Introduzione al programma grafico Pymol

Utilizzeremo il programma grafico pymol (che potete installare ) per visualizzare la struttura
tridimensionale della proteina C, mutare alcuni residui, salvare il modello dei mutanti nel formato
pdb da utilizzare per lo studio elettrostatico.
Introduzione al programma grafico Pymol
Useremo la Protein C per introdurre il programma Pymol.
L interfaccia grafica di Pymol è suddivisa in due parti :
una finestra menu
e una finestra principale
Caricare le coordinate della struttura della proteina C
La struttura della proteina C può essere letta o direttamente dal file PDB o dalla banca dati PDB
attraverso internet.
Per leggere dal file PDB si usa: File menu: File>Open, aprite il file 1aut.pdb
per leggerlo direttamente dalla banca dati usate Loader Service plugin: Plugin>PDB Loader
Service plugin si apre una finestrella che vi chiede Please enter a 4-digit pdb code (1aut è il
codice identificativo della proteina C). Utilizzate entrambi i metodi per caricare le coordinate della
Proteina C.
Utilizzo del mouse per ruotare, zoom e muovere la struttura
Ruotare
Schiacciare il bottone sinistro del mouse e muovete il mouse.
Zoom
Schiacciare il bottone destro del mouse e muovere il mouse.
Muovere
Schiacciare il bottone sinistro del mouse più il tasto Ctrl e muovere il mouse .
Per ritornare nella visualizzazione iniziale schiacciare sul bottone Reset della finestra menu.
Piani di taglio
I piani di taglio consentono di focalizzare la vista su un particolare. Questi piani si muovono
muovendo il mouse lungo la finestra e mantenendo schiacciati i il bottone destro del mouse più il
tasto Shift. Una mappa di come vengono illustrati i piani di taglio è di seguito esposta:
Il tasto Reset svolge una funzione di annulla
Objects and selections
Il codice PDB che identifica la struttura della proteina C che avete caricato è visualizzato sul lato
destro in alto della finestra principale (1aut).
Si possono caricare contemporaneamente più strutture, ognuna avrà una linea separata e Pymol le
considera come oggetti separati. Quando si selezionano delle parti delle strutture queste sono
elencate su nuove linee. Per distinguere le selezioni dagli oggetti, le selezioni sono sempre
rappresentate tra parentesi (N.B.: cancellando una selezione non vengono eliminati gli atomi o i
residui). Appena caricate la struttura potete notare una selezione nominata (all): questa selezione
rappresenta tutto gli oggetti caricati con PyMol. Schiacciando su un residuo della struttura presente
nella finestra principale appare una nuova selezione.
Notare due cose:
Una nuova linea nomi chiamata (sel01) appare e corrisponde al residuo selezionato.
L oggetto e la selezione può essere reso attivo o inattivo schiacciando la barra grigia che
contiene il nome.
Schiacciando sulla linea 1aut_pdb, potete notare che la struttura scompare, schiacciando
ulteriormente la barra grigia la struttura ricompare nella finestra principale.
Menu della finestra principale
Ogni oggetto o selezione ha un serie di menu associati che sono accessibili schiacciando le lettere situate
sulla destra del nome.
A Action
S Show
H Hide
L Label
C Colour
Il menu action
Esplorate il menu action.
Vediamo come si possono visualizzare i legami a idrogeno all interno dell oggetto 1aut:
Selezionate A (Action) >find>polar contact>involving side chains
Se dovete rimuovere l oggetto o la selezione questo può essere fatto dal menu action.
I menus show e hide
I menus show e hide possono essere usati per scegliere le diverse rappresentazioni della struttura, ad
esempio lines, sticks, ribbon, cartoon, spere(CPK) e superficie. Esplorate le diverse
rappresentazioni selezionandole dal menu show, provate differenti combinazioni di
rappresentazioni.
Se arrivate a una visualizzazione della struttura non consona al vostro fine , il menu hide ha il
sottomenu everything che nasconde tutta la rappresentazione e vi consente di ripartire
(H>everything).
Il menu colour
Provate a colorare la struttura in diversi modi, ( il tipo di colorazione dev essere combinata con la
corretta rappresentazione molecolare). Es. la colorazione in base agli elementi può essere usata con
la rappresentazione lines, sticks, spheres and surface, mentre la colorazione in base alla struttura
secondaria (by ss) può essere utilizzata con la rappresentazione a cartoon dove si evidenziano gli
elementi di struttura secondaria eliche, sheet e loop.
Visualizzazione della sequenza e selezione dei residui
Pymol permette di rappresentare la sequenza e di selezionare uno o più residui
contemporaneamente Visualizzazione della sequenza: Display>Sequence sulla finestra menu.
