QUANTA LiteTM dsDNA

QUANTA LiteTM sp100
708990
Per uso diagnostico In Vitro
Complessità CLIA: elevata
Finalità d’uso
Il kit QUANTA LiteTM sp100 è un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la determinazione
semiquantitativa dell’anticorpo anti-sp100 di classe IgG nel siero umano. Questo test ha lo scopo di favorire
la diagnosi della Cirrosi Biliare Primaria (PBC).
Riassunto e Spiegazione del test
La Cirrosi Biliare Primaria (PBC) è una patologia epatica cronica caratterizzata dalla distruzione dei piccoli
dotti biliari intraepatici. La progressiva distruzione dei dotti causa una crescente compromissione della
funzionalità epatica e, col tempo, può determinare un’insufficienza epatica e rendere necessario un trapianto
di fegato.1,2 L’eziologia della PBC è sconosciuta, sebbene una componente genetica e altri fattori potrebbero
risultare importanti per lo sviluppo della patologia. 1,3,4
La PBC colpisce più le donne che gli uomini (con un rapporto tra donna e uomo pari a 9:1) e si manifesta
tipicamente in soggetti di età compresa tra 30 e 65 anni.3, 4 La prevalenza della PBC in congiunti di primo
grado di pazienti affetti da PBC è compresa tra l’1,3 e l’6,4%.3,5 La PBC colpisce tutte le razze ed è presente
in tutto il mondo. Sono state riscontrate ampie variazioni nella prevalenza geografica della PBC, con stime di
bassa prevalenza comprese tra 2 casi su 100.000 in Giappone e Australia e 40 casi su 100.000 negli Stati
Uniti.4,6 Non è chiaro in che misura le ampie variazioni nella prevalenza riscontrate in diverse regioni
geografiche siano il risultato di variazioni geografiche reali o di differenze nella progettazione e nelle
metodologie degli studi.3, 4, 7
I test sierologici sono ausili importanti per il riconoscimento e la diagnosi della PBC in quanto molti anticorpi
associati alla PBC sono presenti prima che i sintomi diventino evidenti.8 Col tempo, la percentuale di pazienti
che rimangono asintomatici si riduce.8 Gli anticorpi antimitocondriali (AMA), tipicamente rilevati nei tessuti
epatici e renali o nelle cellule HEp-2 dal test di immunofluorescenza (IFA) indiretta, sono i marker sierologici
classici dei pazienti affetti da PBC. I primi studi hanno diviso gli AMA in sottogruppi in base alla loro reattività
alle frazioni antigeniche (M1-M9) isolate dalle membrane mitocondriali di fegato murino o cuore bovino.9 La
reattività anti-M2 è la specificità dominante, presente nel 95% dei pazienti affetti da PBC. I test ELISA basati
su M2 sono più sensibili dell’IFA per l'individuazione degli AMA.10, 11
Nonostante la disponibilità di test ELISA più sensibili, l’individuazione degli AMA da parte dell’IFA rimane una
pratica comune in molti laboratori. Vi è, tuttavia, un sottogruppo pari ad almeno il 10% dei pazienti affetti da
PCB che risulta negativo all'AMA. Questi sono stati definiti pazienti affetti da PCB AMA-negativi o pazienti
con colangite autoimmune, ma se ciò va considerato un'entità clinica ben distinta dai pazienti affetti da PCB
AMA-positivi non è ancora chiaro.12,13
Oltre all’AMA, circa il 50-72% dei sieri dei pazienti affetti da PCB contiene anticorpi antinucleari (ANA).14-16
Due pattern ANA specificamente associati alla PBC sono un orlo nucleare punteggiato (una colorazione
membranosa caratteristica della proteina gp210 della membrana del poro nucleare) e un pattern a punti
nucleari multipli (MND) caratteristico della proteina sp100 associata al corpo nucleare.12, 14 Gli anticorpi antisp100 sono stati riscontrati in circa il 25% dei pazienti affetti da PBC e sono altamente specifici per la
PBC.17-19 Inoltre, gli anticorpi anti-sp100 sono presenti in alcuni pazienti che risultano negativi ai marker
convenzionali della PBC quali AMA e M2.15, 20, 21 La presenza di anticorpi anti-sp100 può confermare la
diagnosi di PBC nei casi in cui la presentazione clinica e/o il quadro sierologico fossero poco chiari.22
Di norma, gli anticorpi anti-sp100 producono un pattern punteggiato di circa 10-20 punti nucleari sulle cellule
HEp-2. Il pattern punteggiato associato all’sp100 può essere difficile o impossibile da leggere per via della
concomitante colorazione AMA, ANA o altra colorazione puntiforme. Il bersaglio degli anticorpi anti-sp100 è
stato individuato come una proteina di peso molecolare pari a circa 100 kDa che colocalizza con la proteina
leucemica promielocitica (PML) nei complessi multiproteici denominati corpi nucleari.14, 23 Ulteriori studi
hanno portato alla clonazione molecolare della proteina sp100 e alla realizzazione di test ELISA finalizzati
all’individuazione degli anticorpi anti-sp100.19
Principio della Metodica
Un frammento purificato della proteina sp100 è legato ai pozzetti di una piastra a micropozzetti in polistirene.
