pag. 2-9

© Springer-Verlag 2002
Pathologica (2002) 94:2-9
EDITORIALE
A. Pich · E. Margaria · L. Chiusa
Significato delle AgNOR in patologia tumorale
Significance of AgNORs in tumour pathology
Riassunto L’analisi delle AgNOR, inizialmente considerata
come mezzo diagnostico in patologia tumorale, ha ora assunto un significato essenzialmente prognostico. L’espressione delle proteine AgNOR è associata a vari aspetti biologici delle cellule tumorali: attività metabolica, contenuto di
DNA, grado di differenziazione istologica e, soprattutto, rapidità della proliferazione. Pertanto, un’elevata quantità di
AgNOR è indice di un fenotipo tumorale aggressivo e numerosi lavori hanno dimostrato che le AgNOR sono un parametro prognostico indipendente in molti tipi di neoplasie. I
vantaggi pratici del metodo sono l’applicabilità a piccole biopsie, la possibilità di identificare cloni neoplastici con diversa proliferazione e di definire gruppi di rischio morfo-funzionali, attraverso la combinazione delle AgNOR col grado
di differenziazione istologica. L’analisi standardizzata permette di ottenere risultati oggettivi e riproducibili. Il futuro
delle AgNOR sembra dipendere soprattutto dalla possibilità
di quantificare le proteine AgNOR in cellule in ciclo sia con
metodi immunoistochimici che con citometria di flusso.
Parole chiave AgNOR • Patologia tumorale • Ruolo diagnostico • Ruolo prognostico
Key words AgNOR • Tumour pathology • Diagnostic role •
Prognostic role
A. Pich () • L. Chiusa
Dipartimento di Scienze Biomediche e Oncologia Umana,
Sezione di Anatomia Patologica,
Università di Torino, Via Santena 7, I-10126 Torino, Italia
e-mail: [email protected]
Tel.: +39-011-6706523
Fax: +39-011-6635267
E. Margaria
Divisione di Anatomia Patologica,
ASL 1, Ospedale San Giovanni, Torino, Italia
Introduzione
Le NOR (regioni dell’organizzatore nucleolare) sono quelle
regioni dei cromosomi metafasici attorno alle quali si riformano i nucleoli alla fine della telofase [1]. Esse contengono
i geni ribosomiali e, nell’uomo, sono situate nelle braccia
corte dei cromosomi acrocentrici [2]. Durante l’interfase, le
NOR sono localizzate all’interno dei nucleoli in strutture rotondeggianti, i cosiddetti centri fibrillari, nelle quali sono situati i geni ribosomiali. Associate alle NOR vi sono alcune
proteine caratterizzate da elevata argirofilia, responsabili
della colorazione selettiva delle NOR con l’argento. Le
NOR colorate con l’argento sono definite AgNOR e le proteine argirofile proteine AgNOR. Le principali di queste sono la proteina C23, o nucleolina, e la proteina B23, o numatrina [3]. La proteina C23, una fosfoproteina di 105 kDa,
si lega all’istone H1 del cistrone, inducendo la decondensazione della cromatina e facilitando la trascrizione genica; la
proteina B23, una fosfoproteina di 39 kDa, partecipa anch’essa al processo di biogenesi ribosomiale [4]. Queste proteine sono ricche di gruppi sulfidrilici, disulfidici o carbossilici con elevata affinità per gli ioni Ag [5]. In campo citoistopatologico, con il termine AgNOR si intendono le
AgNOR presenti nei nucleoli durante l’interfase. Il numero
di AgNOR (che, ripetiamo, sono quelle componenti nucleolari dove viene prodotto l’RNA ribosomiale) è correlato con
l’attività di biogenesi ribosomiale della cellula.
Nel 1938, vennero per la prima volta descritti alcuni corpuscoli intranucleolari, chiamati nucleolini, evidenziabili
con impregnazione argentica, la cui somiglianza con quelle
formazioni oggi chiamate AgNOR è sorprendente. Questi
nucleolini erano più numerosi in tessuti neoplastici maligni
che in quelli normali o benigni, tanto più quanto era maligno il tumore [6]. In seguito, venne studiata a scopo diagnostico la distribuzione dei nucleolini in cellule tumorali
isolate [7], ma i metodi per evidenziarli erano piuttosto la-
A. Pich et al.: Significato delle AgNOR in patologia tumorale
boriosi e difficilmente applicabili. Finalmente, nel 1986,
Ploton, perfezionando il metodo di impregnazione argentica,
in un solo passaggio descritto da Howell e Black nel 1980
[8], mise a punto una tecnica di impregnazione argentica rapida e semplice, eseguibile a temperatura ambiente, funzionante anche su tessuti comunemente fissati e inclusi [9].