Quante catene osservate, sono presenti molecole di acqua di cristallizzazione e eteroatomi?
Nascondete le molecole di acqua e il ligando.
Provate a evidenziare alcuni residui sulla struttura premendo sulla sequenza
Scegliete le diverse rappresentazioni e colorate i residui rappresentati.
Salvare la sessione
La sessione può essere salvata per essere utilizzata sucessivamente:
Dalla finestra menu: File>Save session.
Manipolare la struttura utilizzando i comandi di Pymol
Alcune cose sono difficili o impossibili da fare con il mouse e con il menus. Per esempio
selezionare le catene, gli elementi di struttura secondaria o i residui aminoacidici con il nome o il
numero. Il modo per fare questo è di usare sono i comandi di PyMol, utilizzando il prompt presente
nella parte bassa del finestra principale. Con pymol è possibile listare i comandi in un file di script.
selezionare le catene
La struttura della Proteina C è caratterizzata dalla presenza di due catene la catena leggera L e la
catena pesante C, inoltre la proteina è stata cristallizzata con il suo inibitore (DPN PRO MAI).
Il comando per selezionare la catena C:
select chain C
rinominiamo la selezione sel01 con il nome chain C:
set_name sel01, chain C
Provate a rappresentare e colorare la catena C usando i menus della selezione chain C
zoom della catena C:
zoom chain C
selezione degli elementi della struttura secondaria:
i seguenti comandi nominano la selezione degli elementi delle strutture secondarie:
select helix, ss h
select sheet, ss s
select loops, ss l
Se analizzate la sequenza della catena cristallografica la numerazione della catena C presenta dei
residui numerati con un numero e quello successivo con una lettera per semplificare le operazioni
successive andate sulla finestra menu: File>Reinitialize
Dalla finestra menu caricate il file pdb 1aut_chain_C.pdb
selezioniamo i residui con il nome e numero
I residui possono essere selezionati con il codice a tre lettere.
Per selezionare tutti i residui spartici (ASP):
select resn ASP
rinominiamo la selezione:
set_name sel04, ASP
Per selezionare un residuo particolare bisogna selezionare il residuo riferendosi al numero
selezioniamo il residuo della triade catalitica H57 :
select resi 57
rinominiamo la selezione:
set_name sel05, H57
selezioniamo le varianti (G43E, D194N, G216D) vicino al sito attivo:
select resi 43+194+216
Rinomini la selezione sel11 con 43+194+ 216:
set_name sel11, 43+194+216
Dovreste avere l oggetto 1AUT e le seguenti selezioni.
rappresentate i residui H57, G43E, D194N, G216D in stick e colorateli in base al tipo di atomi.
Misurare le distanze che ci sono tra gli atomi:
Misurate le distanze che ci sono tra H57 e i residui G43E, D194N, G216D:
andate nella finestra menu: Wizard>Measurement
nella finestra principale sul lato destro in basso appare il menu measurement:
selezionate mesaurment mode>Distances
selezionate gli atomi per misurare le distanze.
Dovreste realizzare la seguente rappresentazione.
D216
10,85 Å
D194
D102
10,77 Å
H57
E43
I residui G216 G43 D194 si localizzano a circa 12 A dalla H57 modificando la distribuzione di
carica in prossimità del sito.
Mutagenesi
Nascondete tutta la proteina (dalla selezione (all) selezionare H -> everything).
Selezionare ed evidenziare i residui che cadono in un intorno di 4A dal residuo da mutagenizzare:
select intorno, byres(resi 82 around 4)
color yellow, intorno
show lines, intorno
Selezionare ed evidenziare il residuo da mutagenizzare (Asp82Asn):
select asp82, resi 82
show lines, asp82
Applicare la mutazione usando il tool Wizard>mutagenesis
Specificare il tipo di mutazione cliccando sul tasto No mutation -> ASN
Cliccare sul residuo da mutare: la selezione che si viene a creare presenta una percentuale che
indica la probabilità che quel residuo venga sostituito in quel rotamero conformazionale (per
esplorare altri rotameri cliccare su tasti avanti o indietro).
Scegliete il rotamero piu adatto e applicate la mutazione con il tasto Apply .
Utilizzando il Builder aggiungere gli idrogeni al residuo mutato
Salvare il PDB del mutante con File > Save Molecule
Collegarsi al sito http://bioserv.rpbs.jussieu.fr/cgi-bin/PCE-Pot
Risultato dei calcoli dei potenziali elettrostatici
Wt ASP82
mutato ASN82