Biologia molecolare nelle sindromi mielodisplastiche e nelle

Biologia molecolare nelle sindromi mielodisplastiche e nelle

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Recenti Prog Med 2014; 105: 118-122
Biologia molecolare nelle sindromi mielodisplastiche
e nelle leucemie acute mieloidi “smoldering”
Giovanni Martinelli1, Chiara Sartor1, Cristina Papayannidis1, Maria Chiara Abbenante1, Ilaria Iacobucci1,
Stefania Paolini1, Cristina Clissa1, Emanuela Ottaviani1, Carlo Finelli1
Riassunto. Le sindromi mielodisplastiche (SMD) sono un
gruppo eterogeneo di disordini clonali emopoietici di origine mieloide, caratterizzato da citopenie periferiche e frequente evoluzione leucemica. Le SMD differiscono per presentazione clinica, comportamento e progressione, il che è
il riflesso di un’ampia variabilità a livello molecolare. A oggi
la diagnosi dipende ancora dalla morfologia midollare che,
nonostante una solida concordanza tra esperti, rimane soggettiva. L’analisi del cariotipo è fondamentale ma la diagnosi rimane difficoltosa in presenza di cariotipo normale o
citogenetica non informativa. Per meglio definire diagnosi,
prognosi e rischio di progressione leucemica sono necessari marcatori molecolari standardizzati. Tale studio potrebbe fornire un importante strumento terapeutico verso
una terapia personalizzata e un approfondimento dei meccanismi biologici patogenetici.
Molecular biology in myelodysplastic syndromes and acute
myeloid leukemias “smoldering”.
Summary. Myelodysplastic syndromes (MDS) are a heterogeneous group of clonal hematopoietic disorders of the
myeloid lineage characterized by peripheral cytopenias and
frequent leukemic evolution. MDS differ for clinical presentation, disease behavior and progression and this is the reflection of remarkable variability at molecular level. To this
moment disease diagnosis is still dependent on bone marrow morphology that, although high concordance rates
among experts are reported, remains subjective. Karyotype
analysis is mandatory but diagnosis may be difficult in presence of normal karyotype or non-informative cytogenetics.
Standardized molecular markers are needed to better define diagnosis, prediction of disease progression and prognosis. Furthermore, a molecular biology analysis could provide an important therapeutic tool towards tailored therapy and new insights in the disease’s biology.
Parole chiave. Fluorescent in situ hybridation, sequenziamento massivo in parallelo, sindromi mielodisplastiche, single nucleotide polymorphism array, terapia mirata.
Key words. Fluorescent in situ hybridation, myelodysplastic syndromes, next generation sequencing, single nucleotide polymorphism array, target therapy.
Introduzione
fico la conta dei blasti midollari e il grado di displasia a livello midollare1. L’unica entità riconosciuta
come distinta in base a criteri molecolari è la sindrome del5q- isolata, per la nota associazione genotipo e fenotipo. Per la stratificazione del rischio, l’International Working Group for Prognosis in MDS
ha recentemente rivisto l’International Prognostic
Score System (IPSS), basato su blasti midollari, citopenie periferiche e anomalie citogenetiche, attribuendo maggiore peso al cariotipo e individuando
cinque gruppi a differente rischio citogenetico
(IPSS-R)2. Il punteggio dell’IPSS-R citogenetico è il
seguente: prognosi molto buona (very good) -Y e
del(11q); buona (good) cariotipo normale, del(5q),
del(12p), del(20q), doppia alterazione comprensiva
di del(5q); intermedia (fair) del(7q), +8, +19, i(17q),
qualsiasi altro singolo o doppio clone indipendente;
sfavorevole (poor) -7, inv(3)/t(3q)del(3q), doppia
comprensiva di -7/del(7q) o cariotipo complesso con
3 anomalie; prognosi molto sfavorevole (very poor)
cariotipo complesso con più di 3 anomalie citogenetiche2. Tale classificazione ha una migliore capacità
Le sindromi mielodisplastiche (SMD) sono un
gruppo eterogeneo di disordini clonali emopoietici
di origine mieloide caratterizzato da citopenie periferiche, displasia in una o più linee midollari mieloidi e aumentato rischio di evoluzione leucemica.
