5_Manipolazione genetica dellle piante

TRASFERIMENTO GENICO
IN CELLULE VEGETALI:
PIANTE TRANSGENICHE
Perché manipolare geneticamente
le cellule vegetali
• Per
studiare la funzione di geni e
proteine tipici degli organismi vegetali
• Per produrre piante transgeniche
Perché creare piante transgeniche
• Per la produzione di bioreattori:
Anticorpi
Farmaci
• Per migliorare le caratteristiche agronomiche:
Resistenza a erbicidi
Resistenza a patogeni (virus, insetti, funghi, batteri)
• Per modificare le caratteristiche produttive:
Maturazione ritardata
Miglioramento del valore nutritivo (amido, oli, vitamine)
Miglioramento del sapore e dell’aspetto dei frutti
Miglioramento della pigmentazione dei fiori
Coltivazione in vitro di cellule
vegetali
Colture di callo
Colture cellulari in sospensione
Protoplasti
Rigenerazione di piante fertili
Trasferimento genico in
cellule vegetali
• Agrobacterium tumefaciens (stabile)
• Trasferimento diretto (stabile e transiente)
produzione di protoplasti
gene gun
elettroporazione
• Virus vegetali (transiente)
Agrobacterium tumefaciens
Trasformazione da Agrobacterium
Il plasmide Ti (tumor inducing)
T-DNA: Transforming DNA
Le opine sono derivati di
amminoacidi utilizzati da A.
tumefaciens come fonte di
carbonio e azoto
Elementi per il trasferimento del T-DNA
Elementi in cis: sequenze confinanti destra e sinistra
costituite da due ripetizioni dirette di 25 bp che definiscono i
confini del T-DNA
Elementi in trans: geni vir (virulenza) codificano proteine ed
enzimi coinvolti nei processi per il trasferimento stabile del
T-DNA nel genoma della cellula vegetale:
• Escissione del T-DNA dal plasmide Ti
• Trasferimento del T-DNA dal batterio alla cellula vegetale
ospite per coniugazione
• Integrazione del T-DNA in un punto casuale del genoma
della cellula vegetale ospite per ricombinazione non
omologa
Il plasmide Ti come vettore
Il plasmide Ti disarmato
Ai fini del clonaggio il plasmide Ti viene privato dei geni
che causano la trasformazione neoplastica delle piante
Vettori di cointegrazione
Ricombinazione
omologa
Ricombinazione omologa tra due plasmidi:
a) plasmide di E. coli contenente:
• il T-DNA (transgene e il marcatore di selezione tra le sequenze di confine)
• gli elementi tipici di un plasmide batterico (ori, polylinker, marcatori di
selezione batterici)
• Regione di omologia per la ricombinazione
b) plasmide Ti disarmato, necessario per fornire i geni vir, contenente la
regione di omologia per la ricombinazione
Vettori binari
Utilizzo di due plasmidi:
a) plasmide di E. coli contenente
• il T-DNA (transgene e il marcatore di selezione tra le sequenze di confine)
• gli elementi tipici di un plasmide batterico (ori, polylinker, marcatori di
selezione batterici)
• l’ori e un marcatore di selezione di A. tumefaciens
b) plasmide Ti privato del T-DNA, necessario per fornire i geni vir (plasmide
helper)
Marcatori selezionabili
Alternative ai marcatori per la resistenza ad anibiotici ed erbicidi
ƒ Utilizzo del sistema Cre/loxP per eliminare il marcatore di selezione
ƒ Utilizzo di marcatori innocui, come il gene manA di E.coli che codifica per
la mannosio fosfato isomerasi e conferisce alle cellule vegetali trasformate
la capacità di utilizzare il mannosio come unica fonte di carbonio
Espressione di geni esogeni in piante
Promotori forti costitutivi. I più utilizzati sono: a) nelle dicotiledoni, i
promotori dei geni per la sintesi delle opine (nos e ocs) e il promotore
dell’RNA 35S del virus del mosaico del cavolfiore; b) nelle
monocotiledoni, i promotori dei geni vegetali actina-1 di riso e
ubiquitina-1 di mais.
Promotori inducibili
Promotori tessuto-specifici
Enhancers
Segnali di poliadenilazione
Segnali di terminazione della trascrizione
Segnali per la traduzione
Segnali di targeting
Trasformazione dei dischi fogliari
Agrobacterium e le monocotiledoni
Nelle dicotiledoni l’integrazione del T-DNA è probabilmente
favorita dal fatto che le ferite inducono divisione cellulare e
conseguente sintesi di DNA.