Tali antigeni sono adsorbiti sulla superficie dei pozzetti di una piastra microtiter. I controlli pre-diluiti ed i sieri
diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-sp100
eventualmente presenti di legarsi all’antigene adsorbito. L’eccesso di campione non legato viene allontanato
mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-IgG umane
marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-IgG umane marcati con
l’enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo
ulteriore lavaggio per allontanare l’eccesso di anticorpi anti-IgG umane marcati con l’enzima, l’attività
dell’enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l’intensità del colore
che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l’intensità
del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli.
1
Reagenti
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Piastra microtiter ELISA in polistirene, adsorbita con peptide antigene sp100 purificato (12-1 x 8
pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante
Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza
anticorpi anti-sp100, prediluito, 1,2 mL
Controllo ELISA fortemente positivo per sp100, 1 flacone di tampone contenente conservante ed
anticorpi anti-sp100, prediluito, 1,2 mL
Controllo ELISA debolmente positivo per sp100, 1 flacone di tampone contenente conservante ed
anticorpi anti-sp100, prediluito, 1,2 mL
Diluente per campioni HRP, 1 flacone – di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata
con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50 mL
Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x – di colore rosso
contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25 mL. Vedi la Sezione Metodi per
le istruzioni sulla diluizione.
Coniugato HRP IgG, (montone), anti-IgG umane, 1 flacone – di colore blu contenente tampone,
stabilizzatori delle proteine e conservante, 10 mL
Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10 mL
Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone – incolore, 10 mL
Avvertenze
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel
diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di
tumori.
Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state
testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-HIV, per HbsAg e per anticorpi antiHCV mediante metodi approvati dall’FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa
dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo
sp100, ELISA debolmente positivo sp100 ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come
materiali potenzialmente infettivi.24
La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se
ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di
piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità
di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi.
Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se
ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi.
Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito
attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la cute e
con gli occhi.
La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare
l’esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L’acido solforico è
velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche,
evitare il contatto con la cute e con gli occhi.
Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti.
I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le
normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica.
Precauzioni
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Questo prodotto è stato messo a punto per l’uso diagnostico In Vitro.
La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili.
Un lavaggio incompleto o non accurato e l’insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può
causare una scarsa precisione e/o un’elevato background.
L’adattamento di questo test all’uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per
trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli
ottenuti mediante la procedura manuale. E’ responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le
procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità.
Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l’iniziale temperatura dei
reagenti, la temperatura dell’ambiente, l’accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento,
la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre
ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione
durante l’esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati
accurati e riproducibili.
Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite.
Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale
essicante causa la degradazione dell’antigene ed una scarsa precisione nei risultati.
Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più
volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E’ importante seguire
attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente.
Un’eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria
pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio
quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato
HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l’uso di detergenti
chimici.
2
Condizioni di conservazione
1.
2.
3.
Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8°C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di
scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite.
Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile
contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8°C.
Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8°C.