Con questa tecnica, le AgNOR apparivano come strutture
puntiformi o “dots” neri, ben definiti, variamente distribuite
nel nucleo delle cellule in interfase (Figg. 1 e 2).
Il metodo divenne quindi disponibile per i patologi: tra
i primi ad applicarlo, John Crocker nel 1987 segnalò la diversa distribuzione delle AgNOR in lesioni melanocitarie
benigne e maligne [10] e in linfomi maligni di alto o basso
grado [11], suscitando l’interesse della comunità scientifica. Infatti, nel giugno dello stesso anno, apparve su Lancet
un editoriale che definiva l’analisi delle AgNOR come un
metodo potenzialmente interessante in istopatologia tumorale [12].
Da allora sono stati effettuati molti studi sulle AgNOR:
da una Medline eseguita via Internet, a tutt’oggi risultano
pubblicati oltre 1350 lavori scientifici comprendenti i termini “nucleolar organizer region and tumor”.
Fig. 1 Carcinoma vescicale di basso grado (G1). Le AgNOR sono
poche e relativamente voluminose
3
Lo scopo di questa breve rassegna è di riassumere il ruolo che l’analisi AgNOR ha in patologia tumorale, in campo
diagnostico e soprattutto prognostico, discutendone i vantaggi e i possibili sviluppi.
Ruolo delle AgNOR nella diagnosi di malignità
La possibilità di distinguere cellule tumorali benigne e maligne sulla base della diversa distribuzione e quantità di
AgNOR emerse chiaramente già nello studio di Ploton, che
dimostrò che le AgNOR del carcinoma prostatico erano più
numerose e più piccole di quelle dell’ipertrofia prostatica
[9], e in quelli immediatamente successivi di Crocker e
Skilbeck in lesioni melanocitarie [10] e di Crocker e Nar in
linfomi maligni [11]. Molti lavori hanno segnalato una significativa differenza nel numero e distribuzione delle
AgNOR tra neoplasie benigne e maligne, di vari tipi istologici e apparati [4].
Purtroppo, sebbene la quantità delle AgNOR sia generalmente più elevata nei tumori maligni che in quelli beni-
Fig. 2 Carcinoma vescicale di alto grado (G3). Le AgNOR sono
numerose e disperse
4
A. Pich et al.: Significato delle AgNOR in patologia tumorale
Tabella 1 Lesioni in cui l’analisi AgNOR ha permesso una sicura diagnosi di benignità o malignità
Lesioni
Citazioni bibliografiche
Nevo nevocellulare vs. lentigo maligna,
melanoma superficiale, melanocarcinoma
Crocker and Skilbeck
Leong and Gilham
J Clin Pathol 40:885-889, 1987
Hum Pathol 20:257-262, 1989
Versamenti pleurici reattivi
vs. versamenti pleurici neoplastici
Ayres et al.
Derenzini et al.
Thorax 43:366-370, 1988
Acta Cytol 33:491-498, 1989
Noduli di epatociti rigeneranti
vs. epatocarcinoma
Crocker and McGovern
J Clin Pathol 41:1044-1048, 1988
Fibromatosi giovanile
vs. fibrosarcoma infantile
Egan et al.
J Clin Pathol 41:31-33, 1988
Adenoma pleomorfo
vs. carcinoma di ghiandole salivari
Morgan et al.
Histopathology 13:553-559, 1988
Pielonefrite xantogranulomatosa
vs. carcinoma di cellule renali
Bryan and Crocker
J Clin Pathol 43:147-148, 1990
Nevo blu cellulare benigno
vs. nevo blu cellulare maligno
Pich et al.
