lezione 6 cromatografia

LE TECNICHE CROMATOGRAFICHE
L tecniche
Le
t
i h cromatografiche
t
fi h permettono
tt
lla separazione
i
e quantificazione
tifi
i
dei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissime
applicazioni in campo alimentare
alimentare..
Nei metodi cromatografici i componenti di una miscela si separano
distribuendosi tra due fasi
fasi::
‰
una fase stazionaria (un solido o un liquido su supporto solido inerte)
‰
una fase mobile (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su quella
stazionaria..
stazionaria
La separazione è dovuta principalmente alle relative affinità per la fase
stazionaria
stazionaria.
t i
i .
Nella cromatografia liquida (LC) la fase mobile è un liquido, nella gas
g
((GC)) la fase mobile è un g
gas..
gas
cromatografia
CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI
PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA
Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una colonna chiusa
Esempio:
chiusa.. La
fase stazionaria consiste di particelle solide porose contenute all’interno di un tubo
lungo
g e sottile ((colonna)
(colonna).
). Nel p
passaggio
gg attraverso la colonna ogni
g componente
p
X si
distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m):
(m):
Xm ¤ Xs
Il coefficiente
ffi i t di ripartizione
i ti i
( di distribuzione)
(o
di t ib i
) del
d l componente
t X è definito
d fi it come
come::
A: il campione
p
viene iniettato
all’entrata della colonna
B → D: la fase mobile fa spostare
il campione attraverso la fase
stazionaria
i
i
[X]s
[X]m
Flusso del solvente
Quale componente
ha K maggiore?
KX =
A
B
C
D
tR
tM
Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario alla sostanza iniettata
per essere eluita dall’inizio all’uscita della colonna.
Tempo morto (tM): tempo di ritenzione di un composto che non è
trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità
con cui fluisce la fase mobile lungo la colonna.
Analogamente si definiscono i corrispondenti:
Volume di ritenzione ((VR)): volume di fase mobile necessario ad
eluire l’analita dall’inizio all’uscita della colonna.
Volume morto (VM): il volume di ritenzione di un composto che non
è trattenuto
t tt
t (corrisponde
(
i
d all volume
l
di fase
f
mobile
bil che
h occupa la
l
colonna).
Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocità di
migrazione dell’analita
dell analita lungo la colonna è il fattore di capacità, k
k’.
k’.
k' A =
n° totale di moli di A nella fase stazionaria K A ⋅ VS
=
n° totale di moli di A nella fase mobile
VM
Si dimostra che k’ può essere ricavato dai parametri del cromatogramma:
tR − tM
k' A =
tM
Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k’.
La selettività q
quantifica l’entità della separazione
p
fra due specie
specie:
p
: riguarda
g
la
capacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed è
dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella
stazionaria, con (tR)B> (tR)A.
α=
k'B (tR )B − tM
=
k' A ( t R ) A − t M
Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocità
velocità:: la
loro dispersione ha generalmente un profilo Gaussiano
Gaussiano.. Il centro del profilo (banda
di eluizione) rappresenta la velocità media
media..
I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono
sono::
1.
diffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore
concentrazione a quella a minore in direzione parallela all’asse della colonna);
colonna);
2
2.
percorsi multipli
multipli;;
3.
trasferimento di massa tra fase
mobile e fase stazionaria
stazionaria..
Parametri che descrivono quantitativamente l’efficienza
l’efficienza di una colonna (ampiezza dei picchi):
1))
2)
Altezza equivalente
q
di p
piatto teorico H
Numero di piatti teorici N
L = lunghezza colonna
N=
L
H
Piatto teorico:
teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio
reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi.
fasi. Poiché in cromatografia si ha
una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una
singola separazione, N ha un significato puramente matematico.
matematico.
Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione
(migliore è la capacità di separazione della colonna)
colonna).. N è proporzionale alla
lunghezza della colonna.
colonna.
Si può dimostrare che
⎛t ⎞
N = 16 ⎜ R ⎟
⎝W⎠
2
W
W = larghezza del picco
L’altezza equivalente al piatto teorico (H = L/N) consente di confrontare l’efficienza
L’altezza
di colonne di differente lunghezza
lunghezza..
