introduzione

Università Politecnica delle Marche
Facoltà di Medicina e Chirurgia
Dottorato di Ricerca in Patologie
Immunometaboliche,Degenerative ed Infettive
(XIII° ciclo)
Coordinatore: Chiar.mo Prof. Pietro E. Varaldo
Elementi genetici mobili in Streptococcus
agalactiae: varietà, mobilità e contributo
alla diffusione dell’antibiotico-resistenza.
Dottoranda:
Dott.ssa Eleonora Morici
Relatore:
Chiar.mo Prof. Pietro E. Varaldo
Triennio 2012-2014
INDICE
INTRODUZIONE
1.1 Streptococcus agalactiae: importanza clinica e patogenesi
1
1.2 Terapia e profilassi
4
1.3 Distribuzione delle antibiotico-resistenze in S. agalactiae
5
1.4 Tetracicline, meccanismo d’azione e strategie di resistenza
8
1.5 Macrolidi, meccanismo d’azione e strategie di resistenza
12
1.6 Integrative and Conjugative Elements (ICE)
19
1.7 Distribuzione degli ICE in S. agalactiae e il concetto di pan
genoma
22
1.8 ICE e resistenza alla tetraclina negli streptococchi
24
1.9 ICE e resistenza ai macrolidi negli streptococchi
27
1.10 Scopo della tesi
36
MATERIALI E METODI
2.1
Ceppi batterici
38
2.2
Test di sensibilità agli antibiotici: antibiogramma e MIC
39
2.3
Estrazione del DNA
40
2.4
Reazione a catena della polimerasi (PCR)
41
2.5
Elettroforesi in gel di agarosio
47
2.6
Purificazione e sequenziamento
47
2.7
Esperimenti di Coniugazione
48
2.8
PFGE
49
2.9
Southern blotting ed ibridazione
51
RISULTATI
3.1
Caratterizzazione fenotipica e determinanti
di resistenza
3.2
Individuazione del contesto genetico che
veicola il gene tet(M)
3.3
52
55
Identificazione e caratterizzazione di nuovo elemento
genetico che veicola il gene tet(M) in S. agalactiae,
Tn5801.Sag
3.4
Individuazione del contesto genetico che
veicola il gene erm(B)
3.5
56
67
Identificazione e caratterizzazione di nuovo elemento
genetico che veicola il gene erm(B) in
S. agalactiae, ICE1116.Sag
3.6
Individuazione del contesto genetico che veicola
il gene erm(TR)
3.7
79
Elementi correlati a ICE10750-RD.2/Tn1806 e
ICESp1108
3.9
78
Analisi della correlazione genetica dei ceppi
erm(TR) positivi
3.8
69
81
Individuazione e caratterizzazione di un
elemento correlato a ICESp2907
85
3.10 Elementi genetici sconosciuti che veicolano
il gene erm(TR)
93
3.11 Identificazione del plasmide che veicola il gene
erm(T) per la resistenza all’eritromicina
in S. agalactiae
94
DISCUSSIONE
95
BIBLIOGRAFIA
106
Capitolo Primo
Introduzione
INTRODUZIONE
1.1
Streptococcus agalactiae: importanza clinica e
patogenesi
Streptococcus agalactiae è una specie batterica appartenente al
genere Streptococcus, che comprende cocchi Gram-positivi, disposti in
coppie o catenelle, immobili, asporigeni, capsulati, catalasi e ossidasi
negativi. Si tratta di microrganismi aerobi-anaerobi facoltativi, la cui
crescita è favorita dall’incubazione in CO2 al 5% e dall’arricchimento
con
sangue
(5%-7%)
del
terreno
colturale.
Sulla
base
delle
caratteristiche del polisaccaride C, anche noto come antigene di
Lancefield,
gli
streptococchi
vengono
suddivisi in 18 gruppi, indicati con le lettere
dell’alfabeto dalla A alla T, escluse I e J. Il
gruppo A e il gruppo B comprendono
un'unica
specie
corrispondente
rispettivamente allo Streptococcus pyogenes
(Group
A
Streptococcus,
GAS)
e
allo
Figura 1. Colonie ßemolitiche di S. agalactiae
Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus, GBS). Entrambe le
specie batteriche sono β-emolitiche, ovvero in grado di lisare
completamente i globuli rossi in un terreno come l’agar sangue con la
comparsa di un alone chiaro attorno alle colonie. La caratteristica che
consente di discriminare macroscopicamente S. agalactiae da S.
pyogenes è la resistenza alla bacitracina, alla quale lo streptococco di
1
Capitolo Primo
Introduzione
gruppo A risulta sensibile. S.
