HEMOCLOT Factor V-L

HEMOCLOT Factor V-L
Codice prodotto CK061K
Misurazione del fattore V-Leiden valutata attraverso la
sua resistenza all’azione della Proteina C attivata.
Usare solo in vitro
Ultima revisione : 20/12/2005
DESTINAZIONE D’USO:
HEMOCLOT Factor V-L kit si basa su un metodo di coagulazione adatto
per valutare la presenza del fattore V-L (Fattore V di Leiden) nel plasma
trattato con citrato, attraverso la sua resistenza all’azione della Proteina C
attivata (APC). Il saggio si può eseguire in assenza o in presenza della
Proteina C attivata. In presenza di APC, l’allungamento del tempo di
coagulazione è direttamente proporzionale alla concentrazione del
Fattore V normale, ed è inversamente correlato alla quantità di Fattore VLeiden (mutazione R506Q).
INFORMAZIONI CLINICHE:
Il fattore V-Leiden è insensibile all’azione della proteina C attivata. La sua
presenza causa un prolungamento dell’attività coagulante nel sangue
(dovuto ad un aumento del tempo di attività del Fattore Va), che segue
l’attivazione della cascata della coagulazione. I soggetti con il Fattore V-L
(mutazione R506Q) sono inclini a un maggior rischio trombotico. Questo
rischio, già presente nei soggetti eterozigoti, nei quali sono presenti sia il
Fattore V normale sia il Fattore V-Leiden, aumenta notevolmente nei
soggetti omozigoti, che hanno solo il Fattore V-Leiden.
PRINCIPI:
Il kit HEMOCLOT Factor V-L è un metodo di coagulazione, innescato dal
Fattore IXa purificato in presenza di fosfolipidi e ioni calcio, da usare sui
campioni di plasma diluiti che si vogliono analizzare, in presenza o in
assenza della Proteina C attivata. Per prima cosa al campione di plasma
diluito vengono aggiunti i Fattori di coagulazione purificati (Protrombina e
Fibrinogeno), in concentrazioni ottimali e costanti. In seguito si aggiunge il
Fattore X purificato, anch’esso a concentrazioni ottimali e costanti, in
assenza (Tempo di Coagulazione 1) o in presenza (Tempo di
Coagulazione 2) della proteina C attivata. La coagulazione inizia
addizionando il Fattore IXa, in presenza di fosfolipidi (PLP) e di ioni
2+
Calcio (Ca ). I tempi di coagulazione vanno poi registrati. Si calcolano
poi i rapporti dei tempi di coagulazione senza o con APC (Tempo di
Coagulazione 2/ Tempo di Coagulazione 1). Se il plasma è normale,
questo rapporto è ≥ 2,00; se il plasma appartiene a un soggetto portatore
della mutazione R506Q (Fattore V-Leiden), questo rapporto risulta più
basso, ≤ 1,80.
IXa
Cϕ
APC
IXa
Ca++
Xa + Va
X
Ca
Cϕ
V
Ca++
Xa + Va
X
Ca
Cϕ
IIa
IIa
Fibrin
Fbg
Senza PCA
Tempo di Coagulazione 1
R1: Reagente 1:
La miscela di coagulazione contiene Fibrinogeno umano e Protrombina
umana, Fattore VIII:C ricombinante e Proteina S a una concentrazione
costante, ottimizzata per il test, liofilizzata. Contiene inoltre una sostanza
che neutralizza l’eparina. Ricostituire ciascuna vial con esattamente 4 ml
di acqua bidistillata (4 vials di 4 ml).
R2 A: Reagente 2A:
Fattore X umano purificato, a una concentrazione costante, ottimizzata
per il test, liofilizzato. Ricostituire ciascuna vial con esattamente 1 ml di
acqua bidistillata (4 vials di 1 ml).
R2 B: Reagente 2B:
Fattore X umano purificato, a una concentrazione costante, ottimizzata
per il test, la stessa del Reagente 2A, contenente la Proteina C attivata
umana, liofilizzato. Ricostituire ciascuna vial con esattamente 1 ml di
acqua bidistillata (4 vials di 1 ml).
