A liciclobacillo Rile v azione Re al-Tim e PCR

Gli Aliciclobacilli sono batteri Gram positivi, termofili, acidofili, aerobi obbligati e sporigeni. In genere, il batterio
colonizza il suolo, ma può anche infestare frutta e raccolti; alcune specie poi possono causare deterioramento di
bevande a causa della produzione di guaiacolo (A. acidoterrestris) o
di
2-methyltetraidrothiofen-3-one (A.
acidocaldarius) la cui particolarità è l’aroma sgradevole. La crescita di Aliciclobacillo in bevande e salse di
Pomodoro è per sua natura non rilevabile visivamente: la fermentazione avviene senza produzione di CO2,
pertanto lattine e Tetra-brik non mostrano rigonfiamenti né si manifesta lo scolorimento della conserva/succo.
Pertanto l’alterazione del prodotto viene riconosciuta solo nel momento di apertura della confezione per mano
del consumatore.
La conseguenza diretta è un serio danno di immagine per il produttore. Il controllo puntuale della presenza e
della crescita dell’organismo durante i processi di lavorazione, è quindi di fondamentale importanza ma
particolarmente difficile data la forte resistenza delle spore alle alte temperature (92°C per 10 secondi).
Lo screening degli ingredienti per le spore di Aliciclobacillo è pertanto divenuto uno degli strumenti chiave per
prevenire i deterioramenti, specialmente nella produzione di succhi di frutta. È altrettanto importante, da un
punto di vista di controllo qualità, un monitoraggio regolare dei prodotti finiti per assicurare che i controlli siano
efficaci e per rilevare preventivamente potenziali contaminazioni. Queste esigenze hanno portato allo sviluppo di
un range di metodi, basati sulle tecniche colturali tradizionali e le tecnologie rapide.
Scartare il surnatante
24-96 ore
25°C o 45°C
Campionamento
Pellet
batterico
Aliciclobacillo
Rilevazione
Real-Time PCR
Arricchimento in
BAT Broth
Estrazione del DNA con
ION-Force
Real-Time PCR
Impostare la reazione PCR
Purificazione del
DNA
Trattamento termico
del campione
Generon ha sviluppato PATHfinder Alicyclobacillus una soluzione tecnica completa basata sulla
Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction). Industrie del settore conserviero possono adesso
verificare la presenza dell’Aliciclobacillo in campioni ambientali, prodotti crudi, semilavorati e
prodotti finiti, in meno di due ore dopo l’arricchimento.
L’approccio analitico di Generon è basato su uno studio approfondito della letteratura scientifica
sulla genetica e fisiologia del bacillo. I PATHfinder Alicyclobacillus Assay contengono primers e sonde
marcate per rilevare un gene fondamentale per la biosintesi degli acidi grassi ω-cicloalifatici che
conferiscono la resistenza delle spore al calore; sono perciò meno soggetti a cross-reattività con altri
batteri rispetto a quanto accade con l’approccio classico di rilevazione del gene 16S.
I metodi di rilevazione consigliati, a seconda della composizione del campione e del tempo trascorso dalla
lavorazione, sono estratti dai metodi IFU (International fruit and vegetable juice association) per la rilevazione di
Aliciclobacillo in succhi di frutta (2003). Lo shock termico è effettuato incubando a 80°C per 10 minuti.
Materiali crudi
(incluse acque trattate)
Prodotti finiti
Prodotti finiti
provenienti dal mercato
è richiesto un trattamento di
Campionamento diretto del
Pre-incubazioni del campione
shock termico, seguito da
prodotto dopo il processo di
e trattamenti con shock termici
una semina diretta
pastorizzazione senza
sono opzionali. Se si sospetta
(opzionale), filtrazione o
necessità di shock termico: è
un deterioramento ma non
arricchimento in un mezzo
richiesta una pre-incubazione
viene rilevato Aliciclobacillo
liquido del materiale
del campione in un mezzo
dopo la semina diretta, sono
sottoposto al trattamento.
liquido. Crescita per 7 giorni a
consigliati uno shock termico e
Crescita per 4 giorni a 45°C in
45°C in BAT Broth.
l’arricchimento. Crescita per 7
giorni a 45°C in BAT Broth.
BAT Broth.
Gli Aliciclobacilli (soprattutto A. acidoterrestris perché cresce a temperature inferiori ai 30°C) rappresentano una minaccia
specifica per l’intera industria delle conserve, dai produttori dei concentrati agli imbottigliatori di succhi ad altre industrie
che producono bevande come succhi di frutta(arancia, mela, pomodoro, uva bianca, pera, mango, ananas), succhi
misti, succhi concentrati (arancia, albicocca. pesca, pera, mela, mango, cocco). Una rassegna della letteratura ha
mostrato diversi livelli di rischio di contaminazione a seconda della tipologia di succhi (per esempio: succo di mela
concentrato - fino al 75%; succo di arancia concentrato - fino al 80%).
