Artemisia arborescens - Accademia delle arti erboristiche

La variazione della composizione degli oli essenziali e la
loro attività biologica:
Artemisia arborescens (dallo stadio vegetativo alla fine
della fioritura).
Luigi Ornanoa, Alessandro Vendittia, Mauro Balleroa, Cinzia Sannaa, Luana Quassintib, Massimo
Bramuccib, Giulio Lupidib, Fabrizio Papab, Sauro Vittorib, Filippo Maggib, Armanodoriano Biancoa.
a
Consorzio Interuniversitario CoSMeSe, Dipartimento di Scienze Botaniche, Università di Cagliari,
Dipartimento di Chimica, Università di Roma “La Sapienza”.
b
School of Pharmacy, University of Camerino, Camerino, Italy.
Introduzione
In questo lavoro ci si è proposti di effettuare l’ analisi
fitochimica dell’ Artemisia arborescens, con particolare
riguardo all’analisi degli oli essenziali e l’attività
biologica da essi espressa. L’organismo vegetale è stato
raccolto nel nord dell’isola della Sardegna, precisamente
nella zona a nord-ovest dell’ isola di La Maddalena. In
questo lavoro, l’organismo vegetale è stato raccolto in tre
periodi
differenti,
al
fine
di
poter
studiare
la
composizione degli oli essenziali in relazione allo stato
vegetato, all’inizio della fioritura e alla fine di questa. Gli
oli essenziali ottenuti appartengono al chemotipo βthujone/chamazulene, in particolare con la più alta
quantità di camazulene (~ 52%) rilevata fino ad ora in A.
arborescens. Il ciclo fenologico è in stretta relazione con
la composizione quantitativa degli oli essenziali e
rappresenta il passaggio da uno stadio vegetativo alle fasi di fioritura dell’organismo vegetale
oggetto di studio.
L’olio essenziale è stato sottoposto a test di attività biologica come
antiproliferativo, ovvero come inibitore di crescita su: cellule tumorali di glioblastoma T98G,
MDA-MB adenocarcinoma mammario 435s, A375 melanoma maligno, e HCT116 colon carcinoma di linee cellulari umane, mediante saggio MTT. La più alta attività è stata osservata
su A375 e HCT116 linee cellulari, con valori di IC50 di 14,28 e 14,62 mg / ml,
rispettivamente. Inoltre è stata valutata
l’attività di radical scavenger mediante l’inibizione
contro i radicali DPPH e ABTS; dall’analisi di tali test l’olio si è rivelato un efficace
antiossidante con attività paragonabile a quella del Trolox. Questi risultati supportano l'uso
dell'olio nel trattamento dell’infiammazione della pelle.
È stata eseguita l’analisi della frazione polare, per la prima volta in questo organismo vegetale,
il componente principale isolato ed identificato è stato l’acido 5-O-caffeoil-chinico.
Analisi dell’ olio essenziale
L’ Artemisia arborescens è un arbusto cespuglioso, cresce in ambienti ruderali, nella parte
meridionale del bacino del Mediterraneo, in terreni calcarei. È poco utilizzato nella medicina
popolare , non è inclusa nella farmacopea europea. L’ Artemisia arborescens è una composita
fruticosa che in Sardegna, assume una notevole importanza nella caratterizzazione del
paesaggio dato che si presenta abbondantemente diffusa riuscendo a colonizzare ambienti
assai diversi. La composizione degli oli essenziali è stata ottenuta dalle parti aeree dell’
A.arborescens raccolte nei tre periodi sopracitati, riportando un totale di cinquantotto
componenti volatili, corrispondenti al 87.4-96.1% dell’olio ottenuto per distillazione
in corrente di vapore. La frazione più abbondante è rappresentata dalla classe dei
sesquitepeni (32.0-55.3%) e dei monoterpeni ossigenati (37.7-57.7%), il chamazulene
(25.6-51.5%) e il β-thujone (33.8-53.20%) sono rispettivamente i maggiori
componenti. Gli altri componenti, prensenti in bassa percentuale(>1%) sono stati il
germacrene D (3.2-5.4%) e il (E)-caryophyllene (0.4-2.7%) fra i sesquiterpeni, e il
4-terpineolo (0.6-1.4%) fra i monoterpeni ossigenati. Nonostante l’abbondanza