Nelle monocotiledoni le
lignificazione,
pertanto
all’integrazione del T-DNA.
lesioni inducono, invece,
risultano
più
refrattarie
E’ possibile comunque trasformare le monocotiledoni con A.
tumefaciens utilizzando due accorgimenti:
1. l’impiego di cellule proliferanti, come embrioni e meristemi
2. l’aggiunta di acetosiringone
Trasferimento diretto:
produzione di protoplasti
1. Trattamento con pectinasi e cellulasi
2. Introduzione del DNA con agenti chimici (PEG,
liposomi) o con elettroporazione
3. Trasferimento dei protoplasti in terreni selettivi
4. I protoplasti trasformati ricostruiscono la parete
cellulare in 5-10 giorni.
5. Formazione del callo
6. Rigenerazione della pianta
Si può applicare solo ai protoplasti delle cellule di piante
che si prestano a essere rigenerati in piante vitali ( in
genere le dicotiledoni)
Trasferimento diretto: Gene gun
Il DNA viene precipitato con CaCl2 su microparticelle di oro
o tungsteno dal diametro di 1-4 µm. Le particelle vengono
quindi sparate con gas pressurizzato alla velocità di
250m/s contro le cellule vegetali
CARATTERISTICHE DEL METODO
• Il DNA si integra nel genoma in maniera casuale
(trasformazione stabile)
• Utilizzabile con un gran numero di specie vegetali e con
tutti i tipi di colture vegetali (callo, cellule in sospensione,
vari tessuti vegetali)
Trasferimento in planta
Il DNA viene introdotto direttamente nella pianta viva
senza la necessità di un passaggio di coltivazione in
vitro per ottenere una pianta transgenica fertile.
Il
DNA viene trasferito mediante Agrobacterium
tumefaciens o gene gun in
1. cellule germinali (al momento della fecondazione)
2. embrioni molto precoci
CARATTERISTICHE DEL METODO
ƒ Scarsa efficienza
ƒ Poco riproducibile
Trasformazione dei cloroplasti
I vantaggi
‰ L’espressione del transgene raggiunge livelli 50
volte maggiori rispetto a quelli ottenibili con la
trasformazione del DNA nucleare
‰ E’ un metodo naturale dal momento che il
transgene non viene trasmesso al polline e pertanto
non può essere propagato mediante gli incroci
Trasformazione dei cloroplasti
La metodica
ƒ Gene gun
ƒ Il DNA si integra nel DNA dei cloroplasti per ricombinazione
omologa
ƒ I vettori contengono
1. regioni di omologia (~ 400bp ciascuna) con il genoma
del cloroplasto
2. promotori e segnali di terminazione della trascrizione
specifici dei cloroplasti
3. Marcatori di selezione cloroplasto-specifici: aad
(ammino-glicoside adeniltransferasi), che conferisce
resistenza alla streptomicina e alla spectinomicina
Selezione dei cloroplasti
transgenici omogenei
Si applica una forte pressione selettiva,
utilizzando alte dosi di antibiotico per 34 generazioni, per ottenere piante con
una
popolazione
omogenea
di
cloroplasti
Virus vegetali
Caratteristiche
• I genomi virali isolati sono infettivi
• Progenie virale numerosa: alti livelli di espressione delle
proteine ricombinanti
• Le infezioni virali sono spesso sistematiche: l’infezione
virale si diffonde rapidamente all’intera pianta
• Il genoma virale non si integra nel genoma della cellula
ospite. Vantaggi: 1) nessun effetto di posizione; 2) controllo
nella diffusione del transgene. Svantaggi: non si possono
ottenere linee transgeniche
Virus a DNA
Il virus del Mosaico del cavolfiore
Vantaggio
• I promotori delle due unità
trascrizionali (RNA 35S ed
RNA 19S) sono molto forti,
permettendo alti livelli di
espressione della proteina
ricombinante.
Svantaggi
• La dimensione massima di
DNA esogeno da poter
clonare è di 1 kb a causa del
limite di impaccamento del
genoma imposto dal capside.
