiamo determinato la densità della
popolazione lattica in esame. Con le stesse piastre, abbiamo poi verificato l’omogeneit{
morfologica delle colonie (oppure ne abbiamo constatato l’eterogeneit{). In caso di
elevata omogeneità, abbiamo suggerito che il ceppo in esame fosse puro.
Inoltre, per confermare che i ceppi inoculati fossero omofermentanti, oppure
eterofermentanti (secondo quanto previsto per ciascuna specie), ne abbiamo controllato
i profili acidici (HPLC), per verificare che questi indicassero la presenza di solo acido
lattico negli omofermentanti, oppure di acido lattico + acido acetico negli
eterofermentanti (tabella 3.1). Mediante analisi HPLC del mezzo di coltura, abbiamo
anche analizzato la presenza di zuccheri (monosaccaridi) e acidi organici. Come atteso,
abbiamo constatato che gli eterofermentanti obbligati (E; es., L. rossiae e L. brevis)
producono l’etanolo, l’acetato e il lattato, mentre gli eterofermentanti facoltativi (EF) e
gli omofermentanti (O) solo il lattato (tabella 3.1).
In tutti i casi abbiamo osservato l’assenza del glucosio, e questo indica la crescita
ottimale dei ceppi. Al termine della fermentazione, le UFC/gr sono risultate, in tutti i casi
> 1x108.
128
CEPPO SPECIE
METABOLISMO ETANOLO
MANNITOLO
ACETATO LATTATO GLUCOSIO
FRUTTOSIO
FE
0,00
0,00
0,00
61,10
0,00
0,00
E
16,07
0,89
7,26
32,57
0,00
2,56
E
15,32
3,71
7,27
34,64
0,00
0,00
E
11,78
1,32
4,90
26,12
0,00
1,73
E
14,90
2,57
7,78
35,33
0,00
2,39
L. paraplantarum
FE
0,00
0,00
0,00
62,27
0,00
0,00
CA5
L.plantarum
FE
0,00
0,00
0,00
59,34
0,00
0,39
CFA10
P. pentosaceus
O
0,00
0,00
0,00
30,71
0,00
0,00
CFA4 Leuc. Holzapfelii
CVP2 L.paraplantarum
FE
0,00
0,00
0,00
59,71
0,00
0,00
FE
0,00
0,00
0,00
54,14
0,00
0,00
FE
0,00
0,00
0,00
59,52
0,00
0,00
LF3
L.plantarum
L.plantarum
FE
0,00
0,00
0,00
55,56
0,00
0,66
LR21
L. paraplantarum
FE
0,00
0,00
0,00
63,35
0,00
0,60
M7
L.plantarum
FE
0,00
0,00
0,00
62,19
0,00
0,00
SP9
L.manihotivorans
O
0,00
0,00
0,00
41,45
0,00
1,73
UPRA
L. paraplantarum
FE
0,00
0,00
0,00
25,57
0,00
4,59
L.plantarum
PM10 L. rossiae
FE
0,00
0,00
0,00
296,89
0,00
0,00
E
31,67
0,00
0,00
2,65
0,00
2,61
AA4
L.paraplantarum
AM2
BP5
L.rossiae
L.brevis
L. rossiae
L. rossiae
CA1
AS3
AV1
LA1
LA1
PEL2
pdc-
L. curvatus
FE
0,00
0,00
2,71
38,05
0,00
4,57
PM4
L.paraplantarum
FE
0,00
0,00
0,00
57,50
0,00
1,46
C5
L.rossiae
E
6,98
0,00
6,43
57,07
0,00
0,00
LM01
L. paraplantarum
FE
0,00
0,00
0,00
60,17
0,00
0,67
CVP2 L.paraplantarum
FE
0,00
0,00
2,67
60,14
0,00
0,00
E
19,59
1,57
8,65
35,39
0,00
2,29
AM2
L.rossiae
CA1
L. paraplantarum
FE
0,00
0,00
0,00
61,12
0,00
1,59
CA5
L.plantarum
L. rossiae
L.rossiae
FE
0,00
0,00
2,60
65,45
0,00
0,95
E
17,49
2,98
8,71
36,50
0,00
1,14
E
9,34
0,56
7,63
23,17
0,99
3,83
FE
0,00
0,00
2,46
61,41
0,00
0,00
BP5
AV1
CFA4 Leuc. holzapfelii
LF3
L. plantarum
FE
0,00
0,00
2,09
59,90
0,00
1,61
AA4
L.paraplantarum
FE
0,00
0,00
2,73
63,74
0,00
1,26
E
18,09
1,44
7,31
30,20
0,00
0,69
FE
0,00
0,00
1,30
55,67
0,00
1,19
FE
0,00
0,00
1,86
55,27
0,00
0,53
E
32,73
0,47
6,74
16,03
0,00
0,38
L. rossiae
L. plantarum
LA1
L. plantarum
M7
PM10 L. rossiae
C5
TABELLA 3.1 Analisi HPLC riguardanti la quantificazione (mmol) degli acidi organici, dei
monosaccaridi e dell’etanolo presenti nei brodi esausti (monocolture in MMRS+FA) .
A partire dai brodi esausti di ciascun ceppo, e dopo attente estrazioni (cfr. § 3.2.4), i PA e
gli eventuali metaboliti derivati, sono stati sottoposti ad analisi mediante cromatografia
ultra-performante (UPLC e UPLC-MS; cfr. § 3.2.6).
129
FIGURA 3.5 Concentrazioni (ppm) di acido ferulico (rosso), 4-vinil-guaiacolo (verde) e
acido di-idroferulico (barra azzurra) presenti del brodo di coltura dopo 24h di
fermentazione (30°C; PeL e CO: controlli negativi).
La figura 3.5, evidenzia bene come nel ceppo di controllo (PeL, pdc-) e nel campione non
inoculato, non si assista ad alcuna degradazione del FA (barra rossa). Negli altri ceppi
(pdc+) invece, abbiamo osservato interessanti presenze (come atteso) di 4-vinilguaiacolo
(barra verde), ottenuto dalla decarbossilazione dell’acido ferulico, e conseguente
diminuzione dell’FA presente. In alcuni casi l’FA viene degradato quasi completamente, e
in altri abbiamo invece rilevato l’avvenuta riduzione del FA, con produzione del
corrispondente acido di-idroferulico (barra azzurra).
130
3.3.3. Fermentazioni monoceppo in PM modello e analisi UPLC degli acidi
fenolici
Alcuni dei ceppi sono stati utilizzati come starter monoceppo in PM modello ottenute
con farina di frumento integrale o con malto di segale (cfr. § 3.2.5.1), per valutare la
capacità di degradare i PA anche nell’habitat PM.
I campioni sono stati allestiti come descritto (cfr. § 3.2.5.1), e confrontati con un
impasto di controllo (acqua-farina) acidificato (pH ≤ 4) con acido lattico e acido acetico
(cfr. § 3.2.5.1).
Dopo 24 h di fermentazione sono state effettuate le semine e le analisi di eventuale
etanolo, oltre che degli acidi lattico e acetico, in modo da poter valutare la crescita e la
purezza del ceppo inoculato26, e la eventuale presenza di contaminanti (figura 3.6).
FIGURA 3.6 Piastre diverse dopo 3 gg di incubazione (30°C). Nel (a) controllo acidificato
non si assiste alla crescita di alcuna colonia (mMRS). In (b): colonie di S. cerevisiae (YPD);
in (c) L. plantarum (mMRS).
Nelle tabelle 3.2 riportiamo le concentrazioni degli acidi lattico e acetico, oltre che le
verifiche dei monosaccaridi derivanti dalla farina e presenti nei campioni dopo 24 h di
fermentazione (30°C). Interessante notare l’elevata produzione di etanolo da parte dei
lieviti. Il pH, al termine delle 24 h di fermentazione, nei campioni in cui erano stati
inoculati ceppi di LAB e nel controllo acidificato, risulta essere inferiore a 4; al contrario
negli impasti monoceppo fermentati dai lieviti il pH rimane più elevato di 4. La conta
cellulare per i batteri è sempre superiore a 9 log UFC/gr, mentre per i lieviti è maggiore
di 7 log UFC/gr.
Attraverso l’analisi degli acidi organici prodotti e quindi anche dell’etanolo prodotto, si può avere
un’idea sul tipo di metabolismo impiegato dai microrganismi, e capire se nel campione in esame vi è stata
o meno la crescita del ceppo desiderato e inizialmente inoculato. Se un ceppo inoculato è un batterio
omofermentante ci si aspetta, dopo 24 h di fermentazione, l’assenza di etanolo e di acido acetico e una
elevata concentrazione di acido lattico.
26
131
SIGLA
NOME SPECIE o Controllo
METABOLISMO
CA
Controllo acidificato
CVP2
Lactobacillus paraplantarum
AM2
ETANOLO
MANNITOLO
ACETATO
LATTATO
GLUCOSIO
FRUTTOSIO
conta
cellulare
(log
UFC/gr)
pH
dopo
24 h
0,00
0,43
18,20
49,09
44,16
15,19
0,00
3,96
FE
0,00
1,03
3,38
100,62
23,10
3,87
9,84
3,49
Lactobacillus rossiae
E
64,91
13,21
14,07
98,26
12,91
1,14
10,60
3,51
CFA10
Pediococcus pentosaceus
O
0,00
0,00
0,00
105,00
18,77
2,82
10,37
3,39
AA4
Lactobacillus paraplantarum
FE
0,00
0,83
4,03
109,51
20,17
6,64
10,20
3,35
AS3
Lactobacillus brevis
E
63,74
11,32
13,00
103,93
21,20
1,73
10,28
3,53
M7
Lactobacillus plantarum
FE
0,00
0,83
3,68
102,35
18,43
6,12
10,18
3,49
LA1
Lactobacillus plantarum
FE
0,00
0,96
3,61
110,61
17,63
7,40
10,32
3,44
LPM
Lactobacillus plantarum
FE
0,00
nd
4,03
102,70
19,81
nd
10,09
3,55
LPT
Lactobacillus plantarum
FE
0,00
nd
5,13
107,15
25,45
nd
9,96
3,49
LHD
Lactobacillus hammesiae
E
51,89
nd
20,77
107,70
23,23
nd
10,04
3,56
LBF
Lactobacillus brevis
E
54,36
nd
18,20
102,30
32,00
nd
9,90
3,72
SCF
Saccharomyces cerevisiae
ferment. alcolica
215,77
nd
13,05
39,39
1,00
nd
7,93
4,16
CHF
Candida humilis
ferment. alcolica
131,36
nd
12,10
49,12
2,57
nd
7,86
4,10
TABELLA 3.2 Concentrazione (mmol/L) degli acidi organici, dei monosaccaridi e
dell’etanolo. 24h di fermentazione negli impasti mono-ceppo con farina integrale di
frumento.
CEPPO
SPECIE
METABOLISMO
CA
Controllo acidificato
LPM
L.plantarum
FE
LHD
L. hammesiae
E
SCF
S. cerevisiae
ferm. alcolica
ETANOLO
ACETATO
nd
LATTATO
nd
nd
35,00
3,36
32,00
35,57
278,00
20,49
GLUCOSIO
Conta
cellulare
log
UFC/gr
pH24h
nd
0,00
3,86
140,60
73,00
9,80
3,90
118,70
106,00
9,70
3,92
80,11
1,96
7,90
4,13
TABELLA 3.3 Concentrazione in mmol/L degli acidi organici , dei monosaccaridi e
dell’etanolo dopo 24h di fermentazione negli impasti mono-ceppo ottenuti con lo
sfarinato di malto di segale.
L’estrazione degli PA (liberi, coniugati e legati) è stata effettuata per tutti i campioni.
Durante le fermentazioni mono-ceppo, in due campioni-modello abbiamo anche provato
a utilizzare singolarmente anche 2 lieviti, entrambi isolati da PM: S. cerevisiae SCF e C.
humilis CHF. In due altri campioni, invece, abbiamo impiegato, singolarmente, due
diversi LAB pdc- (L. brevis LBF e L. hammesiae LHD).
Nello sfarinato di malto di segale, abbiamo potuto constatare che L. plantarum (LPM)
fosse l’unico ceppo, tra quelli sondati, in grado di degradare l’FA libero. Né i lieviti
utilizzati (C. humilis e S. cerevisiae), né L. hammesiae sembrano essere in grado di
degradare i PA delle farine. Per quanto riguarda gli altri PA non abbiamo registrato
variazioni significative rispetto ai controlli. In tutti i casi, è osservabile un leggero
132
aumento nella quantità di acido siringico e acido sinapico rispetto al controllo
acidificato. Tra i PA legati, non sembrano evidenziarsi differenze significative.
