Sensibilità ai nitrati e nitriti in stagni per l`allevamento degli anfibi nel

Sensibilità ai nitrati e nitriti in stagni per
l'allevamento degli anfibi nel nord-ovest degli USA
ADOLFO MARCO - Departamento de Biologı´a Animal, Universidad de Salamanca, Salamanca 37071, Spain
CONSUELO QUILCHANO - Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologı´a, Consejo Superior de Investigaciones
Cientı´ficas, Salamanca 37071, Spain
ANDREW R. BLAUSTEIN - Department of Zoology, Oregon State University, Corvallis, Oregon 97331, USA
(Received 27 July 1998; Accepted 11 March 1999)
Environmental Toxicology and
Chemistry, Vol. 18, No. 12, pp.
2836–2839, 1999
© 1999 SETAC
Printed in the USA
0730-7268/99
Agosto 2012 – traduzione di
Claudio Cerioni
Riassunto
In questi esperimenti, abbiamo studiato gli effetti di varie soluzioni di nitriti e nitrati su giovani larve di cinque specie di
anfibi:
Rana pretiosa
Hyla regilla
Rana aurora
Bufo Borea
Ambystoma gracile
L'aggiunta all'acqua di ioni nitrato (NO3-) o nitrito (NO2-), provoca vari effetti su alcune larve di anfibi come: riduzione
dell'attività di alimentazione, riduzione della motilità nel nuoto, difficoltà motorie fino alla paralisi, comparsa di edemi e
varie altre patologie con effetti letali. Gli effetti osservati sono correlati sia alla concentrazione che al tempo di
permanenza, sono state rilevate significative differenze tra le varie specie.
Ambystoma gracile si è dimostrata la più sensibile alla presenza in acqua di nitrati e nitriti. Tutte e tre le specie di rana
hanno avuto effetti acuti per la presenza di nitriti in acqua. In esposizioni croniche, Rana pretiosa è la specie più
sensibile ai nitrati e nitriti.
Tutte le specie hanno mostrato 15-d LC501 a concentrazioni inferiori a 2 mg/l di nitriti. L'anfibio meno sensibile alla
presenza di nitrati e nitriti è stato Bufo borea.
Il valore limite per i pesci di 5 mg/l di nitriti indicato da US Environmental Protection Agency 2 risulta letale per tutte le
cinque specie, mentre la mortalità larvale la si ha a concentrazioni di soli 1 mg/l di nitriti che coincide con il valore
limite per le acque potabili. 90 mg/l di nitrati sono risultati particolarmente tossici per Rana pretiosa e per Ambystoma
gracile.
La scomparsa di molte specie di anfibi si sta verificando a un ritmo senza precedenti, la prima causa è la distruzione o
l'alterazione degli habitat. La prima conseguenza è la riduzione della biodiversità e gli anfibi sono tra le specie più
sensibili. Anche se la distruzione degli habitat è la causa principale della riduzione delle popolazioni di anfibi, in molti
casi nonostante che l'habitat non risulta modificato si ha comunque un declino delle popolazioni di anfibi.
Molti prodotti chimici utilizzati in agricoltura, dall'industria e nelle normali attività domestiche (detersivi, ecc.) possono
causare gravi danni a vari ecosistemi. L'habitat può quindi subire significative alterazioni dovute alla presenza di
1) In tossicologia il termine LC50gg è l'acronimo di "Lethal Concentration 50" e si riferisce alla concentrazione di una sostanza, in grado
di uccidere il 50% (cioè la metà) di una popolazione campione di cavie in un determinato periodo (gg).
2) L'United States Environmental Protection Agency è il principale ente di protezione ambientale degli Stati Uniti. Tra i suoi scopi rientra
anche la protezione della salute umana. Spesso abbreviato come EPA o USEPA.
prodotti chimici che si riversano in laghi, stagni, e corsi d'acqua, prodotti che rendono l'habitat inadatto alla presenza di
anfibi. In particolare l'aumento dell'uso di sostanze azotate (nitrati e nitriti) risultano particolarmente tossiche per gli
anfibi, in particolare nella fase larvale (girini) determinando il progressivo declino delle popolazioni di anfibi.