agalactiae cresce su agar sangue
formando colonie grigio-bianche con un diametro di 3-4 mm. La zona
di β-emolisi è in genere meno ampia (Figura 1) rispetto a quella che si
osserva in altri streptococchi del gruppo A, C o G e per una migliore
identificazione delle colonie può essere effettuato il CAMP test, volto a
verificare la produzione di un fattore capace di aumentare l’attività
della β-emolisina di Staphylococcus aureus. Test metabolici utili per
la distinzione dei GBS dagli enterococchi riguardano la capacità di
idrolizzare l’ippurato (reazione positiva per GBS) e l’esculina (reazione
negativa per GBS). S. agalactiae è un commensale del tratto
gastrointestinale e dell’apparato genito-urinario umano. Negli adulti
causa raramente patologie, ma può dare origine a batteriemie,
endocarditi, infezioni della cute e dei tessuti molli, polmoniti ed
infezioni ossee nel caso di pazienti fortemente debilitati (diabetici o
malati cronici). La sua importanza a livello clinico è legata
principalmente alla capacità di causare sepsi, meningiti, polmoniti,
artriti e osteomieliti nel neonato e di provocare amnioniti, endometriti
e infezioni delle vie urinarie nella donna in gravidanza o in prossimità
del parto. Un fattore di virulenza molto importante in S. agalactiae è
rappresentato
dalla
produzione
di
una
capsula
di
natura
polisaccaridica, la quale conferisce resistenza all’opsonizzazione e alla
fagocitosi
mediata
dal
complemento.
Al
momento
sono
state
dimostrate 10 distinte varianti antigeniche capsulari (Ia, Ib, II-IX) e
la sierotipizzazione è ancora il primo approccio epidemiologico per
2
Capitolo Primo
Introduzione
caratterizzare i ceppi di GBS (89). Studi epidemiologici effettuati in
Europa e negli USA hanno mostrato che i sierotipi maggiormente
coinvolti nelle infezioni umane sono Ia, Ib, II, III e V (60). Inizialmente
conosciuto come agente eziologico della mastite bovina, S. agalactiae
ha assunto una rilevanza nell’ambito della patologia umana solo negli
anni ’70 quando i casi di sepsi neonatale ad esso correlati hanno
subito un incremento notevole. Soltanto negli anni ’90 sono state
messe a punto strategie di prevenzione, che hanno ridotto l’incidenza
di tali infezioni. Nella maggior parte dei casi il microrganismo viene
trasmesso per via ascendente (dalla madre al feto) in prossimità del
parto o durante il parto, mentre più raramente l’infezione viene
acquisita orizzontalmente da altri neonati o dal personale sanitario.
Nel caso di trasmissione verticale il fattore di rischio principale è
rappresentato dalla colonizzazione vaginale della donna in gravidanza
(3). Negli Stati Uniti la frequenza di colonizzazione nelle donne gravide
varia tra il 10 e il 40% mentre è inferiore in Europa. Essa risulta
influenzata da diversi fattori come popolazione esaminata, metodi
colturali e modalità di raccolta del campione. La colonizzazione può
essere messa in evidenza mediante screening prenatali, volti a
ricercare GBS nel tratto genitale della donna attraverso metodi
colturali. Si può distinguere una colonizzazione ad alta carica o a
bassa carica, a cui sono associati rischi di infezione diversi. In caso di
positività
le
donne
gravide
vengono
sottoposte
ad
una
chemioprofilassi intrapartum, che riduce la colonizzazione e quindi il
3
Capitolo Primo
Introduzione
rischio di infezione. Le manifestazioni cliniche legate all’infezione da
GBS possono comparire entro la prima settimana dalla nascita (si
parla di infezione precoce) o tra i 7 e i 90 giorni dopo la nascita (si
parla di infezione tardiva) (3).
1.2 Terapia e profilassi
I β-lattamici (in particolare penicillina G, ampicillina o cefalosporine
di terza generazione) rappresentano i farmaci di prima scelta.
Vancomicina, macrolidi e lincosamidi (eritromicina e clindamicina)
sono utilizzati come farmaci di seconda scelta in caso di reazioni
allergiche nei confronti dei β-lattamici (3). A partire dagli anni ’90 è
stata messa a punto un’importante attività di prevenzione nei
confronti delle infezioni neonatali precoci, che ha consentito di
ridurre notevolmente l’incidenza di malattie sostenute da GBS. Le
linee guida definite nel 2002 dal CDC (Centers for Disease Control
and Prevention) e revisionate nel 2010, raccomandano lo screening
colturale, per evidenziare la colonizzazione da parte di GBS, tra la 35°
e la 37° settimana di gestazione e la profilassi antibiotica di tutte le
donne con esito positivo con β-lattamici come farmaci di prima scelta
(65). In altri Paesi, come la Germania e l’Inghilterra, viene eseguita la
chemioprofilassi solo in presenza di fattori di rischio (precedenti
gravidanze con nati affetti da infezioni invasive, particolari condizioni
ostetriche, ad esempio rottura prolungata delle membrane o febbre in
fase di travaglio) (6). Nonostante l’attuazione di strategie preventive
4
Capitolo Primo
Introduzione
abbia
ridotto
l’incidenza
delle
infezioni
è
stata
documentata
l’emergenza e la diffusione dell’antibiotico-resistenza, in particolare ai
farmaci di seconda scelta. In considerazione anche dei costi elevati
legati a screening e chemioprofilassi la ricerca è oggi rivolta verso lo
sviluppo di vaccini. Un vaccino coniugato trivalente, comprendente i
sierotipi Ia, Ib, III, e ora in fase II di studio clinico e il suo impiego
potrebbe essere molto utile per le attività preventive nei confronti
delle infezioni neonatali (82). Allo stato attuale la prevenzione delle
infezioni
rimane
comunque
legata
ad
una
corretta
profilassi
antibiotica, sebbene solo per le infezioni neonatali precoci (EOD) è
stato possibile osservare una riduzione dell’incidenza.
