Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

Transcript

Ricerche Microbiologiche Standard del Regno
Unito
Identificazione di Specie Corynebacterium
Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE
Microbiologia – Identificazione. I ID 2 I Emissione no: 4 I Data emissione: 18.06.14 I Pagina 1 di 24
© Crown copyright 2014
Identificazione di specie Corynebacterium
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS, National Health Service), la Sanità
Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito
web http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnerships. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da
diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare
http://www.hpa.org.uk/SMI/WorkingGroups).
Si ringraziano per i contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i
laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo
documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Microbiology Services Division
Health Protection Agency
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website: http://www.hpa.org.uk/SMI
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
Batteriologia – Identific. I ID 2 I Emissione no:4 | Data emissione: 18.06.14 | Pagina: 2 di 24
UK Standards for Microbiology Investigations | Emesso da Standards Unit, Public Health England
Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................4
RICERCHE MICROBIOLOGICHE STANDARD DEL REGNO UNITO: SCOPO E
OBIETTIVO ........................................................................................................................6
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................9
INTRODUZIONE .........................................................................................................................9
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ...............................................................................11
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .......................................................................12
2
MICRORGANISMI BERSAGLIO ....................................................................................12
3
IDENTIFICAZIONE ..........................................................................................................12
4
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE CORYNEBACTERIUM .................................................18
5
REFERTAZIONE .............................................................................................................19
6
INVIO ...............................................................................................................................20
9
NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE .......................................................................20
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................22
Tabella delle Modifiche
Ogni metodo SMI ha un proprio registro delle modifiche. Quelle attuali sono specificate in questa
pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili sul sito web [email protected].
I documenti nuovi o revisionati dovrebbero essere controllati nel laboratorio secondo il sistema
locale di gestione della qualità.
Modifica No/Data.
6/18.06.14
Emissione eliminata. no
3.2
Inserita emissione no.
4
Sezione(i) interessate
Modifica
Scopo del documento
Il titolo della documento SMI ID3 si riferisce al testo
che è stato aggiornato.
Tassonomia aggiornata.
Introduction.
Alla sezione Caratteristiche sono state aggiunte altre
informazioni. Rimozione di due frasi sulla PCR da
questa sezione.
La sezione sui Principi d’Identificazione è stata
aggiornata per descrivere le quattro prove preliminari
utilizzate per l’identificazione delle specie
Corynebacyerium
Informazione Tecnica/Limitazioni
Aggiornata per includere l’informazione riguardante
l’uso di terreni di agar sangue e la variabilità del test
dei nitrati.
Considerazioni sulla Sicurezza.
Questa sezione è stata aggiornata per includere le
infezioni acquisite in laboratorio, come pure le linee
guida stabilite dal DH Green book.
Apportati aggiornamenti a 3.3 3.4 e 3.6 per inserire gli
standard nella pratica.
Il diagramma è stato pure aggiornato con voci
bibliografiche e sono state aggiunte due colonne per
includere i test della catalasi e della pirazinamidasi.
Aggiornate anche le note a piè del diagramma.
Identificazione.
Il test TP 36 dell’ Ureasi è stato collegato via web.
Sono stati pure menzionati risultati variabili per il
test dei nitrati per C. pseudotuberculosis.
Aggiornato l’invio dei microrganismi isolati al
Laboratorio di Riferimento
La bibliografia usata nella tabella è riportata nelle
note a piè pagina
Aggiornata la Sottosezione 3.5 per includere I Metodi
Molecolari Rapidi.
Diagramma di Flusso per
Identificazione.
Refertazione
L’aggiunta del diagramma di Flusso per
l’identificazione di specie Corynebacterium è stata
sviluppata per fornire un orientamento.
Le sottosezioni 5.1, 5.2, 5.4, 5.5 e 5.6 sono state
aggiornate per puntualizzare le segnalazioni pratiche.
Il collegamento web della sezione 5.4 e 5.5 è stato
rimosso in quanto non accessibile.
Invio.
L’indirizzo del Laboratorio di Riferimento è stato
aggiornato.
Intero documento
Documento presentato in nuovo formato.
BiIbliografia
Parte della bibliografia estate aggiornata
Modifica No/Data.
5/06.03.14
Emissione eliminata. no
3.1
Emissione inserita no.
3.2
Sezione(i) interessate.
Modifica.
Il documento è stato inserito in un nuovo formato che
evidenzia il passaggio della Health Protection Agency
alla Public Health England.
Prima pagina ridisegnata.
Documento intero .