dell’isomero cis del thujone (forma -β), la forma trans (α-thujone) era presente in
piccola percentuale (0.6-1.0%). È risultata importante nell’olio essenziale la presenza
di un diterpene sconosciuto (2.7-7.7%) (MW=286), il cui spettro di frammentazione
MS è attualmente oggetto di studio. L’ α- e β-thujone sono chetoni psicotropici, tipici
anche di altre specie del genere Artemisia, degno di nota è l’impiego come assenzio
(A. absinthium), la quale è impiegata per produrre bevande alcoliche (Leung & Foster,
1996). Il limite d’impiego è legato alla loro tossicità elevata, in Europa il livello
massimo di thujone nelle bevande alcoliche ed analcoliche è fissato tra 35 e 0.5
mg/kg, ripsttivamente (Regulation EC No 1334/2008). Recentemente, molte riviste
hanno riportato nuove attività farmacologiche legate a tali componenti in relazione al
loro profilo lipidico (cholesterol and triglycerides) in diabetic rats (Baddar, Aburjai,
Taha & Disi, 2011), in grado di inibire le metastasi delle cellule B16F-10 (Siveen &
Kuttan, 2011a) ed incrementare la risposta immunitaria dei ratti. (Siveen & Kuttan,
2011b). Il chamazulene è un composto azulenico, prodotto dalla degradazione della
matricina prodotta nelle foglie di camomilla (Matricaria recutita), essa è responsabile
del colore blu intenso del distillato ottenuto dalle foglie. Il Chamazulene è una delle
molecole più attive presenti nella camomilla. Degna di nota è l’attività
antinfiammatoria in vivo per inibizione della sintesi dei leucotrieni (Safayhi, Sabieraj,
Sailer & Ammon, 1994); l’inibizione della perossidazione lipidica (Rekka,
Kourounakis & Kourounakis, 1996). Il chamazulene risulta essere uno dei maggiori
costituenti degli oli essenziali di altre specie del genere Artemisia, a riguardo: A.
absinthium, A. arborescens, A. rehan, A. santonicum, A. copa, A. feddei (Abegaz &
Yohannes, 1982; Sacco, Frattini & Bicchi, 1983; Lopez Arze, Collin, Garneau, Jean &
Gagnon, 2004; Kordali, Cakir, Mavi, Kilic & Yildirim, 2005; Cha, Jung, Kil & Lee,
2007). In tali oli essenziali, il chamazulene risulta essere sempre tra i maggiori
costituenti, il campione da noi analizzato
costituenti,
(51.5%), oltre essere tra i maggiori
ha presentato un valore elevato mai riportato prima. La comparazione
della composizione degli oli essenziali ottenuti nei tre tempi di raccolta, Agosto,
Febbraio e Giugno, ci ha permesso di
rivelare significanti differenze nella
composizione molecolare. Il più alto contenuto di chamazulene (51.5%) è stato
ricavato in tarda estate (Agosto), mentre il β-thujone (53.2%) ha presentato il suo
maggiore contributo all’inizio dell’estate (Giugno). Gli oli essenziali ottenuti ad
Agosto hanno mostrato essere ricchi di sesquiterpeni (55.3%), mentre quelli ricavati in
Giugno risultano ricchi di monoterpeni ossigenati. In entrambi i casi il peso di tali
percentuali è discriminato dalla presenza di chamazulene e di β-thujone, in quanto essi
forniscono il maggior contributo. Rispetto al campione raccolto in Febbraio, i
campioni di Giugno ed Agosto mostrano il più basso contributo di sesquiterpeni
ossigenati (0.4-0.5 vs 3.1%) e diterpeni (2.9-3.9 vs 8.6%). Dal punto di vista
qualitativo, l’olio ottenuto a fine estate (Agosto) ha presentato un minor numero di
componenti rispetto al campione ottenuto a Febbraio e a Giugno, infatti sono stati
rivelati solo 23 componenti rispetto a 50 e 47 rivelati rispettivamente degli stadi di
raccolta precedentemente definiti. Tali differenze possono essere spiegate tenendo
conto del fatto che in tali
specie Mediterranee la componente volatile risulta
incrementata durante i primi mesi dell’anno fino al massimo che corrisponde al
periodo di fioritura (inizio estate), superato tale periodo la pianta subisce una
deidratazione con conseguente perdita della frazione volatile.