Variabili che influenzano l’l’efficienza
efficienza di una colonna:
colonna:
La principale variabile che influenza l’efficienza di una colonna è la velocità di
flusso lineare (cm/s) della fase mobile.
mobile. Questa infatti influenza il tempo di contatto
tra fase mobile e fase stazionaria
stazionaria..
L’altezza equivalente del piatto teorico, H, il
parametro che descrive l’efficienza della
colonna,
l
di
dipende
d proprio
i dalla
d ll velocità
l ità di
flusso della fase mobile (vedere Figura a
lato)..
lato)
Si iin LC che
Sia
h iin GC lla velocità
l ità di flusso
fl
ottimale è piuttosto bassa.
bassa.
Quella ottimale della LC è inferiore a quella
ottimale
tti l della
d ll GC
GC.. Per
P evitare
it
tempi
t
i di analisi
li i
troppo elevati, in LC si usano velocità un po’
maggiori di quella ottimale
ottimale..
La LC è caratterizzata da valori di H inferiori
alla GC.
GC.
g
delle colonne ((GC
(GC:: > 50 m; LC:
LC: < 50 cm),
) la GC è
In considerazione della lunghezza
comunque caratterizzata da valori più elevati di N, e quindi da migliore efficienza.
efficienza.
La risoluzione
risoluzione,, R, è una misura quantitativa della capacità di separare due analiti.
analiti.
Essa è ricavabile dal cromatogramma:
cromatogramma:
R=
2[( t R )B − ( t R ) A ]
2∆Z
=
W A + WB
W A + WB
L risoluzione
La
i l i
caratterizza
tt i
lla bontà
b tà di separazione
i
f due
fra
d picchi
i hi sia
i con riferimento
if i
t
alla differenza fra i tempi di ritenzione (numeratore) sia riguardo all’efficienza di
separazione (denominatore)
(denominatore)..
Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza (picchi molto
stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una buona differenziazione del
comportamento dei soluti (selettività) Æ vedere equazione successiva.
successiva.
Si p
può dimostrare che:
che:
1
⎛ α − 1⎞ kIB
R=
N⎜
I
4
⎝ α ⎠ kB + 1
Effetto della selettività,, dell’efficienza e del fattore di capacità
p
sulla risoluzione
risoluzione scarsa
picchi non separati
buona risoluzione dovuta a buona
efficienza
ffi i
picchi stretti
buona risoluzione dovuta a buona
selettività
picchi distanti
risoluzione
i l i
scarsa d
dovuta
t ad
d un basso
b
fattore di capacità
Le applicazioni della cromatografia vanno dall’analisi qualitativa a quella
quantitativa di miscele anche molto complesse.
q
complesse
p
.
L’analisi quantitativa sfrutta la misurazione dell’altezza o dell’area dei
picchi.
picchi
i hi. La
L misurazione
i
i
d ll’
dell’area
è più
iù affidabile
ffid bil iin quanto
t non risente
i
t
dell’eventuale allargamento dei picchi in seguito a variazione delle
condizioni di lavoro
lavoro..
I metodi di analisi sono tutti indiretti.
indiretti. Si costruisce prima una curva di
calibrazione per ciascun analita e poi si ricava la concentrazione dell’analita
nella
ll miscela
i
l iin esame mediante
di t interpolazione
i t
interpolazione.
l i
.
Il metodo dello standard interno è il più affidabile
affidabile:: una quantità nota di
standard viene introdotta nelle soluzioni standard e nel campione
p
in esame
esame;;
il parametro analitico è quindi costituito dal rapporto tra le aree dello
standard e dell’analita (il metodo funziona solo se il picco dello standard è
vicino ma separato da quello dell’analita)
dell’analita)..
GASCROMATOGRAFIA
L fase
La
f
mobile
bil è un gas
gas.. Le
L sostanze
t
d separare (liquidi,
da
(li idi solidi,
lidi gas))
devono essere portate ad una temperatura sufficiente a renderle
gassose o comunque portarle allo stato di vapore
vapore..
¾ Cromatografia di adsorbimento gas
gas--solido (fase stazionaria =
solido adsorbente)
¾ Cromatografia di ripartizione gasgas-liquido (fase stazionaria =
liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato
sulle p
pareti della colonna))
A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo:
competitivo: il gas
di trasporto serve solo per trascinare i componenti lungo la
colonna
colonna.
l
.
SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO\
He, Ar, N2, H2
Iniezione ed iniettori
Il campione viene iniettato in quantità molto piccole (fino a
0,5 ml per impaccate, fino a 100 volte inf. per capillari).
L’entrata deve essere ad una temperatura sufficientemente
elevata da permettere l’evaporazione istantanea del
campione e abbastanza grande da permettere al vapore di
espandersi senza essere spinto indietro.
Colonne gascromatografiche
Si suddividono in impaccate e capillari
capillari..
L impaccate
Le
i
t contengono
t
particelle
ti ll solide
lid che
h
vengono impaccate:
impaccate: diatomee o diatomee
silanizzate, per ridurre la polarità mediante
arricchimento
i hi
t superficiale
fi i l di gruppii metilici
metilici.
tili i.
Le capillari sono tubi molto più sottili e lunghi
(diametro = 0.3-0.5 mm
mm;; lunghezza = 50
50--300 m) in
cui la fase stazionaria è depositata sulle pareti
interne.. Queste ultime hanno un elevato numero di
interne
piatti teorici (anche 300
300..000
000)) grazie alla loro
elevata lunghezza.
lunghezza.
Colonna capillare standard a fase legata
45°
145°
Influenza
f
della T sui tR:
più la temperatura è elevata più il
soluto tende a trasferirsi nella fase
gassosa Ö
aumentando T diminuisce tR
programma di T
Rivelatori
Dovrebbero avere le seguenti proprietà
proprietà:: risposta lineare, stabilità, risposta
uniforme per i diversi analiti (o comunque prevedibile e più o meno selettiva)
selettiva).. Il
rivelatore ideale non esiste
esiste..
principio
p del p
ponte di Wheatstone.
Rivelatore a conducibilità termica:
termica: si basa sul p
controllo della corrente
del filamento
cella di
riferimento
cella del
campione
registratore
attenuatore
a ponte
4 filamenti
filamenti:: 2 sono circondati da gas di trasporto che fluisce in una corrente di
riferimento, l’altra coppia è circondata da gas di trasporto che proviene dalla
colonna.. Quando il ponte è in equilibrio tra i punti 1 e 2 non appare alcun
colonna
segnale
segnale.
l . Una
U variazione
i i
d ll conducibilità
della
d ibilità termica
t
i del
d l gas (dovuta
(d
t all’eluizione
ll’ l i i
di analiti con il gas) produce un segnale tra 1 e 2 .
Il Rivelatore a Ionizzazione di Fiamma è forse il più diffuso. Si basa sul
fatto che molti composti organici, quando bruciano, in una fiamma,
producono intermedi ionici che possono aumentare la conducibilità della
fiamma stessa.
È più sensibile di quello a conducibilità termica (fino a 10-13 g/mL).
+
-
HPLC = CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA EFFICIENZA
Vantaggi rispetto alla LC classica: velocità, risoluzione e sensibilità superiori.
A
A.
B.
C.
B
C
crom.
crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d >
150 µm, D = 20
20--50 mm, L = 50
50--200 cm)
HPLC con riempimento
p
pellicolare ((d = 40
p
40--70 µm,, D = 1-3 mm,, L = 50
50--100
cm)
HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 µm, D = 2-6 mm, L =
10--50 cm)
10
d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna
LC classica:
dimensione delle p
particelle e diametro interno della colonna molto maggiori
gg
che nella HPLC;
velocità di flusso molto basse;
tempi
p di analisi lunghi.
g
Cercando di aumentare la velocità del solvente, diminuiscono efficienza e
risoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori profondi e nei lunghi
canali interparticellari.
HPLC:
impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili;
contropressioni maggiori;
tempi d’analisi contenuti.
Per favorire il flusso della fase mobile è quindi necessario l’uso di pompe ad
alta pressione. Efficienza aumentata di 10-100 e tempi di separazione diminuiti
(miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase stazionaria e della
fase mobile).