1.3
Distribuzione delle antibiotico-resistenze in S.
agalactiae
S. agalactiae viene tuttora considerato come sensibile ai farmaci βlattamici, nonostante prime segnalazioni di una ridotta sensibilità
alla penicillina G e ad altri β-lattamici siano state riportate in
Giappone dalla metà degli anni ’90. I primi isolati, raccolti tra il 1977
e il 2005, evidenziavano una ridotta sensibilità ai β-lattamici a causa
dell’accumulo di mutazioni a livello della PBP2X, ma recentemente è
stato osservato un alto livello di resistenza alle cefalosporine, dovuto
a mutazioni non solo a livello della PBP2X ma anche della PBP1A
(56).
5
Capitolo Primo
Introduzione
Molto più significativo e rilevante è il progressivo aumento della
resistenza ai farmaci di seconda linea, in particolar modo nei
confronti dell’eritromicina e della clindamicina. Questa tendenza
generale può essere rilevata in diversi studi realizzati negli ultimi
anni in paesi come Giappone, Brasile, Stati Uniti, Nuova Zelanda,
Australia e Francia.
Secondo dati del 2012, in Giappone la frequenza di ceppi resistenti si
aggira intorno al 12.8% per l’eritromicina e al 9% per la clindamicina;
alte percentuali di resistenza si osservano anche nei confronti di
levofloxacina (18.4%) e tetraciclina (46.5%) (95). In Nuova Zelanda e
in Australia il confronto di isolati GBS ottenuti in due differenti
periodi
(1992-1994;
2002-2004)
ha
mostrato
un
aumento
significativo negli ultimi anni della resistenza all’eritromicina e alla
clindamicina. Le percentuali di ceppi eritromicino-resistenti in Nuova
Zelanda e in Australia sono rispettivamente del 6% e 9% (22), 11-13%
in Brasile (68) e (12%-15%) in Italia (32), (55). In Francia la resistenza
all’eritromicina ha subito un incremento notevole passando da una
percentuale del 20.2% nel 2007 ad una del 35.3% nel 2010, con
elevata diffusione del sierotipo capsulare V (92). Un andamento
allarmante può essere, infine, osservato negli Stati Uniti: uno studio
effettuato a New York su ceppi ottenuti da donne in gravidanza con
colonizzazione vagino-rettale tra gli anni 2010 e 2011 mostra valori di
resistenza alla clindamicina pari a 38.4% e all’eritromicina pari a
50.7% (2).
6
Capitolo Primo
Introduzione
Per quanto riguarda la tetraciclina, è stato più volte riportato che la
maggior parte dei GBS è resistente a questo antibiotico, anche se
quest’ultima non viene presa in considerazione per la terapia. In uno
studio francese del 2003 veniva riportata una percentuale di
resistenza pari all’85% (72); si trattava di analisi condotte nell’arco di
2 anni (gennaio 1998-dicembre 1999) su ceppi isolati da pazienti
diversi e derivanti da svariate tipologie di campioni: urine, secrezioni
genitali di donne in stato di gravidanza e adulti in genere, emocolture,
liquido cefalorachidiano, pus di neonati. In Spagna sempre nel 2003,
sono stati riportati tassi di resistenza dell’85,2% (8). In Italia, uno
studio epidemiologico svolto nel 2007 e relativo a ceppi raccolti
durante gli anni 2002-2005 aveva riportato una resistenza del 68,1%
alla tetraciclina (45) ma nel 2011, lo stesso gruppo di lavoro
segnalava oltre il 93% di ceppi resistenti (55) denotando quindi un
incremento sostanziale; in questo lavoro i ceppi erano stati ottenuti
da campioni clinici (sangue o liquido cefalorachidiano), raccolti tra
febbraio 2005 e giugno 2008, appartenenti a neonati con infezioni ad
esordio precoce e tardivo (55). Uno studio del 2012 svolto, su ceppi
isolati da neonati, nel laboratorio di microbiologia dell’ospedale di
Tunisi mostra una resistenza alla tetraciclina pari al 97.3% (54).
Infine, in uno studio più recente in Egitto (86) la tetraciclinoresistenza era pari al 98%.
7
Capitolo Primo
Introduzione
1.4
Tetracicline, meccanismo d’azione e strategie di
resistenza
Le tetracicline, famiglia di antibiotici scoperti alla fine degli anni ’40,
sono molecole costituite da nuclei tetraciclici, fusi linearmente tra
loro, i cui capostipiti sono clortetraciclina e ossitetraciclina, derivati
naturali rispettivamente da Streptomyces aureofaciens e da S.
rimosus.