Avevamo impiegato questo sfarinato di malto di segale, per valutare se vi fossero enzimi
che, attivati dall’acidit{ batterica, potessero aumentare la concentrazione di acidi
fenolici liberi rispetto alla farina integrale di frumento. Poiché abbiamo constatato che
non vi sono state differenze tra gli PA-legati del controllo e quelli del controllo
acidificato, e dato che questo materiale è comunque contaminato da un proprio
microbiota27, abbiamo dovuto interrompere con questi esperimenti.
(a)
(b)
133
FIGURA 3.7 PM monoceppo in sfarinato di malto di segale. (a) PA liberi; (b) PA coniugati
+ liberi (LPM = L.plantarum; SCF = S. cerevisiae; LHD = L. hammesiae; CA = controllo
acidificato; CO = acqua e farina).
Invece, nel caso delle fermentazioni mono-ceppo in farina di frumento integrale, si
osserva un’elevata e significativa diminuzione nella quantità di acido ferulico28 libero
(FA) nei due ceppi LPM ed LPT (L. plantarum, pdc+).
Tale risultato si osserva sia per i PA liberi29, sia per quelli coniugati (estratti dalle nostre
paste-modello; (cfr § 3.2.5). E’ interessante notare che, a differenza delle altre specie, L.
hammesiae sembra essere in grado di degradare l’acido vanillico libero: una
constatazione – a quanto pare – non ancora riportata nella letteratura specializzata.
Inoltre, il ceppo LHD (L. hammesiae) sembra essere in grado di liberare FA dai composti
in cui è presente (FA-legato). Infatti, nei campioni fermentati con LHD, tra i PA legati i
Contaminazione verificata anche per la partita impiegata nei nostri esperimenti.
Si ricorda che l’acido ferulico è il più abbondante acido fenolico presente nella farina di frumento.
29 Es., acido vanillico, acido sinapico, acido ferulico ecc.
27
28
titoli di FA sono ben inferiori rispetto ai controlli; tra i PA liberi, invece, l’FA è presente a
concentrazioni maggiori rispetto ai controlli.
(a)
(b)
134
(c)
FIGURA 3.8 PM monoceppo con farina integrale. (a) PA liberi; (b) PA coniugati + liberi; (c)
PA legati. Sono riportati solo alcuni esempi. (LBF = L.brevis; LPT = L.plantarum LPM =
L.plantarum; SCF = S. cerevisiae; LHD = L. hammesiae; CA = controllo acidificato; CO = acqua
e farina).
3.3.4. Cofermentazioni Rel + - Deg + in PM modello
Come anticipato (cfr. § 3.12), i composti fenolici volatili derivanti dalla degradazione dei
PA sono piuttosto interessanti (Beek & Priest, 2000), soprattutto per migliorare le
proprietà organolettiche del pane. Di conseguenza, abbiamo condotto diverse cofermentazioni Rel+ - Deg+ per verificare se vi fossero maggiori degradazioni di FA
conseguenti all’azione combinata del ceppo LHD con fenotipo “FAREL” [ferulic acid
release, rilascio di acido ferulico dagli acidi fenolici legati), da noi codificato Rel+ e di un
ceppo (variabile) con fenotipo “FADEG” (ferulic acid degradation, degradazione
dell’acido ferulico libero), da noi codificato Deg+30 in impasti modello tra il ceppo di L.
hammesiae (LHD) capace presumibilmente di liberare FA dalla forma legata a quella
libera (FAREL), e altri capaci capaci di degradare FA libero (FADEL; pdc+). La figura 3.9
illustra le attività in questione nelle paste co-inoculate.
135
FIGURA 3.9 Schema di degradazione degli acidi ferulici legati: l’attività Rel + del ceppo LHD,
accompagnata da quella Deg + dei ceppi pdc + , è in grado di liberare acido ferulico e di
degradarlo poi a 4-vinil-guaiacolo.
Anche in questo caso abbiamo valutato la presenza degli acidi organici e dei
monosaccaridi presenti nei campioni dopo 24 h di fermentazione (tabella 3.4). Si
osserva come sia sempre presente l’etanolo, dato che LHD è un ceppo etero-fermentante
obbligato, e quindi in grado di produrre questo alcol. L’osservazione delle cellule
cresciute su piastra dopo isolamento dai campioni fermentati per 24 h, ha dimostrato ciò
che ci attendevamo: in tutti i campioni erano presenti 2 colonie morfologicamente
differenti (es., figura 3.10).
Tra i ceppi Deg+ vi sono senz’altro quelli col gene pdc funzionale (pdc+). Non necessariamente, com’è
ovvio, questi saranno però gli unici capaci di degradare i PA. In questo lavoro, di fatto, tutti i ceppi Deg+
sono pdc+.
30
NOME DELLE SPECIE O CONTROLLO
ETANOLO
MANNITOLO
ACETATO
LATTATO
GLUCOSIO
FRUTTOSIO
CONTA
CELLULARE
log UFC/gr
pH dopo
24h
L. hammesii + L. paraplantarum
L. hammesii + L. paraplantarum
LHD + CVP2 L. hammesii + L. paraplantarum
L. hammesii + L. plantarum
LHD+ M7
LHD + LPM L. hammesii + L. plantarum
L. hammesii + L. plantarum
LHD + LA1
18,55
7,55
6,80
2,55
5,73
11,40
5,93
107,93
76,30
25,76
14,71
2,30
2,05
10,05
9,70
3,16
3,32
10,42
10,74
11,58
110,96
117,76
112,28
23,96
23,23
21,99
1,87
2,75
1,90
10,10
10,27
10,20
3,4
3,23
3,35
10,77
17,95
111,46
55,74
19,77
32,73
2,15
14,66
10,09
0,00
3,15
3,57
CEPPI
LHD + PM4
LHD + LM0
CA
Controllo acidificato
19,75
12,80
19,67
14,10
0,00
6,27
6,81
7,01
0,36
TABELLA 3.4 Concentrazione degli acidi organici prodotti e dei monosaccaridi residui
dopo 24 h di fermentazione in PM-modello ottenute con farina integrale. Riportati anche
diversi parametri salienti caratterizzanti i campioni.
136
FIGURA 3.10 Co-fermentazione di L. plantarum e L. hammesiae. Colonie cresciute su piastra
dopo semina della diluizione -7. Nell’immagine si osservano sia le colonie di L. plantarum
(LPT; cerchio rosso), sia le colonie di L. hammesiae (LHD; quadrato giallo). Si osserva
chiaramente la diversa morfologia delle colonie.
In tutti i casi si è osservata un’elevata degradazione dell’acido ferulico libero presente. Al
contrario, la quantità di FA legato non sembra essere significativamente differente
(figura 3.11).
FIGURA 3.11 Concentrazioni di acido ferulico libero, coniugato e legato, estratti dagli
impasti-modello (3 gr di campione) co-fermentati dal ceppo Rel + (LHD) e Deg + . Osservabile
una certa degradazione dell’acido ferulico libero (rispeto al controllo acidificato) . Non si
osservano variazioni significative tra l’acido ferulico legato dei campioni e quello dei
controlli. (LHA= L. hammesiae; LA1= L. plantarum; LPM=L. plantarum; M7 = L .plantarum;
PM4 = L .plantarum; CA = controllo acidificato; CO = acqua e farina).
3.4 Discussione
La capacità di degradare gli acidi fenolici da parte dei microrganismi sembra essere
associata a un meccanismo di detossificazione. Essi degradano questi composti in
quanto i metaboliti risultanti sono da loro tollerati meglio. Nei prodotti da forno ottenuti
con particolari farine o con farina di frumento integrale, in cui la concentrazione di acidi
fenolici è abbastanza elevata, la loro degradazione a fenoli volatili incrementa
l’accettabilit{ organolettica del pane da parte del consumatore.
Fino a ora la capacità di degradare gli PA è stata associata principalmente ai LAB isolati
da substrati ricchi di PA.
E’ interessante notare che nel 57,6% dei nostri campioni è presente almeno un ceppo
pdc+ (decarbossilasi degli acidi fenolici), anche se si tratta di campioni ottenuti con l’uso
di farina di frumento non integrale, e quindi con tenori di PA piuttosto bassi). Infatti,
solo in rari casi le PMT erano state rinfrescate impiegando farine di frumento integrali.
Tale risultato indica che Deg+ capaci di degradare i PA si trovano anche in habitat poveri
di acidi fenolici.
Interessante sottolineare che quasi tutti i ceppi di L. plantarum, isolati dai nostri
campioni, possiedono il gene pdc e risultano essere in grado di decarbossilare l’acido
ferulico. Come osservato dall’analisi dei metaboliti prodotti a partire da FA, molto spesso
la capacità di decarbossilazione è associata a quella di riduzione dello stesso con
formazione sia di 4-vinil-guaiacolo, sia di acido di-idrossiferulico.
137
4. Messa a punto di P M naturali, originate ex-novo
4.1. Introduzione
4.1.1. Fattori ecologici influenzanti l’ecologia microbica
La selezione di uno specifico microbiota è fortemente influenzato da molteplici fattori
ecologici (Vogelmann et al., 2009) che possono essere suddivisi in due grandi gruppi: (i)
fattori esogeni, cioè esterni all’habitat, o (ii) fattori endogeni, interni all’habitat (figura
4.1).
138
FIGURA 4.1 L’ecologia microbica della PM N è fortemente influenzata da numerosi fatt ori
esogeni (principalmente parametri di processo), ed endogeni (composizione chimica e
microbiologica degli ingredienti). La qualità del prodotto da forno, ottenuto con l’uso di
PM N , dipende dall’ecologia microbica della stessa PM N .
4.1.1.1.
Fattori esogeni
I fattori esogeni comprendono principalmente i parametri di processo: la resa
dell’impasto (DY), la temperatura di fermentazione o di mantenimento, il potenziale
redox, la quantità di ossigeno presente, il tempo di fermentazione, la tipologia di
propagazione, eventuali inoculi, ecc.
Numerosi studi scientifici hanno avuto l’obiettivo di indagare come i parametri di
processo possano influenzare la comunità microbica di una PMN.
Tra i parametri fondamentali, in panificazione si ricorda la DY e la temperatura di
fermentazione. In generale, è stato osservato che bassi valori di DY e di temperatura (25-
30 °C) determinano una maggiore produzione di acido acetico. Al contrario, gli impasti
più soffici (DY più elevati), in combinazione a temperature più elevate (35-37 °C) come
nelle produzioni industriali (impasti acidi di tipo II), favoriscono la formazione di lattato
a causa del più rapido sviluppo dei batteri omolattici (Decock & Cappelle, 2005). La
variazione nella produzione dei principali acidi organici, influenza indirettamente il
quoziente di fermentazione (FQ31) e, quindi, l’aroma del prodotto finito.
Più la PM è liquida e più alta sar{ l’acidit{ nella stessa, con conseguente più rapido
consumo di zuccheri fermentescibili (Lebeault et al., 2003).
Quando hanno utilizzato temperature di fermentazione elevate (40-50 °C) Lönner &
Ahrnè (1995)
hanno constatato la selezione di una specifica comunità microbica
termofilica, che ha dato origine a una PM molto stabile. Al contrario, l’uso di basse
temperature influenza positivamente la crescita dei microrganismi normalmente
presenti a basse concentrazioni (minoritari o secondari; Lönner et al., 1995).
La quantità di propagazioni della PM influenza il pH iniziale della fermentazione, e in
questo modo anche la crescita dei LAB (Brandt et al., 2004).
De Vuyst et al. (2011) hanno analizzato la popolazione microbica di 4 diversi campioni
di PM liquida, al variare della temperatura (23-30-37°C) e delle modalità si rinfresco.
Tali autori hanno valutato come questi fattori influenzino la popolazione microbica
finale dei campioni. Le PM ottenute e propagate in laboratorio a diverse temperature di
fermentazione, hanno mostrato variazioni nella popolazione microbica finale. In
particolare, a 23°C Leuc. citreum, era dominante, mentre a 30 e 37°C era L. fermentum a
dominare. A 37°C però, la popolazione fungina è quasi completamente assente,
probabilmente a causa della migliore fitness32 dei LAB a queste temperature. Nel
campione ottenuto a 30°C e rinfrescato ogni 48 h, si è assistito a una co-dominanza di L.
fermentum e L. plantarum.
Tra i fattori esogeni, rientra anche la possibile influenza dell’ambiente di lavorazione:
Minervini et al. (2012) hanno seguito per 80 giorni l’evoluzione di sette PMN nelle
rispettive panetterie. Contemporaneamente, mantenendo tutti i parametri tecnologici
identici a quelli delle panetterie, ciascuna PMN veniva propagata in laboratorio. Sebbene
la densità cellulare dei batteri non venisse influenzata dall’ambiente di lavorazione, la
FQ è rapporto molare tra acido lattico e acido acetico. In panificazione è considerato ottimale quando il
valore è di ca. 2-2.7 (Hammes & Gänzle, 1998).