L’incidenza è di circa 5 casi su 100.000 abitanti all’anno, cifra che aumenta nella popolazione anziana sopra i 60 anni di età a 20-50 casi su 100.000
abitanti per anno. Trattandosi di una patologia correlata all’età, il numero di pazienti affetto aumenta parallelamente con l’allungarsi dell’aspettativa
di vita. Le SMD differiscono per presentazione clinica, comportamento e progressione, il che è il riflesso di un’ampia variabilità a livello molecolare.
A oggi la diagnosi dipende ancora dall’esame della morfologia midollare che, nonostante sia riportata una solida concordanza tra gli esperti, rimane
soggettiva. All’interno della classificazione WHO
2008 dei disordini della mielopoiesi, le SMD sono
classificate in base a criteri morfologici, nello speci-
1Dipartimento di Medicina Specialistica, Diagnostica e Sperimentale, Istituto di Ematologia Lorenzo e Ariosto Seràgnoli, Università di Bologna.
Pervenuto l’8 novembre 2013.
G. Martinelli et al.: Biologia molecolare nelle SMD e nelle leucemie acute mieloidi “smoldering”
predittiva, in termini di sopravvivenza e di evoluzione leucemica. Tuttavia, pur all’interno dei gruppi di rischio così definiti, permane una grande variabilità e la possibilità di ulteriore stratificazione.
Per la terapia delle SMD è disponibile un’ampia
gamma di opzioni terapeutiche, che vanno dalla terapia di supporto al trapianto di cellule staminali
allogeniche. È fondamentale riuscire a individuare
la prognosi del paziente per poter proporre la terapia adatta alle diverse categorie di rischio.
La tabella 1 mostra le procedure diagnostiche
e il grado di raccomandazione vigente per porre
diagnosi di SMD. L’analisi del cariotipo è fondamentale ma la diagnosi rimane difficoltosa in presenza di cariotipo normale o citogenetica non informativa. Pertanto, per meglio definire diagnosi,
rischio di progressione leucemica e prognosi sono
necessari marcatori molecolari standardizzati. Numerosi sforzi sono indirizzati a individuare strumenti diagnostici che rendano la diagnosi di SMD
più accurata. Tra questi sono comprese l’analisi
fluoricitometrica dell’immunofenotipo e tecniche di
biologia molecolare in aiuto alla citogenetica convenzionale: fluorescent in situ hybridation (FISH),
single nucleotide polymorphisms array (SNPa) e
next generation sequencing (NGS). Un’analisi molecolare approfondita può fornire un importante
strumento terapeutico per individuare specifici
sottogruppi di pazienti a cui proporre una terapia
personalizzata e rivelare i meccanismi biologici patogenetici. Il diffondersi di tecniche innovative di
NGS procurerà presto al clinico un importante
strumento diagnostico, prognostico e terapeutico.
Obiettivo di questo articolo è presentare le tecniche di biologia molecolare attualmente in uso in ambito diagnostico, terapeutico e di ricerca e in che modo si integrano con la citogenetica convenzionale.
Citogenetica convenzionale-metaphase
cytogenetics (MC)
Il ruolo dello studio citogenetico come strumento diagnostico e indicatore prognostico nelle SMD
è stato riconosciuto e codificato all’interno dell’IPSS
e implementato nell’IPSS-R2. Sono state definite
cinque principali categorie citogenetiche di rischio2.