Successivamente
sono
stati
identificati
altri
tipi
di
tetracicline, sia molecole naturali prodotte da altre specie di
Streptomyces
(dimetilclortetraciclina),
sia
prodotti
semisintetici
(metaciclina, doxyciclina e minociclina).
Le tetracicline inibiscono la sintesi proteica impedendo l’associazione
dell’aminoacil-tRNA al ribosoma batterico (21); diversi studi hanno
indicato un unico sito di legame ad alta affinità per le tetracicline alla
subunità 30S.
Prima della metà degli anni ’50, la maggior parte dei batteri
commensali e patogeni erano sensibili alle tetracicline. Nell’ambito
della famiglia Enterobacteriaceae solo il 2% dei ceppi erano resistenti,
una piccola quota che rifletteva la pressione selettiva esercitata
dall’uso di questo farmaco nell’uomo (21). L’attuale resistenza alla
tetraciclina, oggi altamente diffusa tra batteri Gram-positivi e Gramnegativi,
è
da
considerarsi
un
evento
moderno,
dovuto
all’introduzione e all’uso, spesso smodato, di questi agenti anche in
medicina veterinaria e in zootecnia. La resistenza, largamente diffusa
in molti batteri commensali e patogeni, è dovuta all’acquisizione
8
Capitolo Primo
Introduzione
orizzontale di geni tet, che sono spesso associati ad elementi mobili,
quali plasmidi e/o trasposoni coniugativi (21) (79).
Sono stati individuati tre meccanismi di resistenza:

Efflusso attivo

Protezione ribosomiale

Inattivazione enzimatica
I geni codificanti le pompe di efflusso producono proteine, energia
dipendenti, associate alla membrana, capaci di esportare attivamente
l’antibiotico
fuori
dalla
cellula,
riducendone
la
concentrazione
intracellulare. Al momento sono noti 23 geni tet identificati in batteri
Gram-positivi, 3 da Streptomyces e 16 da batteri Gram-negativi. Tali
geni sono stati divisi in 6 gruppi in base all’identità della loro
sequenza aminoacidica; i principali diffusi nel genere Streptococcus
sono tet(K) e tet(L), inclusi nel Gruppo 2. Le proteine di efflusso Tet(K)
e Tet(L) conferiscono la resistenza a tetraciclina e clortetraciclina, ma
non a minociclina e alle glicilcicline, come il farmaco di ultima
generazione tigeciclina.
Al contrario, il meccanismo di protezione ribosomiale risulta più
efficace e conferisce una resistenza ad alto livello non solo alla
tetraciclina, ma anche a doxiciclina e minociclina. Le proteine di
protezione ribosomiale sono omologhe ai fattori di allungamento EFTu e EF-G e la maggiore omologia con questi prodotti è a livello della
regione
N-terminale,
che
contiene
il
dominio
GTP-legante.
Il
meccanismo di protezione ribosomiale agisce sia in vivo che in vitro e
9
Capitolo Primo
Introduzione
richiede membrane cellulari intatte. Il modello è basato sull’ipotesi
che in condizioni normali i ribosomi si trovano in una configurazione
standard e funzionano normalmente. Il sistema viene perturbato
dall’introduzione
della
tetraciclina
che
inibisce
il
ciclo
di
allungamento, bloccando la sintesi proteica. Si suppone che le
proteine di protezione ribosomiale interagiscano con un segmento
(h34) dell’RNA 16S, causando una distruzione allosterica del sito o
dei siti primari della tetraciclina, favorendo quindi il distacco di
queste molecole dal ribosoma, che ritorna al suo normale stato
conformazionale, consentendo il proseguimento della sintesi proteica
(79). Il sistema di protezione ribosomiale è stato sviluppato in base
agli studi svolti con due proteine, Tet(M) e Tet(O), che sono anche le
più diffuse tra i batteri. Per la similarità a livello aminoacidico è stato
assunto che altre proteine del “ribosomal protection group” [Tet(S),
Tet(T), Tet(Q), TetB(P), Tet(W), and Otr(A)] hanno la medesima attività
e interagiscono con tetraciclina e ribosomi in modo analogo. Anche in
questo caso la classificazione si basa sulla comparazione delle
sequenze aminoacidiche. I geni codificanti le proteine di protezione
ribosomiale includono tet(M), tet(O), tet(S), tet(W), otr(A), tetB(P), tet(Q),
tet(T) ed i più recenti geni tet(33) e tet(37).
Il meccanismo di inattivazione enzimatica della tetraciclina è mediato
dal gene tet(X), che codifica per una NADPH-ossidoreduttasi e dai
geni più recentemente scoperti, tet(37) e tet(35). Il gene tet(37) codifica
10
Capitolo Primo
Introduzione
per una NADPH-ossidoreduttasi, mentre tet(35) per un enzima simile
alla xantina-guanina fosforibosil transferasi (79).
Per
riassumere,
al
momento
sono
noti
38
differenti
tipi
di
determinanti di resistenza, comprendenti geni tet (resistenza alla
tetraciclina) e geni otr (resistenza alla ossitetraciclina). Di questi, 23
codificano per proteine di efflusso energia dipendenti, 11 per proteine
di protezione ribosomiale, 3 per enzimi che inattivano l’antibiotico e 1
tet(U) ha un meccanismo non ancora noto (79).