Rinominata la pagina di Stato come” Scopo e
Obiettivo” ed aggiornata in modo appropriato.
I loghi delle organizzazioni professionali sono stati
revisionati ed aggiornati.
Revisionati e aggiornati Standard di sicurezza e
referenti delle denunce
Il contenuto scientifico rimane invariato.
Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito:
Scopo e Obiettivo#
Utilizzatori delle SMI
• Nel Regno Unito, le SMI sono principalmente intese come risorsa generale per i
professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive.
• Le SMI forniscono ai clinici informazioni sull’elenco dei test disponibili e sullo standard dei
servizi di laboratorio per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti, come anche
provvedono alle documentazioni che facilitano la prenotazione elettronica di tests
appropriati.
• Questi documenti forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai
responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte integrata delle
procedure da adottare per la salute, sia clinica che pubblica per la propria popolazione.
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte fasi del processo
diagnostico, dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di
laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).
Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi
differenziale e le indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le linee guida della qualità
descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la
validazione del saggio della prova
La standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una
condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le
attività di ricerca e di sviluppo
Collaborazione Paritaria
La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS,
Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali.
L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito web
http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnershipshttp. L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI
implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti
delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che
sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a
quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono, né a quelle delle loro organizzazioni. I
rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e il dialogo.
Le opinioni espresse sono ricercate con un processo di consultazione. Le SMI sono sviluppate,
revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione.
Le SMI sono sviluppate, revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione.
______________________
* Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General
Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.
Assicurazione di Qualità
Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata
dai Gruppi di Lavoro per produrre le SMI. L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida
prodotte dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO
9001:2008.
Le SMI rappresentano una buona procedura standard alla quale si devono attenere per la propria
attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI sono
accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello
di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori
dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche supplementari ove opportuno.
Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell’accreditamento promuovendo procedure
d’elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per
lo sviluppo del metodo.
L’efficienza delle SMI dipende dal personale competente e dalla qualità dei reagenti e delle
attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e
quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori
dovrebbero partecipare a controlli di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure
del controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
I Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e del pubblico nello
sviluppo delle SMI. Grazie al coinvolgimento pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e
organizzazioni di volontariato, la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le
esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al
pubblico con accesso libero al nostro sito web.
Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere
ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui
pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni
di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è soggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1317133470313. Gruppi di Lavoro SMI sono
impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità grazie a un’efficace consultazione con i membri del
pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialisti coinvolti.
Dichiarazione Legale
Sebbene ogni cura sia stata intrapresa per la preparazione delle SMI, la PHE e ogni altra
organizzazione di sostegno, declinano la loro responsabilità da tutte le perdite, i costi, i reclami,
danni o le spese derivanti da o connesse all'uso di una SMI o a qualsiasi informazione ivi
contenuta, per quanto possibile in base alle leggi vigenti. Se si apportano modifiche a una SMI, si
deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel
corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo
da revisioni dello standard, da un’azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente
accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono di proprietà della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuto
ove appropriato.
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England. (2014). Identification of Corynebacterium species. UK Standards for
Microbiology Investigations. ID 2 Emissione 4. http://www.hpa.org.uk/SMI/pdf.
Scopo del Documento
Questa SMI descrive la procedura d’identificazione a livello di specie Corynebacterium diphtheriae,
Corynebacterium ulcerans e Corynebacterium pseudotuberculosis isolati da faringe, cute e da altre
sedi. Questi microrganismi possono essere isolati in casi clinici sospetti di difterite classica o
cutanea e molto raramente in altri tipi di infezione clinica, quale faringite o infezione cutanea
cronica. E’ messa in particolare evidenza l’importanza della produzione di tossina nella patogenesi
della malattia.
Il documento descrive inoltre l’identificazione delle specie non produttrici di tossina,
Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium striatum e di quelle clinicamente significative
(Arcanobacterium haemolyticum, noto in precedenza come Corynebacterium haemolyticum
descritto nella ID 3 - Identification of Listeria species, and other Non-Sporing Gram Positive Rods
(except Corynebacterium).
Questa SMI descrive quattro prove per l’identificazione preliminare delle specie patogene di
Corynebacterium e raccomanda l’invio dei microrganismi al Laboratorio di Riferimento per la
conferma dell’identificazione e per la ricerca della tossina, se richieste.
Questa SMI deve essere usata congiuntamente con le altre SMI.