Lo studio dei cromosomi in metafase con tecniche di
G-banding-metaphase cytogenetics (MC) è l’attuale gold standard per l’analisi del cariotipo, in grado
di individuare alterazioni cromosomiche bilanciate
(traslocazioni, inversioni) e non bilanciate (trisomie, delezioni e duplicazioni), con un approccio che
visualizza l’intero patrimonio genetico. Il risvolto è
sia prognostico sia terapeutico, perché l’individuazione di determinate alterazioni permette di mirare entità diverse caratterizzate da aberrazioni cromosomiche specifiche. La deleTabella 1. Iter diagnostico strumentale nelle SMD (modificata da Malcovati et al.)14.
zione 5q, isolata e non, consente di selezionare pazienStrumento diagnostico
Valore diagnostico
Priorità
ti candidati a terapia immuStriscio di sangue periferico Valutazione aspetti displastici su una o Obbligatorio
nomodulatrice con lenalidoStriscio di sangue midollare più linee cellulari
mide, con ottenimento da
Conta delle cellule blastiche
parte dei pazienti a rischio
Aspirato midollare
Conta delle cellule blastiche
Obbligatorio
basso e intermedio-1 di trasfusione-indipendenza in un
Conta dei sideroblasti ad anello
terzo dei casi3. A maggior ragione, pertanto, diventano
Biopsia osteomidollare
Valutazione cellularità, cellule CD34+ e Obbligatorio
importanti sia l’individuafibrosi midollare
zione di tale alterazione sia
il monitoraggio della rispoAnalisi citogenetica
Individuazione di anomalie cromosomi- Obbligatorio
che clonali acquisite che permettano
sta nel tempo.
diagnosi conclusiva e valutazione proAttualmente tale metodignostica
ca individua alterazioni cariotipiche nel 40-50% delle
FISH
Rilevazione di anomalie cromosomiche Raccomandato
SMD; le più frequenti inclutarget in nuclei in interfase in seguito a
citogenetica convenzionale non diadono del(5q), monosomia 7 o
gnostica
del(7q), trisomia 8 e del(20q),
percentuale
che aumenta
Immunofenotipo
Rilevazione di anomalie delle linee eri- Raccomandato
considerevolmente se assofluorocitometrico
troidi, mieloidi immature, granulocitarie
ciata a metodiche ad alta rimaturanti, monocitiche, linfoidi mature
soluzione4. La metodica ine immature
fatti presenta alcuni limiti
SNP-array
Rilevazione di alterazioni cromosomi- Suggerito
legati
alla dipendenza dalla
che, UPD e copy number variations ad
presenza
di almeno 20 cellualta risoluzione, in combinazione con la
le in metafase e a una risolucitogenetica convenzionale
zione relativamente bassa.
Analisi mutazionale
Rilevazione di mutazioni somatiche che Suggerito
La visualizzazione di aberradi geni candidati
permettano una diagnosi conclusiva e
zioni con metodica G-banuna affidabile valutazione prognostica
ding è limitata anche in pre-
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Recenti Progressi in Medicina, 105 (3), marzo 2014
senza di cromosomi ad anello e di riarrangiamenti
particolarmente complessi. La necessità di associare alla MC analisi aggiuntive nasce sia al momento
della diagnosi, in particolare in presenza di un cariotipo non informativo o normale, sia nel follow-up.
FISH
Il ruolo della FISH nella diagnostica delle SMD
è controverso. Da numerosi studi, che hanno messo a confronto FISH e MC, si sono ottenuti risultati
contrastanti, in parte compromessi dalla limitatezza dei campioni. Il vantaggio dell’analisi FISH
è l’indipendenza dallo stato di divisione cellulare;
infatti, viene effettuata su nuclei in interfase e viene effettuato il riscontro di subcloni e microaberrazioni non visualizzabili alla MC. La FISH ha la
capacità di identificare l’origine di materiale perso
o acquisito che il G-banding non visualizza, quali
cromosomi marker, aggiunta di materiale, cromosomi ad anello e homogeneously staining regions
(HSR)5. Il principale limite della metodica è associato all’individuazione delle sole alterazioni note
per cui siano state costruite sonde specifiche.
La FISH in alcuni studi è risultata in grado di
rilevare anomalie cromosomiche fino a un 15% in
pazienti con cariotipo normale con grande sensibilità. Uno studio condotto su 110 pazienti affetti da
SMD ha individuato con metodica FISH alterazioni cromosomiche in 3/8 pazienti con cariotipo non
diagnostico alla MC e in 5/54 pazienti con cariotipo normale. Nei pazienti con cariotipo aberrante
in 6/48 pazienti si sono riscontrate alterazioni aggiuntive, nessuna delle quali modificava il gruppo
prognostico6.