Nell’ambito degli streptococchi e degli enterococchi sono stati
segnalati due tra i meccanismi di resistenza noti: l’efflusso attivo,
mediato
prevalentemente
da
Tet(K)
e
Tet(L)
e
la
protezione
ribosomiale, ad opera delle proteine Tet(M), Tet(O), Tet(T) e Tet(S).
In S. agalactiae il gene tet(M) è sicuramente il più diffuso, meno
frequentemente si ritrova tet(O) che può essere da solo o, in alcuni
casi, presente insieme a tet(M). Già descritta, sebbene più rara, è la
dimostrazione della presenza contemporanea di tre distinti geni di
resistenza tet(L), tet(M) e tet(O) (72). Un terzo meccanismo di
protezione ribosomiale, mediato dal gene tet(T), originariamente
individuato in S. pyogenes, è stato individuato anche in S. agalactiae
(72). La maggiore diffusione del gene tet(M) in ceppi di GBS
tetraciclino-resistenti è confermata anche da studi epidemiologici
condotti in Italia (45) (55) dove la resistenza alla tetraciclina è
conferita, nella quasi totalità dei ceppi di GBS, dal solo gene tet(M), e
11
Capitolo Primo
Introduzione
solo di rado è possibile osservare il gene tet(O) da solo o in
combinazione con tet(M) e tet(O).
Il
gene
tet(M)
appartenenti
è
alla
caratteristicamente
famiglia
associato
Tn916/Tn1545
(76),
ad
la
elementi
famiglia
di
trasposoni più promiscua, con un ampio range di ospiti batterici sia
Gram-negativi che Gram-positivi. Gli altri geni tet possono essere
portati da altri elementi mobili, quali plasmidi, trasposoni o
trasposoni coniugativi che spesso possono veicolare altri geni di
resistenza agli antibiotici e/o ai metalli pesanti.
1.5 Macrolidi, meccanismo d’azione e strategie di
resistenza
I macrolidi sono una classe di antibiotici costituiti da un anello
lattonico macrociclico a 14, 15 o 16 atomi. L’anello lattonico può
presentare varie ramificazioni metiliche e può essere legato a due o
più
deossizuccheri
mediante
legami
glicosidici.
La
molecola
capostipite dei macrolidi è l’eritromicina, caratterizzata da un lattone
a 14 atomi di carbonio. Scoperta nel 1952, l’eritromicina è prodotta
naturalmente da Saccharolyspora erythraea, una specie batterica
appartenente
agli
attinomiceti
e
comunemente
nota
come
Streptomyces erythraeus. Al fine di ampliare lo spettro d’azione di tale
antibiotico sono stati prodotti derivati semisintetici (azitromicina,
claritromicina, chetolidi) con varie sostituzioni a livello del lattone; i
nuovi derivati sono molecole maggiormente stabili, con una migliore
12
Capitolo Primo
Introduzione
capacità di assorbimento e un numero inferiore di effetti collaterali
(78). I macrolidi sono oggi utilizzati nel trattamento delle infezioni
delle alte e basse vie respiratorie, della cute e dei tessuti molli, nella
cura
delle
Chlamydia
malattie
sessualmente
trachomatis,
trasmissibili
Treponema
pallidum,
urealyticum) e delle malattie causate da
(sostenute
da
Ureaplasma
Bordetella pertussis,
Campylobacter spp., Listeria monocytogenes. I macrolidi hanno come
bersaglio la subunità ribosomiale 50S; in particolare, essi legano
l’RNA ribosomiale 23S in corrispondenza del sito catalitico della
peptidil-trasferasi
e
impediscono
l’allungamento
della
catena
peptidica durante la traduzione. I primi meccanismi di resistenza nei
confronti dei macrolidi sono stati descritti nel genere Staphylococcus
qualche anno dopo l’introduzione in commercio dell’eritromicina ed
hanno poi interessato numerosi altri generi batterici. Il meccanismo
d’azione dei macrolidi è comune anche ad altre classi di antibiotici
quali lincosamidi e streptogramina di tipo B. I lincosamidi sono
derivati alchilici della prolina e sono sprovvisti dell’anello lattonico,
mentre le streptogramine sono composte da due fattori A e B, che
agiscono in sinergia e vengono prodotti dallo stesso microrganismo.