Introduzione
Tassonomia1,2
In questo genere sono attualmente comprese 112 specie e 11 sottospecie3. Tutte le specie di
Corynebacterium con caratteristiche genetiche e chemotassonomiche incompatibili con quelle
attualmente attribuite a questo genere sono state riassegnate ad altri generi. Al contrario, al
genere sono stati aggiunti consistenti raggruppamenti di microrganismi assegnati ad altri generi e
quelli con caratteristiche simil-Corynebacterium4. Di questi, 55 specie sono cause occasionali o
estremamente rare di infezione umana o sono trasmesse all'uomo attraverso contatto zoonotico, le
restanti sono state riscontrate esclusivamente in animali o uccelli, nell'ambiente, acqua, prodotti
alimentari o materiali sintetici.
Le potenziali specie di Corynebacterium tossigene comprendono C. diphtheriae, C.
pseudotuberculosis e C. ulcerans. C. diphtheriae comprende quattro biotipi: gravis, mitis,
intermedius, e belfanti.
Caratteristiche
Le specie Corynebacterium sono costituite da bastoncini Gram positivi, spesso con estremità
claviforme, disposti singolarmente o in coppia. Alcune cellule possono colorarsi in modo non
uniforme assumendo aspetto granulare. Le loro dimensioni sono comprese fra 2-6 μm di
lunghezza e 0.5 μm di diametro. Si raggruppano in modo caratteristico, descritto come forme a "V",
"palizzate", o a "lettere cinesi". I granuli metacromatici sono di solito presenti rappresentando sedi
di accumulo di fosfati. Sono aerobici o anaerobi facoltativi e, in determinate condizioni, presentano
un metabolismo fermentativo (carboidrati in acido lattico). Sono microrganismi esigenti, crescono
lentamente anche su terreno arricchito. L’agar contenente sangue e tellurito di potassio, come
quello di Hoyle, serve come terreno selettivo e differenziale. Su agar sangue, formano piccole
colonie grigiastre con un aspetto granulare, per lo più translucide, ma con centri opachi, convesse,
con bordi continui. La loro temperatura ottimale di crescita è di 37 ° C
Sull’agar tellurito di Holey C. diphtheriae sviluppa colonie grigio/nere in 16 -18 ore e di tipo
caratteristico dopo 48 ore. Gli isolati delle specie di Corynebacterium potenziali produttori di
tossina crescono anche su agar sangue. La morfologia della colonia varia nelle diverse specie. Su
agar sangue le colonie di C. ulcerans e C. pseudotuberculosis possono sviluppare una debole βemolisi.
C. diphtheriae, C. ulcerans e C. pseudotuberculosis sono anaerobi facoltativi, non formano spore,
non formano spore e non sono acido resistenti. Questi microrganismi sono immobili e catalasi
positivi.
C. ulcerans e C. pseudotuberculosis sono ureasi positivi e questa prova può essere utile per una
loro possibile differenziazione da presunti C. diphtheriae.
I ceppi di queste specie possono ospitare il fago che trasmette il gene tox, richiesto per la
produzione di tossina5. I ceppi produttori di tossina possono causare difterite o malattia simile a
quella difterica. I possibili ceppi tossigeni delle specie Corynebacterium devono essere inviati il più
presto possibile al Laboratorio di Riferimento per la ricerca della produzione della tossina.
I ceppi di corinebatteri non produttori di tossina e quelli non tossigeni di C. diphtheriae, C.
ulcerans, C. jeikeium e C. striatum sono in grado di causare malattie nell’uomo quali: infezione
polmonare, leucemia ed endocardite. C. jeikeium e C. striatum sono entrambi non-emolitici, ureasi
negativi e catalasi positivi6.
Principi di Identificazione
Gli isolati su colture primarie sono identificati dall’aspetto delle colonie, colorazione Gram e dai
quattro test preliminari (comprendenti prove dei nitrati, ureasi, catalasi, pirazinamidasi) che
consentono un’identificazione presunta entro 4 ore e il rilievo della potenziale produzione di tossina
delle specie Corynebacterium Può essere eseguita un’ulteriore identificazione con confezione
commerciale associata al test per la produzione della tossina. Si consiglia l’invio delle colture
sospette alla Streptococcus and Diphteria Reference Unit (SDRU) per la conferma
dell’identificazione e per la prova di tossinogenicità.
In questa SMI l’uso della colorazione di Albert non è raccomandato perché i granuli metacromatici
non sono specifici per C. diphtheriae o per qualsiasi potenziale corinebattere produttore di tossina.