In presenza di un cariotipo normale o di una citogenetica non informativa, il dato ottenuto con
FISH può essere determinante per individuare
anomalie cromosomiche con valore prognostico e
attribuire IPSS diverso o nel follow-up di paziente
con anomalie note4,7.
Le raccomandazioni attuali sono di eseguire la
FISH in presenza di un cariotipo non diagnostico o
normale, mentre i vantaggi della metodica, peraltro costosa, non sono evidenti nei pazienti con cariotipo alterato alla MC8,9.
SNP array
La tecnologia single nucleotide polymorphisms
array è stata oggetto di discussione in merito al
prezioso ruolo complementare in associazione alla
MC. L’associazione delle due metodiche permette
uno studio ad alta risoluzione dell’intero genoma
(genome wide). La MC è in grado di visualizzare le
traslocazioni bilanciate che la metodica SNPa non
visualizza. L’analisi SNPa permette invece una
maggiore risoluzione di aberrazioni cromosomiche
non bilanciate, di piccole delezioni e duplicazioni
criptiche, associata alla possibilità di identificare
la perdita acquisita dell’eterozigosi (acquired copy-
neutral loss of heterozygosis aCN-LOH), nota anche come disomia uniparentale (UPD). Inoltre, come per la FISH, l’analisi degli SNP non necessita
di cellule in divisione cellulare. Le SMD sono una
famiglia di patologie adatte allo studio SNP poiché
l’acquisizione di alterazioni cromosomiche è relativamente frequente, più spesso non bilanciate.
Per questi motivi gli SNP stanno emergendo come strumento di identificazione di difetti non visualizzati dalla citogenetica standard, suggerendo
un ruolo di utilità clinica10,11. Uno studio recente
condotto su 430 pazienti, affetti da SMD,
SMD/MPN o AML secondaria a SMD, ha confrontato i dati citogenetici di MC associata a SNPa contro sola MC. L’associazione MC/SNPa era in grado
di individuare aberrazioni cromosomiche nel 74%
dei casi, contro 44% della sola MC (p<,0001)12. La
differenza dei risultati è da imputarsi a una maggiore risoluzione degli SNP, all’applicazione su cellule in interfase e al riconoscimento di aCN-LOH.
L’analisi SNPa si è inoltre mostrata in grado di modificare la prognosi e delineare ulteriormente il
gruppo di rischio citogenetico IPSS, stratificando
con maggiore precisione il rischio di evoluzione leucemica e progressione di malattia11. Il numero di
pazienti con cariotipo realmente normale, come determinato da SNPa/MC, ha effettivamente prognosi favorevole. Al contrario i pazienti precedentemente classificati come a cariotipo normale, che
presentino aberrazioni cromosomiche individuate
dagli SNPa hanno prognosi peggiore. In alcuni casi in presenza di alterazioni note come aCNLOH7q, 17p, o 11q, si assisteva a una riclassificazione all’interno della classificazione IPSS11,13.
L’impatto sull’IPSS si traduce nella selezione della
terapia appropriata (basso rischio vs alto rischio).
L’uso concomitante di SNPa e MC per la caratterizzazione cariotipica alla diagnosi diventerà
parte integrante dell’iter diagnostico delle SMD
per la capacità di produrre informazione clinicamente rilevanti14.
NGS
L’NGS (o sequenziamento massivo in parallelo)
è un approccio di sequenziamento profondo in grado di esaminare variazioni genetiche all’interno di
più geni contemporaneamente. La metodica è rapida e vantaggiosa dal punto di vista economico. Le
applicazioni attuali della metodica comprendono sia
pannelli multi-gene sia analisi del genoma intero
(whole-genome) e dell’esoma intero (whole-exome).