32 In ecologia, la fitness è l’idoneità biologica di una specie, di un ceppo o una popolazione.
31
139
densità dei lieviti presenti nelle PMN trasferite in laboratorio subiva un decremento
marcato (ca. 4 ordini di grandezza). Le analisi DGGE dimostravano un progressivo
decremento di S. cerevisiae. Anche la popolazione batterica è stata influenzata: nei
campioni di laboratorio, infatti, i ceppi di Leuc. Citreum sembrano essere più persistenti.
L. sanfranciscensis, invece, non ha manifestato variazioni significative. Gli autori
suggeriscono che il continuo uso della PM nei panifici, e l’introduzione della farina nello
stesso ambiente durante ogni rinfresco, favorisca la selezione di un microbiota
caratteristico (house microbiota), capace di fungere da extra-inoculo di ceppi naturali
competitivi. Non solo la farina, insomma, ma soprattutto l’ambiente di lavoro può essere
causa di modificazioni biologiche delle PMN (Scheirlink et al., 2007).
4.1.1.2.
Fattori endogeni
Uno dei fattori endogeni più importanti è la tipologia degli ingredienti utilizzati, tra i
quali la farina impiegata. Al variare degli ingredienti, cambiano i carboidrati, le fonti
azotate, i minerali, i lipidi e gli acidi grassi liberi: tutti composti e ioni adatti al
metabolismo microbico.
Benchè l’aggiunta di sale possa anche non essere effettuata, in Italia e nel mondo
Occidentale, diverse ricette e processi ne prevedono l’introduzione. Il sale alimentare
(NaCl), rallenta l’attivit{ microbica e inibisce lo sviluppo di alcuni microrganismi
sensibili (alosensibili). Tuttavia, esso sembra rendere stabili le proprietà della PMN
durante le lavorazioni e gli stoccaggi della stessa. Nelle PM contenenti sale alimentare
(Lönner & Ahrnè, 1995), si ritrovano prevalentemente i LAB eterofermentanti facoltativi
e gli omofermentanti obbligati. Ciò è dovuto, probabilmente, al fatto che gli
eterofermentanti obbligati sono maggiormente sensibili all’NaCl (Tiusanen et al., 1992).
L’aggiunta di saccarosio, invece, può influenzare il FQ, attraverso l’incremento nella
produzione di acido acetico (Corsetti et al., 1994).
In PM ottenute utilizzando diversi parametri di fermentazione, Simonmson et al. (2003)
hanno analizzato le variazioni nel rapporto lieviti:LAB, in dipendenza dell’NaCl e del
saccarosio. Quando la concentrazione di NaCl è alta (3,2%) il rapporto diventa 1:1, i
lieviti sono più resistenti alle elevate concentrazioni saline; mentre a elevate
concentrazioni di saccarosio il rapporto lieviti:LAB diminuisce.
Gänzle et al. (1998) hanno valutato la crescita di L. sanfranciscensis e C. milleri in PMmodello, in risposta alla variazione di diverse variabili di processo (comprese la
140
concentrazione di NaCl); hanno così dimostrato che C. milleri riesce a resistere anche a
concentrazioni di sale pari all’8%, mentre L. sanfranciscensis è inibito già in presenza del
4% di NaCl.
Le interazioni tra batteri e lieviti sembrano essere molto importanti per la stabilità del
microbiota nelle PMN.
L’impasto si acidifica durante la fermentazione microbica, attraverso la produzione di
acido lattico (100-200 mmol/L) e di acido acetico (40-60 mmol/L). Il pH è un fattore
importante in quanto può inibire la crescita microbica. Gänzle et al., 1998 e Brandt et al.,
2004 (es.), hanno dimostrato che L. sanfranciscensis non cresce nelle PM a pH inferiori a
3.8-4.0, mentre C. humilis sembra essere molto meno influenzata dal pH della PM
(Valmorri et al., 2008).
In ogni impasto, più le attività enzimatiche sono attive, più esse influenzano il
microbiota, forse in conseguenza del miglior rilascio di metaboliti “attivi” nelle PM con
elevate attività enzimatiche. Tra questi metaboliti, ricordiamo soprattutto alcuni “fattori
di crescita” come gli amminoacidi, le fonti di carbonio e i sali minerali.
In alcuni casi, gli stessi microrganismi sono in grado di produrre enzimi: alcuni autori
hanno individuato, per esempio, capacità amilolitiche associabili a Lactobacillus
paracasei B41 (Petrov & Petrova, 2011), e attività fitasiche in diversi ceppi di LAB
(Parente et al., 2006; De Angelis et al., 2003), oltre che attività proteolitiche legate alla
presenza di alcuni ceppi di LAB (Gobbetti et al., 1996).
Come detto, il tipo di farina utilizzata, sembra essere un fattore molto importante per la
selezione della popolazione microbica. Minervini et al. (2012) hanno osservato come in
campioni di PM ottenuti con farina di Triticum durum (ricca di maltosio, glucosio,
fruttosio e amminoacidi liberi) si assiste a selezioni naturali di LAB eterofermentanti
obbligati associati a un numero molto inferiore di eterofermentanti facoltativi.
Vogelmann et al. (2009) hanno valutato la competitività di alcuni ceppi di LAB variando
il tipo e la qualità della farina utilizzata (con farine di cereali, pseudocereali, quinoa). La
capacità di adattamento a uno specifico substrato, naturalmente varia al variare del
ceppo batterico, e dipende fortemente dalla composizione chimica del substrato. Piccoli
cambiamenti nella qualità del substrato e dei fattori di processo possono influenzare il
microbiota della PMN. Alcuni LAB e alcuni lieviti sono capaci di adattarsi a molteplici
substrati, e per tale ragione sono stati individuati più spesso (Vogelmann et al., 2009).
141
4.1.1.3.
La fermentazione spontanea nella PM
Le tecniche necessarie all’ottenimento e al mantenimento della PMN risalgono alla
tradizione e si differenziano da produttore a produttore. Spesso, per preparare una PMN
basta aggiungere alla farina dell’acqua (con rapporto variabile) e l’impasto ottenuto
viene lasciato a temperatura ambiente per qualche giorno. I microrganismi naturali
presenti nella farina, quelli dell’ambiente di lavorazione e quelli provenienti dalle mani
degli operatori, possono “attecchire”, cioè crescere e moltiplicarsi, sino a ottenere una
piccola fermentazione “spontanea”. Secondo Lönner et al. (1986), inizialmente non tutta
la popolazione microbica presente è adatta alla panificazione. Si possono ritrovare
infatti anche specie di batteri enterici, di batteri sporigeni e di micrococcaceae. Oltre a
questi, però, appaiono anche i primi LAB e i lieviti, che in questa fase iniziale,
costituiscono solo una minoranza.
Durante i rinfreschi, quando il pH si abbassa a causa delle fermentazioni microbiche,
diventano predominanti i LAB e i lieviti (Lönner et al., 1986). Mano a mano che l’impasto
viene rinfrescato (nuova aggiunta di acqua e farina) le popolazioni lattica e lievitiforme
si moltiplicano più velocemente, dato che le fermentazioni acide e alcoliche effettuate,
inibiscono lo sviluppo degli altri microrganismi presenti.
In alcuni casi, per velocizzare il processo di ottenimento della PM, che risulta essere
molto lungo dato che è un processo di selezione naturale, alcuni produttori aggiungono
all’acqua e alla farina, un “prodotto naturale” tipicamente ospitante cenosi microbiche
naturali (frutta, erbe, semi, vinacce, yogurt, madre dell’aceto, sterco di vacca, ecc.). Tale
processo velocizza spesso la fermentazione e la lievitazione dell’impasto, diminuendo i
tempi necessari all’ottenimento della PMN, quantunque non vi siano studi scientifici al
riguardo. Conosciamo poco, infatti, l’influenza di questi diversi “inoculi naturali” sulla
selezione/composizione della popolazione microbica che infine risiederà nella PMN.
4.1.1.2 Il MICROBIOTA nei cereali
Come indicato, alcuni dei microrganismi presenti in queste prime fasi possono derivare
dal microbiota dei cereali e della farina. Alcuni studi indicano che la microflora dei
cereali è composta da batteri, lieviti e funghi filamentosi (in totale 104-107 UFC/gr),
mentre quella della farina è composta da 2x104-6x106 UFC/gr (Stolz, 1999). La gran
142
parte dei batteri presenti è mesofila. Tra i batteri si ritrovano alcune specie Gram aerobiche (es., Pseudomonas), alcuni aerobi facoltativi (Enterobacteriaceae), e diversi
batteri Gram+: i batteri lattici (LAB) omofermentanti (L. casei, L. coryniformis), i LAB
eterofermentanti, i cocchi omofermentanti come E. faecalis, L. lactic, P. parvulus, P.
pentosaceus) e quelli eterofermentanti (Weissella sp., Leuconostoc sp.). Possono essere
presenti anche Staphylococcus aureus e Bacillus cereus oltre che altri batteri indesiderati.
I lieviti sono rinvenuti sia nei cereali (9x104 UFC/gr) che nella farina (2x103 UFC/gr) e in
particolare alcune specie appartenenti ai seguenti generi: Candida, Cryptococcus, Pichia,
Rhodotorula,
Torulaspora,
Trichosporon,
Saccharomyces
e
Sporobolomyces.
E’
interessante sottolineare che nella farina e nei cereali non è stata mai individuata la
presenza di S. cerevisiae (Galli et al., 1987; Corsetti et al., 2001).
Tra le muffe (circa 3x104 UFC/gr) si ritrovano principalmente i seguenti generi:
Alternaria, Cladosporium, Drechslera, Fusarium, Helminthosporium e Ulocladium
originanti verosimilmente dalle colture; Aspergillus e Penicillium originanti dai locali di
conservazione.
4.1.1.3 Fattori influenzanti l’adattabilit{ microbica
La selezione microbica durante i rinfreschi selettivi (RS), dipende da diversi fattori. Per
prima cosa va considerato il tipo di metabolismo microbico dei carboidrati: sarà più
adattabile un microrganismo in grado di utilizzare le principali fonti energetiche
presenti nell’impasto (tra le quali maltosio e fruttosio), rispetto a uno meno dotato di
queste proprietà. In secondo luogo occorre segnalare i fattori di crescita fisico chimici
(temperatura e pH). I LAB e i lieviti presentano, inoltre, molteplici meccanismi di
risposta agli stress come l’acidità, le basse o elevate temperature, l’osmolarità, gli stress
ossidativi, la mancanza di composti nutritivi (Gobbetti et al., 2001; De Vuyst & Neysen,
2005). Inoltre è da ricordare che la capacità di produrre composti antimicrobici (es., gli
acidi organici e/o le batteriocine), aumenta la competitività dei ceppi microbci che le
producono, e può contribuire alla persistenza/stabilità della popolazione microbica
durante la fermentazione nelle PMN (Gänzle & Vogel, 2002).
Alcuni studi hanno mostrato che la composizione del microbiota nella PMN è soggetta a
fluttuazioni che dipendono dal vigore dei ceppi e dai fattori ambientali in gioco
(Minervini et al., 2012).
143
4.1.2 HRMqPCR
Le PCR quantitative con denaturazioni “ad alta risoluzione” (High Resolution Meltingquantitative-PCR, HMRqPCR) si basano sull’individuazione della diversa capacit{ di
denaturazione di due o più ampliconi per poter discriminare differenze di sequenza
anche a carico di una singola base33.
Le applicazioni della PCR HMRq, riguardano principalmente l’individuazione e l’analisi di
eventuali mutazioni geniche (gene scanning); le analisi di eterozigosi; il DNA
fingerprinting; lo SNP genotyping; l’identificazione-di-specie; la prevalenza allelica in una
popolazione.
La tecnica consiste di una prima amplificazione in presenza di un particolare colorante
(EvaGreen), che permetterà di avere un elevato quantitativo di amplicone legato al
colorante fluorescente. Il colorante non interagisce con il ssDNA, ma solo col dsDNA.
Solo quando il colorante si trovi legato al dsDNA, emette fluorescenza. Le variazioni di
fluorescenza possono essere usate per valutare l’incremento di DNA durante
l’amplificazione, e può misurare direttamente la denaturazione termica del dsDNA
indotta durante l’HRM.