L’interpretazione clinica di Corynebacterium isolato da campioni microbiologici può essere
problematica. Per l’identificazione a livello di specie, dovrebbe essere considerato un
Corynebacterium isolato come predominante da un campione prelevato da una sede normalmente
sterile, ferita, ascesso o espettorato purulento, da più di un’emocoltura, o presente a ≥ 104 cfu/mL
in coltura pura nelle urine. Il significato clinico è rafforzato quando l’isolamento di specie
Corynebacterium è riscontrato in campioni multipli o quando i microrganismi sono osservati come
predominanti o associati a una significativa risposta leucocitaria in strisci colorati con il Gram7.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Corynebacterium pseudotuberculosis
C. pseudotuberculosis può dare un risultato variabile alla prova dei nitrati. Questo perché si
compone di due biotipi: biovar.equi (da cavalli o bovini) che riduce nitrati e biovar ovis (da pecore o
capre), che non li riduce6.
Terreni contenenti Agar
In alcune specie di Corynebacterium la morfologia classica delle colonie si sviluppa
apparentemente meglio su terreni contenenti sangue di montone, piuttosto che di cavallo. Per
esempio, il grado di emolisi di Arcanobacterium haemolyticum, precedentemente noto come
Corynebacterium haemolyticum è molto maggiore su piastra di agar sangue di montone rispetto
alla maggior parte degli altri corinebatteri8.
1
Considerazioni sulla Sicurezza9-25
C. diphtheriae, C. ulcerans e C. pseudotuberculosis appartengono al Gruppo di microrganismi di
Rischio 2; in alcuni casi le caratteristiche del lavoro possono richiedere un completo Contenimento
Livello di 3. Tutti i laboratori devono manipolare i campioni considerandoli ad alto rischio potenziale.
Tutti gli isolati sospetti di corinebatteri potenzialmente tossigeni devono essere trattati in cabina
microbiologica di sicurezza. Per la prova dell’ureasi, il becco di clarino è considerato più sicuro di
un mezzo liquido.
C. diphtheriae e C. ulcerans determinano malattie gravi e talvolta fatali. Sono state segnalate
infezioni acquisite in laboratorio26,27. Il microrganismo infetta principalmente per via respiratoria. La
vaccinazione antidifterica è disponibile; le indicazioni sono fornite dal DH Green Book28. Inoltre,
dovrebbe essere protetto dalla vaccinazione tutto il personale che può essere esposto al contagio
di difterite durante il proprio lavoro; le eccezioni a questa raccomandazione sono per coloro che
hanno avuto un richiamo negli ultimi 10 anni o hanno avuto una reazione avversa
all’immunizzazione28,29.
L’antitossina difterica per il trattamento di casi clinici è distribuita dal PHE Immunisaton
Department e dovrebbe essere somministrata senza attendere la conferma batteriologica.
Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza nella manipolazione di tutti i microrganismi del
gruppo di Rischio 2 documentati in questa SMI.
Le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina
microbiologica di sicurezza17.
Le linee guida precedentemete esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e la
valutazione del rischio.
E’ essenziale il rispetto delle regolamentazioni postali e del trasporto.
2
Microrganismi bersaglio
Specie Corynebacterium potenzialmente toxigene1
Corynebacterium diphtheriae var Belfanti, Corynebacterium diphtheriae var gravis,
Corynebacterium diphtheriae var intermedius, Corynebacterium diphtheriae var mitis,
Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium ulcerans
Specie Corynebacterium non tossigene6
Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium ulcerans
Corynebacterium jeikium, Corynebacterium striatum
Altre specie Corynebacterium sono state riconosciute come causa d’infezione nell’uomo2.
3
Identificazione
3.1
Aspetto Microscopico
Colorazione di Gram (TP 39 - Staining Procedures)
Bastoncini Gram-positivi, pleiomorfi, leggermente incurvati con estremità affusolate o claviformi.
Le cellule si presentano isolate o appaiate, spesso a forma di V (aspetto simile a “lettere cinesi”).
Di solito le cellule si colorano debolmente e in modo non uniforme assumendo aspetto granulare.
3.2
Terreni di Isolamento Primario
Agar sangue – tamponi cutanei incubati con 5 -10% CO2 a 35 - 37°C per 40 - 48 ore e tamponi
faringei incubati in anaerobiosi a 35 - 37°C per 16 - 24 ore. Possono essere presenti streptococchi
β-emolitici, specialmente nei tamponi faringei.
Agar tellurito di Holey incubato in aerobiosi a 35 - 37°C per 16 - 48 ore.