SCHEMA DI CROMATOGRAFO HPLC
COMPARTIMENTO
TERMOSTATATO
COLONNA
PRECOLONNA
SERBATOIO
SOLVENTE
REGISTRATORE
INIETTORE
FILTRO
MISURATORE
PRESSIONE
POMPA
RIVELATORE
O
SPURGO
COLLETTORE
DI FRAZIONI
ELEMENTI DI CROMATOGRAFO HPLC
Riserva di fase mobile (degasamento, eluizione isocratica o a gradiente)
Sistema di pompaggio (pressioni fino a 6000 psi ⇒ ≈ 400 atm)
Sistema
S
ste a d
di iniezione
e o e
Colonne (precolonne
(precolonne**, colonne analitiche, le più diverse)
3.0
and
4.6mm
HPLC Columns
Standard
Super-Link
System™
Rivelatori (Il rivelatore può essere selettivo verso una classe di analiti (es
(es::
’
f
solo i composti che assorbono nell’UV,
solo quelli fluorescenti,
ecc)) o
universale (rivela tutti i componenti)
componenti).. In cromatografia liquida i rivelatori più
usati sono:
sono:
rivelatore UVUV-vis
rivelatore a fluorescenza
rivelatore a indice di rifrazione (RI)
* Per rimuovere particolato,
saturare la fase mobile con la
stazionaria
HPLC DI RIPARTIZIONE
Fase stazionaria e mobile immiscibili l’una con l’altra: liquidi con proprietà solventi
notevolmente diverse.
Limitata a composti con valori di k' relativamente bassi perché la fase stazionaria
deve essere un buon solvente per il campione, ma un cattivo solvente per la fase
mobile: aumentando la forza del solvente per poter eluire composti con valori elevati
di k' si aumenterà anche la solubilità della fase stazionaria;
utile per risolvere differenze molto piccole nella solubilità degli analiti: l’impiego della
coppia fase stazionaria/fase mobile appropriata permette un’alta selettività.
I primi lavori con cromatografia di ripartizione usavano fasi stazionarie altamente polari
(glicol, acqua,ecc.) e fase mobile non polare (esano, isopropiletere, ecc) ovvero
operavano in fase normale.
normale Attualmente,
Attualmente la fase stazionaria più usata è apolare (un
idrocarburo) e quella mobile è un solvente relativamente polare (metanolo, acqua,
acetonitrile, ecc.): questo tipo di cromatografia viene detto a fase inversa.
BPLC (Cromatografia a fasi chimicamente legate )
per i riempimenti della LC sono stati utilizzati tre tipi generali di legami chimici
nei quali i gruppi Si-OH possono essere :
1. esterificati p
per reazione con alcoli p
producendo esteri di silicati
2. silanizzati per reazione con organocloro- o organoalcossi-silani
3. trasformati per clorurazione in Si-Cl e, in seguito, in Si-C per reazioni di
Grignard o Wurtz, o qualche altra reazione tipica dei composti alogenati.
gli impaccamenti sono più stabili nel tempo.
1
2
3
Si-OH + HOR Æ
Si-O-R + H2O
R'
Si-OH + Cl-Si-R Æ
R'
R'
Si-O-Si-R + HCl
R'
Si-OH + SOCl2 Æ
Si-Cl + SO2 + HCl
Si-Cl + R-Mg-Br Æ
Si-R + MgClBr
HPLC DI ADSORBIMENTO
Fase stazionaria: materiali adsorbenti come solidi porosi (silice, allumina) con
area superficiale specifica da 50-1000 m2/g preparati in particelle di dimensioni
appropriate I gel di silice,
appropriate.
silice per esempio,
esempio sono preparati facendo reagire silicato
di Na con un acido minerale (es. HCl) e poi mediante polimerizzazione con
formazione di un sistema tridimensionale di tetraedri di SiO4. A seguito della
disidratazione si forma un solido stabile poroso con terminazioni superficiali
silanoliche e silossaniche.
legami idrogeno
gruppi
ossidrilici
isolati
gruppi
silossanici
Le interazioni tra superficie adsorbente e soluto variano da non specifiche (forze
di dispersione o di Van der Waals) a specifiche (interazioni elettrostatiche o
interazioni tra accettori o donatori di elettroni -legami idrogeno).