R3: Reagente 3:
Fattore IXa umano purificato, contenente fosfolipidi (cefalina) di cervello
di coniglio e calcio, liofilizzato. Ricostituire ciascuna vial con esattamente
4 ml di acqua bidistillata (4 vials di 4 ml).
Nota:
• Il plasma umano usato per la purificazione del Fibrinogeno, Protrombina, Proteina S (R1), del
Fattore X (R2A e R2B), della APC e del Fattore IXa (R3) è stato testato ed è risultato negativo
per gli anticorpi per l’HIV, HBs Ag e HVC. In ogni caso nessun test può escludere totalmente la
presenza di qualunque agente infettivo. Tutti i materiali di origine umana devono essere
maneggiati con tutte le cautele del caso, come se fossero potenzialmente infettivi.
• Siero di albumina bovina, usato come fattore stabilizzante, è stato preparato a partire da
plasma bovino, testato per determinare l’assenza di agenti infettivi e raccolto da animali negativi
al test per l’ Encefalite Spongiforme Bovina (BSE). In ogni caso nessun test può escludere
totalmente la presenza di qualunque agente infettivo. Come ogni prodotto di origine bovina, il
reagente R1 deve essere maneggiato con tutte le cautele del caso, come se fosse
potenzialmente infettivo.
REAGENTI E MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI CON IL KIT:
Reagenti:
• Acqua bidistillata; soluzione fisiologica salina o Owren Koller Buffer.
• Plasma Normale Controllo (# 223201) e Plasma Anormale Controllo
(BIOPHEN Act. PC-r Control Plasma, # 223405) per il Fattore V-Leiden.
Materiali:
• Bagnetto ad acqua o strumento per coagulazione semi-automatica o
automatica.
• Cronometro.
• Pipette calibrate da 50 e 100 µl.
++
II
Fbg
V
Vinh
Normal
Factor V
++
II
Cϕ
REAGENTI FORNITI CON IL KIT:
HEMOCLOT Factor V-L contiene differenti reagenti necessari per
analizzare 4 serie di 20 pazienti ciascuna, seguendo la metodica manuale
o 4 serie da 40 pazienti ciascuna seguendo la metodica automatica.
Fibrin
Con PCA
Tempo di Coagulazione 2
CONSERVAZIONE:
Nel confezionamento originale, e prima dell’uso, quando conservato a 28°C, i reagenti del kit Hemoclot Factor V-L sono stabili fino alla data di
scadenza indicata sul kit.
Nota: studi di stabilità condotti a 30°C dimostrano che tutti i reagenti possono essere
spediti a temperatura ambiente senza subire danneggiamenti.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI E STABILITA’:
IXa
Cϕ
Ca++
Xa + VLa
X
Cϕ
VL
IIa
Fbg
X
Ca++
Xa + VLa
X
Factor V
Leiden
Ca++
II
Cϕ
Cϕ
VL
IIa
Fbg
Reagente 1 R1: Fattori di Coagulazione Purificati:
Ricostituire ciascuna vial con esattamente 4 ml di acqua bidistillata.
Lasciare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (18-25°C); agitare
delicatamente fino alla completa dissoluzione del liofilizzato.
Reagente 2A R2A: Fattore X umano Purificato:
Ricostituire ciascuna vial con esattamente 1 ml di acqua bidistillata.
Lasciare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (18-25°C); agitare
delicatamente fino alla completa dissoluzione del liofilizzato.
Ca++
II
Fibrin
Preparazione
APC
IXa
Fibrin
D.750.20/CK/061K
Reagente 2B R2B: Fattore X umano Purificato in presenza di APC:
Ricostituire ciascuna vial con esattamente 1 ml di acqua bidistillata.
Lasciare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (18-25°C); agitare
delicatamente fino alla completa dissoluzione del liofilizzato.
Reagente 3: Fattore IXa umano, contenente cefalina e calcio.
Ricostituire ciascuna vial con esattamente 4 ml di acqua bidistillata.
Lasciare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (18-25°C); agitare
delicatamente fino alla completa dissoluzione del liofilizzato; rendere
omogeneo il contenuto prima di ogni utilizzo.