3.3
Aspetto della Colonia
Su agar sangue la morfologia è variabile nelle diverse specie. Per maggiori informazioni consultare
di seguito la Sezione 3.4 Procedure di prova.
3.4
Procedura di Prova
I test rapidi (4 ore) dovrebbero essere eseguiti per ureasi, pirazinamidasi, catalasi e riduzione dei
nitrati.
Test della catalasi (TP 8 - Catalase Test)
Tutti i corinebatteri potenziali produttori di tossina sono catalasi positivi e le specie Corynebacterium
non produttrici di tossina sono catalasi variabili.
Test Pirazinamidasi
Tutti i corinebatteri potenzialmente tossigeni (C. diphtheriae, C. ulcerans e C. pseudotuberculosis)
sono pirazinamidasi negativi mentre gli altri corinebatteri sono positivi.
Test Ureasi (TP 36 - Urease Test)
Il test dell’ureasi è utilizzato per determinare la capacità di un microrganismo di idrolizzare l’urea
tramite la produzione dell'enzima ureasi.
C. ulcerans e C. pseudotuberculosis sono ureasi positivi.
Test di riduzione dei nitrati (consultare la tabella sottostante)
Prove biochimiche
Terreni di Coltura
Ceppi
Agar tellurito di Hoyle
C.
diphtheriae
biotipo biovar
gravis30
colonie smussate, grigio/
nere, diametro 1.5-2.0 mm,
superficie rugosa, friabile,
che si rompe in piccole
parti quando toccata con
un’ansa diritta di ferro
Agar sangue
Nitrati
Ureasi
Catalasi
Pirazinamidasi
non emolitici
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
C.
diphtheriae
biotipo biovar
mitis30
colonie grigio/nere, opache,
diametro 1.5-2.0 mm, bordo
continuo e superficie liscia
lucente; frequente
variazione nelle dimensioni
colonie
presentano una
piccola zona di
β-emolisi
Positiva
Negativa
Positiva
Negative
C.
diphtheriae
biotipo biovar
30
intermedius
colonie piccole, grigio/nere,
superficie lucente, isolate,
translucide 0.5-1.0 mm di
diametro
colonie
presentano una
piccola zona di
β-emolisi
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
C.
diphtheriae
biotipo biovar
belfanti30
colonie piccole, grigio/nere,
opache 1.5-2.0 mm, bordo
continuo e superficie liscia
lucente; frequente
variazione nelle dimensioni
le colonie
presentano una
piccola zona di
β-emolisi
Negativa
Negativa
Positiva
Negativa
C. ulcerans30
colonie grigio/nere, molto
asciutte, opache
le colonie
presentano una
piccola zona di
β-emolisi
Negativa
Positiva
Positiva
Negativa
C. pseudotuberculosis
colonie grigio/nere, molto
asciutte, opache
le colonie
presentano una
piccola zona di
β-emolisi
Positiva/
Negativa
Positiva
Positiva
Negativa
Non emolitiche
bianche, umide
lisce
Positiva/
Negativa
Positiva
Positiva
Negativa
Positiva
Positiva
1,6,31
C.
1,2,31
striatum
Colonie grigio/nere
colonie >2 mm
dopo 24 ore
Negativa
Non emolitiche
C. jeikeium
Colonie grigio/nere
grigio/bianche
lievemente
convesse
Negativa
†Consultare TP 36 - Urease Test
*Se i risultati di queste prove eseguite in 4 ore sono indicativi per specie Corynebacterium informare immediatamente il
medico microbiologo ed inviare il ceppo isolato al Laboratorio di Riferimento. Per questa prova C. xerosis può essere
utilizzato come controllo positivo.
Se queste prove preliminari non sono significative per specie Corynebacterium, prendere in considerazione altri tipi di
accertamento se clinicamente indicato.
I risultati del test dei nitrati possono essere variabili per C. pseudotuberculosis. Ciò è dovuto alla presenza di due
biotipi, variante equi (da cavalli o bovini) che riduce nitrati e variante ovis (da pecore o capre), che non è in grado di
compiere questa reazione.
Usare confezioni d’identificazione commerciale e, se clinicamente appropriato, inviare l’isolato al Laboratorio di
Riferimento).
Nota: E’ opportuno il controllo con microrganismo da coltura recente.