Le analisi dello HRM si eseguono incrementando automaticamente la temperatura (per
es. da un minimo di 50°C ad un massimo di 95°C), e misurando in continuo la
fluorescenza emessa dall’EvaGreen. Con l’aiuto di software appositi, si è facilmente in
grado di comparare l’andamento della fluorescenza all’aumentare della temperatura
imposta (figura 4.2). Siccome il colorante emette solo quando è legato al dsDNA, la
fluorescenza sarà massima alle temperature inferiori, cioè all’inizio delle analisi. A
determinate temperature il dsDNA inizia a denaturarsi per cui l’EvaGreen interagire più
labilmente, con conseguente riduzione delle emissioni. Alle temperature più elevate,
quando il dsDNA sarà scomparso, e nel mix si trovi quindi solo ssDNA, la fluorescenza
sarà pressoché nulla.
Questa tecnica (HMRqPCR) caratterizza i campioni di DNA sulla base della loro dissociazione, e sulle
modalit{ con cui avviene, all’aumentare della temperature, la transizione dsDNA  ssDNA.
33
144
FIGURA 4.2 Rappresentazione schematica delle principali fasi necessarie alle analisi
HRMqPCR.
145
4.2. Materiali e metodi
4.2.1 Materiale chimico e biochimico
4.2.1.1 Sorgente microbica natural (SNM)
Abbiamo utilizzato diverse sorgenti microbiche naturali come inoculo: fiori, bacche, frutti di
specie diverse, e una madre dell’aceto naturale come si osserva dalla seguente tabella.
CAMPIONE
PYR
Bia
Fonte di
Bacche di
Bacche di
inoculo
Pyracantha
biancospino
CAMPIONE
Fonte di
inoculo
SE
Fiori di
Senapis
alba
CB
Fiori di
una
Crucifera
bianca
Myr
Pes
Bacche
Fiori
di
di
Mirto
Pesco
VP
M
Fiori di
Fiori
Veronica
del
persica
Melo
Alb
MND
Fiori di
Fiori di
Albicocco
Mandorlo
OL
Mel
Olive
Melograno
AM
Madre
dell’aceto
4.2.1.2 Tipologia di farina
La farina utilizzata è di frumento e ottenuta dall’azienda “Molino Bianchi” sede in Osimo (AN).
4.2.1.3
Terreni di coltura
I terreni di coltura utilizzati per gli isolamenti e le precolture microbiche sono YPD per i μo
fungini e mMRS per la popolazione batterica (cfr. § 2.2.1.2).
4.2.2
Campioni ex novo e metodo di campionamento
Alla farina e all’acqua è stato aggiunto un substrato naturalmente contaminato (inoculo
20%; cfr. § 4.2.1.1). Gli impasti così ottenuti sono stati mantenuti per i primi 15 gg a
temperatura ambiente e propagati ogni 2 gg, successivamente conservati in frigorifero e
propagati ogni 7 gg (DY 200, inoculo 20%). Campioni di tali impasti sono stati prelevati
a ogni RS e conservati in congelatore per ulteriori analisi.
4.2.3 Identificazioni a partire dal DNA dei ceppi isolati
Il metodo utilizzato è uguale a quello spiegato per la popolazione batterica nel paragrafo
2.2.6.2.4 , mentre per la popolazione fungina nel paragrafo 2.2.6.2.6.
Anche la conta cellulare è stata spiegata nel paragrafo 2.2.6.2.1.
146
In particolare gli isolamenti e le successive identificazioni sono state eseguite sui
campioni al 1° RS; al 4°RS e al 10°RS per i batteri mentre solo al 4°RS per i lieviti.
4.2.4 Campioni di PM modello
Campioni di PM modello in cui abbiamo inoculato la stessa concentrazione cellulare (ca.
107 UFC/gr), di 4 diverse specie batteriche, risultate essere dominanti nei campioni di
PMEN dopo 10 gg di RS. I LAB scelti sono: L. sanfranciscensis, L. rossiae, L .plantarum, L.
graminis. Abbiamo utilizzato utilizzato una DY=200. Abbiamo anche voluto variare la
farina utilizzata (farina di frumento integrale, farina di frumento 00 e sfarinato di
segale), ottenendo 3 campioni. I campioni sono stati rinfrescati come spiegato per i
campioni di PMEN (20% di inoculo).
4.2.5 Determinazione dell’evoluzione microbica nel tempo attraverso HRMqPCR
4.2.5.1 Estrazione DNA totale
1gr di pasta madre congelata è stata mescolata con 1 ml di acqua milliQ per 10 min
utilizzando il vortex a temperatura ambiente (25°C). Dopo centrifugazione a 500 rpm
per 10 min il surnatante viene posto in un nuovo tubo da 2 ml e nuovamente
centrifugato a 600 rpm per 10 min. Il surnatante sarà utilizzato per estrarre il DNA
seguendo il kit DNeasy blood & tissue. A seconda se si voglia isolare il DNA dei lieviti o dei
batteri è stato utilizzato un diverso buffer di estrazione preparato come descritto nel
libretto di istruzioni del kit. Il campione così preparato è stato inserito nella macchina
QIcube (figura 2.9)
147
4.2.5.2 Popolazione dei batteri e dei lieviti
I primer utilizzati sono primer universali a tutti i batteri e sono schematizzati nella
tabella seguente.
Primer
Regione
1
Tb1/
Tb2
16S
2
Yeast-r /
Yeast-f
26S
NL1/
LS2
26S
3
Sequenza
Riferimento
bibliografico
Applicazione
Batteri
Nadkarni et al.,
(2002)
Batteri che
causano la
carie dei denti
Lieviti
Park et al,
(2009)
Target
5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′
5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′
5`-TCTCTTTCCAAAGTTCTTTTCATCTTT-3`
5`-GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGC-3`
5’-GCCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’
5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’
O’Donnell, 1993
Lieviti
Lieviti totali
presenti in
Kimchi
Pasta madre
La miscela di reazione è stata eseguita secondo quanto suggerito dal kit Type-it HRM PCR,
istruzioni riportate nella seguente immagine.
148
4.3. Risultati
4.3.1. La selezione di cenosi batteri-lieviti per usi artigianale o
industriali
Molti artigiani dai cui panifici provenivano le nostre PMT (cfr. § 2.3), tenevano a
sottolineare che la propria PM differiva dalle altre, soprattutto perché l’avevano creata
da soli, utilizzando un particolare substrato iniziale (es., miele, sterco di vacca ecc.).
Nella tabella 4.1 riportiamo alcuni risultati dei campioni di PMT di cui conosciamo
l’origine.
SNM
PMT
sterco di vacca
1-MA
Miele
2-FA
Miele
3-AA
polpa di mela
4-LM
Mela
5-AC
farina e acqua
6-CP
CEPPO
ISOLATO
MAXIII
MAXXVIII
FA9
FA5
AA4
AA3
AA1
LM01
LM4
LM0
LM5
AC1
AC4
AC3
AC11
CP4
CP2
CP7
IDENTIFICAZIONE
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. sanfranciscensis
Pediococcus pentosaceus
L. brevis
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
Pediococcus pentosaceus
W. cibaria
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
Pediococcus pentosaceus
A. cerevisiae
L. sakei
L. brevis
A. cerevisiae
L. graminis
L. sakei
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. spicheri
Leuc. holzapfelii
TABELLA 4.1 Esempi di PM T ottenute con SNM diverse, e relative identificazioni batteriche.
Ripercorrendo la tradizione, abbiamo messo a punto una procedura per ottenere dei
campioni di PM ex novo, cioè a partire da zero. Abbiamo altresì voluto analizzare come le
popolazioni microbiche evolvessero all’interno di tali PM EN, selezionando nel tempo i
tipi più adatti.
149
Con l’eccezione della “sorgente naturale microbica” (SNM) 34, tutti gli ingredienti della
pasta sono stati identici, per composizione e condizioni di incubazione adottate (cfr. §
4.2.2).
4.3.2. Isolamenti e identificazioni molecolari d ei batteri e dei lieviti
Dagli isolamenti e dalle conte microbiche effettuate dopo 4 rinfreschi selettivi (RS) si
osserva come il rapporto tra lieviti e batteri abbia già raggiunto la dimensione tipica di
tutte le PM (ca. 1:100). Anche il numero di cellule per grammo ha – grosso modo –
raggiunto le dimensioni consuete: lieviti, ca. 1x107 UFC/gr e batteri, ca. 1x109 UFC/gr
(tabella 4.2).
Campione Sorgente Naturale Microbica "SNM"
batteri (UFC/gr)
lieviti (UFC/gr)
Pyr
Pyracantha, bacche
1x10
1x107
Bia
Biancospino, bacche
2,1x109
6,6x107
Myr
Myrtus communis, bacche
5,8x108
8,7x107
Pes
Pesco, fiori
1x109
3,7x107
Alb
Albicocco, fiori
1x109
1x107
MND
Mandorlo, fiori
1x109
3x106
9
7
SE
Senapis alba, fiori
9
5x10
5x10
9
C.F.
Crucifera bianca, fiori
1,7x10
9,2x107
VP
Veronica persica, fiori
4x109
1x107
M
melo, fiori
1x109
2x107
OL
olive, frutti
8,4x109
1,2x107
MEL
melograno, frutto
1,2x109
1,4x107
AM
aceto, madre
8,4x109
1,2x107
TABELLA 4.2 Conta microbica (UFC/gr) di lieviti e batteri nelle PM ex novo.
Gli isolamenti batterici (cfr. § 2.2.6.2.1) sono stati effettuati al 1°, al 4° e al 10° RS,
mentre quelli dei lieviti35 solo al 4° RS.
Nel corso dell’indagine abbiamo analizzato solo alcune PMEN36. (tabella 4.2).
Cioè una sorgente naturale “abitata” da microrganismi. Ad esempio frutti, fiori, madre dell’aceto ecc.
Più propriamente: dei lieviti e dei funghi filamentosi
36 I campioni analizzati sono tutti derivati da SNM di origine botanica diversa. Secondo noi queste sono
state in passato tra le fonti di inoculo (SNM) più frequenti, quanto meno in certi areali come quelli centromeridionali.
34
35
150
Gli isolati scelti sulla base della diversa morfologia su piastra, sono stati sottoposti a
tipizzazione RAPD, utilizzando il primer universale M13 (figura 4.1).
M
Bia
1
2
3
4
5
6
7
8
9
(a)
10
AM
11 12 13
Se
14AM
15 16
Mel
17 18MND
19
Mel
PYR
Myr
(b)
FIGURA 4.3 Tipizzazione RAPD di alcuni ceppi isolati da PM ex novo: in (a) batteri e in (b)
lieviti.
Per i ceppi aventi profili RAPD diversi, sono state poi effettuate le amplificazioni delle
regioni ribosomiali e le identificazioni molecolari (cfr. § 4.2.3).
In tutti i casi, al primo RS si osserva una popolazione batterica eterogenea in cui sono
presenti anche ceppi di Enterococcus, Acetobacter, Gluconobacter, Leuconostoc e
Lactobacillus (tabella 4.3).
Al 4° e al 10° RS si ritrovano invece solo specie lattiche37. Dopo 10 RS, nel campione
ottenuto coi fiori del melo, abbiamo potuto identificare L. plantarum e L. rossiae; L.
graminis nel campione ottenuto coi fiori della Senapis alba; L. plantarum nel campione
ottenuto col melograno; in tutti gli altri casi L. sanfranciscensis è la specie lattica che
prevale sulle altre.
In quasi tutti i casi il batterio presente al 10° RS è già presente al 1° RS.; negli altri esso
compare a partire dal 4° RS.
Ci riferiamo ai risultati derivanti dalle nostre procedure: esse hanno utilizzato solo diluizioni elevate
(dalla -6 in poi). In senso rigoroso, quindi, con la nostra frase non si esclude la presenza di altri generi, per
quando le loro conentrazioni potessereo solo essere basse o molto basse.
37
151
SNM
1° RS
4° RS
10° RS
MELO, fiori
Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus plantarum
Lactobacillus pentosus
Lactobacillus rossiae
Lacobacillus graminis
L. plantarum
L. rossiae
L. rossiae
Lactobacillus brevis
L. graminis
L. graminis
Senapis alba, fiori
Gluconobacter cerinus
Lactobacillus sakei
L. graminis
L. mesenteroides
L. sanfranciscensis
L. plantarum
L. sanfranciscensis
G. cerinus
L. sanfranciscensis
L. plantarum
Veronica persica, fiori
G. cerinus
L. rossiae
Biancospino, bacche
L. sakei
Lactobacillus curvatus
L. graminis
L. mesenteroides
L. sanfranciscensis
L. sanfranciscensis
L. sanfranciscensis
Lactobacillus paraplantarum
L. curvatus
L. graminis
L. mesenteroides
L. holzapfelii
L. sanfranciscensis
Myrtus communis,
bacche
Leuconostoc holzapfelii
L. mesenteroides
Enterococcus hirae
Acetobacter tropicalis
melograno, frutto
L. holzapfelii
L. plantarum
Pediococcus pentosaceus
L. holzapfelii
L. plantarum
Acetobacter cibinongensis
G. cerinus
L. sanfranciscensis
L. holzapfelii
L. sanfranciscensis
aceto, madre
L.sakei
L.brevis
TABELLA 4.3 Identificazioni molecolari degli isolati batterici ottenuti dalle diverse PM ex
novo, al 1°, 4° e 10° RS.