Hum Pathol 24:1323-1329, 1993
gni, ben presto apparve che vi erano sovrapposizioni in
molti casi, soprattutto in lesioni mammarie [13-16] e di
ghiandole endocrine [17]. Questo, oltreché rendere problematica l’applicazione pratica nel singolo caso, ha contribuito non poco a diffondere tra i patologi, il cui obiettivo
primario resta la diagnosi, un certo scetticismo sul metodo
nel suo complesso.
Tuttavia, in alcuni casi l’analisi delle AgNOR può essere considerata come un parametro assoluto di malignità
o benignità, nel senso che non si sono osservate sovrapposizioni nei valori AgNOR tra nevi benigni da una parte e
lentigo maligna, melanoma a diffusione superficiale e melanocarcinoma dall’altra [10], tra versamenti pleurici reattivi o neoplastici [18], tra noduli di epatociti rigeneranti
nella cirrosi e foci di epatocarcinoma, tra fibromatosi e fibrosarcomi giovanili, tra adenomi e carcinomi di ghiandole salivari, tra pielonefrite xantogranulomatosa e carcinomi
renali (Tab. 1).
Noi abbiamo dimostrato una netta differenza nel numero
e distribuzione delle AgNOR tra nevo blu cellulare benigno
e maligno: in effetti, il numero medio delle AgNOR nel primo era 3.69 (range: 2.8-4.35) e 8.33 (range: 7.36-9.66) nel
secondo, senza alcuna sovrapposizione [19].
cinomi del grosso intestino [22-24] e gliomi [25]. Da allora
sono stati pubblicati più di 400 lavori sul rapporto tra
AgNOR ed evoluzione clinica di neoplasie di vari tipi istologici e apparati. Gran parte della bibliografia relativa è riportata in ampie recensioni [4, 26, 27]. Nella maggior parte
dei lavori, è segnalata una correlazione tra elevata quantità
di AgNOR e prognosi sfavorevole.
Ma le AgNOR sono un fattore di prognosi davvero importante? Per esserlo, devono conservare il loro significato
prognostico anche quando sono confrontate con altri parametri di prognosi, in altre parole quando sono una variabile
indipendente in analisi multivariata. Questo è stato dimostrato in numerosi lavori riportati in letteratura (Tab. 2) e anche nella maggior parte delle nostre ricerche.
Per oltre 10 anni abbiamo studiato le AgNOR in casistiche omogenee di diversi tipi di neoplasie umane, con followup minimo di 3-5 anni: carcinomi di faringe, rene, prostata,
mammella maschile, timoma, mieloma multiplo e leucemie
mieloidi acute dell’adulto.
In 94 pazienti con carcinoma della faringe, tutti trattati unicamente con radioterapia esterna presso il Dipartimento di Radioterapia e Otorinolaringoiatria dell’Ospedale
Maggiore di Novara, la sopravvivenza a 5 anni dei pazienti
con ≤10.64 AgNOR/cellula (mediana dell’intera casistica)
era del 56% contro il 12% di quelli con un numero di
AgNOR più elevato (p<0.0001). In analisi multivariata,
eseguita secondo il modello di Cox, dei sei parametri
esaminati (età, grado istologico, T, N, sede tumorale e
AgNOR), solo tre sono risultati indipendenti: la sede tumorale, il grado istologico e le AgNOR (X2=36.23, p<0.0001,
r.r.=7.04).
In 116 pazienti con mieloma multiplo, tutti provenienti da un unico centro, la Divisione di Ematologia
AgNOR e prognosi tumorale
Il ruolo più rilevante delle AgNOR in patologia tumorale è
senza dubbio quello legato al loro valore prognostico.
Questo venne suggerito da osservazioni su casi di neuroblastoma infantile [20] e di tumori mastocitari spontanei in
cani [21] e venne confermato in più vaste casistiche di car-
A. Pich et al.: Significato delle AgNOR in patologia tumorale
5
Tabella 2 Neoplasie in cui il parametro AgNOR si è dimostrato fattore prognostico indipendente in analisi multivariata
Tumori
Carcinomi orali
Carcinomi dell’esofago
Carcinomi gastrici
Carcinomi colo-rettali
Carcinomi epatocellulari
Carcinomi della colecisti
Carcinomi faringei
Carcinomi della laringe
Carcinomi del polmone
Carcinomi renali
Carcinomi vescicali
Carcinomi della prostata
Carcinomi mammari
Carcinoma della mammella
maschile
Carcinomi cervicali
Carcinomi dell’endometrio
Sarcomi
Lesioni paratiroidee
Melanoma
Melanoma della coroide
Leucemie/Linfomi
Mieloma
Timoma
Citazioni bibliografiche
Teixeira et al.
