VITAMINA D_ - Giesse Diagnostics srl

25OH VITAMINA D TOTALE
ELISA
AZIENDA CERTIFICATA DNV
UNI EN ISO 9001:2008
UN EN ISO 13485:2012
REF. 7017 - 96 Tests
USO PREVISTO
Dosaggio immunoenzimometrico per la determinazione quantitativa in vitro della
25-idrossivitamina D2 e D3 (25OH-D2 e 25OH-D3) nel siero.
Reagenti
Kit
96 test
Ricostituzione
INFORMAZIONI CLINICHE
La Vitamina D è il termine generico usato per designare la Vitamina D2 o
ergocalciferolo e la Vitamina D3 o colecalciferolo.
Gli esseri umani producono naturalmente Vitamina D3 quando la pelle è esposta ai
raggi solari ultravioletti. La Vitamina D3 è metabolizzata, principalmente nel fegato,
in 25-Idrossivitamina D3 (25OH D3) che è la principale forma di Vitamina D
circolante nel corpo. La 25OH D3 è un precursore per altri metaboliti della Vitamina
D ed ha di per sè una limitata attività. Il derivato più attivo è 1,25-idrossivitamina
D3, prodotta nel rene (o placenta) dalla 1-idrossilazione della 25OH D3.
La 25OH Vitamina D stimola l'assorbimento intestinale di calcio e fosforo e anche il
riassorbimento osseo e la mineralizzazione.
La Vitamina D3 e la Vitamina D2 sono disponibili anche per ingestione attraverso il
cibo e l'integrazione alimentare. Poichè la Vitamina D2 è metabolizzata in modo
simile alla Vitamina D3, entrambe contribuiscono allo stato complessivo della
Vitamina D di un individuo. Questo è il motivo per cui è molto importante misurare
entrambe le forme di 25OH Vitamina D anche per una corretta diagnosi di carenza o
insufficienza di Vitamina D o di intossicazione. La carenza di Vitamina D è un
importante fattore di rischio per il rachitismo, l'osteomalacia, l'osteoporosi, il cancro
e gli esiti di una gravidanza. Il dosaggio di entrambe le forme di 25OH Vitamina D è
necessario anche per determinare la causa di anomale concentrazioni sieriche di
calcio nei pazienti. Un eccesso di Vitamina D può causare danni renali e ai tessuti.
PRINCIPIO
La 25OH Vitamina D Totale ELISA della GIESSE è un'analisi di Immunoassorbimento
di enzima in fase solida eseguita su micropiastre. Durante una prima fase di
incubazione di 2 ore, a temperatura ambiente la 25OH Vitamina D Totale (D2 e D3)
presente nei calibratori, controlli e campioni si dissocia dal legame delle proteine del
siero per fissarsi sui siti di legame di uno specifico anticorpo monoclonale. Dopo una
fase di lavaggio una quantità fissata di 25OH Vitamina D-marcata con biotina in
presenza di perossidasi di rafano (HRP), compete con 25OH Vitamina D2 e 25OH
Vitamina D3 non marcata presente sui siti di legame dell'anticorpo monoclonale
specifico. Dopo un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, la micropiastra
viene lavata per fermare la reazione di competizione. Viene aggiunta la soluzione
cromogena (TMB) e si lascia in incubazione per 15 minuti. La reazione viene bloccata
con l'aggiunta della Soluzione Bloccante (Stop Solution) e la micropiastra viene
quindi letta alla lunghezza d'onda appropriata. La quantità di substrato turnover è
determinata colorimetricamente misurando l'assorbanza che è inversamente
proporzionale alla concentrazione della 25OH Vitamina D Totale (D2 e D3).
Viene tracciata una curva di calibrazione e le concentrazioni di 25OH Vitamina D
Totale (D2 e D3) dei campioni vengono calcolate per interpolazione dalla curva di
calibrazione.
REAGENTI FORNITI
Reagenti
Kit
96 test
Micropiastre con 96 pozzetti
rivestiti di anticorpi monoclonali
anti 25 OH Vit. D2 e D3.