Tra i lieviti isolati al 4° RS, solo 3 diverse specie sono state identificate: S. cerevisiae, A.
protae e W. anomalus.
152
4.3.3. Evoluzione della popolazione batterica fino al raggiungimento
della stabilità (HRM qPCR)
Per conoscere la temperatura di melting del DNA di ciascuna specie (figura 4.4), e
riuscire così a identificare la stessa specie in ciascun campione attraverso l’analisi del
DNA totale delle PMEN, il DNA delle diverse specie batteriche isolate e identificate, è stato
analizzato mediante HRMqPCR ( cfr. § 4.2.5).
L. mesenteroides,
L. holzapfelii,
L. rossiae
3,5
dF/dT
L. plantarum,
P. pentosaceus,
L. brevis
L. graminis,
L. curvatus,
L. sakei
L.sanfranciscensis
L.sakei
L.mesenteroides
3
P.pentosaceus
L.holzapfelii
2,5
L.plantarum
L.curvatus
E.hirae
2
L.rossiae
L.brevis
1,5
A.tropicalis
A.cibinongensis
L.graminis
1
Gluconobacter cerinus
0,5
153
0
82
83
84
85
86
87
T (^C)
88
FIGURA 4.4 Curve di melting di ogni specie batterica identificata nei campioni ex novo;
ottenute attraverso analisi HRMqPCR.
Alcune specie di LAB presentano temperature di melting molto simili tra loro (es., L.
curvatus; L. graminis; L. sakei): in questi casi sarà importante la comparazione con le
identificazioni in vivo ottenute precedentemente mediante isolamenti.
2,5
2,5
(b)
dF/dT
dF/dT
(a)
2
2
1,5
1,5
1
1
0,5
0,5
0
0
82
83
84
85
86
87 T(^C) 88
82
83
84
85
86
T(^C) 87
FIGURA 4.5 Curve di melting della popolazione batterica. Analisi HRMqPCR di (a) tutti i
campioni al 1° RS, e di (b) tutti i campioni al 10° RS.
Comparando le curve di melting dei campioni scelti al 1° e al 10° RS (figura 4.5) si
osserva come la popolazione batterica cambi: nel 1° RS si osservano invariabilmente
picchi tra gli 84°C e gli 87°C ( = grande variabilità), mentre al 10° RS solo picchi tra
83.5°C e 85°C = piccola variabilità). Nel tempo, la popolazione batterica cambia
qualitativamente (cioè, cambiano le specie) e quantitativamente (al 10° rinfresco non
abbiamo mai osservato più di 2 specie batteriche).
154
2.5
dF/dT
(a)
2
1.5
1
0.5
0
82
83
84
85
86
87
88
T(^C)
155
FIGURA 4.6 Curve di melting. Popolazione batterica al 1° (), 2°(=), 3° (○), 4° (╼⋅╼), 5° ( .
.
6° (⧠), 7° (⧍), 10° (---) e 11° ( ⥰⥰⥰ ) RS, ottenute utilizzando la HRMqPCR. (a) AM; (b) SA;
(c) VP; (d) BIAN; in (e) MG; in (f) FdM .
. ),
Confrontando le curve di melting dei ceppi con quelle ottenute dal DNA estratto dai
campioni di PM ai diversi RS, abbiamo potuto valutare e analizzare l’evoluzione del
microbiota.
Nel campione AM (figura 4.6-a) al 1° RS è presente Acetobacter e Gluconobacter, mentre
al 2° RS L. sakei prende il sopravvento sulla popolazione acetica. E’ necessario aspettare
fino al 5° RS per osservare la presenza di L. sanfranciscensis, che inizia a crescere da
questo passaggio, fino al 10° RS, in cui è presente un solo picco tipico, quello di L.
sanfranciscensis. In questo caso è al 5° RS che la popolazione sembra selezionarsi
definitivamente.
Nel campione SA (figura 4.6-b) il picco presente nei vari RS è sempre lo stesso (ca.
84.5°C); tre sono le specie individuate con questa temperatura di melting: L. graminis, L.
curvatus e L. sakei, e per tale ragione è impossibile discriminare l’uno dall’altro
attraverso l’uso esclusivo di questa tecnica. Grazie agli isolamenti effettuati possiamo
affermare che L. graminis è il LAB che in questo campione prende il sopravvento sugli
altri.
Nel campione VP (figura 4.6-c), al 1° RS si osservano almeno 3 specie diverse tra cui L.
plantarum che sarà la specie dominante nel 2° e 3° RS. Al 4° RS L. sanfranciscensis
prende il sopravvento su L. plantarum, fino a rimanere l’unico presente sino al 10° RS.
Nel campione ottenuto con le bacche di biancospino (figura 4.4-d) già al 1° RS si osserva
la presenza di L. sakei e L. graminis; al 3° RS L. sanfranciscensis prende il sopravvento
sugli altri e rimanere l’unica specie batterica fino al 10° RS.
Nel campione-MG (figura 4.6-e), da una popolazione molto eterogenea composta da
almeno 4 specie batteriche diverse (1° rinfresco) si arriva al 10° RS in cui solo L.
sanfranciscensis è presente. La stabilità della popolazione batterica in questo caso si
ottiene dopo il 7° RS (14 gg).
Nel campione-FdM (figura 4.6-f) la popolazione batterica finale è composta dalle specie
L. plantarum e L. rossiae, sebbene fino al 6° RS sembrava prevalere L. plantarum.
156
4.3.4. Co-fermentazioni lattiche
Nei campioni ex novo, i batteri che dopo 10 RS, risultano prendere il sopravvento sugli
altri, sono ceppi di LAB: L. sanfranciscensis, L. plantarum, L. rossiae e L. graminis.
A questo punto, abbiamo testato, con metodologia analoga, alcuni “impasti-modello”,
ottenuti mescolando le 4 specie insieme, per valutare se tra questi ve ne fosse uno che
potesse prevalere sugli altri tre.
Sono stati utilizzati tre diversi tipi di farina: (i) bianca di frumento, (ii) integrale di
frumento e (iii) sfarinato di malto di segale (figura 4.7).
157
FIGURA 4.7 PM-modello (3° RS), preparate aggiungendo la stessa concentrazione di L.
sanfranciscensis, L. plantarum, L. rossiae e L. graminis al 1° impasto, e utilizzando 3
tipologie diverse di farina. Si noti la diversa colorazione dell’impasto al vari are della farina
utilizzata.
Come si può osservare dalla figura 4.7 al variare della farina il risultato non cambia: il
LAB che dopo 3 RS (6 gg) rimane nel campione è L. sanfranciscensis. Tale risultato
conferma quanto già ipotizzato da diversi autori, cioè che L. sanfranciscensis è un LAB
particolarmente adatto per le PM. E’ possibile, in definitiva, che una PMEN contenente
una di queste 3 specie, possa subire colonizzazioni esterne di L. sanfranciscensis,
soprattutto se queste derivassero da “contaminazioni” vigorose (es., 1010 UFC/gr).
(b)
dF/dT
dF/dT
dF/dT
(a)
(c)
FIGURA 4.8 Curve di melting del DNA batterico amplificato e analizzato con le analisi
HRMqPCR. (▲) L. rossiae; (●) L. graminis; (---) L. plantarum; ( _ _ _) L. sanfranciscensis;
(
) PM iniziale; (
) 1° RS; (
) 2° RS; (
) 3° RS.
158
4.3.5. Messa a punto di un metodo HRMqPCR per analizzare
l’evoluzione della popolazione fungina
Abbiamo poi messo a punto un metodo HRMqPCR per la popolazione fungina,
utilizzando diversi tipi di primer.
Inizialmente essi sono stati Yeast-R e Yeast-F (cfr. § 4.2.5.2). Analizzando le curve dei
DNA fungini (figura 4.9), è sembrato che la regione amplificata da questi primer non sia
utile al nostro scopo, dato che le diverse sequenze nucleotidiche non sono
sufficientemente variabili per farci ottenere delle curve di melting diverse al differire
della specie.
In tutti i casi si osservano Tm di 78°C (figura 4.9).
1,4
dF/dT
(a)
1,2
1
159
0,8
0,6
0,4
0,2
0
76
77
78
79
80
81
82
83
84 T(°C) 85
FIGURA 4.9 Curve di melting del DNA di 3 diverse specie fungine ottenute con la tecnica
HRMqPCR utilizzando i primer Yeast-R/ Yeast-F.
La seconda prova è stata effettuata utilizzando invece la coppia di primer NL1, LS2 (cfr. §
4.2.5.2). Grazie all’uso di questi primer è stato possibile questa volta distinguere le
diverse specie fungine, dato che i loro DNA sono caratterizzati da T m piuttosto differenti
(figura 4.10, tra 81 e 82°C W. anomalus; 82.5°C; Aureobasidium protae; 82.2°C ceppi di S.
cerevisiae).
dF/dT
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
80
81
82
83
T(°C)
84
85
FIGURA 4.10 Curve di melting da analisi HRMqPCR (primer NL1 / LS2). In verde i diversi
ceppi di S. cerevisiae, in blu Aureobasidium protae e in viola i due ceppi di W. anomalus.
Dopo aver valutato tali primer come “idonei” per l’ottenimento di ciò che volevamo
ottenere, abbiamo analizzato tutti i campioni di DNA delle diverse paste madri ex novo ai
diversi RS.
Comparando tutti i campioni al 1° RS, si osserva come la popolazione fungina sia
piuttosto eterogenea, e come tutti i campioni differiscono tra loro (figura 4.11 - a). Al 10°
RS si distingue invece quasi sempre un solo picco (83°C), associabile a ceppi di S.
cerevisiae (figura 4.11 - b).
2,5
(a)
(b)
dF/dT
2,5
2
2
1,5
1,5
1
1
0,5
0,5
0
0
80
82
84
86
88
T (^C) 90
80
82
84
86
88
T (^C) 90
FIGURA 4.11 Curve di melting ottenute attraverso HRMqPCR (primer NL1- LS2). (a) tutti i
campioni al 1° RS; (b) tutti i campioni al 10° RS.
160
Nella maggior parte dei casi, dopo 5 RS si ottiene la stabilità della popolazione fungina.
Nella figura 4.12 è rappresentata la popolazione della PMEN FdM, durante alcuni RS (1°2°-3°-6°-8°). Come nel caso della popolazione batterica, anche quella fungina è
caratterizzata – sembra – da variazioni temporali delle specie. Avendo isolato e
identificato solo le specie presenti al 4° RS, possiamo solo avere un’idea del numero
delle specie presenti, a non sempre siamo in grado di identificarle.
dF/dT
2,5
(b)
2
1,5
1
0,5
0
79
81
83 T (^C)
85
FIGURA 4.12 Curve di melting ottenute attraverso analisi HRMqPCR con i primer NL2-LS1
del DNA fungino estratto dal campione FdM in 5 diversi RS: (◦) 8°; (- -) 6°; (=) 2°; ( . . . ) 3°;
(─) 1°.
Per confermare l’attendibilit{ del metodo anche con le specie fungine, abbiamo voluto
analizzare allo stesso modo il DNA degli altri funghi (lieviti) isolati durante questa
indagine (figura 4.13). Si osserva come in quasi tutti i casi la temperatura di melting sia
differente, e tale risultato conferma la validità del metodo.
161
dF/dT
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
80
81
82
83
84
85 T(°C)
86
FIGURA 4.13 Curve di melting di alcune specie di lievito isolate dai campioni di PM T
durante questo lavoro. In viola W. Anomalus; in arancio Chriptococcus sp.: in rosso S.
unisporus; in azzurro S. delbrueckii; in verde S. cerevisiae; in nero S. barnetti.
162
4.3.6. Aromi nelle PM E N
Nei campioni analizzati (24 h di esposizione alla fibra) si osserva la presenza di
numerosi picchi associabili ad alcoli, alcani, alcheni, alcoli superiori, esteri, aldeidi.
Il campione che si distingue maggiormente dagli altri sembra essere quello ottenuto con
FdM: in esso, infatti, si è osservata la presenza esclusiva di diversi composti, come l’acido
ottanoico, il decanale (dolce, aldeidico, ceroso, buccia-d’arancia, fiore-d’agrume) il 2,4nontadienale, il ciclo-ottano, il 2,4-decandienale, l’eptadecano il pentacosano, del 6tetra-decanone, l’estere di-butilico dell’acido pentanedioico, l’1-tridecano, l’eicosano.