I risultati di questi test sono corrispondenti alla tassonomia presente nei più diffusi sistemi pubblicati1,2,6,30,31
E 'importante che un’identificazione preliminare di possibili colonie di C. diphtheriae o altre specie
Corynebacterium potenzialmente tossigene sia fatta il più rapidamente possibile usando i test a 4
ore. Le prove preliminari forniscono un'indicazione della probabile presenza o assenza di C.
diphtheriae, C. ulcerans o C. pseudotuberculosis. I risultati devono essere considerati associati alle
informazioni cliniche.
Tutti gli isolati sospetti di C. diphtheriae o di altre specie Corynebacterium potenzialmente
tossigene devono essere sub-coltivati su una piastra di agar sangue per verificare la purezza e un
becco di clarino di agar sangue (preferibilmente) o di terreno di Loeffler (per un possibile invio al
Laboratorio di Riferimento) quando le prove sono state impostate.
Sistemi di identificazione commerciale
I laboratori devono seguire le istruzioni del produttore e i test rapidi e le confezioni dovrebbero
essere validati e avere dimostrato di soddisfare le richieste prima del loro utilizzo.
3.5 Identificazione Successiva
Metodi Molecolari Rapidi
Sono stati sviluppati vari metodi rapidi d’identificazione sensibili per gli isolati dai campioni clinici;
questi includono tecniche molecolari come la real-time Polymerase Chain Reaction (PCR),
l’Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), l’ analisi delle sequenze del gene 16S rRNA
(rDNA), la Multi-locus sequence typing (MLST), Whole Genome Sequencing e la Matrix Assisted
Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF). Tutte queste applicazioni permettono la
sottotipizzazione dei ceppi non correlati, ma lo eseguono con diversa precisione, potere di
differenziazione e riproducibilità.
Tuttavia, alcuni di questi metodi rimangono accessibili solo a laboratori di riferimento e sono difficili
da implementare nei laboratori clinici per l'identificazione batterica di routine.
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry
(MALDI-TOF)
La tecnologia MALDI-TOF MS è utilizzata di routine in molti laboratori di microbiologia; in questa
metodologia le proteine liberate dai batteri sono ionizzate e rilevate da uno spettrometro di massa
(MS), lo spettro è poi analizzato e confrontato con altri presenti in una banca dati, aumentando la
possibilità di confronto32. Questa tecnologia è stata pubblicizzata come rivoluzionaria, poiché non
richiede per l’uso un’ampia formazione o esperienza in spettrometria di massa o in chimica. Il
costo dei materiali necessari è considerato relativamente basso, a parte quello dello strumento
MALDI-TOF4.
MALDI-TOF MS è stato utilizzato con successo per identificare a livello di specie, i
Corynebacterium potenzialmente tossigeni negli isolati clinici in meno di 15 minuti33. Pertanto,
questa tecnologia potrebbe essere utilizzata come metodo di screening rapido, contribuendo a
decidere se le colonie sospette devono essere analizzate per la presenza del gene tox con la PCR
real-time.
MALDI-TOF può riconoscere Corynebacterium aurimucosum da Corynebacterium minutissimum,
due specie Corynebacterium strettamente correlate, precedentemente considerate di difficile
differenziazione34.
WGS-Whole Genome Sequencing (WGS)
L’intero sequenziamento del genoma (noto anche come sequenziamento del genoma intero,
completo sequenziamento del genoma, o intero sequenziamento del genoma), è un procedura di
laboratorio che determina la sequenza completa del DNA del genoma di un organismo in una sola
volta. Ciò comporta il sequenziamento di tutto il DNA cromosomico di un organismo e anche del
DNA contenuto nei mitocondri.
Un certo numero di specie Corynebacterium ha avuto il sequenziamento completo del genoma4.
Le sequenze genomiche sono disponibili in una banca dati pubblica per C. glutamicum, C.
efficiens, C. diphtheriae C. jeikeium, C. pseudotuberculosis e C. ulcerans. Ciò ha pure aiutato
nell'identificazione delle specie Corynebacterium.
Real-time Polymerase Chain Reaction (PCR)
La PCR è generalmente considerata un buon metodo di rilevazione batterica perché semplice,
rapida, sensibile e specifica. La base per le applicazioni diagnostiche della PCR in microbiologia è
la rivelazione degli agenti infettivi e la differenziazione dei ceppi non patogeni dai patogeni, in virtù
del rilievo di geni specifici. Tuttavia, ha delle limitazioni. Sebbene il gene 16S rRNA sia
generalmente utilizzato per definire la specificità di specie dei primer d’identificazione della PCR,
questa procedura è difficoltosa quando le sequenze dei geni omologhi possiedono gradi elevati di
similitudine.