Raccolta dei campioni
Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L’aggiunta al campione di sodio azide o di altri
conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica,
trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l’uso
di sieri fortemente emolizzati o lipemici.
Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell’NCCLS
raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura
ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in
frigorifero a 2-8°C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni,
congelare a ≤-20°C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di
essere testati.
Procedura
Materiali forniti
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Piastra microtiter ELISA sp100 (12-1 x 8 pozzetti), con supporto
1,2 mL Controllo ELISA Negativo prediluito
1,2 mL Controllo ELISA debolmente positivo sp100 prediluito
1,2 mL Controllo ELISA fortemente positivo sp100 prediluito
50 mL Diluente per campioni HRP
25 mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata
10 mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-IgG umane
10 mL Cromogeno TMB
10 mL Soluzione di arresto HRP, 0,344 M Acido solforico
Materiali richiesti ma non forniti
Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, 200-300 e 500 µL
Puntali monouso per micropipette
Provette per la diluizione dei sieri, volume 4 mL
Acqua distillata o deionizzata
Beuta da 1 L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata
Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450 nm (e 620 nm per le letture a doppia lunghezza d’onda)
Metodica
Prima di incominciare
1.
2.
3.
4.
Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26oC) e mescolarli bene.
Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito
con il kit a 975 mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l’intera piastra in una sola volta, si
può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0 mL di concentrato a 78
mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile
per 1 settimana a 2-8oC.
Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5 µL di siero a 500 µL di
Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione.
NON DILUIRE i Controlli ELISA debolmente positivo sp100, ELISA fortemente positivo sp100 ed
ELISA Negativo.
La determinazione della presenza o dell’assenza di autoanticorpi anti-sp100 usando unità arbitrarie
richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione
clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato.
Esecuzione del test
1.
2.
3.
TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26°C)
PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere
immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla
bene per minimizzare l’esposizione all’umidità ambientale.
Distribuire 100 µL dei Controlli ELISA debolmente positivo sp100, ELISA fortemente positivo sp100
ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per
30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo
l’aggiunta dell’ultimo campione.
Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire 200-300 µL di
soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per
altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l’ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla
fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E’ importante
vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l’aspirazione mantenere la
stessa sequenza usata per l’aggiunta dei campioni.
3
4.
5.
6.
7.
8.
Distribuire 100 μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato
dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria
per l’esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O
CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i
pozzetti per 30 minuti come descritto al punto 2.
Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto 3.
Distribuire 100 µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a
temperatura ambiente.
Distribuire 100 µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l’aggiunta della Soluzione di
arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l’aggiunta del Cromogeno
TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti.
Leggere l’assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450 nm entro 1 ora dall’aggiunta della soluzione di
arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d’onda, si può usare la lunghezza d’onda di
620 nm come riferimento.
Controllo di qualità
1.
2.
3.
4.
I Controlli ELISA debolmente positivo sp100, ELISA fortemente positivo sp100 ed ELISA Negativo
devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test
funzionino in modo corretto.
Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo sp100, ELISA fortemente positivo
sp100 ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le
tecniche di diluizione utilizzate per i campioni.
Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti
regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere
preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20°C.
Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se
anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed
il test dovrebbe essere ripetuto.
a.
L’assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo sp100 prediluito deve essere maggiore
di quella del Controllo ELISA debolmente positivo sp100 prediluito che a sua volta deve
essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito.
b.
Il Controllo ELISA fortemente positivo sp100 prediluito deve avere un’assorbanza maggiore di
1,0 mentre l’assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di
0,2.
c.
L’assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo sp100 deve essere maggiore di due
volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25.
d.
Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo sp100 servono per controllare
un’eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo sp100
non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test.
e.
L’utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell’NCCLS per ulteriori
informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità.25
Calcolo dei risultati
Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di
ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore
medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo sp100 e moltiplicando il risultato per il numero
di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo sp100, che è stampato sull’etichetta del flacone.
Assorbanza campione
Valore del campione = ———————————————— x Valore Controllo ELISA debolmente positivo sp100 (unità)
(unità)
Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo sp100
La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le
diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o
diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione
di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del
contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L’ultima diluizione che
risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente.