Molto probabilmente la composizione aromatica così variegata, è dovuta alla diversa
popolazione batterica di questo campione. In FdM, infatti, oltre a S. cerevisiae sono
presenti 2 ceppi lattici (L. plantarum e L. rossiae), uno etero-fermentante facoltativo e
l’altro etero-fermentante obbligato.
Nel campione SA ritroviamo invece altri composti particolari, anch’essi esclusivi:
l’ossirano (ossido di etilene), l’esadecile, l’acido ottanoico, il 3-metilbutilestere, il
ciclopentano, l’1-metil-2-metilene (forse derivato alla presenza, in questa PM di L.
graminis).
Tipici di tutti i campioni sono invece l’etanolo, l’etilacetato, l’1-esanolo, l’acido acetico,
l’estere esilico, l’1,3-esanediene, il fenil-etil-alcol (dolce, floreale, sapore di pane con una
sfumatura di miele), gli esteri etilici dell’acido ottanoico (vino fruttato, ceroso, albicocca
dolce, banane, pere), e dell’acido nonanoico (fruttato, rum, ceroso, naturale, tropicale).
163
DISCUSSIONE
L’ottenimento delle PMEN, ci ha fornito l’interessante possibilità di valutare come le
popolazioni batteriche e fungine si selezionino naturalmente dopo un inoculo. Tali
campioni sono stati ottenuti seguendo una particolare ricetta e variando un solo
l’ingrediente–di–inoculo, da noi denominato “sorgente naturale microbica” (SNM).
E’ stato quindi possibile valutare, crediamo per la prima volta, l’influenza di inoculi
diversi sullo sviluppo del microbiota dei vari campioni.
La selezione microbica è stata valutata monitorando la variazione delle specie
microbiche presenti nei vari RS. Oltre ai tradizionali metodi, è interessante evidenziare
l’impiego per la prima volta crediamo, della recente metodologia di PCR quantitativa
(HRMqPCR), non solamente per identificare una specie, ma per monitorare la presenza
di una popolazione microbica (batterica o fungina) analizzando il DNA totale estratto dal
campione.
L’utilizzo di questi inoculi naturali (SNM), popolati–è noto–da lieviti e batteri (lattici e
acetici), ha consentito a popolazioni microbiche iniziali piuttosto vaste (e
potenzialmente capaci di colonizzare gli impasti) di evolvere facilmente verso
popolazioni stabili, auto-selezionatesi per il carattere tecnologico da noi desiderato:
l’incremento del volume delle paste quanto più rapido possibile.
E’ interessante notare che, a differenza di quanto osservato in PM EN ottenute da semplici
impasti farina/acqua (Lönner et al., 1986), non si osserva nelle nostre paste (neanche
nei primissimi stadi della colonizzazione), alcuna micrococcacea, né specie
endosporigena del genere Bacillus.
Da subito, infatti, le popolazioni sono state acidificanti, e quindi escludenti in linea di
massima, ogni batterio non acidofilo/acidotollerante. Ciò ha consentito di risparmiare
passaggi e rinfreschi selettivi.
Abbiamo inoltre osservato che la popolazione dei batteri acetici (Gluconobacter,
Acetobacter) scompare dopo il secondo RS, e che la popolazione lattica invece, si affermi
proprio da questo momento. Crediamo che questo possa dipendere dalla metodologia di
propagazione impiegata: un rinfresco ogni 48 ore (Tamb), quindi, evidentemente non
fornisce sufficiente ossigeno per poter garantire a queste popolazioni una sopravvivenza
adeguata. Dopo ca. 6 RS, infatti, in tutti i campioni la popolazione batterica era formata
164
di soli LAB, ed è risultata stabilizzata. Abbiamo riscontrato la presenza, in tutte le paste,
di S. cerevisia senza altri lieviti. Nel caso dei batteri si ritrovava L. plantarum associato a
L. rossiae, oppure il solo L. graminis, oppure ancora l’esclusiva presenza di L.
sanfranciscensis.
Abbiamo poi attuato alcune co-fermentazioni delle 4 specie batteriche senza lievito, per
valutare se
tra queste ve ne fosse almeno una capace di prevalere. Interessante
osservare che, in linea con quanto osservato in altre occasioni (Gobbetti & Corsetti,
1997), L. sanfranciscensis è risultato prevalere in ogni esperimento, indipendentemente
dal tipo di farina utilizzata. Come già ipotizzato, L. sanfranciscensis è fisiologicamente
adatto all’habitat-PM, forse anche a causa della capacità di fosforilare il maltosio e della
sua pronunciata attività proteolitica (Corsetti et al., 2007). Infine, occorre ricordare che
questi campioni sono molto simili agli impasti di tipo-Ia (classificazione di Stolz; 1999),
dato che sono piuttosto liquidi e propagati ogni 2 gg. Stolz (1999) sottolinea infatti che
tali impasti sembrano favorire la crescita di L. sanfranciscensis.
165
5
5.1
Birre acide inoculate con PM
Introduzione
5.1.1 La birra e i suoi legami con la pasta madre
La storia della birra viaggia di pari passo a quella del pane, forse anche perché le materie
prime per ottenere questi due prodotti sono le stesse: i cereali e l’acqua, a cui segue la
fermentazione microbica.
Vi sono numerose leggende che legano questi due prodotti: una di queste si riferisce alla
nascita della pasta madre e quindi del pane. Tale leggenda fa riferimento al popolo
Egizio. Si sosteneva che una schiava fece cadere per sbaglio della birra sull’impasto per
ottenere il pane e vide che progressivamente questo aumentava di volume.
E’ interessante ricordare, inoltre, che S. cerevisiae, inteso come starter colturale per le
fermentazioni, è denominato lievito di birra (brewing yeast) o lievito per panificazione
(baker’s yeast).
Ai primordi della sua produzione, venivano utilizzati diversi tipi di cereali, e le
fermentazioni erano spontanee, operate sia da lieviti che da batteri e, per la sua
conservazione, si utilizzavano delle miscele di spezie.
Il luogo di origine della birra, è probabilmente il Mediterraneo, dalle popolazioni della
Mesopotamia nel 4000 a.C. (Kiple & Ornelas, 2000). Sembra che fossero in grado di
ottenere 19 tipi di birra variando il cereale impiegato (orzo, farro o una miscela dei due),
il quantitativo, le erbe aromatiche utilizzate (es., salvia e rosmarino), e il miele aggiunto.
Nei “Codici di hammurabi” (1728-1686 a.C.) si leggono descrizioni molto dettagliate sul
procedimento di lavorazione di questa bevanda che nei suoi punti essenziali è ancora
valido. Per cui in Mesopotamia la produzione della birra era sotto stretto controllo dello
Stato. Veniva condannato a morte chi non rispettava i criteri di fabbricazione indicati
(es., annacquava la birra).
Molte leggende sottolineano il grande consumo da parte dei re di questa “bevanda che fa
vedere chiaro” come veniva chiamata dai sumeri (ser-bar-bi-sag).
Gli antichi Egizi facevano largo uso di birra, e la consideravano un alimento e una
medicina. Vi sono notizie certe sulla produzione egizia di tre tipi di birra: la zythum,
birra chiara, la curmy, birra più scura e la sà birra ad alta gradazione e riservata ai
166
faraoni e per le cerimonie religiose. Moltissimi i reperti archeologici che ci illustrano e
raccontano delle usanze e del rapporto che gli egizi avevano con questa bevanda (es.,
vasi da birra e papiri).
Invece, sull’isola di Creta, birra e vino erano in competizione; la birra era chiamata
“Bruton”. I greci e i romani, invece, prediligendo il vino, non producevano birra, bensì la
importavano, i greci dai mercanti fenici, i romani dalle loro province (terre conquistate).
In Grecia la si consumava durante i giochi olimpici poiché era vietato bere vino o nei riti
sacri alla dea Demetra, a Roma il consumo era limitato ma aveva un impiego nella
cosmesi. I Celti e i Germani, invece, diffusero questa bevanda nel Nord Europa.
Queste prime birre erano più dense e dal sapore dolciastro rispetto a quelle che
conosciamo oggi, tanto da potersi definire “pane liquido”.
Il medioevo è stato un momento storico molto importante per questa bevanda, infatti,
per la prima volta si aggiunse il luppolo38 alla sua produzione, ottenendo una birra molto
più simile a quelle di oggi. La presenza del luppolo permetteva alla birra di schiarirsi, di
decantarsi, di diventare più liquida e quindi più una bevanda che un cibo (come prima
era considerato). Le infiorescenze femminili del luppolo conferivano un sapore amaro
che contrastava il dolce prodotto dagli zuccheri dei cereali e permetteva una migliore
conservazione nel tempo. Inoltre, in questo modo non è stato più necessario adoperare
le spezie aromatiche (es., rosmarino, ginepro, resine, verbena). Interessante ricordare
che nel Medio Evo sembra che le migliori birre venissero realizzate in prossimità delle
panetterie (Meussdoerffer, 2009).
Verso la fine dell'800, le scoperte di Luis Pasteur sul lievito spianarono la strada al
microbiologo Emil Christian Hansen, ricercatore presso i laboratori della danese
Carlsberg, che nel 1883 riuscì a ottenere una coltura pura di lievito, permettendo di
utilizzarla come starter e avere più controllo sulle birre prodotte (Meussdoerffer, 2009).
Durante il XX secolo la progressiva industrializzazione delle birrerie, e l’aumentata
concorrenza, ha spinto al miglioramento della produttività cercando di mantenere bassi
i prezzi, ciò ha portato a una standardizzazione dei processi e dei prodotti con la
progressiva perdita di sapori e stili tradizionali.
Si utilizzano le infiorescenze femminili non fecondate della pianta Humulus lupulus; una pianta dioica
appartenente alla famiglia delle Cannabaceae.
38
167
Oggi, come nel caso della pasta madre, si sta assistendo a un nuovo interesse per la
produzione tradizionale della birra.
Importante da ricordare il Birrificio Menaresta (Carate Brianza; MB), che tra le altre
birre artigianali produce la BIRRA MADRE (figura 5.1): una birra di ispirazione Belga e
fermentata con una pasta madre della zona. A livello scientifico queste tipologie di birre
non sono state ancora studiate e non se ne conosce l’evoluzione microbica e tecnologica.
FIGURA 5.1 Birra Madre, del birrificio artigianale Menaresta (MB). “Birra chiara
leggera tipo Lambic, più delicata, meno estrema, fatta fermentare con il lievito madre da
panificazione” [dal pieghevole 2013 del birrificio Menaresta].
5.1.2 I microrganismi nella birra
La normativa italiana (n. 1354 del 1962 e successive modifiche) descrive la birra come il
prodotto "ottenuto dalla fermentazione alcolica con ceppi di Saccharomyces
carlsbergensis e Saccharomices cerevisiae dei mosti preparati con malto d'orzo anche
torrefatto e acqua amaricati con luppolo". Inoltre, la fermentazione alcolica del mosto
può essere integrata con una fermentazione lattica.
5.1.2.1 I lieviti:
La maggior parte dei lieviti impiegati nella produzione della birra convenzionale,
appartengono al genere Saccharomyces (Tenge, 2009). Due sono le specie di
Saccharomyces impiegati come starter nella produzione della birra: i lieviti così detti “ad
alta fermentazione” (top fermenting yeast; es., ale, Stout, Weizen), e i lieviti così detti “a
bassa fermentazione” (bottom fermenting yeast; es., lager, Pilsner, Bock e Märzen). I primi
appartengono alla specie S. cerevisiae, mentre i secondi appartengono alla specie S.
pastorianus (ex., S. carlsbergensis).
168
I lieviti ad alta fermentazione durante la fermentazione (temperatura ottimale ca. 20°
C), hanno la caratteristica di salire sulla superficie del mosto, formando uno strato
spesso di schiuma. Queste tipologie di birre hanno un profilo aromatico ricco in esteri,
che ricordano profumi fruttati e floreali.
I lieviti a bassa fermentazione, invece, tendono a depositarsi sul fondo del fermentatore
quando la fermentazione (temperatura 7-15°C) sta volgendo al termine. Le birre così
prodotte hanno un profilo aromatico più delicato ed esaltano maggiormente le note del
malto (caratterizzate da un aroma parzialmente solforoso; Dufour 2003). Necessitano di
un periodo di maturazione a bassa temperatura più lungo di quelle precedentemente
descritte.