La Rana pretiosa molto diffusa nell'Oregon in particolare in tutta la Willamette Valley e
nelle pianure dello stato di Washington, è quasi scomparsa in soli 4 decenni. Queste aree
sono caratterizzate da un'agricoltura intensiva che utilizza grosse quantità di fertilizzanti
azotati, questi sono la probabile causa della scomparsa di Rana pretiosa. Problemi analoghi
sono probabilmente dietro la forte riduzione di popolazione di Rana aurora e del rospo
Bufo borea.
Altri anfibi come la raganella Hyla regilla e la salamandra Ambystoma gracile sono ancora
presenti in queste valli, probabilmente sono meno sensibili a inquinanti azotati, questo può
essere il motivo per cui le popolazioni di entrambe le speci sono presenti nelle stesse aree
ove le rane sono andate via via scomparendo.
Questo lavoro ha come obbiettivo di verificare la nostra ipotesi della sensibilità degli anfibi
alle sostanze azotate in particolare ai nitrati e nitriti. Abbiamo voluto vedere quale relazione c'è fra dose-effetto oltre alle
eventuali differenze di sensibilità fra le cinque specie prese in esame Rana pretiosa, Rana aurora, Bufo borea, Hyla
regilla, e Ambystoma gracile. L'esperimento è stato effettuato in stagni artificiali appositamente realizzati così da poter
stabilire le concentrazioni letali (LC50) ad entrambi gli ioni a 4, 7 e 15 giorni
Materiali, metodi e procedure sperimentali
Le uova delle varie specie sono state raccolte fra febbraio e marzo 1996 in diverse zone dell'Oregon (USA). Quattro
specie (esclusa Rana aurora) sono state testate alla sensibilità verso soluzioni di nitrato, e tutte le specie sono state
testate per la sensibilità a soluzioni di nitrito. Ogni specie è stata testata in modo indipendente. Gli esperimenti sono
stati condotti in laboratorio a 15°C sotto luce artificiale a incandescenza con un fotoperiodo naturale. Sei gruppi di
girini sono stati esposti a varie soluzioni di nitrati e di nitriti, un gruppo è stato utilizzato come controllo, quindi
immerso in vasche prive di nitrati e nitriti, il tutto per periodi di 15 giorni.
Le vasche utilizzate (21) per l'esperimento sono state assegnate casualmente, abbiamo utilizzato nitrato di potassio
(KNO3) e nitrito di sodio (NaNO2) per compensare le variazioni di concentrazione durante le fasi dell'esperimento. Per i
vari esperimenti a base di nitrato, abbiamo usato le seguenti concentrazioni finali:
0.0, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5 e 25.0 mg/l di NO3- .
Per i trattamenti a base di nitriti, abbiamo usato le seguenti concentrazioni finali:
0.0, 0.22, 0.44, 0.88, 1.75, 3.5 e 7.0 mg/l di NO2-.
I valori delle concentrazioni sono state definite basandoci su precedenti lavori condotti su Rana pretiosa. Abbiamo
usato l'acqua del rubinetto senza cloro e trattata chimicamente per rimuovere l'ammoniaca, cloro, clorammina, e metalli
pesanti, il pH è stato controllato con dei tamponi.
All'inizio dell'esperimento sono stati definiti i gruppi di larve ed assegnati casualmente alle varie vasche come pure le
soluzioni da utilizzare. Le larve sono state alimentate ad libitum con lattuga precedentemente lavata con acqua distillata
e bollita per un minuto. Le concentrazioni di ioni nelle vasche sono state controllate al 7 ° giorno e al termine degli
esperimenti. Le analisi chimiche delle acque sono state condotte utilizzando metodologie standard. Le concentrazione di
nitrati e nitriti nei campioni sono stati determinate colorimetricamente su un Lachat Flow-Injection Autoanalyzer
(Lachat Instruments, Milwaukee, WI, USA). Non ci sono stati scostamenti significativi (> al 25%) dalle concentrazioni
di ioni originali. Dopo 7 giorni si è proceduto alla pulizia delle vasche e alla sostituzione delle soluzioni. Tutti gli
esperimenti sono stati condotti per 15 giorni. La mortalità larvale, il livello di attività, comportamento, e la presenza di
anomalie sono state monitorate continuamente come pure la rimozione delle larve morte.