Precedentemente, la componente volatile dell’ A. arborescens colta nell’isola di La
Maddalena
(Sardegna),
è
stata
investigata
da
Biondi
and
coll.
(2000).
Sorprendentemente, la composizione dell’olio essenziale riportata si discosta molto da
quella eseguita in questo lavoro. Biondi and coll. Ottennero l’olio essenziale per
idrodistillazione dalle parti aeree (foglie e fiori) e hanno riportato come maggiori
costituenti: canfora (45.1%), isoborneolo (14.6%), e α-thujone (17.7%). Canfora
(13.0%) e β-caryophyllene (16.2%) come i maggiori costituenti, rispettivamente. Nel
campione di olio essenziale da noi analizzato canfora e isoborneolo sono risultati
totalmente assenti. Un altro fatto sorprendente riguarda il chamazulene, in tutti i
precedenti studi
non è stato rivelato mentre in questo lavoro risulta tra i maggiori
costituenti. In aggiunta è stata riscontrata la presenza di una frazione diterpenica
sconosciuta e che costituisce un’importante percentuale del campione analizzato.
Nonostante il numero di componenti rilevati era simile, solo 16 erano in comune tra i
due studi. Tra questi β-thujone è risultato il principale rappresentante nei nostri
campioni, mentre α-tujone (0,6-1,0%) non ha raggiunto gli alti livelli riportati nel
lavoro precedente (17,7%). Tali differenze confermano che il genere Artemisia mostra
un'elevata variabilità sia a livello intraspecifico che interspecifico con chemiotipi
diversi (Militello, Carrubba e Blázquez, 2012). La popolazione studiata sembra
appartenere a un tipo β-thujone/chamazulene, quindi molto diverso dal tipo
canfora/isoborneolo riportato in precedenza (Biondi, Valentini e Bellomaria, 2000).
Quest'ultimo era di una popolazione in crescita nella stessa zona ristretta della
Sardegna in cui è localizzata questa specie. Pertanto, altre indagini di diverse
popolazioni sarde sono necessari per chiarire la presenza di chemiotipi diversi
all'interno di questa taxon endemica localizzata.
Figura 1. Chamazulene e β-thujone.
Tabella 1. Composizione dell’Olio Essenziale delle parti aeree dell’ A. arborescens.
N.
Component
1
α-pinene
a
LRI lit.c
Calc.
LRIb
Adams
Nist 08
932
939
932
August
2011
%d
February
2012
Tr
f
2
sabinene
971
975
972
3
β-pinene
974
979
974
4
6-methyl-5-hepten-2-one
991
985
5
myrcene
991
990
991
6
α-phellandrene
1003
1002
1003
7
isobutyl 2-methylbutyrate
1004
8
α-terpinene
1017
9
iso-amyl iso-butyrate
1021
10
p-cymene
1026
1024
1026
11
β-phellandrene
1030
1029
1029
12
1,8-cineole
1033
1031
1033
13
γ-terpinene
1061
1059
1061
14
isopentyl butanoate
1065
1058
1064
15
cis-sabinene hydrate
1069
1070
1070
16
terpinolene
1087
1088
1087
17