Oltre alle specie sopra menzionate, per alcune birre speciali a fermentazione spontanea
si ritrovano altre specie fungine appartenenti al genere Brettanomyces (es.,
Brettanomyces bruxellensis e Brettanomyces anomalus; Sparrow, 2005), che sono capaci
di utilizzare le destrine come substrato di crescita; questi lieviti crescono spesso in
associazione con altri lieviti e/o con LAB. Interessante ricordare che un ceppo di
Brettanomyces è stato isolato nel 1904 da una birra Inglese in tarda fermentazione
(Henschke et al., 2007).
Altre specie di lievito ritrovate nelle birre a fermentazione spontanea appartengono ai
generi Candida, Cryptococcus, Pichia, Hansenula e Kloeckera.
5.1.2.2 I batteri
I batteri enterici appartenenti alla famiglia delle enterobacteriaceae, sono uno dei gruppi
batterici che possono fermentare il malto nei primi stadi dei processi per birre a
fermentazione spontanea. Alcuni dei principali generi coinvolti sono Escherichia,
Shigella, Yersinia, Morganella, e Samonella (Priest & Campbel, 1987). Sono Gram- e in
grado di metabolizzare il glucosio producendo acido lattico, ac. acetico e etanolo e CO2.
Non utilizzano il maltosio e il maltotrioso. Consumano gran parte degli amminoacidi
presenti nel mosto e peptidi influenzando notevolmente l’aroma del prodotto.
Producono composti solfurici (DMS), carbonili e fenoli; sebbene alcuni di questi vengono
persi durante le successive fermentazioni, una fermentazione enterica influenza l’aroma
del prodotto finito. Crescono a pH superiori di 4,3, e contenuto alcolico non superiore al
2%.
169
Nelle birre a fermentazione spontanea o birre acide è cruciale la fermentazione lattica
guidata dai batteri lattici. I principali LAB identificati nelle birre acide sono appartenenti
ai generi Lactobacillus, Pediococcus anche se specie appartenenti al genere Lactococcus
(Lactococcus lactis subsp. Lactis; Haggblade & Holzapfel, 1989) sono state isolate da
birre di sorgo del Sud Africa. Nel genere Lactobacilus le specie maggiormente isolate
sono L. delbrueckii (omolattico) e L. brevis (eterolattico). Nel genere omolattico
Pediococcus, le specie P. parvulus e P. damnosus hanno ceppi che sembrano
particolarmente resistenti ai composti antimicrobici del luppolo.
Infine, in alcune fermentazioni spontanee si assiste alla fermentazione acetica dovuta a
batteri del genere Gluconobacter o Acetobacter. Si assiste così alla trasformazione
dell’etanolo in acido acetico. Ciò comporta un ulteriore abbassamento di pH e
soprattutto a un aumento dell’acidit{ volatile.
170
5.1.3 Birre a fermentazione spontanea - birre acide - la Lambic
La Lambic è una birra caratterizzata da un inoculo spontaneo di lieviti e batteri (figura
5.2). Questa tipologia di birra è prodotta in Belgio, nella regione del Pajottenland. E’ un
prodotto di antica tradizione, che viene tutt'oggi apprezzato da molti consumatori.
Le principali specie microbiche che si ritrovano comunemente appartengono ai generi
Saccharomyces, Brettanomyces, Pediococcus, Lactobacillus e Acetobacter.
Il processo fermentativo può essere suddiviso in 4 diverse fasi, dominate da 4 diversi
microrganismi. La prima fase è dominata dal lievito K. Apiculata e dai batteri enterici; la
seconda da Saccharomyces (Verachtert et al., 1989); la terza da LAB, e nell’ultima fase
prendono il sopravvento specie del genere Brettanomyces.
K. apiculata, raggiunge la massima concentrazione di 105 UFC/mL alla prima settimana
di fermentazione, questa specie di lievito è velocemente soppiantata da specie di
Saccharomyces. K. apiculata può solo fermentare il glucosio e non il maltosio presente
nel mezzo. K. apiculata e le Enterobacteriacea causano un abbassamneto di pH (5,1
4,6) in quanto producono acido acetico e lattico. K. apiculata ha la capacità di secernere
proteasi che idrolizzano le proteine non precipitate precedentemente.
La terza fase di fermentazione è dominata dai LAB e dai batteri acetici che conferiranno
alla birra la caratteristica acidità. La maggior parte dei LAB coinvolti appartengono al
genere Pediococcus. Non tutti i ceppi di Pediococcus conferiscono benèfici alla birra,
alcuni hanno l’abilit{ di produrre EPS (birre viscose e translucide; Van Oevelen &
Verachtert, 1979). I batteri acetici
convertono l’etanolo in acido acetico causando
un’elevata acidit{ volatile, non sempre apprezzata in questo tipo di birra.
Dopo ca. 8 mesi, la terza e ultima fase è caratterizzata da un aumento del numero di
cellule di lievito (Brettanomyces sp.) che influenzerà lo sviluppo dell’aroma della birra.
Brettanomyces può convertire gli acidi in esteri, producendo etil acetato ed etil lattato,
composti che influenzano gradevolmente l’aroma della birra (De Keersmaecker, 1996).
Importante è anche l’abilit{ dei Brettanomiceti di sintetizzare gli etil-fenoli (es., 4etilfenoli e 4-etilguaiacolo) e i vinil-fenoli (Heresztyn, 1986).
171
FIGURA 5.2 Evoluzione di etanolo (1), acido lattico (2), etilacetato (3), pH (4), estratto
totale (5) e acido acetico (6) in una birra artigianale a fermentazione spontanea, di tipo
Lambic (Van Oevelen et al., 1977). Messi in evidenza anche i microrganismi dominanti nelle
diverse fasi fermentative.
172
5.1. Materiali e metodi
5.2.1 Conte e identificazioni microbiche nei campioni di pasta madre
Le identificazioni molecolari sono state svolte a partire dalle colture pure dei ceppi
isolati (cfr. § 2.2.6.2). Le conte microbiche dei campioni di pasta madre e nelle birre
durante i giorni di fermentazione sono stati eseguiti come descritto nel paragrafo
2.2.1.2, a eccezione del fatto che per l’isolamento dei lieviti è stato utilizzato sia il
terreno di coltura YPDac., sia ME-agar (estratto di malto 3% e agar 1,8%).
5.2.2 Preparazione dei campioni di PM e inoculo nel mosto
Le paste madri scelte sono sia campioni di PM T, sia campioni di PMEN. Le paste madri
rinfrescate consecutivamente per 3gg utilizzando farina 00 e DY=200, perciò con
popolazione microbica attiva metabolicamente sono state sottoposte ad un particolare
rinfresco. Il rinfresco preparatorio all’inoculo è caratterizzato dall’utilizzo di un’elevata
quantità di acqua. PM:FARINA:ACQUA = 1: 0,2: 4. Questo impasto semi-liquido è stato
posto in una beuta e posto in cella fredda per 48 h per favorire la separazione tra fase
solida e fase liquida. La fase liquida è stata prelevata e filtrata con pezzi di tessuto di
cotone sterile. Un volume di 125 ml di sospensione sono stati inoculati in 4 L di mosto
(3%).
5.2.3 Nuova ricetta per ottenere birre acide a partire da pasta madre
La procedura impiegata per l’ottenimento delle birre, utilizzando come starter i nostri
campioni di pasta madre, è spiegato in dettaglio nella tesi di laurea del Dott. Matteo
Tomassetti (2012).
5.2.4
Parametri tecnologici: la densità e il pH
Il densimetro è stato utilizzato per misurare il progresso della fermentazione in modo
indiretto. Viene infatti analizzato il progressivo diminuire della densità del mosto. Il
densimetro è un galleggiante di vetro che termina con un’asta graduata, che indica i Kg
di zuccheri presenti per ogni litro (considerando che la densit{ dell’acqua è 1000). Tanto
più si immerge il densimetro, tanto meno il liquido è denso. Il pH è stato determinato
attraverso l’utilizzo del pH Meter Basic 20 (Crison). Misurando questi valori durante i
173
giorni di fermentazione è stato possibile realizzare delle curve della densità e
dell’acidificazione.
5.2.5
Analisi HS-GC-MS
Le analisi gas-cromatografiche sono state effettuate presso l’istituto “E. Fermi” a Fermo.
Il protocollo utilizzato è lo stesso del capitolo 2.2.7.
174
5.2. Risultati
5.3.1. Birra ottenuta con la pasta madre tradizionale “K”
Per la pasta madre “K”, originaria della Sardegna, l’identificazione microbica ha rilevato
la presenza di un ceppo della specie S. cerevisiae e di un ceppo LAB di L. sanfranciscensis.
Le analisi microbiologiche dei campioni hanno rivelato come la popolazione dei lieviti e
dei batteri abbia subìto un cambiamento durante la fermentazione nel mosto. La
popolazione di lieviti e batteri, infatti, ha quasi sempre mostrato un rapporto di 1:100
(lieviti : batteri), sin dall’inizio della fermentazione. Come si vede, tali rapporti sono
opposti a quelli presenti all’interno delle paste madri, e discrepanti rispetto al primo
prelievo nelle altre tre fermentazioni.
Da 5-log UFC/ml iniziali, i lieviti sono aumentati, nei primi 8 gg di fermentazione, di
quasi 3 ordini di grandezza, per poi diminuire lentamente fino al 40° giorno, a partire
dal quale si rileva un plateau numerico (5 log UFC/ml). Nei primi 8gg, anche i batteri
sono aumentati da 3 log UFC/ml, fino a 6 log UFC/gr, per poi diminuire fino a un plateau,
che incomincia dopo il 23° giorno (3 log UFC/ml).
FIGURA 5.3 Evoluzione della densità del mosto (verde) durante la fermentazione della
birra inoculata con la PM T “K”, a confronto con la popolazione dei lieviti (rosso) e dei
batteri (azzurro, batteri).
Mettendo in relazione l’evoluzione della microflora con la densit{ zuccherina del mosto
(figura 5.3) si osserva come quest’ultima diminuisca molto velocemente nella prima
settimana di fermentazione. Tale andamento è correlato alla maggiore crescita
microbica osservata in questi giorni, e quindi all’elevato consumo zuccherino durante la
175
prima settimana. Allo stesso modo, comparando l’evoluzione del pH con l’evoluzione
della popolazione microbica si osserva come l’abbassamento di pH segua la crescita
microbica. Il pH più basso si registra infatti contemporaneamente alla massima crescita
microbica (figura 5.4).
FIGURA 5.4 Evoluzione del pH (verde) durante la fermentazione della birra inoculata con
la PM T “K”, a confronto con la popolazione dei lieviti (rosso) e dei batteri (azzurro,
batteri).
Dalle analisi gascromatografiche degli spazi-di-testa, questo campione appare ricco di
composti volatili, tipici delle birre Lambic (es., etilcaprato, etilcaprilato), ma si
riscontrano anche aromi particolari come quello di canfora.
176
5.3.2 Birra ottenuta con la pasta madre tradizionale “AA”
La pasta madre AA ci è stata donata da una famiglia (tabella 2.3). Dalle nostre
identificazioni (cfr. § 2.3.4.3) sappiamo che la popolazione di questo campione è formata
da 3 ceppi lattici e 2 lieviti: L. plantarum (AA4); P. pentosaceus (AA3); W. cibaria (AA1);
S. cerevisiae e W. anomalus. Per inciso, si noti che W. cibaria è un ceppo EPS+.
L’evoluzione microbica nel mosto-AA sembra essere più complessa. I lieviti partono con
una concentrazione cellulare (UFC/ml) di ca. 3 ordini di grandezza inferiore rispetto ai
batteri. Dopo 8 gg si osserva una leggera diminuzione della popolazione batterica
mentre i lieviti iniziano a crescere e passano da 3-log UFC/ml a ca. 5-log UFC/ml. Dopo
ca. 16 gg, i lieviti raggiungono la massima concentrazione: 7-log UFC/ml, e il rapporto
tra lieviti e batteri comincia a essere a favore dei lieviti.
177
FIGURA 5.5 Evoluzione della densità del mosto (verde) durante la fermentazione della birra
inoculata con la PM T “AA”, a confronto con la popolazione dei lieviti (rosso) e dei batteri
(azzurro, batteri).
Mettendo a confronto l’evoluzione della microflora con la densit{ del mosto (figura 5.5)
si osserva come questo campione sembra avere due momenti in cui la densità
diminuisce velocemente. Il primo corrisponde alle prime fasi della fermentazione, il
secondo al picco di crescita dei lieviti.
Analogamente alla densità, anche il pH ha il suo picco minimo nel momento in cui si è
raggiunta la massima densità cellulare dei lieviti (figura 5.6).
FIGURA 5.6 Evoluzione del pH del mosto (verde) durante la fermentazione della birra
inoculata con la PM T “AA”, a confronto con la popolazione dei lieviti (rosso) e dei batteri
(azzurro, batteri).