Risultati del trattamento con i nitrati
Nessuna delle larve del gruppo di controllo è morta
durante i 15 giorni dell'esperimento. Fra le quattro
specie testate si sono evidenziate differenze di
sensibilità ai nitrati.
Particolarmente sensibili sono risultate le larve di
Ambystoma gracile e Rana pretiosa, mentre Bufo
borea e Hyla regilla non hanno manifestato particolari
reazioni. Alle concentrazioni più elevate di nitrati le
larve di Ambystoma gracile e Rana pretiosa
presentavano una ridotta attività alimentare, notevole
riduzione delle capacità natatorie, piaghe cutanee,
paralisi e altre problematiche che hanno determinato
un'alta mortalità. Al 4°giorno è risultata Ambystoma
gracile la più sensibile mentre a 15 giorni con 25 mg/l
Rp = Rana pretiosa, Ag = Ambystoma gracile,
di nitrati la mortalità è stata superiore al 50% sia per
Bb = Bufo borea,
Hr = Hyla regilla
Ambystoma gracile che per Rana pretiosa. Con 12,5
mg/l la mortalità di Rana pretiosa era oltre il 40% molto più elevata di Ambystoma gracile che presentava una mortalità
del 15%. La LC5015 per Rana pretiosa è di 16.45 mg/l di NO3 mentre per Ambystoma gracile è di 23.39 mg/l.
Risultati dei trattamenti con nitriti
Anche qui nessuna delle larve del gruppo di controllo è morta durante i 15 giorni dell'esperimento. Alle concentrazioni
più elevate tutte le larve delle cinque specie hanno manifestato una ridotta attività alimentare, problemi di mobilità e
maggiori difficoltà natatorie, formazioni di piaghe sull'epidermide, code piegate, paralisi e morte. Anche qui si sono
evidenziate differenze fra le varie specie sia all'aumentare della concentrazione e del tempo di esposizione. Tutte le
specie hanno evidenziato una forte sensibilità ai nitriti presentando a tutte le concentrazioni un'elevata LC50.
A 4 giorni vi sono significative ed evidenti differenze
fra le varie specie, Ambystoma gracile (LC504 = 1,3
mg/l) è risultata quella con il più alto tasso di mortalità
in tutte le differenti concentrazioni, già a 0,44 mg/l
alcune larve sono morte. Le altre specie hanno
mostrato una particolare sensibilità a partire da 3,5
mg/l, mentre la sola Bufo borea è risultata la meno
sensibile e solo alla concentrazione più elevata alcune
larve sono morte (mortalità < 10%)
Al giorno 7 Ambystoma gracile (LC507 = 0,75 mg/l)
risulta sempre la più sensibile alle basse concentrazioni
seguita a breve distanza dalle altre ad esclusione di
Bufo borea che ha iniziato a presentare una discreta
sensibilità (mortalità < 18%) a 3,5 mg/l mentre tutte le
altre hanno superato il 50%. Alla concentrazione più
elevata Bufo borea ha superato il 60% mentre tutte le
altre specie hanno avuto una mortalità superiore al
75% con punte superiori al 90% per Hyla regilla
(LC507 = 3,1 mg/l) e del 100% per Rana pretiosa
(LC507 = 1,45 mg/l)
Al 15° giorno anche Bufo borea (LC5015 = 2,4 mg/l) ha
raggiunto una mortalità di poco inferiore al 10% anche
alle concentrazioni più basse, mentre a 1,75 mg/l tutte
le specie (LC5015 da 0,5 a 1,3 mg/l) hanno presentato
una mortalità superiore al 50% per arrivare, alla
concentrazione più alta, a valori superiori al 95% di
Ambystoma gracile, mentre per le altre specie si è
raggiunto il 100%.