96
pozzetti
Ricostituzione
INC BUF
Tampone di incubazione con
caseina e proclin
1 fiala
20 ml
CONJ CONC
Coniugato Concentrato 25OH
Vit. D
1 fiala
0.4 ml
HRP CONC
HRP Concentrato
1 fiala
0.2 ml
CONJ BUF
Tampone Coniugato con caseina
e proclin
1 fiala
30 ml
WASH SOLN CONC
Soluzione di lavaggio (TRIS-HCl)
1 fiala
10 ml
CHROM TMB
Soluzione Cromogena TMB
(Tetrametilbenzidina)
1 fiala
12 ml
STOP SOLN
Soluzione Bloccante
HCl 1.5 N
1 fiala
12 ml
Pronto all'uso.
Diluire 100 x con tampone
coniugato
Diluire 200 x con tampone
coniugato
Pronto all'uso.
Diluire 200 x con acqua distillata
(usare un agitatore magnetico)
Pronto all'uso.
Pronto all'uso.
Nota: Utilizzare il Calibratore 0 per la diluizione dei campioni con valori superiori al
calibratore più elevato.
Nessun materiale di riferimento internazionale è disponibile.
MATERIALI NON FORNITI
Il seguente materiale è richiesto ma non fornito nel kit:
1.
Acqua distillata
2.
Pipette per dispensare: 50 µl, 150 µl, 200 µl e 1 ml (si raccomanda l'uso di
pipette di precisione con puntali di plastica.
3.
Vortex Mixer
4.
Agitatore magnetico
5.
Agitatore per piastre (da 300 a 700 rpm)
6.
Lavatrice per micropiastre.
7.
Lettore per micropiastre in grado di leggere a 450 nm e 650 (lettura
bicromatica).
PREPARAZIONE DEL REAGENTE
CAL 0
Calibratore 0: matrice biologica
con gentamicina e proclin.
1 fiala
liofilo
CAL N
Calibratori 1-5 in siero di cavallo
con gentamicina e proclin.
5 fiale
liofilo
CONTROL N
Controlli N=2
in siero umano con proclin
2 fiale
liofilo
Pronti all'uso.
Aggiungere 2 ml di acqua
distillata
Aggiungere 1 ml di acqua
distillata
Aggiungere 1 ml di acqua
distillata
1.
2.
3.
4.
Calibratore 0 : Ricostituire il calibratore 0 con 2 ml di acqua distillata.
Calibratori 1-5 : Ricostituire i calibratori 1-5 con 1 ml di acqua distillata.
Controlli: Ricostituire i controlli con 1 ml di acqua distillata.
Soluzione di lavoro HRP Coniugato:
! La Soluzione di lavoro HRP Coniugato deve essere preparata
assolutamente entro 15 minuti dall'inizio della prima fase di incubazione di
2 ore.
Preparare la quantità necessaria di soluzione di lavoro HRP Coniugato
mescolando Coniugato Concentrato, HRP Concentrato e Tampone Coniugato
secondo il numero di strisce utilizzate, come indicato nella tabella sottostante:
per esempio: per 6 strisce (48 pozzetti): 100 µl di Coniugato Concentrato, 50
µl di HRP Concentrato, 10 ml di Tampone Coniugato.
Utilizzare un Vortex per omogeneizzare.
Mantenere la soluzione di lavoro HRP Coniugato a temperatura ambiente e
evitare la luce diretta o usare un flacone di vetro scuro per la sua preparazione.
Giesse Diagnostics srl
V. Enrico Fermi, 3 - Z.I. V. Tiburtina Km 18.300 - 00012 Guidonia Montecelio (RM) - Italia
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e-mail: [email protected] – web site: www.giessediagnostics.com
701707
Ed. 2014/12 rev. 02
N di
strisce
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
5.
Volume di
Coniugato
Concentrato
(µl)
30
50
60
80
90
100
120
140
160
180
200
220
Volume di
HRP
Concentrato
(µl)
15
25
30
40
45
50
60
70
80
90
100
110
Volume di
Tampone
Coniugato
(ml)
3
5
6
8
9
10
12
14
16
18
20
22
Soluzione di lavaggio: Preparare la quantità necessaria di Soluzione di Lavoro
aggiungendo 199 volumi di acqua distillata a 1 volume di Soluzione di
lavaggio (200x). Usare un agitatore magnetico per omogeneizzare. Eliminare
la soluzione di lavaggio inusata a fine giornata.
CONSERVAZIONE E SCADENZA DEI REAGENTI
−
−
−
−
Prima dell'apertura o della ricostituzione, tutti i componenti del kit sono stabili
fino alla data di scadenza indicata in etichetta se conservati a 2-8°C.