Interpretazione dei risultati
Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella
popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio
dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli,
sull’apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard.
I campioni vengono interpretati come negativi (negativi per l’anticorpo IgG anti-sp100), equivoci, o positivi
(individuato un anticorpo IgG anti-sp100) in base alla seguente tabella:
Negativo
Equivoco
Positivo
1.
0,0 - 20,0
20,1 - 24,9
≥ 25
unità
unità
unità
Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi IgG anti-sp100 e suggerisce la possibilità che sia
in corso una Cirrosi Biliare Primaria.
4
2.
3.
4.
5.
Non è possibile valutare lo stato anticorpale di un campione con livelli equivoci di IgG sp100. Se i
risultati rimangono equivoci dopo ripetuti test, sarebbe opportuno riportare il risultato come equivoco
e/o prelevare un altro campione
Un risultato negativo indica l’assenza di anticorpi IgG anti-sp100 oppure la loro presenza a livelli
inferiori al limite di individuazione del test.
Campioni che danno letture di OD al di sopra del range di lettura del lettore della piastra possono
essere riportati come superiori alla OD misurabile più elevata diviso per la OD debolmente positiva e
moltiplicato per 25, oppure possono essere diluiti e rianalizzati per ottenere un valore calcolato.
Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: “I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il
test QUANTA LiteTM sp100 ELISA della INOVA. I valori di autoanticorpi anti-sp100 ottenuti con test
prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG
determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint.”
Limitazioni del test
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Un risultato negativo relativo al sp100 non esclude la presenza di Cirrosi Biliare Primaria.
Un risultato negativo relativo all’anticorpo anti-sp100 non esclude la presenza di tali anticorpi in
quanto la concentrazione potrebbe essere inferiore al limite di individuazione del test.
Un risultato positivo del test indica solo la presenza di anticorpi anti-sp100 e non indica
necessariamente la presenza di Cirrosi Biliare Primaria.
La diagnosi di Cirrosi Biliare necessita della documentazione cumulativa della demografia di un
paziente, della presentazione clinica e di altri esami diagnostici.
Le prestazioni di questo test non sono state definite per la popolazione pediatrica.
I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del
paziente e del risultato degli altri test sierologici.
Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero.
Valori attesi
La prevalenza della PBC in congiunti di primo grado di pazienti affetti da PBC è compresa tra l’1,3 e
l’6,4%.3,5 La PBC colpisce tutte le razze ed è presente in tutto il mondo. Sono state riscontrate ampie
variazioni nella prevalenza geografica della PBC, con stime di bassa prevalenza comprese tra 2 casi su
100.000 in Giappone e Australia e 40 casi su 100.000 negli Stati Uniti.4,6
Range normale
Un gruppo di 272 pazienti sani asintomatici residenti negli Stati Uniti è stato analizzato per verificare la
presenza di anticorpi sp100 utilizzando il test ELISA QUANTA LiteTM sp100. Il gruppo era costituito di 105
uomini e 87 donne di età compresa tra 18 e 78 anni. Il valore medio per questa popolazione era di 5,8 unità.
Quello mediano di 4,8 unità. La specificità del test era del 99,3% (270/272). Dei 2 campioni interpretati come
positivi, uno era debolmente positivo (28,5 unità) e uno era fortemente positivo (134 unità). L’analisi IFA sulle
cellule HEp-2 ha dimostrato che il campione fortemente reattivo presentava un classico e inconfondibile
pattern a punti cellulari, mentre il campione debolmente positivo aveva un pattern indefinito.
Caratteristiche specifiche delle prestazioni
La frequenza degli anticorpi sp210 rilevata con il test ELISA Quanta LiteTM sp100 su un totale di 273
campioni di PBC e campioni “in sovrapposizione” PCB è riportata nella Tabella 1. L’analisi ha combinato i
risultati ottenuti con il test ELISA Quanta LiteTM sp100 su 3 coorti cliniche. La sensibilità complessiva del test
era del 24,5% (67/273). La specificità del test era del 99,5% (381/383). Il valore predittivo positivo era del
97,1% e quello negativo del 64,9%. I valori medi e mediani relativi a tutti i campioni non PBC o PBC/epatite
autoimmune (EAI) erano rispettivamente di 5,14 e 4,55.