Piffko et al.
Piffko et al.
Xie et al.
Morita et al.
Kakeji et al.
Giuffrè et al.
Moran et al.
Rüschoff et al.
Joyce et al.
Öfner et al.
Shimizu et al.
Nishizawa-Takano et al.
Pich et al.
Bockmuhl et al.
Xie et al.
Oyama et al.
Lee et al.
Antonangelo et al.
Bernardi et al.
Carvalho et al.
Delahunt et al.
Delahunt et al.
Delahunt et al.
Shimazui et al.
Pich et al.
Yasunaga et al.
Lipponen et al.
Masuda et al.
Contractor et al.
Chiusa et al.
Bockmuhl et al.
Lesty et al.
Aubele et al.
Aubele et al.
Nakayama e Abe
Öfner et al.
Ceccarelli et al.
Biesterfeld et al.
Pich et al.
Pich et al.
Tosi et al.
Trerè et al.
Trerè et al.
Giuffrè et al.
Tomita et al.
Kuratsu et al.
Kuratsu et al.
Nakanishi et al.
Tuccari et al.
Barzilai et al.
Tuccari et al.
Jakic-Razumovic et al.
Trerè et al.
Pich et al.
Korkolopoulou et al.
Metze et al.
Pich et al.
Pich et al.
Pich et al.
Pich et al.
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No. casi
43
94
80
51
98
91
78
51
70
164
92
89
76
61
30
93
102
73
81
52
45
182
183
206
59
21
96
229
90
63
65
40
32
137
137
131
115
217
89
27
34
85
33
45
64
194
44
151
70
19
30
34
61
119
40
91
57
64
80
116
90
6
dell’Ospedale S. Giovanni Battista di Torino, trattati con
melfalan e prednisone o cicli alternati VMCP (vincristina,
melfalan, ciclofosfamide, prednisone) o VBAP (vincristina,
BCNU, adriamicina, prednisone), la sopravvivenza a 5 anni
dei pazienti con ≤4.4 AgNOR/plasmacellula era del 44% e
solo del 5% in quelli con un numero di AgNOR più alto
(p<0.0001). Delle 12 variabili introdotte nel modello di Cox
(tipo di immunoglobulina, emoglobina, piastrine, creatinina,
stadio di Durie, massa tumorale, grado di atipia delle plasmacellule, tipo di infiltrazione, entità dell’invasione midollare, fibrosi, labeling index e AgNOR), solo tre risultarono
indipendenti: il tipo di infiltrazione midollare, la presenza di
proteine Bence-Jones e le AgNOR (X2=26.18, p<0.001,
r.r.=3.15).
In 90 pazienti affetti da timoma maligno, tutti sottoposti
a resezione chirurgica radicale o parziale presso il Centro di
Chirurgia Toraco-Polmonare dell’Università di Torino, e in
parte trattati con radio- o chemio-radioterapia adiuvante, la
sopravvivenza a 5 anni era del 95% nei casi con ≤5.58
AgNOR/cellula, mentre solo del 55% in quelli con più
AgNOR (p<0.0001). Delle sette variabili esaminate nel modello di Cox (età, sesso, istotipo secondo la classificazione
americana ed europea, stadio clinico, miastenia grave e
AgNOR), solo lo stadio tumorale e la quantità di AgNOR
(X2=6.8, p=0.009, r.r.=6.94) risultarono parametri indipendenti.
In 65 pazienti con carcinoma della prostata, provenienti
dalla Divisione di Urologia dell’Ospedale S. Giovanni
Battista di Torino e trattati soltanto con terapia ormonale, la
sopravvivenza a 5 anni era del 74% nei pazienti con ≤7.84
AgNOR/cellula e solo del 7% in quelli con più AgNOR
(p<0.0001). Delle sei variabili esaminate in multivariata
(età, grado istologico secondo OMS e Gleason, area nucleare e nucleolare ed AgNOR), solo quest’ultima è risultata indipendente (X2=21.48, p<0.001, r.r.=1.44).