La PCR per Corynebacterium diphtheriae è rapida e può essere completata entro 4 ore dal
ricevimento del ceppo, anche se la produzione di tossine deve sempre essere verificata con il test
fenotipico di tossigenicità35. Per rilevare il gene tox, gene strutturale per la tossina difterica, può
anche essere utilizzata una PCR diretta verso la subunità A del gene della tossina difterica, anche
se questo saggio non conferma la produzione della tossina29. La caratterizzazione molecolare
basata sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) di alcuni dei ceppi non tossigeni ha
dimostrato che i batteri spesso contengono proteine funzionali dtxR, che potrebbero produrre
tossina36.
Multi-locus Sequence Typing (MLST)
La MLST misura direttamente le variazioni di sequenza del DNA in una serie di geni costitutivi e
caratterizza i ceppi tramite i loro unici profili allelici. Il principio della MLST è semplice: la tecnica
prevede l'amplificazione PCR seguita da sequenziamento del DNA. Le differenze nucleotidiche tra
ceppi possono essere controllate in un numero variabile di geni, secondo il grado di discriminazione
desiderato. La tecnica è molto discriminante, in quanto rileva tutti i polimorfismi all'interno di un gene
piuttosto che le modifiche del ceppo non sinonimo che alterano la mobilità elettroforetica della
componente proteica. Uno dei vantaggi della MLST rispetto ad altri metodi di tipizzazione
molecolare consiste nel fatto che i dati di sequenza sono trasmissibili tra laboratori; ciò ha portato
alla creazione di banche dati globali che permettono lo scambio delle informazioni sulla tipizzazione
molecolare tramite internet37.
La MLST è stata usata con successo per la caratterizzazione di Corynebacterium diphtheriae ed è
stata valutata in varie pubblicazioni nelle quali è stato riscontato che è anche in grado di fornire
una buona comprensione delle diversità del patogeno38-40.
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
L’Amplified Fragment Length Polymorphism) è una metodologia ad alta risoluzione per il genoma,
utilizzata come strumento per l'analisi rapida ed economica, volta a definire la diversità genetica fra
i genomi batterici. È utile per una vasta gamma di applicazioni quali l'identificazione e la
sierotipizzazione dei microrganismi da campioni clinici, l'identificazione di genotipi epidemici, studi
di micro e macro-variazione, e per la genetica della popolazione41 42.
L’Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) è un metodo che utilizza il gel e può essere
usata anche per un'identificazione successiva e ha avuto successo nella distinzione e
differenziazione di isolati di C. diphtheriae. E’ stato considerato il metodo di ribotipizzazione più
veloce e più conveniente (è lo standard di riferimento per la tipizzazione di C. diphtheriae). Questo
metodo è il più adattabile, soprattutto nei laboratori che hanno limitato finanziamento e
strumentazione43, 44.
Gene 16S rRNA (rDNA) analisi della sequenza
E’ un metodo d’identificazione genotipica, con sequenziamento genetico del 16S rRNA; è utilizzato
per studi filogenetici ed è stato successivamente riscontrato capace di ri-classificare i batteri in
specie, o addirittura generi, completamente nuovi. E 'stato anche usato per descrivere nuove
specie che non sono mai state coltivate con successo.
L'uso dei metodi genetici molecolari come la sequenza genetica 16S rRNA analisi (rDNA) ha
facilitato una definizione molto più ristretta del genere Corynebacterium, e la disponibilità dei dati di
sequenza comparativi del gene 16S rRNA con migliori dati fenotipici ha consentito un’identificazione
di specie migliore e più affidabile; tuttavia, sono utilizzate le sequenze genetiche rpoB in quanto
sono più polimorfe del 16S rDNA e possono garantire studi affidabili di filogenetica34,45. L'unico
inconveniente con l’uso del sequenziamento del gene rpoB è che si tratta di un processo che
richiede tempo e la formazione del personale a livello di competenza33.
3.6
Conservazione e Invio
Inviare il più presto possibile al Laboratorio di Riferimento i presunti isolati di C. dip htheriae, C.
ulcerans o C. pseudotuberculosis su becco di clarino di terreno di Loeffler o di agar sangue.
Batteriologia – Identific. I ID 2 I Emissione no:3.2 | Data emissione: 06.03.14 | Pagina: 18 di 24
5
Refertazione
5.1
Identificazione Presunta
L’identificazione presunta è ottenuta se sono dimostrate: caratteristiche di crescita appropriate,
aspetto delle colonie, colorazione Gram della coltura, risultati dei test a 4 ore e dei metodi rapidi.