trans-sabinene hydrate
1097
1098
18
α-thujone
1102
1102
19
2-methyl butyl-2-methyl butyrate
1107
1100
20
21
β-thujone
iso-3-thujanol
1114
1136
1114
1138
22
trans-sabinol
1141
1142
23
terpinen-4-ol
1176
24
α-terpineol
25
methyl salicylate
26
myrtenol
27
(3Z)-hexenyl 2-methyl butanoate
28
thymol, methyl ether
1237
1235
1237
Tr
29
cumin aldehyde
1239
1241
1239
Tr
1235
0.1
0.1
1004
1017
1017
Tr
1021
0.1
June
2012
0.2
IDe
Std
1.3
RI,MS
0.1
Std
0.1
RI,MS
0.1
Std
0.3
Std
Tr
RI,MS
0.2
Std
0.1
RI,MS
0.2
Std
Tr
RI,MS
0.1
0.2
Std
0.1
0.4
Std
Tr
RI,MS
Tr
0.6
RI,MS
Tr
0.1
Std
Tr
Tr
0.1
RI,MS
1102
0.6
1.0
1.3
Std
1107
0.1
0.2
0.7
RI,MS
1114
38.0
0.1
33.8
0.2
53.2
0.2
Std
RI,MS
Tr
0.1
Tr
RI,MS
1177
1175
0.6
1.4
1.0
Std
1190
1188
1190
0.2
0.6
0.6
Std
1192
1191
1192
1194
1195
1194
1237
1232
0.1
Tr
RI,MS
Tr
Tr
Tr
30
(3Z)-hexenyl 3-methyl butanoate
1241
31
2,3-dimethoxytoluene
1245
Tr
32
carvotanacetone
1247
1247
1247
0.1
33
perilla aldehyde
1271
1271
1271
0.3
34
eugenol
1358
1359
1358
35
α-copaene
1370
1376
1370
0.1
36
β-bourbonene
1377
1388
1377
0.1
37
β-cubebene
1384
1388
1245
Std
Tr
RI,MS
RI,MS
Tr
RI,MS
Tr
RI,MS
0.2
RI,MS
RI,MS
0.2
RI,MS
0.5
0.4
RI,MS
0.3
0.1
RI,MS
1384
Tr
Tr
RI,MS
Tr
Std
38
β-elemene
1387
1390
1387
0.3
RI,MS
39
(Z)-jasmone
1397
1392
1397
Tr
RI,MS
40
methyl eugenol
1409
1403
1409
0.2
0.2
0.2
RI,MS
41
(E)-caryophyllene
1409
1419
1411
0.4
2.7
1.3
Std
42
β-copaene
1421
1432
43
α-humulene
1445
1454
1444
44
selina-4(14),7(11)-diene
1469
45
46
germacrene D
β-selinene
1473
1477
1485
1490
1473
1477
47
γ-himachalene
1480
1482
1480
Tr
1469
0.1
Tr
RI,MS
0.2
0.1
Std
4.3
Tr
RI,MS
RI,MS
0.1
3.2
5.4
0.7
RI,MS
0.1
RI,MS
48
bicyclogermacrene
1487
1500
1487
Tr
0.2
0.1
RI,MS
49
δ-cadinene
1517
1523
1518
Tr
0.2
0.1
RI,MS
50
elemol
1544
1549
1544
0.4
0.3
0.4
RI,MS
51
caryophyllene oxide
1572
1583
1572
0.5
0.1
Std
52
neryl isovalerate
1585
1583
Tr
0.1
Tr
RI,MS
53
geranyl 2-methyl butanoate
1603
1601
Tr
0.3
0.1
RI,MS
54
geranyl isovalerate
1610
1607
0.4
1.8
1.0
RI,MS
55
junenol
1615
1619
1613
0.4
RI,MS
56
(Z)-methyl jasmonate
1647
1649
1652
0.3
0.1
RI,MS
57
α-bisabolol
1679
1685
1680
0.1
Tr
RI,MS
58
59
chamazulene
unknown diterpene (MW 286)g
1718
1997
1731
1718
51.5
Tr
34.2
0.7
25.6
0.2
RI,MS
MS
60
61
unknown diterpene (MW 286)g
2005
2082
3.9
7.7
0.2
2.7
MS
MS
96.1
87.4
95.9
0.4
2.9
unknown diterpene (MW 300)g
Total identified (%)
Grouped compounds (%)
Monoterpene hydrocarbons
a
Oxygenated monoterpenes
40.0
37.7
57.7
Sesquiterpene hydrocarbons
55.3
45.2
32.0
Oxygenated sesquiterpenes
0.4
3.1
0.5
Diterpenes
3.9
8.6
2.9
Others
0.3
1.0
2.3
Compounds are listed in order of their elution from a HP-5MS column.