Dopo ricostituzione, calibratori e controlli sono stabili per una settimana a 28°C. Per periodi di conservazione più lunghi, si dovrebbero fare delle aliquote
e bisognerebbe tenerle a -20°C per un massimo di 3 mesi. Evitare ripetuti cicli
di congelamento-scongelamento.
La soluzione di lavaggio deve essere utilizzata lo stesso giorno della
preparazione.
Alterazione dell'aspetto fisico dei reagenti del kit possono indicare instabilità o
deterioramento.
PREPARAZIONE E RACCOLTA DEI CAMPIONI
−
−
−
−
Questo kit è adatto per campioni di siero.
I campioni di siero devono essere mantenuti a 2-8°C.
Se il test non viene eseguito entro le 24 ore, si raccomanda il
campionamento e la conservazione a -20°C.
Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
PROCEDIMENTO
Note di manipolazione
Non usare il kit o i suoi componenti oltre la data di scadenza.
Non mescolare materiali provenienti da lotti diversi.
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell'uso.
Mescolare attentamente tutti i reagenti e i campioni con una leggera agitazione o
roteazione.
Eseguire calibratori, controlli e campioi in doppio. Si raccomanda un allineamento
verticale.
Utilizzare un contenitore di plastica pulito per preparare la Soluzione di Lavaggio.
Per evitare una contaminazione incrociata, usare un puntale pulito monouso per
l'aggiunta di ogni reagente e campione.
Per dispensare la Soluzione Cromogena e la Soluzione Bloccante evitare pipette con
parti metalliche.
Pipette di alta precisione o pipette automatiche miglioreranno la precisione.
Rispettare i tempi di incubazione.
Per evitare la deriva, il tempo tra il pipettaggio del primo calibratore e dell'ultimo
campione deve essere limitato al tempo indicato nella Sezione "PRESTAZIONI E
LIMITAZIONI" - punto E. (Tempo di ritardo).
Preparare una curva di calibrazione per ogni run, non usare dati di precedenti sedute.
Dispensare la soluzione Cromogena entro 15 minuti dal lavaggio della micropiastra.
Durante l'incubazione con la Soluzione Cromogena, evitare la luce solare diretta sulla
micropiastra.
Procedura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Selezionare il numero di strisce necessario per la seduta. Le strisce inutilizzate
devono essere rimesse nel sacchetto con un essiccante e conservate a 2-8°C.
Fissare le strisce nel telaio.
Pipettare 50 µl di ogni Calibratore, Controllo e Campione nei rispettivi
pozzetti.
Pipettare 150 µl di Tampone di Incubazione in tutti i pozzetti.
Incubare per 2 ore a temperatura ambiente su un agitatore per micropiastre
(da 300 a 700 rpm)
Preparare la Soluzione di lavoro HRP Coniugato non appena è cominciata
l'incubazione (entro 15 minuti).
Aspirare il liquido da ciascun pozzetto.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Lavare la piastra 3 volte:
•
dispensando 0.4 ml di Soluzione di lavaggio in ogni pozzetto
•
aspirando il contenuto di ogni pozzetto.
Pipettare 200 µl di Soluzione di Lavoro HRP Coniugato in ogni pozzetto.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente la micropiastra, su un
agitatore per micropiastre (da 300 a 700 rpm)
Aspirare il liquido da ogni pozzetto.
Lavare la piastra 3 volte:
•
dispensando 0.4 ml di Soluzione di lavaggio in ogni pozzetto
•
aspirando il contenuto di ogni pozzetto.
Pipettare 100 µl della Soluzione Cromogena in ognuno dei pozzetti entro 15
minuti dalla fase di lavaggio.
Incubare la micropiastra per 15 minuti a temperatura ambiente, su un
agitatore per micropiastre (da 300 a 700 rpm), evitare la luce solare diretta.
Pipettare 100 µl di Soluzione Bloccante in ogni pozzetto.
Leggere l'assorbanza a 450 nm (filtro di riferimento 630 nm o 650 nm) entro
1 ora e calcolare i risultati come descritto nella Sezione "CALCOLO DEI
RISULTATI".
CALCOLO DEI RISULTATI
1.
2.
3.
Leggere la piastra a 450 nm contro un filtro di riferimento fissato a 650 nm (o
630 nm).
Calcolare la media delle determinazioni in doppio.
Calcolare per ogni calibratore, controllo e campione:
B/B0 (%) = DO (Calibratore, Controllo o Campione) X 100
DO (Calibratore Zero)
4.