Dalle analisi gascromatografiche si è notata la presenza di etil caprato, etilcaprilato e di
estere etilico dell’acido decanoico. Questi composti sono gi{ stati riscontrati nelle birre
Lambic (Sparrow, 2005) e sono aromi fruttati con sentore di albicocca, ananas, banana,
ecc.. Molto interessante è risultata la presenza dell’alcol benzilico che è collegato al
profumo di rose.
178
5.3.3 Birra ottenuta con la pasta madre ex novo “CB”
Il campione di PMEN “CB” è caratterizzato da una popolazione microbica più eterogenea.
Le identificazioni molecolari dei batteri isolati da questa pasta madre hanno rivelato la
presenza di Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus crustorum, Lactobacillus pentosus,e
Pediococcus pentosaceus. Due ceppi appartenenti a S. cerevisiae.
Dalle analisi microbiologiche sul mosto durante la fermentazione abbiamo osservato che
nel campione-CB la popolazione microbica iniziale è di 3 ordini di grandezza a favore dei
batteri che, da 7 log UFC/ml raggiungono il loro massimo a 8 log UFC/ml in una
settimana, per poi diminuire lentamente fino al 20° gg a partire dal quale poi, sembra
aumentare lievissimamente. Successivamente, la popolazione si riduce lentamente fino
alla sesta settimana (un dato non mostrato nella figura 5.7) in cui la popolazione
batterica è di ca. 3-log UFC/ml.
Nei primi 8gg, i lieviti del campione-CB aumentano di 3 ordini di grandezza (da 4 a 7 log
UFC/ml). In questo campione la popolazione lievitiforme e batterica mostra la massima
concentrazione cellulare in contemporanea, dopo 8 gg di fermentazione. Dopo il 14°, la
concentrazione dei lieviti vivi sembra superare quella dei batteri, e dopo 20 gg essa
rimane di 1 ordine di grandezza a favore dei lieviti (fino a 4 log UFC/ml).
FIGURA 5.7 Evoluzione della densità del mosto (verde) durante la fermentazione della
birra inoculata con la PM T “CB”, a confronto con la popolazione dei lieviti (rosso) e dei
batteri (azzurro, batteri).
La densità del mosto mostra una prima diminuzione in corrispondenza con la massima
crescita della popolazione microbica (8gg), e una seconda in corrispondenza con il
179
secondo picco batterico dopo ca. 20 gg (figura 5.7). Il pH ha il suo picco minimo a 8 gg
(figura 5.8).
FIGURA 5.8 Evoluzione del pH del mosto (verde) durante la fermentazione della birra
inoculata con la PM T “CB”, a confronto con la popolazione dei lieviti (rosso) e dei batteri
(azzurro, batteri).
Il profilo aromatico della birra-CB presenta anch’esso numerosi picchi corrispondenti ai
composti tipici delle birre Lambic, come l’ estere etilico, l’etil caprato, l’etilcaprilato,
l’etilbutirrato, l’estere etilico dell’acido decanoico. Molto interessante è la presenza del
carene e dell’alcol etilfenilico: il primo è tipico dell’olio essenziale di arancia dolce, il
secondo rientra nella composizione dell’aroma di rose.
5.3.4 Birra ottenuta con la pasta madre ex novo “PY”
Il campione di PMEN “PY”, ottenuto a partire da bacche di Pyracantha, risultava
contenere, al momento dell’inoculo nel mosto, L. curvatus, Leuc. Holzapfelii, oltre che S.
cerevisiae.
Il mosto con questo inoculo mostra una densità batterica iniziale di 4 ordini di
grandezza superiore a quella dei lieviti. Dopo 12 gg, invece, abbiamo potuto osservare
un rapporto di lieviti : batteri invertito. I primi raggiungono la massima concentrazione
a 7 log UFC/ml. I batteri sembrano invece continuare a diminuire fino a 3 log UFC/ml
fino a ca. 25 gg. Da questo momento in poi i batteri ricominciano a crescere fino a 4 log
UFC/ml, per diminuire infine di un’unit{ logaritmica.
Anche in questo caso il pH mostra il suo picco in corrispondenza della massima crescita
microbica.
180
FIGURA 5.9 Evoluzione della densità del mosto (verde) durante la fermentazione della
birra inoculata con la PM T “PY”, a confronto con la popolazione dei lieviti (rosso) e dei
batteri (azzurro, batteri).
181
FIGURA 5.10 Evoluzione del pH del mosto (verde) durante la fermentazione della birra
inoculata con la PM T “PY”, a confronto con la popolazione dei lieviti (rosso) e dei batteri
(azzurro, batteri).
Il profilo gascromatografico della birra-PY ha anch’esso mostrato la presenza di
numerosi composti volatili. Anche qui, molti i composti aromatici tipici delle Lambic,
come l’etilcaprilato, l’etilcaprato, l’estere etilico dell’acido decanoico, il nonenale, l’estere
isoamilico dell’1-ottanolo.
5.3.5 Evoluzione delle quattro birre a confront o
Mettendo a confronto le quattro birre, possiamo senz’altro mettere in evidenza alcune
interessanti differenze (figura 5.11). E’ interessante notare che, nel caso della
popolazione dei lieviti, la birra-K è quella che ha mostrato una più elevata densità
cellulare rispetto alle altre (poco più di 5 log UFC/ml). I campioni “PY” e “AA” invece,
hanno mostrato una densità cellulare dei lieviti di partenza più bassa (ca. 3 log UFC/ml).
In tutti i campioni abbiamo assistito a un aumento della concentrazione dei lieviti
presenti, e in uno dei campioni (AA) questo è risultato molto più lento, dato che la
massima concentrazione è stata osservata solo dopo ca. 17 gg. In tutti i campioni, dopo
ca. 40 gg, le conte dei lieviti si sono stabilizzate su un plateau di 1x104 UFC/ml.
Nel caso della popolazione batterica (figura 5.11-b), nella maggior parte dei campioni la
concentrazione iniziale è risultata essere superiore a 6 log UFC/gr a eccezione della
birra “K” in cui la concentrazione di batteri è risultata essere inferiore di ca. 3 ordini di
grandezza. Nei campioni “PY” e “AA” non si osservano incrementi cellulari batterici.
Dopo ca. 40 gg, in tutti i campioni le conte batteriche si sono stabilizzate su un plateau di
1x103 UFC/ml.
La variazione di pH (figura 5.11-c) è simile a quasi tutti i campioni: l’unico a differire è il
campione-AA, in cui la variazione è leggermente meno evidente. Inoltre, in “AA” e “PY”, si
osserva un aumento del pH a fine fermentazione, forse anche a causa dell’utilizzo del
lattato da parte dei lieviti presenti.
Nei primi 8 gg, la densità del mosto diminuisce in tutti i casi piuttosto velocemente, e
continua poi a diminuire, seppur più lentamente.
182
(a)
(c)
(b)
(d)
FIGURA 5.11 Confronto tra le quattro diverse birre (“AA”, blu, “PY”, rosso, “CB”, verde e
“K,” nero). In (a) i lieviti; in(b) i batteri; in (c) il pH; in (d) la densità.
183
5.4 Discussione
L’impiego come inoculo di paste madri naturali, per l’ottenimento di birre acide di tipo
Lambic sembra non essere mai stato studiato in letteratura, anche se abbiamo
conosciuto artigiani che producono birre così ottenute.
Interessante notare che tutte e quattro le paste madri impiegate a tale scopo hanno
risposto adeguatamente, dando origine ad attenuazioni apparenti piuttosto elevate.
L’evoluzione della popolazione microbica ha indicato, in quasi tutti i casi, una prevalenza
batterica iniziale, evidentemente dovuta all’inoculo iniziale (PM), e una successiva
predominanza dei lieviti. L’unica eccezione è apparsa essere quella del campione-K, in
cui fin dal principio si è assistito a una prevalenza dei lieviti, con un continuo rapporto di
100:1 a loro favore.
Nei campioni il pH non è mai sceso al disotto di 4.3; nelle birre Lambic, invece,
tipicamente il mosto viene acidificato maggiormente, anche se questo fatto è registrabile
soltanto dopo ca. 4 mesi). La popolazione batterica dei nostri campioni, quindi, seppur
presente, non è stata sinora predominante: probabilmente questo dipende dal fatto che
le Lambic derivano da fermentazioni spontanee, mentre nel nostro caso i campioni sono
stati inoculati con PMN, e perciò anche con lieviti. In tutti i campioni erano presenti ceppi
selvatici di S. cerevisiae.
Le analisi gascromatografiche hanno rilevato infine la presenza di alcuni composti tipici
nelle birre acide (es., etilcaprato, etilcaprilato, ecc.) altri invece particolari e tipici per
ogni campione. Le birre sono state analizzate quando ancora non mature, per cui per il
momento risultano poco appetibili, e con sentori fenolici talvolta preponderanti.
184
Ringraziamenti
Desidero ringraziare, in primo luogo, tutti gli artigiani e gli appassionati della pasta
madre che mi hanno donato un loro campione di pasta madre naturale, senza la loro
disponibilità non sarebbe stato possibile questo lavoro di dottorato.
Ringranzio il Prof. Enrico Berardi, mio supervisore per questo studio e mio primo
insegnante di microbiologia, per aver creduto nelle mie potenzialità, per avermi
sostenuto e per le sue grandi idee. Inoltre, è soprattutto merito suo se, durante questo
dottorato, sono riuscita a effettuare degli stage in altri laboratori di ricerca. In essi ho
potuto confrontarmi con altri coleghi, imparare nuove tecnologie e culture, crescere e
maturare.
Durante il primo anno di dottorato mi sono recata a Cremona presso il CRB
dell’Universit{ Cattolica del Sacro Cuore grazie al Prof. Lorenzo Morelli e alla
supervisione della Dott.ssa Marialuisa Callegari. Grazie anche alla Dott.ssa Vania Patrone
e della Dott.ssa Susanna Ferrari. A Cremona ho potuto iniziare i miei esperimenti sulle
paste madri ed effettuare le prime analisi molecolari per le identificazioni microbiche
(DGGE, identificazioni di alcuni batteri).
Il mio ultimo anno di dottorato l’ho trascorso, invece, quasi interamente all’Universit{
dell’Alberta (Canada), nel laboratorio del Prof. Michael Gänzle, che voglio ringraziare
immensamente per il tempo dedicatomi, la fiducia affidatami e tutti i suoi consigli.
Vorrei anche ringraziare tutti i ragazzi che ho conosciuto nel suo laboratorio: la vostra
disponibilità e amicizia mi accompagneranno sempre, Sandra Galle, Maria Wimmer,
Pasquale Filannino, Marlis Struchen, Yaunyao Chen.
Un ringraziamento particolare va anche alla mia “famiglia” canadese: Sandi Segal, Perry
Segal, Buddy il cane e tutti i loro figli e nipoti, per i momenti meravigliosi che abbiamo
trascorso insieme. Col il loro affetto hanno contribuito a rendere indimenticabile lo stage
in Canada.
Ringrazio la Prof.ssa Teresa Cecchi dell’ITIS Enrico Fermi di Fermo: è solo grazie al tuo
prezioso aiuto se sono riuscita ad analizzare gli aromi di tutti i nostri campioni.
Ringrazio Osvaldo e Paola del panificio “Panis Kòmaros” per il tempo che mi hanno
dedicato, e alle spiegazioni e illustrazioni del loro processo produttivo artigianale di
panificazione.
Infine un grande ringraziamento alla mia famiglia e ad Alessandro: il vostro importante
aiuto e sostegno sono stati di immenso valore per il compimento di questa tesi. Inoltre,
185
grazie per le attenzioni che mi avete dedicato durante il periodo in Canadese. Siete
riusciti a farmi sentire vicina anche se mi trovavo lontana.
186
Appendice I- Volantino della Comunità del Cibo della Pasta madre
187
Appendice II- Evoluzione del volume e del pH dei campioni di PM T
188
Appendice III- Profili aromatici di un campione di PM T “AA”
189
Appendice IV- Profili aromatici delle birre acide
190
191
Appendice V- Ceppi batterici pdc +
pdc+
CEPPO
LA1
BP5
CA1
LF3
MAXIII
UPRA
AM2
AA4
LR21
M7
CFA10
CFA4
AS3
AS1
AV1
LM01
SGL1
PM4
PM10
SP9
CVP2
SPECIE
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. rossiae
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. rossiae
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
Pediococcus pentosaceus
Leuc. holzapfelii
L. brevis
L. sakei
L. rossiae
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. rossiae
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
L. rossiae
L. guizhouensis
L.plantarum, L.paraplantarum, L. pentosus
192
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