Linear retention index on HP-5MS column, experimentally determined using homologous series of C8-C30 alkanes.
c
Relative linear retention index taken from Adams (2007) and/or NIST 08 (2008) libraries.
d
Percentage values are means of three determinations ± standard deviation.
e
Identification methods: std, based on comparison with authentic compounds; MS, based on comparison with WILEY,
ADAMS and NIST 08 MS database; RI, based on comparison of LRI with those reported in ADAMS and NIST 08.
f
Tr, % below 0.1%.
g
Tentative identification based on MS fragmentation pattern.
b
L’attività biologica degli oli essenziali dell’ A. arborescens
Attività antiproliferativa
L'olio essenziale di A. arborescens (campione di Febbraio) è stato sottoposto a test
vitro allo scopo di valutare l'effetto potenziale inibitorio sulla crescita delle cellule
tumorali su determinate linee cellulari, quali: la linea cellulare T98G glioblastoma, la
linea MDA MB-435s umana adenocarcinoma mammario, linea cellulare A375 umano
,linea cellulare di melanoma maligno, linea cellulare HCT116 umano, linea cellulare
di carcinoma del colon, mediante saggio MTT. I risultati mostrano che l'olio
essenziale presenta un variabile effetto inibitorio sulle cellule tumorali umane
esaminate. I dati mostrano che la più alta attività è stata osservata su linee cellulari
A375 e HCT116, con valori di IC50 di 14,28 ± 2,53 mcg / ml e 14,62 ± 1,79 mcg / ml,
rispettivamente. È stata ottenuta una bassa attività sulla T98G, con valore IC50 di
59,82 ± 1,76 mcg / ml. L'attività citotossica di olio essenziale di A. arborescens è stata
attribuita a componenti specifici del petrolio. I principali composti presenti nell'olio
essenziale sono thujone (33,8%), chamazulene (34,2%), e germacrene D (5,4%). Vi
sono pochi dati in letteratura relativi ad attività citotossica di questi composti. E 'stato
riportato che un estratto ricco di tujone di Thuja occidentalis esercita attività
citotossica, antiproliferativa e apoptotica sulla linea cellulare di melanoma maligno
A375 (Biswas, Mandal, Dutta, Bhattacharyya, Boujedaini e Khuda-Bukhsh, 2011).
Inoltre, il thujone può inibire la metastasi polmonare di linea cellulare di melanoma
topo B16F-10, attraverso l'inibizione della proliferazione delle cellule tumorali,
adesione, e l'invasione (Siveen & Kuttan, 2011). La presenza di thujone nell'olio
essenziale può parzialmente spiegare l'attività citotossica sulla linea cellulare di
melanoma umano. Attività antiproliferativa del germacrene D su linee cellulari contro
la MDA-MB 231, MCF7, Hs578T, PC-3 e Hep-G2 è stata riportata da Setzer et al.
(2006). In letteratura non sono disponibili dati in relazione alla citotossicità del
chamazulene.
Tabella 2. Test di citotossicità in vitro dell’olio essenziale delle parti aeree dell’ A. arborescens.
HCT 116
Essential oil
c
14.62 ± 1.79
Cell line (IC50a µg/mL ± SDb)
MDA-MB 435Sd
T98Ge
27.79 ± 3.17
59.82 ± 1.76
A375f
14.28 ± 2.53
Reference
Cisplatin
2.29 ± 0.1
7.37 ± 0.63
2.34 ± 0.13
0.18 ± 0.02
a
IC50 = The concentration of compound that affords a 50% reduction in cell growth (after 72 h of incubation).
b
SD = Standard deviation of four determinations.
c
Human colon carcinoma cell line.
d
Human breast adenocarcinoma cell line.
e
Human glioblastoma multiforme cell line.
f
Human malignant melanoma cell line.