Rp = Rana pretiosa,
Hr = Hyla regilla,
Ag = Ambystoma gracile,
Ra = Rana aurora
Bb = Bufo borea,
DISCUSSIONE
Ambystoma gracile è ancora presente nelle pianure delle valli occidentali dell'Oregon e Washington, mentre Rana
pretiosa è estremamente rara. I nostri esperimenti hanno evidenziato la forte sensibilità di Rana pretiosa e di
Ambystoma gracile anche a bassi livelli di nitrati e di nitriti.
Tuttavia, sono emerse alcune differenze tra le due specie nella loro risposta a queste sostanze. Nonostante che
Ambystoma gracile abbia avuto una mortalità più elevata alle basse concentrazioni, alcuni individui sono riusciti a
sopravvire alle concentrazioni più elevate, mentre le larve di Rana pretiosa sono tutte morte. Da ciò si può ipotizzare
che in Ambystoma gracile ci siano individui in grado di sopravvivere a concentrazioni di nitrati e nitriti letali per Rana
pretiosa.
Al di là di tutto ciò i nostri esperimenti hanno dimostrato l'elevata sensibilità di queste cinque specie di anfibi ai prodotti
azotati ed in particolare ai nitriti. Nella Willamette Valley troviamo alcuni anfibi tra cui la Rana toro che potrebbe aver
contribuito al declino di Rana pretiosa occupandone l'habitat, ciò è stato probabilmente facilitato anche dal fatto che i
suoi girini sono relativamente tolleranti ai nitriti come hanno dimostrato Huey e Beitinger
Molte forniture di acqua pubblica negli Stati Uniti contengono tenori di nitrati che normalmente superano i 10 mg/l, in
Willamette Valley, le concentrazioni sono mediamente comprese fra 15-22 mg/l. Questi valori medi risultano essere
tossici per Rana pretiosa e Ambystoma gracile anche per il fatto che possono venire ridotti a nitriti.
Normalmente la concentrazione di nitriti in habitat acquatici è molto bassa (< 0,06 mg/l) ma in ambienti particolarmente
ricchi di materia organica la concentrazione di nitriti può salire a livelli tossici superiori a 1 mg/l. A ciò va aggiunto il
fatto che i nitrati possono anche essere ridotti a nitriti nel tratto gastrointestinale degli animali, in particolare di quelli
più giovani, e da qui raggiungere il flusso sanguigno combinandosi con l'emoglobina per formare la metaemoglobina,
con la conseguente riduzione delle capacità respiratorie dell'animale.
Un habitat acquatico adatto agli anfibi non dovrebbe superare i 10 mg/l di nitrati, valore che è già moderatamente
tossico per Rana pretiosa mentre i pesci possono tollerare valori almeno 4-5 volte superiori, valori che risultano letali
per Rana pretiosa e Ambystoma gracile, come probabilmente per molti altri anfibi.
Il valore limite di nitriti per l'acqua potabile di 1 mg/l (0,5 mg/l Italia) è altamente tossico per Rana pretiosa e
Ambystoma gracile e relativamente tossico per gli altri anfibi utilizzati nell'esperimento. Per i pesci un analogo valore di
tossicità lo si raggiunge a 5 mg/l, vediamo che anche per i nitriti la sensibilità degli anfibi è almeno 5 volte superiore a
quella dei pesci.
Da quest'esperimento emerge che i parametri indicati da US Environmental Protection Agency per definire i criteri di
qualità delle acque non garantiscono la sopravvivenza della gran parte degli anfibi. Siamo d'accordo con altri autori che
suggeriscono la necessità di stabilire criteri di qualità delle acque per gli anfibi, e riteniamo che le larve di specie
sensibili potrebbero essere utilizzate come bio-indicatori della qualità delle acque nel nord-ovest del Pacifico.