Stabilità
La stabilità dei reagenti ricostituiti R1, R2A, R2B e R3, conservati nella
loro confezione originale, è:
24 ore
2 – 8 °C
8 ore
temperatura ambiente
1 mese
congelata velocemente a –20°C o meno
Cautele
Per migliorare la stabilità, i reagenti devono essere chiusi con il loro tappo
a vite, ogni volta dopo l’uso. I reagenti inoltre devono essere maneggiati
con cura, in modo da evitare ogni contaminazione durante l’uso.
Nota:
• Le vials dei reagenti R1, R2A, R2B e R3 sono state chiuse sotto vuoto. Rimuovere
delicatamente il tappo per evitare ogni perdita di polvere quando si apre la vial.
• Secondo il metodo automatizzato usato, i reagenti possono essere ricostituiti in volumi
differenti da quelli raccomandati. In ogni caso, i rapporti stabiliti tra i reattivi (le
concentrazioni dei rispettivi reagenti nel reactive milieu e nel volume totale) per ciascun
reagente devono essere strettamente rispettati.
• Usare solamente i reagenti da kit con lo stesso numero di lotto. Non usare reagenti da kit
provenienti da lotti differenti quando si effettua un saggio. I reagenti R1, R2A, R2B e R3
sono ottimizzati per ciascun lotto di kit.
PREPARAZIONE DEL PLASMA:
Il sangue (9 volumi) deve essere raccolto insieme a l’anticoagulante
citrato 0,109 M (1 volume), con la massima cura possibile, in modo da
evitare una qualsiasi attivazione. La raccolta dei campioni avviene
attraverso un prelievo di sangue venoso e le prime gocce di sangue
devono essere scartate.
• Entro 2 ore il sangue deve essere centrifugato a 3.000 g per 20 minuti
a 18°C o a una temperatura inferiore, e il surnatante del plasma deve
essere raccolto in una provetta di plastica, usando una pipetta di
plastica
• Conservazione del plasma:
• fino a 8 ore a 20°C
• fino a 24 ore a 2-8°C
• fino a 1 mese se congelato a –20°C o a temperature inferiori
(prima dell’uso scongelare per 15 minuti in un bagnetto a 37°C).
PROCEDURE:
Il kit HEMOCLOT Factor V-L è un metodo di coagulazione, manuale o
automatizzato. Il test viene svolto a 37°C e misura il tempo di
coagulazione, innestata dal reagente R3.
Test sul plasma:
Il plasma da analizzare deve essere diluito 1/5 nella soluzione fisiologica
salina (9 g/l di cloruro di sodio, NaCl) o in un tampone tipo l’Owren
Koller.
Metodica:
Test
Metodica manuale
Senza APC
Plasma diluito 1/5 in soluzione fisiologica salina
Con APC
50µl
Reagente R1
100µl
Miscelare e incubare 1 minuto a 37°C poi aggiungere
Reagente R2A or
50µl
Reagente R2B
50µl
Miscelare e incubare 1 minuto a 37°C poi aggiungere
Reagente R3, preincubato a 37°C, e miscelato
Misurazione del tempo di coagulazione
100µl
CT1
CT2
Bisogna calcolare il rapporto CT2/CT1.
Gli adattamenti per la procedura automatizzata sono disponibili qualora
vengano richiesti.
CONTROLLO DI QUALITA’:
L’uso di plasmi di controllata qualità, normali o anormali per il Fattore VLeiden, permette di validare le prestazioni del saggio e l’omogeneità della
reattività del kit HEMOCLOT Factor V-L, da un esperimento all’altro, se
viene usato lo stesso lotto di reagenti. Questi controlli sono disponibili e
vengono riportate qui sotto le specifiche referenze:
Biophen Normal Control Plasma: (#223201).
Biophen Act PC-r Control Plasma: (#223405).