Macrolidi, lincosamidi e streptogramina B, pur avendo una differente
struttura chimica, condividono lo stesso target e sono spesso
considerati insieme con la sigla MLSB (macrolidi, lincosamidi,
streptogramina B) in quanto sono soggetti a fenomeni di cross-
13
Capitolo Primo
Introduzione
resistenza. Attualmente la resistenza MLSB è estesa a molti generi
batterici e consiste principalmente in:

Modificazione del bersaglio

Efflusso attivo dell’antibiotico all’esterno della cellula

Inattivazione dell’antibiotico

Mutazioni a livello del bersaglio
Degli 82 geni coinvolti nella resistenza MLSB, 36 sono denominati erm
(erythromycin
ribosome
methylation)
(http://faculty.
washington.edu/marilynr); essi codificano per enzimi noti come RNA
metiltrasferasi, i quali addizionano post-trascrizionalmente uno o due
gruppi metile ad un residuo di adenina (A2058 in Escherichia coli) a
livello dell’rRNA 23S. La modificazione del bersaglio che ne consegue
dà origine ad un fenomeno di cross-resistenza, in quanto riduce
l’affinità per il target non solo dei macrolidi ma anche dei lincosamidi
e della streptogramina B. Alcuni dei geni erm sono geni naturalmente
presenti nel genere Streptomyces e nelle specie di Mycobacterium
resistenti ai macrolidi. I geni erm descritti in questi due generi hanno
un contenuto in C+G di gran lunga superiore rispetto a quelli
ritrovati in altri generi (C+G maggiore del 70% nei primi, inferiore al
40% nei secondi). Tra i geni erm il più diffuso è l’erm(B), descritto in
un ampio range di microrganismi (Gram positivi, Gram negativi,
aerobi, anaerobi) e in molti diversi ecosistemi. La diffusione
dell’erm(B) è legata principalmente all’associazione dello stesso con
14
Capitolo Primo
Introduzione
elementi genetici mobili che possono essere trasferiti orizzontalmente
in modo intraspecifico e/o interspecifico. Il gene erm(B) è stato
identificato in trasposoni non coniugativi come Tn917 e Tn551, in
plasmidi ed in trasposoni coniugativi localizzati nei cromosomi. Il
primo esempio di traspone coniugativo recante il gene erm(B) è
Tn1545, che contiene anche il gene aphA-3, che codifica per la
resistenza alla kanamicina (29).
Il secondo tipo di gene erm molto diffuso è erm(TR), identificato in S.
pyogenes
(84),
incluso
nella
sottoclasse
erm(A)
(78).
Esso
è
ampiamente diffuso negli isolati di S. pyogenes ed in altre specie di
streptococchi β-emolitici, compreso S. agalactiae mentre è raramente
dimostrato in S. pneumoniae (96).
Infine, un altro gene erm è erm(T), sporadicamente rilevato in passato
negli streptococchi, è stato recentemente riportato in isolati non
clonali di S. pyogenes e S. agalactiae. In entrambe le specie, è stato
sempre localizzato in piccoli plasmidi strettamente correlati. Questo
ha generato l’ipotesi che, sebbene non auto-trasmissibili, i plasmidi
che veicolano il gene erm(T) possano diffondersi orizzontalmente
nell’ambito della popolazione streptococcica mediante mobilizzazione
in trans ad opera di altri elementi genetici mobili (67) (28).
In generale i diversi alleli erm presentano una diversa regolazione
dell’espressione
fenotipica,
la
quale
può
essere
costitutiva
o
inducibile. Mentre il determinante erm(B), largamente diffuso negli
streptococchi, può essere espresso costitutivamente o in seguito ad
15
Capitolo Primo
Introduzione
induzione ed è usualmente associato ad una resistenza di alto livello,
il gene erm(TR) è generalmente associato ad un fenotipo inducibile
(96).
I meccanismi sono stati ampiamente studiati negli stafilococchi (53).
Nel caso di un’espressione costitutiva, i ceppi sono resistenti a tutti
gli antibiotici macrolidi, lincosamidi ed alle streptogramine di tipo B
(fenotipo MLSB). Quando l’espressione è inducibile, i ceppi sono
resistenti ai macrolidi a 14 (eritromicina, roxitromicina, e spesso
l’oleandomicina) ed a 15 atomi di carbonio (azitromicina); rimangono
invece attivi antibiotici come i macrolidi a 16 atomi (spiramicina,
josamicina,
miocamicina
e
midecamicina),
i
lincosamidi
e
le
streptogramine di gruppo B. Il meccanismo alla base del fenotipo
inducibile, ampiamente studiato per il gene erm(C), descritto
originariamente sul plasmide stafilococcico pE194, prevede un
fenomeno
di
attenuazione
della
traduzione
(53).
L’espressione
inducibile o costitutiva della resistenza dipende dalla sequenza della
regione regolatrice, a monte del gene strutturale codificante per la
metilasi. Il gene strutturale e quello regolatore vengono cotrascritti in
un singolo mRNA, la cui traduzione può avvenire solo in seguito al
riconoscimento da parte del ribosoma delle due sequenze di ShineDalgarno (SD), localizzate a poche paia di basi di distanza dal codone
di inizio. In assenza di eritromicina, l’mRNA trascritto assume una
forma a stem-loop tale da rendere inaccessibile la SD2 al ribosoma e
impedendo la traduzione. In presenza di eritromicina, il legame
16
Capitolo Primo
Introduzione
dell’antibiotico
riarrangiamento
con
il
ribosoma
conformazionale
probabilmente
nell’mRNA,
induce
un
causando
il
dislocamento della struttura a stem-loop. Resa libera la SD2, essa
può essere riconosciuta dai ribosomi per l’inizio della traduzione della
metilasi (58).
