fluorochrome conjugated single reagent
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fluorochrome conjugated single reagent
Monoclonal Mouse Anti-Human CD41, Platelet Glycoprotein llb, Clone 5B12 Codice N. F 7088 FITC-Conjugated Codice N. R 7058 RPE-Conjugated Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. F7088 e R7058 sono finalizzati per l’uso nella citometria a flusso. CD41 è un marcatore selettivo delle piastrine e dei precursori delle piastrine, gli anticorpi anti-CD41, pertanto possono essere utili per l’immunofenotipizzazione delle leucemie megacarioblastiche e per l’identificazione della tromboastenia di Glanzmann (1). L’interpretazione dei risultati deve essere effettuata da patologi qualificati, nel contesto dell'anamnesi clinica del paziente e di altri test diagnostici. Sinonimi per l’antigene Glicoproteina llb (GPllb), integrina ll(1). Introduzione CD41 è la sottounità del complesso CD41/CD61 (GPllb-llla), un eterodimero calcio-dipendente, associato non covalentemente. CD41 è una molecola di 135 kDa, formata da due peptidi: una catena 129 dKa ed una catena 23 kDa. La catena e quella sono collegate da un singolo legame disolfuro. La catena contiene quattro siti di legame del calcio ed è completamente extracellulare, mentre la catena possiede domini extracellulari, di transmembrana e citoplasmatici (1). Il complesso CD41/CD61 compare precocemente durante la maturazione dei megacariociti (2). Il complesso CD41/CD61 attivato è un recettore del fattore di von Willebrand, del fibrinogeno solubile e della fibronectina (1) e ricopre un ruolo fondamentale nell'attivazione e nell’aggregazione delle piastrine (1, 3). L’espressione di CD41 si evidenzia in gradi variabili nelle leucemie megacarioblastiche/citiche (4), mentre è assente o ridotta nelle piastrine di pazienti affetti da tromboastenia di Glanzmann (5). Reagenti forniti Gli anti-CD41 coniugati, C 7088 e R 7058 sono stati prodotti da anticorpi monoclonali di topo purificati. I coniugati vengono forniti in forma liquida in tampone contenente 1% di albumina serica di bovino (BSA) e 15 mmol/L NaN3 , pH 7,2. Ogni fiala contiene 100 test (10 L di coniugato per max. 106 piastrine dl sangue periferico normale). Isotipo: IgG1, kappa. Concentrazione coniugata mg/L: vedi etichetta della fiala. Controllo negativo Anticorpo codice no. Fluorocromo F 7088 FITC (isotiocianato di fluorescina isomero 1) X 0927 R 7058 RPE (R-ficoeritrina) X 0928 codice no. Immunogeno Piastrine umane normali. Specificità L’anti-CD41, 5B12 è stato trattato durante il Fifth Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (Boston 1993) e studi effettuati da diversi laboratori ne hanno confermato la reattività con CD41. Erroneamente il clone è stato catalogato come SB12 (6). Precauzioni 1. Per operatori specializzati. 2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), sostanza chimica altamente tossica allo stato puro. Alle concentrazioni indicate, il prodotto non è classificato come pericoloso, ma la sodio azide potrebbe reagire con le tubature in piombo e rame formando azidi metalliche altamente esplosive. Per lo smaltimento del prodotto è consigliabile sciacquare abbondantemente per prevenire la formazione di azidi metalliche nelle tubature. 3. Come per ogni prodotto di derivazione biologica, utilizzare procedure di manipolazione adeguate. Conservazione Procedura di colorazione Conservare al buio a 2-8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti vengono conservati in condizioni diverse da quelle specificate, queste dovranno essere verificate dall’utente. Non esistono segni evidenti che indichino l'instabilità del prodotto. Per questo motivo, i campioni del paziente devono essere sottoposti simultaneamente sia a controlli positivi che negativi. Se si dovesse osservare una colorazione non attribuibile a modifiche delle procedure di laboratorio e se si sospetta un problema relativo agli anticorpi, contattare il servizio tecnico. 1. Raccogliere sangue venoso in una provetta contenente EDTA come anticoagulante. 2. Entro 5 minuti, centrifugare a 200 x g per 5 minuti, a temperatura ambiente. 3. Raccogliere 100 L del plasma superiore ricco di piastrine (sufficiente per 20 test) e miscelarlo con 1 mL di paraformaldeide 1% in 0,01 mol/L PBS, pH 7,4. Incubare a 4 C per ½-1 ora. 4. Centrifugare a 1200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare delicatamente il surnatante ed eliminarlo, conservando approssimativamente 50 L di fluido. 5. Aggiungere 2 mL 0,01 mol/L PBS, pH 7,4 e risospendere le piastrine, utilizzando un miscelatore a vortice. 6. Centrifugare a 1200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare delicatamente il surnatante ed eliminarlo, conservando approssimativamente 50 L di fluido. (104237-002) Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark F 7088/ R 7058/IT/MBH/01.07.02 p 1/2 · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17 7. Aggiungere 1 mL 2% di siero di feto bovino in 0,01 mol/L PBS e risospendere le piastrine utilizzando un miscelatore a vortice. 8. Miscelare 50 L di sospensione piastrinica con 10 L di anti-CD41 coniugato con fluorocromo. 9. Utilizzare un anticorpo monoclonale non reattivo dello stesso isotipo, coniugato con lo stesso fluorocromo, come controllo negativo (vedi tabella). 10. Incubare al buio a 4 °C per 20 minuti. 11. Lavare due volte con PBS contenente 2% di BSA. Risospendere le piastrine in un fluido appropriato per la citometria a flusso, p.e. 0,3 mL di paraformaldeide (fissativo) al 1% in 0,01 mol/L PBS, pH 7,4. 12. Analizzare con un citometro a flusso. Per il controllo del reagente e della preparazione, si raccomanda di includere un idoneo campione di controllo positivo e negativo in ogni prova. Occorre ricordare che i coniugati con fluorocromi sono sensibili alla luce e che pertanto i campioni devono essere protetti dalla luce durante la procedura di colorazione, fino all'analisi. Riferimenti bibliografici 1. Sun QH, Newman PJ. CD guide. CD41. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 1139. 2. Vinci G, Tabilio A, Deschamps JF, van Haeke D, Henri A, Guichard J, et al. Immunological study of in vitro maturation of human megakaryocytes. Br J Haematol 1984;56:589-605. 3. Nachman RL, Leung LLK. Complex formation of platelet membrane glycoproteins IIb and IIIa with fibrinogen. J Clin Invest 1982;69:263-9. 4. Breton-Gorius J, Tabilio A, Vainchenker W, Vinci G, van Haeke D, Henri A, et al. Diagnosis of megakaryoblastic leukemias. Verh Dtsch Ges Path 1983;67:166-81. 5. George JN, Caen JP, Nurden AT. Glanzmann's thrombasthenia: the spectrum of clinical disease (review). Blood 1990;75:1383-95. 6. Honda S, Felding-Habermann B, Loftus J, Annis D, Kunicki TJ. CD41/CD61 cluster workshop report: localization of epitopes on integrins IIb 3(CD41/CD61) and v 3(CD51/CD61). In: Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leucocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1995. p. 1293-8. Legenda dei simboli Numero di catalogo Limiti di temperatura Utilizzare entro Dispositivo medico-diagnostico in vitro Conservare al riparo dalla luce solare Fabbricante Consultare le istruzioni per l’uso Codice del lotto (104237-002) Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark F 7088/ R 7058/IT/MBH/01.07.02 p 2/2 · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17