Tabella 1: prestazioni del test ELISA QUANTA LiteTM sp100 su dati combinati – tutte le coorti
sp100 ELISA
N=
positivo
eq
negativo
PBC
266
65
7
194
273
PBC/AIH
2
0
0
2
PBC?, PBC/AIH?, AIH?/PBC
5
2
0
3
HBV, HCV
6
0
0
6
SLE
36
0
2
34
AIH-1, AIH/PSC?, AIH-2
43
0
0
43
Artrite reumatoide
3
0
0
3
111
Colangite sclerosante primaria (PSC), PSC?
3
0
0
3
Varie : Sm(1), SS-B(1), istone (3),
Jo-1(1), Scl-70(1), riboP(1), GBM(2), RNP(1),
383
cromatina(2), centromero (1), ASCA(2)
16
0
0
16
Diagnosi incerta
4
0
0
4
272
Normale
272
2
0
270
Totale
656
69
9
578
Sensibilità PBC & PBC/AIH
Specificità di tutti i non-PBC
Valore predittivo positivo
Valore predittivo negativo
Valore medio di tutti i non-PBC
Valore mediano di tutti i non-PBC
=
=
=
=
=
=
24,5% (67/273) (95% Intervallo di confidenza [(CI)] = 19,6-30,1%)
99,5% (381/383) (95% CI = 98,1-99,9%)
97,1%
64,9%
5,12 unità
4,55 unità
5
Sono stati analizzati i sieri di 111 pazienti affetti da patologie epatiche diverse dalla PBC, patologie
autoimmuni e altre condizioni mediante il test ELISA Quanta LiteTM sp100 per determinare la specificità del
test. Nessun campione non PBC o non PBC/EAI è stato interpretato come positivo dal test ELISA Quanta
LiteTM sp100 come indicato nella Tabella 2. La specificità complessiva relativa al test Quanta LiteTM sp100,
compresi sia controlli sani che sieri di pazienti affetti da patologie diverse dalla PBC, era pertanto del 99,5%
(381/383).
Tabella 2: studio sulla reattività incrociata del test ELISA QUANTA LiteTM sp100
Virus dell’epatite B
Virus dell’epatite C
Lupus eritematoso sistemico (LES)
Epatite autoimmine (AIH)
Artrite reumatoide
Colangite sclerosante primaria (PSC) or PSC?
Campioni vari positivi a: Sm(1),
RNP(10), SS-B(1), Scl-70, Jo-1(1),
ribosome P(1), cromatina(1), centromero (1),
ASCA(1), GBM(2), sclerodermia
Diagnosi incerta
Totale
N=
2
4
36
43
3
3
16
4
111
sp100 ELISA Positivo
0
0
0
0
0
0
% Positivo
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Precisione e riproducibilità
Le prestazioni intra-test sono state valutate analizzando 9 campioni per un totale di 6 volte ciascuno.
Tabella 3: Prestazioni intra-test del test ELISA QUANTA LiteTM sp100
A
B
C
D
E
F
Unità medie
140,2
3,7
164,2
4,3
188,3
21,5
Deviazione standard
0,6
0,5
2,5
0,6
0,9
0,5
Coefficiente di variazione % 0,4
12,2
1,5
13,0
0,5
2,5
G
27,2
0,6
2,1
H
24,8
1,4
5,6
I
21,0
0,7
3,5
Le prestazioni inter-test sono state valutate testando, in doppio, 5 campioni due volte al giorno (una volta al
mattino e una volta al pomeriggio) per 3 giorni.
Tabella 4: Prestazioni inter-test del test ELISA QUANTA LiteTM sp100
HPC
1
2
3
4
Unità medie
139,5
141,4
4,3
172,2
4,7
Deviazione standard
6,1
6,7
0,1
8,1
0,2
Coefficiente di variazione % 4,4
4,8
3,3
4,7
3,7
5
197,9
8,5
4,3
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INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
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August 2005
Revision 1
7