La presenza di mutazioni puntiformi non influisce attualmente sul punteggio prognostico delle SMD, ma diventerà verosimilmente l’elemento
cardine per la determinazione del fenotipo clinico
e predittivo di sopravvivenza globale (overall survival - OS). La comprensione del ruolo delle diverse mutazioni riscontrate potrebbe migliorare la
stratificazione prognostica, oltre a fornire importanti meccanismi patogenetici su cui intervenire
con terapia specifica.
G. Martinelli et al.: Biologia molecolare nelle SMD e nelle leucemie acute mieloidi “smoldering”
Numerosi sono i geni riconosciuti come alterati
nelle SMD, che ne spiegano l’eterogeneità fenotipica, e diversi sono i meccanismi patogenetici con cui
essi intervengono: meccanismi trascrizionali (per
es., TP53, RUNX1, ETV6), meccanismi coinvolti
nell’epigenetica, metilazione di DNA e istoni (per
es., TET2, DNMT3A, ASXL1, IDH1/2, EZH2), splicing pre-mRNA(per es., SF3B1, U2AF1, SRSF2), signaling (per es., NRAS, JAK2, NPM1)15,16. Nessuno
di questi è specifico per le SMD, ma sono geni comunemente alterati nelle neoplasie mieloidi, tuttavia sono indicatori di clonalità nel paziente con sospetta SMD. La correlazione tra presenza di mutazione e prognosi o fenotipo per alcune alterazioni è
già stata individuata (tabella 2). Per esempio, una
mutazione di TP53, gene che codifica per p53, la proteina-guardiano del genoma, correla con prognosi infausta ed è spesso presente in associazione alla delezione del 5q: nel 19% dei casi di del5q isolata e nel
73% dei casi di cariotipo complesso con -5/-5q. Tale
alterazione correla con un IPSS intermedio-2/alto,
con una maggiore percentuale di cellule blastiche e
con una rapida progressione leucemica17. Tramite
l’analisi mutazionale e la signature di espressione
genica (gene expression profiling - GEP), due recenti studi hanno mostrato che le mutazioni di
TP53, EZH2, ETV6, RUNX1 e ASXL1 sono fattori
predittivi indipendenti di sopravvivenza e associati
a prognosi infausta a prescindere da caratteristiche
di rischio preassegnate16,18. In questo studio, il 51%
dei pazienti presentava almeno una mutazione ed
erano presenti alterazioni nel 52% dei pazienti con
cariotipo normale15. In uno studio successivo, nel totale dei pazienti analizzati, il 74% presentava almeno una lesione puntiforme oncogenica o una modificazione del numero di copie di geni SMD-correlati riscontrabile al sequenziamento19.
La differenziazione cellulare è un processo altamente controllato, tra i cui meccanismi vi è la
metilazione del DNA e degli istoni. Nelle SMD la
perdita di differenziazione viene frequentemente
ricondotta a un’alterazione nei meccanismi di metilazione, tra cui le mutazioni di TET2 e DNMT3A,
coinvolte nella metilazione del DNA, e EZH2 e
ASXL1, coinvolti nella metilazione istonica. La terapia con agenti ipometilanti e demetilanti è infatti particolarmente attiva nelle SMD20. La ricerca di mutazioni in tali geni può indirizzare l’utilizzo di 5-azacitidina o decitabina nel paziente candidato, quest’ultima particolarmente attiva in presenza della mutazione di DNMT3A.
Recentemente, il sequenziamento massivo, effettuato in Giappone su 29 pazienti affetti da SMD, ha
rivelato mutazioni ricorrenti dei geni coinvolti nello
splicing dell’RNA21. Tali mutazioni si presentavano
nel 44% dei pazienti affetti da SMD senza sideroblasti ad anello, fino a un 85% dei pazienti con sideroblasti ad anello, in maniera mutualmente esclusiva. I geni coinvolti sono SF3A1, SRSF2, U2AF35 e
ZRSR2, e con minore frequenza SF3A1, SF1, UAF64
e PRPF40B15. È la prima volta che alterazioni nella
macchina dello splicing sono associate a patogenesi
neoplastica, individuando un nuovo meccanismo di
leucemogenesi e potenziale bersaglio terapeutico22.