Il metodo tradizionale fenotipico per lo studio dell’espressione
costitutiva o inducibile dei geni erm è noto come test del doppio
dischetto e prevede l’utilizzo di due soli antibiotici, eritromicina e
clindamicina. Come già riportato, nel fenotipo costitutivo (cMLSB) vi è
piena resistenza ad entrambi gli antibiotici. La formazione di un alone
di inibizione a “D” attorno al dischetto di clindamicina documenta
un’espressione di tipo inducibile (iMLSB) (58). Lo sviluppo di un
successivo test a triplo dischetto, ottenuto aggiungendo un dischetto
di josamicina (30 μg) ai due del test a doppio dischetto, eritromicina
(30 μg) e clindamicina (10 μg), ha consentito di classificare i ceppi
iMLS di S. pyogenes in 3 distinti sottogruppi: iMLS-A, iMLS-B e iMLSC (46). I ceppi iMLS-A sono altamente resistenti ai macrolidi a 14, 15
e 16 atomi di carbonio; i ceppi iMLS-B mostrano resistenza elevata
nei confronti dei macrolidi a 14 e 15 atomi di carbonio, sensibili ai
macrolidi a 16 atomi senza induzione e resistenti a josamicina dopo
induzione; i ceppi iMLS-C presentano bassi livelli di resistenza ai
macrolidi a 14 e 15 atomi (con incremento della resistenza dopo
induzione) e sensibilità ai macrolidi a 16 atomi di carbonio e
resistenza solo alla josamicina solo dopo induzione. Un ulteriore
17
Capitolo Primo
Introduzione
meccanismo di resistenza consiste nell’efflusso attivo dell’antibiotico
all’esterno della cellula attraverso l’utilizzo di pompe ATP-dipendenti
o di altri tipi di trasportatori (Major Facilitator Transporters).
La resistenza all’eritromicina mediata da sistemi di efflusso attivo è
dovuta prevalentemente alla presenza di geni codificanti delle pompe
proteiche, denominati geni mef. Negli streptococchi sono state
dimostrate diverse varianti, di cui le meglio caratterizzate sono mef(A)
e mef(E), che risultano distribuite in modo non omogeneo nell’ambito
degli streptococchi.
Il fenotipo conferito dalla presenza di un gene mef viene indicato
come fenotipo M ed è caratterizzato da un debole alone di inibizione
intorno
all’eritromicina
e
piena
resistenza
nei
confronti
della
clindamicina e della josamicina. Un ulteriore gruppo di geni di
resistenza è costituito da geni codificanti per enzimi in grado di
inattivare gli antibiotici. Attualmente tra questi troviamo enzimi
appartenenti alla classe delle esterasi, liasi, trasferasi e fosforilasi.
Infine la resistenza può essere legata allo sviluppo di mutazioni a
livello delle sequenze codificanti per il dominio V dell’rRNA 23S e dei
geni che codificano per le proteine ribosomiali L4 e L22 (41)(42).
Questo tipo di mutazioni sono clonali, essendo trasmesse alla cellule
figlie durante la replicazione, ma non sono trasmesse in senso
orizzontale tra ceppi o generi batterici differenti. Le mutazioni a livello
dell’rRNA 23S possono determinare un incremento della resistenza ai
macrolidi,
lincosamidi,
streptogramine
B,
telitromicina
e/o
al
18
Capitolo Primo
Introduzione
linezolid sia nei Gram-positivi che nei Gram-negativi (68)(91). Sono
state identificate mutazioni a vari livelli, ma la più comune è quella
presente nel dominio V con mutazioni nelle posizioni A2058 e A2059
(numerazione in E.coli) (97). Mutazioni a livello del bersaglio (rRNA
23S) portano gradualmente ad un incremento della resistenza
batterica, in funzione del numero delle copie mutate del gene
codificante l’rRNA 23S (80). Le mutazioni a livello delle proteine
ribosomiali
L4
e
L22
comprendono
cambiamenti
(inserzione/delezione) che portano all’aggiunta o all’eliminazione di
un amminoacido. Queste modificazioni, descritte sia nei Grampositivi che nei Gram-negativi, da sole sono responsabili di una
moderata diminuzione dell’efficacia di uno o più degli antibiotici del
gruppo MLSKO.
1.6
Integrative and Conjugative Elements (ICE)
Gli ICE sono elementi genetici mobili auto-trasmissibili in grado di
sintetizzare
autonomamente
sia
il
complesso
“macchinario”
necessario per la coniugazione, sia tutte le strutture coinvolte nella
regolazione e nel controllo della propria escissione dal cromosoma e
della loro propagazione orizzontale. Determinate condizioni possono
favorire l'escissione degli ICE dal cromosoma, a seguito della quale si
verifica la sua circolarizzazione, replicazione e trasferimento al nuovo
ospite attraverso il complesso di coniugazione. L’ICE si integra ,
19
Capitolo Primo
Introduzione
quindi, nel cromosoma ricevente e replica come parte di esso, mentre
una copia permane nella cellula donatrice nel cui cromosoma torna
nuovamente ad integrarsi (Figura 2).