Attività Antiossidante
L'olio essenziale di A. arborescens (campione Febbraio) ha presentato una rapida ed
efficace attività di scavenger contro le ABTS radicali, tale attività è risultata
paragonabile a quella del Trolox. Il valore di IC50 è stato 21,9 µ g / ml di olio
essenziale rispetto al 15,1 µ g / ml del Trolox. L’attività di Scavenging è un attributo
importante per le sostanze antiossidanti. ABTS, uno Scavenging Protone-radicale
presenta la caratteristica assorbanza massima a 734 nm, che diminuisce con
l'evacuazione dei radicali- protone (Mathew & Abraham, 2006).
Il lavaggio dei ABTS + radicale da olio essenziale di A. arborescens è risultato essere
molto maggiore di quella nei confronti del radicale DPPH. Fattori come
stereoselettività dei radicali o la solubilità dei campioni di prova in sistemi diversi
sono stati segnalati per influenzare la capacità di campioni di reagire togliere i radicali
diversi (Yu, Haley, Perret, Harris, Wilson & Qian, 2002). Wang e collaboratori
(Wang, Li, Rangarajan, Shao, La Voie, e Huang Ho, 1998) ha rilevato che alcuni
composti che hanno attività ABTS+ scavenging non ha mostrato inibizione nei
confronti del DPPH radicale. Il potenziale antiossidante dell'olio è stato stimato dalla
sua capacità di ridurre TPRZ-Fe (III)-TPTZ complesso Fe (II). La riduzione ferrico /
potere antiossidante (FRAP assay) è ampiamente utilizzata nella valutazione del
potenziale antiossidante dei polifenoli alimentari e attività antiossidante aumenta
proporzionalmente al contenuto di polifenoli. Il valore FRAP riportato per l'olio di A.
arborescens è stato di 147,7 (± 2,8) TE umol / g, relativamente più elevata rispetto a
quella del Trolox (399,53 mmol / g). Sulla base di questi dati si può concludere che
l'olio essenziale di A. arborescens presenta elevata capacità di scavenging o come
inibitore di radicali liberi così come un antiossidante primario reagisce con i radicali
liberi, che possono limitare i danni dei radicali presente nel corpo umano.
Tabella 3. Contenuto fenolico totale e capacità totale antiossidante dell’olio essenziale di A. arborescens.
Essential oils
Total
Phenols
mgGAE/
ml/gr
DPPH
TEAC
µmol TE/g
93 ± 8
Control
Trolox
ABTS
FRAP
IC50
µg/ml
TEAC
µmol TE/g
IC50
µg/ml
TEAC
µmol TE/g
>200
2696 ±2.9
21.9 ± 0.3
147.7 ± 2.8
4.36 ±0.3
15.1 ± 0.4
TEAC=trolox equivalent (TE) antioxidant concentration
Analisi della frazione polare dell’estratto idroalcolico
Le parte aeree di campioni di A.arborescens , raccolti nei periodi precedentemente
messi in evidenza, sono stati sottoposti ad analisi della frazione polare non volatile.
Gli estratti grezzi sono stati purificati per via cromatografica (cromatografia su
colonna); le frazioni raccolte sono state analizzate per via cromatografica (TLC); le
frazioni riunite sono state investigate attraverso la spettroscopia di risonanza
magnetica nucleare al protone (1H-NMR) al carbonio-13 (13C-NMR) e mediante la
spettrometria di massa (ESI-MS); tali analisi ci hanno permesso di individuare la
presenza dell’acido 5-O-caffeoil chinico; mediante il confronto con un campione di
riferimento è stato possibile confermare la sua identificazione.
Figura 3. Acido 5-O-caffeoil-chinico (acido neoclorogenico)
.
Conclusioni
Sulla base della nostra ricerca, l'olio essenziale di una popolazione sarda di A.
arborescens appartiene al chemotipo β-thujone/chamazulene, ha prodotto un largo
interesse per le applicazioni nel trattamento infiammatorio della pelle e per malattie
intestinali o come potenziale agente antitumorale e antiossidante. Ulteriori
sperimentazioni farmacologiche sono in ogni caso necessarie.
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