Per l’industria delle salse di pomodoro, invece, la minaccia principale è rappresentata da A. acidocaldarius in quanto i
trattamenti termici applicati ai pomodori sono più severi rispetto a quello cui vengono sottoposti i frutti. Le spore di A.
acidocaldarius sono le uniche in grado di rimanere vitali dopo questi trattamenti e pertanto crescere e degradare il
prodotto.
Trattamenti termici industriali correlati con le specie di Alicyclobacillus che causano aromi sgradevoli
Alicyclobacillus acidocaldarius
Alicyclobacillus spp.
Trattamenti termici industriali
Alicyclobacillus spp.
Alicyclobacillus acidoterrestris
Ciò si riflette anche nella possibilità di differenziare A. acidoterrestris da A. acidocaldarius attraverso l’incubazione delle
colture a 30°, 45° e 65ºC. A. acidoterrestris non cresce a 65ºC e A. acidocaldarius non cresce a 30ºC. PATHfinder
Alicyclobacillus Assay consente la rilevazione di entrambi quando il passaggio di arricchimento è eseguito a 45°C; se
invece l’arricchimento avviene a 30°C solo A. acidoterrestris può proliferare ed essere rilevato dal saggio.
Concentrati Semilavorati
Frutta
Fasi della produzione dei succhi di frutta e punti di controllo per monitorare la contaminazione da Aliciclobacillo
Fase produttiva
Punto di controllo
Raccolta e trasporto della frutta
Frutta caduta
Igiene dei container di frutta, stoccaggio intermedio e trasporto
Ricezione della frutta e
maneggiamento
Sporcizia della frutta o materia vegetale estraneo (es. fogliame)
Pulizia della frutta e smistamento
Acqua di lavaggio e risciacquo
Spremitura e estrazione dei succhi
Acqua di estrazione dei succhi
Acqua per la pulizia delle attrezzature
Chiarificazione/filtrazione dei succhi
Igiene efficiente e integrità delle membrane
Rimozione di colore o amarezza
Igiene efficiente delle resine
Pastorizzazione
Temperatura, durata e procedura
Concentrazione
Condizioni termiche
Riempimento e conservazione
Temperatura di conservazione
Condizioni termiche
Prodotti Finiti
Gestione dello spazio di testa
Stoccaggio di materiale crudo
Temperatura di conservazione
Formulazione
Qualità degli ingredienti usati (es.: sciroppo di zucchero)
Monitoraggio precursori Guaiacolo
Conservazione
Condizioni termiche
Gestione dello spazio di testa
Pastorizzazione
Condizioni termiche
Riempimento
Condizioni termiche
Stoccaggio e distribuzione
Condizioni termiche
I nuovi PATHfinder Alicyclobacillus acidoterrestris e acidocaldarius Assay consentono la rilevazione specifica dei principali
agenti deterioranti anche quando l’arricchimento è eseguito a 45°C. I due saggi possono anche essere usati in multiplex
per una diagnosi completa circa la presenza di questi batteri nel campione. I PATHfinder Assay di Generon possono essere
usati su qualsiasi strumento Real-Time PCR (ad eccezione dei sistemi Light Cycler I e II) sebbene specificamente sviluppati e
validati per il sistema Bio-Rad CFX Deep-Well.
Informazioni utili all’ordine
Kit di rilevazione
Tutti i kit includono oligo mix + polimerasi + controlli positive e negativi
• PMB48A-AT
PATHfinder Alicyclobacillus acidoterrestris Assay – 100 test
• PMB48A-AC
PATHfinder Alicyclobacillus acidocaldarius Assay – 100 test
Questi kit includono un controllo di amplificazione interna positivo rilevabile con canale HEX. Disponibile anche nel formato 50 test
• PMB48A-M
PATHfinder A.acidoterrestris (FAM) + acidocaldarius (HEX) Multiplex Assay – 100 tests
Il kit include un controllo di amplificazione interna positivo rilevabile con canale Texas Red. Disponibile anche nel formato 50 test
Materiale di riferimento e di controllo del processo
• PMB48X-AT
PATHfinder sureXtra Alicyclobacillus acidoterrestris – 50 vials
• PMB48X-AC
PATHfinder sureXtra Alicyclobacillus acidocaldarius – 50 vials
Il calore inattiva i pellet batterici a una quantità cellulare nota (fino a 106 CFU/fiala) contenenti una sequenza target per
A. acidoterrestris per assicurare uno stretto controllo dell’efficacia del processo di estrazione del DNA.
Kit di estrazione del DNA
• EXD001
ION-Force FAST DNA Extractor
Accessori per l’estrazione
• ACC2063
Microcentrifuga 14500 rpm
• ACC2003
Vortex a velocità variabile
• ACC6037
Termoblocco riscaldante per microtubi
Responsabili commerciali di zona
Emilia Romagna, Marche
Altre regioni
Stefano Callea
Daniela Superchi
Alessandro Ruffato
Simone Ruffato
Francesco Rossi
Caterina Novi
- [email protected]
- [email protected]
- [email protected]
- [email protected]
- [email protected]
- [email protected]
Generon srl
Stradello Aggazzotti,104 – Modena -  +39 059 8637161  +39 059 7353024
 [email protected]  www.generon.it
- 349 5503780
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