5.
6.
Utilizzando una carta millimetrata semi-logaritmica, riportare i valori (B/B0
(%)) per ogni calibratore in funzione della concentrazione di 25OH Vitamina D
di ogni punto di calibrazione. Scartare i valori anomali.
Per costruire la curva di calibrazione si possono usare anche metodi
computerizzati. Se si usa un processo di elaborazione automatico, si
raccomanda una curva a 4-parametri.
Da valori di interpolazione del campione (B/B0 (%)), determinare le
concentrazioni di 25OH Vitamina D dei campioni dalla curva di calibrazione.
CARATTERISTICHE TIPICHE
I seguenti dati sono solo a scopo illustrativo e non dovrebbero mai essere usati al
posto della reale curva di calibrazione.
25OH-EASIA
Unità D.O.
Calibratore
0
10
25
55
100
180
2.54
1.71
1.27
0.61
0.23
0.09
ng/ml
ng/ml
ng/ml
ng/ml
ng/ml
ng/ml
Nota: 1 ng/ml = 2.5 pmol/ml
PRESTAZIONI E LIMITAZIONI
A. Limite di Rilevazione
Venti calibratori zero sono stati analizzati insieme ad una serie di altri
calibratori.
Il limite di Rilevazione, definito come due deviazioni standard della
concentrazione apparente al di sotto del valore medio di DO indistinguibile da
zero, era 1.5 ng/ml.
B.
Specificità
Le percentuali di reattività crociata stimata confrontando la concentrazione
che produce una inibizione del 50% sono rispettivamente:
Composto
25OH-Vitamina D3
25OH-Vitamina D2
1,25(OH)2-Vitamina D3
1,25(OH)2-Vitamina D2
Vitamina D3
Vitamina D2
24,25(OH)2-Vitamina D3
25,26(OH)2-Vitamina D3
3-epi-25 idrossi vitamina D3
Reattività crociata (%)
100%
83%
50%
< 0.2%
< 0.2%
< 0.2%
≥ 100%
≥ 100%
< 0.2%
Le prestazioni del test non sono influenzate da emolisi (emoglobina testata 5g/L),
bilirubinemia (bilirubina testata 0.5 g/L) o trigliceridi (5g/L).
Giesse Diagnostics srl
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701707
Ed. 2014/12 rev. 02
C.
Precisione
VALORI ATTESI
NELLA SERIE
Campione
A
B
TRA LE SERIE
N
<X>±DS
(ng/ml)
CV
(%)
Campione
35
35
27.4±1.5
43.0±1.2
5.5
2.7
A
B
N
<X>±DS
(ng/ml)
CV
(%)
26.3±1.3
42.0±1.9
4.9
4.5
1
0
DS: Deviazione Standard; CV: Coefficiente di variazione.
D.
La dieta, la razza, la stagione e l'età sono noti per influenzare i livelli normali della
25OH-Vit.D3.
Ogni laboratorio dovrebbe stabilire il proprio intervallo in relazione alla popolazione
locale.
La letteratura recente ha suggerito i seguenti intervalli per la classificazione dello
stato della 25OH-Vitamina D: Carenza: < 10 mg/mL; Insufficienza: 10 - 29 ng/ml;
Sufficienza: 29 - 100 ng/mL; Tossicità: > 100 ng/mL.
PRECAUZIONI E AVVERTENZE
Sicurezza
Accuratezza
Solo per uso diagnostico in vitro.
I componenti di origine umana inclusi in questo kit sono stati testati con metodi
approvati in Europa e/o da FDA e sono risultati negativi per HbsAg, anti-HCV, antiHIV-1 e 2. Nessun metodo noto garantisce con assoluta certezza che i derivati del
sangue umano non trasmettano l'epatite, l'AIDS o altre infezioni. Pertanto la
manipolazione dei reagenti, dei campioni di siero o plasma deve essere in accordo
con le procedure di sicurezza vigenti.
Tutti i componenti di origine animale e derivati sono stati raccolti da animali sani.
Componenti di origine bovina provengono da paesi in cui la BSE non è stata
segnalata. Tuttavia, i componenti che contengono sostanze di origine animale
devono essere trattati come potenzialmente infettivi.
Evitare il contatto con la pelle con tutti i reagenti, la Soluzione bloccante contiene
HCl. In caso di contatto lavare abbondantemente con l'acqua.