Tra i 21 pazienti con carcinoma di cellule renali, tutti sottoposti a nefrectomia radicale presso la Divisione di Urologia dell’Ospedale S.Giovanni Battista di Torino e in parte
trattati con chemioterapia adiuvante ed alfa-interferon, tutti
quelli con ≤5.94 AgNOR/cellula erano ancora vivi dopo 6
anni, mentre soltanto il 60% di quelli con più AgNOR lo era
(p=0.01). Degli 8 parametri valutati in analisi multivariata
(età, sesso, grado istologico, stadio T e N, tipo di terapia,
Ki67 scores e AgNOR), solo quest’ultimo risultò indipendente (X2=5.97, p=0.015, r.r.=7.88).
In 40 pazienti adulti con leucemia mieloide acuta non
M3, secondo la classificazione FAB, tutti trattati nel
Dipartimento di Ematologia dell’Ospedale S.Giovanni
Battista di Torino coi protocolli 8A e 8B dell’EORTC/GIMEMA, la sopravvivenza a 5 anni era del 44% per quelli
con >6.6 AgNOR/blasti contro il 16% per quelli con minor
numero di AgNOR (p=0.0009). Delle 11 variabili introdotte
nel modello di Cox (età, sesso, categorie FAB, citogenetica,
performance status, emoglobina, globuli bianchi, piastrine,
blasti periferici, espressione di CD34 e AgNOR), solo
A. Pich et al.: Significato delle AgNOR in patologia tumorale
quest’ultima è risultata indipendente (X2=8.3, p=0.005,
r.r.=0.31).
Infine, in 50 uomini con carcinoma della mammella, tutti sottoposti a mastectomia e in parte a chemio-, radio- od
ormonoterapia adiuvante, la sopravvivenza a 5 anni era del
71% nei casi con area AgNOR ≤3.54 µm2 e del 32% in quelli con area maggiore (p=0.01). Delle 17 variabili introdotte
nel modello di Cox (età, grado istologico, stadio T e N, ER,
PgR e AR, espressione di p53, c-erbB-2, bcl-2 e c-myc,
MIB-1, PCNA, area e perimetro nucleare, tipo di terapia e
area AgNOR), solo tre mantennero un valore prognostico indipendente: l’espressione di p53, di c-erbB-2 e l’area
AgNOR (X2=6.67, p<0.001, r.r.=2.36).
Gran parte dei risultati relativi al significato prognostico
delle AgNOR nelle casistiche sopra riportate sono stati oggetto di pubblicazione [27-37].
Le ragioni teoriche e sperimentali del valore prognostico
delle AgNOR sono numerose e sono state in parte discusse
in ampie recensioni [4, 26, 27, 38-41]. Innanzi tutto, un aumento di AgNOR può dipendere da una aumentata richiesta
di biogenesi ribosomale, il che riflette una elevata attività
metabolica cellulare. Inoltre, essendo le AgNOR localizzate
nei cromosomi acrocentrici, un aumento di questi, che si può
verificare in condizioni di aneuploidia, può tradursi in un
aumento del numero di AgNOR. Noi abbiamo osservato una
significativa associazione tra AgNOR e contenuto di DNA,
valutato con citometria di flusso, in carcinomi vescicali, timomi [32] e carcinomi mammari maschili [33]. Inoltre, l’associazione tra AgNOR e grado di differenziazione istologica, uno dei classici parametri di prognosi tumorale, è ben documentata in letteratura [42]. Questo è emerso anche in nostre ricerche nel mieloma multiplo [29] e in carcinomi vescicali [43], mammari maschili e prostatici [36]. Soprattutto,
la quantità di AgNOR riflette l’attività proliferativa cellulare. A conferma di numerosi lavori riportati in letteratura, noi
abbiamo dimostrato una forte correlazione tra AgNOR e indici di proliferazione, come il Ki67 in carcinomi renali [44],
MIB-1 e PCNA in carcinomi mammari maschili, vescicali e
faringei [45] e incorporazione di bromodesossisuridina nel
mieloma multiplo [46].