Il genoma è costituito da una molecola di
• Il virus può infettare un
DNA circolare di 8 kbp contenente 8 geni
numero limitato di specie
di cui due (i geni II e VIII) non sono
vegetali.
essenziali per la replicazione
Virus a RNA
Il virus del Mosaico del tabacco
Vantaggio
Non ci sono limiti imposti dal
capside virale, essendo virus
filamentosi.
Pertanto
il
transgene viene aggiunto al
genoma selvatico.
Il genoma virale è
costituito da una singola
molecola di RNA di 6.5
kbp
Svantaggio
Fenomeni di ricombinazione
omologa possono causare
delezione del transgene.
Procedura: isolamento di cloni di cDNA corrispondenti all’intero genoma del
virus, clonaggio del gene esogeno, trascrizione in vitro del cDNA in RNA
con la RNA polimerasi per la produzione di un genoma ricombinante a RNA
APPLICAZIONI DELLE
PIANTE TRANSGENICHE
Perché creare piante transgeniche
• Per la produzione di bioreattori:
Anticorpi
Farmaci
• Per migliorare le caratteristiche agronomiche:
Resistenza a erbicidi
Resistenza a patogeni (virus, insetti, funghi, batteri)
• Per modificare le caratteristiche produttive:
Maturazione ritardata
Miglioramento del valore nutritivo (amido, oli, vitamine)
Miglioramento del sapore e dell’aspetto dei frutti
Miglioramento della pigmentazione dei fiori
Le piante come bioreattori
Alcune proteine ricombinanti umane con valore terapeutico prodotte in piante
Vaccini ricombinanti prodotti nelle piante
Resistenza agli erbicidi
Biosintesi
di aa
fotosintesi
Meccanismo di azione di erbicidi e modifiche apportate alle
piante per renderle resistenti alla loro azione
Resistenza agli erbicidi: il glifosato
Il glifosato è un erbicida non selettivo che non causa danni all’ambiente
poiché nel suolo viene rapidamente degradato in composti non tossici.
E’ un inibitore della 5-enolpiruvilscichimato-3-fosfato (EPSP) sintasi,
enzima chiave della via biosintetica degli amminoacidi aromatici nei
batteri e nelle piante.
Piante resistenti al glifosato vengono ottenute attraverso due approcci
sperimentali:
1. la proteina bersaglio dell’erbicida (EPSP
Struttura del glifosato
sintasi) viene sovra-espressa
2. viene prodotta una versione mutata della
proteina EPSP sintasi che conserva la sua attività
catalitica, ma ha una ridotta affinità per l’erbicida.
RISCHI
Il transgene che conferisce resistenza all’erbicida
può essere trasmesso orizzontalmente alle specie
infestanti, creando nuovi ceppi di “super-erbacce”.
Resistenza ai patogeni
Resistenza ai virus. Una pianta infettata da un particolare ceppo virale
è resistente alla sovrainfezione di un secondo ceppo, correlato al
primo. Sono state create piante di tabacco transgeniche che esprimono
la proteina di rivestimento del virus del mosaico del tabacco per
proteggere la pianta dall’infezione da parte del virus stesso.
Resistenza ai funghi. Sono state create piante transgeniche che
esprimono proteine antifungine. Piante di tabacco che esprimono il
gene della chitinasi del fagiolo sono resistenti al fungo patogeno
Rhizoctonia solani. La chitinasi idrolizza la chitina, un polimero della
parete cellulare di molti funghi.
Resistenza agli insetti. Numerose specie di piante da raccolto sono
state geneticamente modificate per esprimere il gene cry1Ac e cryAb
del batterio Bacillus thuringiensis, che codificano tossine per insetti.
Modifiche delle caratteristiche
produttive
Maturazione ritardata
Miglioramento del valore nutritivo (amido, oli, vitamine)
Miglioramento del sapore e dell’aspetto dei frutti
Miglioramento della pigmentazione dei fiori
MATURAZIONE RITARDATA. Dal 1994 sono in commercio
pomodori transgenici in cui il transgene codifica l’RNA antisenso
per l’enzima poligalacturonasi, coinvolto nel controllo della rottura
progressiva dell’acido poligalacturonico, un componente della
parete cellulare del pericarpo della frutta. L’azione dell’enzima è
importante per la graduale maturazione del frutto. Ritardando
l’azione dell’enzima, il frutto matura più lentamente.
La tecnologia dei semi terminatori