Non fumare, bere, mangiare o applicare cosmetici nell'area di lavoro. Non pipettare
con la bocca. Usare indumenti protettivi e guanti monouso.
TEST DI RECUPERO
25OH-Vit.D3 aggiunta
(ng/ml)
Recupero
(%)
0
25
50
100
95
92
25OH-Vit.D2 aggiunta
(ng/ml)
Recupero
(%)
0
25
50
100
105
95
SINTESI DEL PROTOCOLLO
TEST DI DILUIZIONE
Diluizione del
Campione
Conc. Teorica
(ng/ml)
Conc. Misurata
(ng/ml)
Recupero
(%)
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
66.2
33.1
16.5
8.2
4.1
2.1
34.5
15.5
8.2
4.4
2.2
104
93
99
106
106
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
E.
62.0
31.0
15.5
7.7
3.8
38.3
15.8
7.5
4.0
123
102
97
103
Tempo di ritardo tra calibratore e campione
Come mostrato di seguito, il risultato dell'analisirimane accurato anche
quando il Tampone di incubazione viene dispensato 10 e 20 minuti dopo che
il calibratore è stato aggiunto nei pozzetti.
TEMPO DI RITARDO
CALIBRATORI
(µl)
CAMPIONE (I)
CONTROLLI
(µl)
50
-150
-50
150
Calibratori (0-6)
Controlli, Campioni
Tampone di incubazione
Incubare per 2 ore a temperatura ambiente con agitazione costante a 400 rpm.
Aspirare il contenuto di ogni pozzetto.
Lavare 3 volte con 400 µl Soluzione di lavaggio e aspirare.
Soluzione di lavoro HRP
Coniugato
200
Incubare per 30 min. a temperatura ambiente con agitazione costante a 400 rpm.
Aspirare il contenuto di ogni pozzetto.
Lavare 3 volte con 400 µl Soluzione di lavaggio e aspirare.
Soluzione Cromogena
100
100
Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con agitazione costante.
0' (ng/ml)
10' (ng/ml)
20' (ng/ml)
27.9
49.5
30.5
47.5
30.2
49
Soluzione Bloccante
Campione 1
Campione 2
200
100
100
Leggere su un lettore per micropiastre.
Registrare l'assorbanza di ogni pozzetto a 450 nm (contro 630 o 650 nm).
CONTROLLO DI QUALITA' INTERNO
Se i irisultati ottenuti per il Controllo 1 e/o il Controllo 2 non rientrano nel
range specificato sull'etichetta del flacone, i risultati non possono essere
utilizzati a meno che non sia stata data una spiegazione soddisfacente della
discrepanza.
Se opportuno, ogni laboratorio può preparare un proprio pool di campioni di
controllo che devono essere conservati congelati in aliquote. Controlli che
contengono azide possono interferire con la reazione enzimatica e non
possono essere usati.
I criteri di accettazione per la differenza tra i risultati dei campioni in duplicato
devono basarsi sulla buona prassi di laboratorio.
Si raccomanda di analizzare regolarmente i Controlli come i campioni
sconosciuti per misurare la variabilità dell'analisi. Le prestazioni del test
devono essere monitorate con i grafici di controllo di qualità dei Controlli.
E' buona norma verificare visivamente la curva scelta dal computer.
BIBLIOGRAFIA
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DAWSON-HUGHES B., HEANEY R.P., HOLICK M.F., LIPS P., MEUNIER P.J.
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Prevalence of Vitamin D insufficiency inan adult normal population.
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2.
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DAWSON-HUGHES B. (2006)
Estimation of optimal serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D for
multiple health outcomes.
Am.J.Clin.Nutr., 84:18-28.
Giesse Diagnostics srl
V. Enrico Fermi, 3 - Z.I. V. Tiburtina Km 18.300 - 00012 Guidonia Montecelio (RM) - Italia
Tel. +39 0774 051100 - Fax +39 0774 051111
e-mail: [email protected] – web site: www.giessediagnostics.com
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Ed. 2014/12 rev. 02
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Am.J.Clin.Nutr., 80:16788S-1688S.
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Clinical Laboratory International, October 2010, vol. 34:16-19.
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The problem of an optimal target level for 25-hydroxyvitamin D, the test
for vitamin D nutritional status.
Clinical Laboratory International, November 2010, vol. 34:28-30.
Giesse Diagnostics srl
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