Tuttavia, la progressione neoplastica dipende non solo
dal numero delle cellule proliferanti, ma anche dalla rapidità
della proliferazione ed è stato osservato che le AgNOR sono strettamente correlate con la velocità di duplicazione cellulare [47]. Infatti, la duplicazione cellulare richiede la sintesi di molte nuove proteine e quindi un’attiva sintesi di
RNA ribosomale, per la cui trascrizione sono necessarie le
proteine AgNOR, soprattutto la nucleolina e la B23. Se il
tempo di duplicazione è breve, la sintesi di RNA ribosomale in questo periodo deve essere necessariamente elevata e
grande è l’aumento di tutte le proteine nucleolari implicate
nella trascrizione ed assemblaggio del RNA ribosomale.
Pertanto, un elevato numero di AgNOR indica che un tumore ha una elevata attività metabolica, ha probabilmente un
contenuto abnorme di DNA, è verosimilmente poco diffe-
A. Pich et al.: Significato delle AgNOR in patologia tumorale
renziato, ha una elevata attività proliferativa e una rapida
crescita. Quindi una grande quantità di AgNOR è espressione di un fenotipo tumorale altamente aggressivo.
Vantaggi pratici dell’analisi AgNOR
Oltre che fornire informazioni sulla biologia tumorale, l’analisi AgNOR presenta alcuni vantaggi di ordine pratico per
il patologo. In primo luogo, può essere eseguita anche su
biopsie molto piccole e difficilmente ripetibili, consentendo
la contemporanea valutazione dell’attività proliferativa e la
diagnosi istologica, a differenza di altri metodi, come la citometria di flusso, che comportano spesso l’esaurimento del
materiale. In aggiunta, permette di individuare nell’ambito
di una neoplasia gruppi o foci di cellule con elevata attività
proliferativa, localizzando cloni neoplastici particolarmente
aggressivi. A questo proposito, è stato segnalato il forte valore prognostico della valutazione dell’attività proliferativa
nel fronte di invasione tumorale [48]. Inoltre, consente di valutare l’attività proliferativa delle sole cellule neoplastiche
quando sono scarse e disperse tra altre cellule non tumorali
proliferanti, come nei timomi a prevalenza linfocitaria [30]
o nei mielomi con infiltrazione di tipo interstiziale. Infine,
la combinazione della proliferazione e del grado di differenziazione istologica permette al patologo di identificare gruppi di rischio morfo-funzionali. Proprio su queste basi, abbiamo potuto stratificare pazienti con mieloma [34], carcinomi della faringe, della mammella maschile e della prostata [36] in gruppi di alto e basso rischio, che potrebbero beneficiare di diversi approcci terapeutici. Ad esempio, tutti i
pazienti con carcinoma della prostata da noi studiati erano
stati trattati solo con terapia ormonale: nessuno dei 13 pazienti con carcinoma grado 3 secondo OMS e AgNOR/cellula >7.84 era vivo dopo 53 mesi, mentre l’82% dei 29 pazienti con carcinoma G1-2 e minor numero di AgNOR lo era
(p<0.0001) [27]. Questo significa che la sola terapia ormonale non è in grado di controllare un carcinoma della prostata scarsamente differenziato e con alta velocità di proliferazione.
Quale futuro per le AgNOR?
Nonostante i vantaggi dell’analisi AgNOR in patologia tumorale siano evidenti, è innegabile che essa non sia molto
diffusa tra i patologi.
Come sottolineato da Derenzini e Trerè nella loro lucida
esposizione sullo stato dell’arte [41], questo dipende in parte dall’aver considerato il metodo AgNOR come un parametro essenzialmente diagnostico: i limiti delle AgNOR in questo ambito hanno determinato un generale scetticismo sul
metodo. In aggiunta, si è invocata una certa indaginosità del
7
metodo, che in realtà non è più complicato di altre metodiche immunoistochimiche, anche se è certamente meno agevole preparare ogni volta le necessarie diluizioni dei reagenti, piuttosto che ricorrere a “kits” preconfezionati. Ma le
principali obiezioni riguardano una presunta scarsa riproducibilità dei risultati. È vero che numerose variabili, come lo
spessore delle sezioni istologiche, la temperatura di reazione, la concentrazione del nitrato di argento, i tempi di incubazione, persino l’uso di vetreria non perfettamente pulita,
possono ostacolare la messa in evidenza di AgNOR nettamente distinte e causare precipitati di nitrato di argento in cui
può essere difficile distinguere le singole AgNOR. Per queste ragioni si è ritenuto opportuno misurare l’area dei precipitati, più che contare le singole AgNOR. Il metodo standardizzato per l’evidenziazione e la misurazione della quantità
di AgNOR, proposto dal Comitato Europeo per la Quantificazione delle AgNOR [49], ha definitivamente risolto i
problemi di riproducibilità e ha dimostrato inoltre di avere
grande valore prognostico [50, 51]. Un ulteriore perfezionamento si è ottenuto con la misurazione della quantità di
AgNOR in cellule in ciclo, mediante una doppia reazione
istochimica (AgNOR) e immunoistochimica (Ki67/MIB-1),
che consente la valutazione simultanea della frazione di crescita e della velocità di proliferazione [41, 52].