LIMITAZIONI NELL’USO DELLA PROCEDURA:
• Il tempo di coagulazione ottenuto è sensibile alla concentrazione del
FattoreV. Solamente il rapporto tra CT2 e CT1 permette di evidenziare
la presenza del Fattore V-L. Se la concentrazione del Fattore V è
diminuita, o se c’è qualsiasi altra causa che prolunga il CT1, entrambi i
tempi di coagulazione (CT1 e CT2) saranno proporzionalmente
aumentati e il rapporto CT2/CT1 rimarrà generalmente invariato. Il
saggio può essere effettuato su pazienti affetti da LA, ACA, in terapia
con eparina o trattati con dicoumarolo. In presenza di un CT1
insolitamente prolungato (> 50 sec), si raccomanda di confermare la
diagnosi con un altro metodo. Per una corretta esecuzione del saggio è
necessaria, nel dosaggio del campione, una concentrazione del Fattore
V ≥ 20%.
• La raccolta impropria del campione e la preparazione del plasma,
potrebbero provocare un consumo dei Fattori V and VIII: C, che può
indurre tempi di coagulazione prolungati per CT1 e CT2. La presenza di
fattori coagulanti può accorciare i CT1 e CT2, e il rapporto CT2/CT1.
• Utilizzando reagenti dello stesso lotto e testando i medesimi campioni,
per CT1 e CT2 si possono riscontrare differenze in rapporto allo
strumento utilizzato, e la regolazione della sensibilità di detenzione del
coagulo. Questo può avere effetti sul rapporto CT2/CT1. Validare
sempre i valori del cut-off utilizzati per i pazienti normali e per quelli
portatori della mutazione del Fattore V, e, qualora fosse necessario,
adeguarli.
RISULTATI:
Il rapporto del tempo di coagulazione ottenuto con o senza APC,
CT2/CT1, permette la misurazione della sensibilità del Fattore V, nei
campioni analizzati, all’azione della Proteina C Attivata.
Il plasma normale, che possiede il Fattore V normale, è sensibile a
questa azione, e presenta un rapporto CT2/CT1 ≥ 2,00.
I plasmi dei soggetti affetti dalla mutazione R506Q per il Fattore V, che
per esempio hanno il Fattore V di Leiden, avranno un rapporto CT2/CT1
≤ 1,80.
La biologia molecolare permette di confermare la diagnosi e di
suddividere i soggetti in eterozigoti e omozigoti.
SPECIFICHE CARATTERISTICHE DELLE PERFORMANCE DEL TEST:
Esempio di riproducibilità ottenuto con la metodica manuale:
Campioni
Plasma normale
Plasma di soggetti eterozigoti
CT1
N
Media
12
39,0 secondi
82,0 secondi
CT2
12
Rapporto
12
2,10
CT1
12
39,2 secondi
CT2
Rapporto
12
12
56,1 secondi
1,40
VALORI ATTESI:
L’incidenza del Fattore V-L (mutazione R506Q) è variabile a seconda
dell’area geografica. E’ più alta del 15% nei paesi scandinavi mentre nei
paesi mediterranei è di circa il 5%. Questa mutazione è assente nella
popolazione cinese o giapponese.
REFERENCE :
1. Dahlback B. and all. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized
mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C:
prediction of a cofactor to activated protein C. Proc Natl Acad Sci USA, vol 90 (3) 10048 (1993).
2. Bertina RM and all. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to
activated protein C. Nature, Vol 369 (6475) 64-7 (1994).
3. Brenner B. and all. Activated protein C resistance can be associated with recurrent
foetal loss. British Journal of Haematology; Vol 97 551-554 (1997).
4. Hille E. and all. Mortality and Causes of Death in Families With the Factor V Leiden
Mutation (Resistance to Activated Protein C). Blood, Vol 89 (6) 1963-1967 (1997).
5. Rosendaal F.R. and all. Factor V Leiden (Resistance to Activated Protein C) Increases
the Risk of Myocardial Infarction in Young Women. Blood Vol 89 (8) 2817-2821 (1997).
6. Chao-Hung Ho. Prevalence of Activated Protein C Resistance in the Chinese
Population. Thrombosis research Vol 88 409-412 (1997).
7. Labrouche S. and all. Molecular mechanism for APC resistance in the absence of Arg
506 mutation: factor V gene sequencing strategy. Thrombosis research Vol 87 (2) 263267 (1997).
8. Crookston K.P. and all. False negative factor V Leiden assay following allogeneic stem
cell transplant. British Journal of Haematology, Vol 100 600-602 (1998).
D.750.20/CK/061K