5.2
Conferma dell’Identificazione
La conferma dell’identificazione e della tossigenicità deve essere eseguita esclusivamente dal
Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit (RVPBRU) PHE Colindale.
5.3
Medico Microbiologo
Informare il medico microbiologo della presunta e della conferma delle specie di C. diphtheriae, C.
ulcerans o C. pseudotuberculosis. Il medico microbiologo deve essere anche informato se nel
modulo di richiesta sono contenute importanti informazioni quali:
•
Caso sospetto o contatto con difterite o viaggio all’estero.
•
•
Tonsillite membranosa/pseudomembranosa.
•
Qualsiasi delle precedenti condizioni, associata a manifestazioni di tipo neurologico o
cardiologico.
•
•
Anamnesi positiva per lavoro in fattoria o veterinario.
Lesioni ulcerative della cute acquisite all’estero. Il medico microbiologo deve essere
consapevole dei possibili fattori presenti nei protocolli esteri che possono influire sui risultati.
Qualsiasi viaggio all’estero, in modo particolare nel subcontinente Indiano, Sud Est Asiatico,
Africa, Sud America, nei precedenti Stati Sovietici e nell’Europa Orientale
Per casi presunti e confermati di specie Corynebacterium non produttrici di tossina deve essere
informato il medico microbiologo se il modulo di richiesta contiene importanti informazioni quali:
•
•
•
Casi di sospetta endocardite associata a campione appropriato
Infezione da dispositivi medici a permanenza (protesi valvolari, pacemakers, cateteri
peritoneali e vascolari, drenaggi LCR).
Anamnesi positiva per abuso di droghe, alcolismo, immunodeficienza o altre gravi malattie
concomitanti, o pazienti sottoposti a trattamento antineoplastico che induce neutropenia e/o
mucosite.
Seguire i protocolli locali per la segnalazione al clinico.
5.4
CCDC
Fare riferimento al Memorandum di Informazione locale.
5.5
Public Health England46
Fare riferimento alle linee guida attuali del CIDSC e alle segnalazioni del COSURV.
Poiché la difterite nel Regno Unito è una malattia soggetta a denuncia, per la tutela della salute
pubblica devono essere denunciati immediatamente ai Public Health England Centres la gestione
dei casi clinici, i contatti, le epidemie e tutti i casi sospetti.
Tutti gli isolati dai laboratori diagnostici clinicamente significativi devono essere notificati per
garantire l’avvio urgente delle procedure appropriate e tutti questi isolati devono essere inviati al
laboratorio nazionale di riferimento per le prove tossinogenicità.
5.6
Gruppo di Controllo Infezione
Informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati sospetti e confermati di C. diphtheriae
secondo i protocolli locali.
6
Invio
6.1
Laboratorio di Riferimento
Contattare l’appropriato laboratorio di riferimento nazionale adibito per informazioni sulle prove
disponibili, tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri requisiti per l’invio del
campione:
Corinebatteri potenzialmente tossigenici (C. diphtheriae, C. ulcerans,
C. pseudotuberculosis)
Streptococcus and Diphtheria Reference Section
WHO Global Collaborating Centre for Streptococcal and Diphtheria Infections
Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London
NW9 5EQ
http://www.hpa.org.uk/cfi/rsil/rsiluser.pdf
Altre specie di Corynebacterium
Laboratory of HealthCare Associated Infection
Antimicrobial Monitoring and Health Care Associated Infections Reference Unit
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London
NW9 5EQ
http://www.hpa.org.uk/cfi/lhcai/lhcaiuser.pdf
Contattare il centralino della PHE: Tel. +44 (0) 20 8200 4400
7
Notifica al PHE46,47 o Equivalente48-51
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla
Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva, Le denuncie devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta
entro sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici
e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di
alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare
Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification
Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic
Laboratories’.
http://www.hpa.org.uk/Topics/InfectiousDiseases/InfectionsAZ/HealthProtectionRegulations/
Esistono accordi diversi in Scotland48,49, Wales50 e Northern Ireland51.
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marked leak proof container" to describe containers bearing the CE marking used for the
collection and transport of clinical specimens. The requirements for specimen containers are
given in the EU in vitro Diagnostic Medical Devices Directive (98/79/EC Annex 1 B 2.1) which
states: "The design must allow easy handling and, where necessary, reduce as far as possible
contamination of, and leakage from, the device during use and, in the case of specimen
receptacles, the risk of contamination of the specimen. The manufacturing processes must be
appropriate for these purposes".
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Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

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