Superate le obiezioni di carattere metodologico e scientifico, lo sviluppo futuro del metodo AgNOR sembra dipendere ormai essenzialmente da due fattori: visibilità e commercializzazione.
Dal 1993, il Comitato Europeo per la Quantificazione
delle AgNOR organizza incontri di lavoro a scadenza annuale o biennale, per discutere i risultati più recenti e proporre aggiornamenti e nuove applicazioni del metodo.
Sarebbe opportuno che queste riunioni non fossero limitate
ad una ristretta cerchia di appassionati, ma venissero inserite nel contesto di Congressi Scientifici nazionali ed internazionali di più ampio respiro. Per questo è di buon auspicio
che alle AgNOR sia stato riservato uno spazio anche nel II
Congresso SIAPEC di Torino del settembre 2001.
Per quanto riguarda la commercializzazione, è indubbio
che i costi (e i relativi guadagni) dei reagenti per l’analisi
AgNOR siano molto minori di quelli dei vari anticorpi monoclonali e sistemi di rivelazione di una qualsiasi reazione
immunoistochimica. D’altra parte, la stessa analisi di immagine, necessaria per il metodo standardizzato, attraversa un
momento di crisi ed è sempre di più confinata a ristrette
élites di ricercatori. Tuttavia, del tutto recentemente è stato
dimostrato che è possibile quantificare le proteine AgNOR
in cellule in sospensione con la citometria di flusso [53].
Questo originale perfezionamento utilizza metodi e apparecchiature ampiamente diffusi in ogni laboratorio e, inoltre,
rende possibile la contemporanea valutazione della frazione
di crescita (Ki67/MIB1) e della velocità di duplicazione
(AgNOR). È possibile che questa innovazione, se sarà applicabile anche a materiale di routine, rappresenti davvero il
futuro delle AgNOR. Purtroppo, come già accaduto con l’a-
8
A. Pich et al.: Significato delle AgNOR in patologia tumorale
nalisi standardizzata, anche con questo nuovo metodo viene
ad essere definitivamente trascurato l’aspetto qualitativo
della distribuzione delle AgNOR nelle cellule tumorali, che
è capace di fornire con immediatezza indicazioni sulla malignità di una neoplasia, dal momento che le AgNOR sono
particolarmente disperse nelle cellule di tumori poco differenziati e rapidamente proliferanti.
Ringraziamenti Il lavoro è stato svolto in parte con i finanziamenti del MURST (ex quota 60%). Si ringrazia il Prof. L. Pollice
per la revisione critica del manoscritto.
Summary Analysis of silver-stained nucleolar organizer
regions (AgNORs), originally regarded as a diagnostic tool,
is now considered mainly as a prognostic parameter. Indeed,
the expression of AgNOR proteins is associated with several
biological properties of neoplastic cells: metabolic activity,
DNA content, histological grade of differentiation and,
especially, the rapidity of cellular proliferation. Thus, a high
AgNOR quantity is a marker of aggressive tumour phenotype, and a large number of papers have shown the independent prognostic value of AgNOR analysis in several
human neoplasias. Moreover, the method can be applied to
small biopsies, can identify neoplastic clones with different
proliferative activities and may stratify patients into different
risk groups. The standardized method for AgNOR quantification offers objective and reproducible results. The evaluation of AgNOR quantity in cycling cells, either by immunohistochemistry or by a novel flow cytometry technique, may
represent the future of AgNOR analysis.
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