Influenza della fase mobile: le interazioni implicano una competizione tra le
molecole
l
l dell’analita
d ll’
lit e quelle
ll della
d ll fase
f
mobile
bil per i siti
iti di adsorbimento.
d bi
t
I solventi possono essere distinti a seconda della loro forza di adsorbimento (serie
eluotropica).
idrocarburi alif.
olefine
idrocarburi arom
arom.
alogenuri
solfuri
eteri
nitrocomposti
esteri, aldeidi e
chetoni
ammine
solfoni
solfossidi
ammidi
ac. carbossilici
acqua
p
o
l
a
r
i
t
à
ELUIZIONE A GRADIENTE
Fase mobile debole : i componenti
p
che sono ritenuti debolmente sono trattenuti e
separati ma quelli ritenuti fortemente saranno eluiti in tempi troppo lunghi (e
probabilmente con picchi troppo allargati).
Fase mobile forte
forte:: saranno eluiti troppo rapidamente i componenti poco ritenuti,
e saranno separati correttamente quelli trattenuti fortemente
fortemente..
Come separare tutti i componenti con K’ molto diversi? ⇒ è necessario far variare
la velocità di migrazione delle bande durante il corso dell
dell’analisi
dell’analisi:
analisi: eluizione a
analisi:
gradiente..
gradiente
L’eluizione viene iniziata, ad esempio, con un solvente debole e la forza del
solvente viene progressivamente aumentata
aumentata.. L
L’effetto
effetto complessivo è quello di una
eluizione progressiva delle sostanze più fortemente ritenute e al tempo stesso,
di una riduzione nella formazione di code.
code.
In GC il gradiente è un gradiente di temperatura.
temperatura. Perché?
SOLVENTE
DEBOLE
SOLVENTE
FORTE
FORZA
INTERMEDIA
GRADIENTE
DI SOLVENTE
HPLC A SCAMBIO IONICO
Per composti ionici, ionizzabili (acidi e basi organiche), e che possono interagire con
gruppi ionici.
Fasi stazionarie: polimeri funzionalizzate
con gruppi carichi (solfonici e carbossilici
come scambiatori ionici).
Fase mobile: contiene generalmente un
controione di carica opposta al gruppo
ionico sulla superficie, in equilibrio con
essa per formazione di una coppia ionica.
ionica
scambio cationico
scambio anionico
dove:
X+ + R-Y+ ¤ Y+ + R-X+
X- + R+Y- ¤ Y- + R+X-
X = ione del campione
Y = ione della fase mobile (controione)
R = sito ionico sullo scambiatore
Lo scambio dipende dal pH, temperatura, forza ionica, natura e concentrazione,
p
, ecc.
dello ione competitore,
HPLC AD ESCLUSIONE
È utile nel caso di miscele di analiti ad alto peso molecolare (polipeptidi, proteine,
enzimi, carboidrati, ecc.).
Fasi stazionarie: particelle di polimeri e silice a
porosità uniforme e controllata. Il tempo di residenza
d li analiti
degli
liti nella
ll fase
f
stazionaria
t i
i dipende
di
d dalle
d ll loro
l
dimensioni. Se sono abbastanza piccole rimangono
intrappolate nei percorsi multipli all’interno delle
particelle Se sono troppo elevate non penetrano
particelle.
nella fase stazionaria e vengono eluite velocemente.
Le tecniche che usano impaccamenti idrofili ed
idrofobi sono note rispettivamente come gel
gelfiltrazione e, rispettivamente, gel-permeazione.
Si usano rispettivamente per specie polari e specie
non polari.
Fase mobile: la fase mobile ha la stessa polarità
dell’impaccamento (acquosa per impaccamenti idrofili
e apolare per quelli idrofobi).
In prima approssimazione, un problema analitico può essere
condensato nell’insieme delle seguenti informazioni:
Analita
Matrice
Analisi qualitativa, quantitativa o di speciazione
Livello di concentrazione
Risoluzione (laterale,
(laterale in profondità)
Incertezza di misura (esattezza, precisione)
Numero di campioni
p
Tempi
Costo
Per aiutarsi nella selezione di una tecnica analitica potenzialmente
idonea alla risoluzione del problema analitico, è utile esaminare le
diverse classificazioni delle tecniche di analisi strumentale.
strumentale