Attualmente nella pratica clinica non viene effettuato lo screening mutazionale di routine alla
diagnosi, ma rimane prerogativa di centri specializzati, con fini di ricerca. La diffusione di metodiche quali l’NGS permetterà di riconoscere e individuare dal sangue periferico le alterazioni specifiche della singola patologia, facilitando il clinico
nella diagnosi e fornendo preziose indicazioni per
una terapia personalizzata.
Conclusioni
Le raccomandazioni attuali per porre diagnosi e
per stratificare il paziente affetto da SMD, assegnando gruppi di rischio e distinte terapie, si basano sulla presentazione clinico-laboratoristica di malattia, a cui si associano criteri di tipo morfologico e
Tabella 2. Correlazione tra alterazioni genotipo e fenotipo. La presenza di diverse mutazioni all’interno delle SMD permette di spiegarne
l’eterogeneità clinica e prognostica.
Patologia
Morfologia midollare
Biologia molecolare
Citopenia refrattaria con displasia
unilineare
Displasia eritroide isolata, <5% CB, <15% sideroblasti
ad anello
SRSF2, U2AF35
Anemia refrattaria con sideroblasti
ad anello
Displasia eritoride isolata, <5% CB, >15% sideroblasti
ad anello
SF3B1
Sindrome del5q-
Megacariociti normali o aumentati, ipolobati, <5% CB,
RPS14, miR145, miR146
TP53 (evoluzione leucemica)
no corpi di Auer
Citopenia refrattaria con displasia
multilineare
Displasia in ≥10% cellule in 2 o più linee cellulari mieloidi, <5% CB, no corpi di Auer, <15% sideroblasti ad
anello
SF3B1
Anemia refrattaria con eccesso di blasti-1 Displasia monolineare o multilineare, 5%<CB<9%,
no corpi di Auer
TP53, ASXL1, RUNX1,
EZH2, ETV6
Anemia refrattaria con eccesso di blasti-2 Displasia monolineare o multilineare, 10%<CB<19%,
occasionali corpi di Auer
TP53, ASXL1, RUNX1,
EZH2, ETV6
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citogenetico. Il ruolo della biologia molecolare è ancora in corso di definizione, ma la sua importanza a
livello prognostico e terapeutico è evidente, in particolare in presenza di un gruppo di patologie così eterogenee. Il riconoscimento di una firma genica per
ogni SMD potrebbe permettere in futuro di scegliere la terapia in funzione del pattern molecolare e di
valutare in tempi precoci la risposta alla terapia,
mediante la valutazione della malattia minima residua a livello molecolare. La metodica di NGS per il
sequenziamento massivo in parallelo offre uno strumento unico, rapido e a basso costo potenzialmente
utilizzabile front-line nella diagnosi, prognosi, trattamento e monitoraggio di numerose neoplasie, fra
cui le SMD. In particolare la proposta di utilizzare
una terapia personalizzata guidata dal genotipo delle singole malattie è auspicabile. Se questo è auspicabile per ogni patologia neoplastica, il sottogruppo
delle SMD assume particolare rilevanza perché la
popolazione anziana, prevalente in questa malattia,
potrebbe maggiormente beneficiare di una terapia
target, che minimizzi la tossicità. Al paziente anziano, in cui spesso le numerose comorbilità limitano la
possibilità di terapie aggressive, potrebbe essere proposta una terapia individualizzata e mirata, sulla
base di una accurata valutazione molecolare.
Ringraziamenti
AIL, AIRC, PRIN 2010-2011, Programma Ricerca RegioneUniversità 2010-2012, progetto Europeo FP7 NGS-PTL.
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Indirizzo per la corrispondenza:
Prof. Giovanni Martinelli
Istituto di Ematologia Lorenzo e Ariosto Seràgnoli
Università di Bologna
Via Massarenti 9
40138 Bologna
E-mail: [email protected]