Figura 2. Modello del ciclo funzionale di un integrative and conjugative
element (ICE).
a. Un ICE è normalmente integrato nel cromosoma di una cellula ospite e si
propaga attraverso la replicazione del DNA dell’ospite e la divisione cellulare. b. In
determinate condizioni, l’ICE si stacca (escissione) dal cromosoma formando un
intermedio circolare. c. L’intermedio circolare replica ed è trasferito attraverso
coniugazione ad una cellula ricevente; tutti i componenti necessari per la
coniugazione sono codificati dall’ICE. d. L’intermedio replicato si integra nel
cromosoma della cellula ospite. (85)
Questi elementi combinano quindi caratteristiche peculiari di altre
classi di elementi genetici mobili: i fagi (che si integrano e escindono
dal cromosoma, ma non sono trasmissibili via coniugazione), i
trasposoni (in grado di integrarsi nel cromosoma e di staccarsi da
esso, ma che non sono trasmessi orizzontalmente) e i plasmidi (per
definizione,
unità
replicative
indipendenti
che,
se
coniugativi,
possono trasferire da cellula a cellula).
Sulla base delle conoscenze attuali, gli ICE, a differenza dei plasmidi,
non possono però essere mantenuti in uno stato extracromosomico e
non sono dotati di replicazione autonoma (100).
20
Capitolo Primo
Introduzione
Con il termine di ICE si intendono tutti quegli elementi mobili,
integrativi
e
auto-trasmissibili
indipendentemente
dal
loro
meccanismo d’integrazione o di coniugazione: vanno pertanto inclusi
in questa categoria anche i trasposoni coniugativi, che spesso
integrano nel cromosoma ospite con una minima specificità di
sequenza consensus e possono trasferirsi sia intracellularmente che
da cellula a cellula.
In questa sorta di raggruppamento sono inclusi anche elementi che
dimostrano siti di integrazione molto più restrittivi, come l’ICE SXT
derivato da Vibrio cholerae, che è stato il primo MGE con proprietà
simili ad un ICE ad essere descritto nei Gammaproteobacteria (100).
Anche alcuni elementi, classificati come isole genomiche, [ICEclc e
l’ICEMlSym (100)] ricadono nella definizione di ICE.
La dimostrazione sperimentale di un ICE è spesso difficile, in quanto
questi elementi sono fisicamente collocati sul cromosoma batterico e
spesso non veicolano informazioni genetiche fenotipicamente evidente
(come ad esempio la resistenza ad un antibiotico). Pertanto, un
approccio tradizionale allo studio dell’HGT potrebbe non evidenziare
la presenza di questi elementi. Tuttavia, l’analisi di numerosi genomi
batterici completi ha dimostrato che gli ICE sono largamente diffusi
nel mondo microbico e che essi rappresentano una quota variabile di
DNA
che
può
contribuire
enormemente
all’adattabilità
e
alla
sopravvivenza batterica (51). In S. agalactiae addirittura i due terzi
21
Capitolo Primo
Introduzione
delle regioni di diversità genomica sono costituiti da ICE o elementi
ICE-correlati (100).
Gli ICE hanno in genere una struttura modulare, con cluster genici
che presiedono ad un determinato processo funzionale (18)(76).
Tutti gli ICE contengono tre distinti moduli che ne assicurano: (i) il
mantenimento
(maintenance
modules),
(ii)
la
disseminazione
(dissemination modules) e (iii) la regolazione (regulation modules)
(18). Pur avendo un ciclo di funzionamento e una struttura modulare
comune, gli ICE possono però distinguersi per alcune proprietà
elemento-specifiche.
Di
grande
rilievo
risulta
la
documentata
associazione tra singoli ICE e una vasta gamma di fenotipi, compresa
la resistenza agli antibiotici e ai metalli pesanti e la capacità di
degradare composti aromatici; ma interessanti sono anche la capacità
di colonizzare un ospite eucaristico, di fissare l’azoto (89) e di
promuovere la virulenza e la formazione di biofilm (40).
I
due
ICE
(trasposoni
coniugativi)
più
studiati
sono:
Tn916
originariamente identificato in Enterococcus faecalis e Tn1545
descritto per la prima volta in S. pneumoniae (24)(73).
1.7
Distribuzione degli ICE in S. agalactiae e il
concetto di pangenoma
Lo sviluppo a partire dagli anni ’80 di metodi di sequenziamento
genomico ha rivoluzionato l’approccio allo studio dei patogeni umani,
consentendo di acquisire nuove importanti conoscenze riguardo il
22
Capitolo Primo
Introduzione
genoma batterico. Analisi comparative di genomi microbici hanno
suggerito che una specie può essere descritta dal suo “pan-genoma”
(dal greco παν, “tutto”), che include un “core” condiviso da tutti gli
isolati appartenenti a quella specie e un “pool flessibile” variabile nei
diversi isolati. Questo significa che per comprendere a pieno la
complessità di una specie microbica non ci si può limitare alla
considerazione di un unico genoma ma si deve ricorrere al confronto
di un maggiore numero di isolati. In uno studio del 2005 è stato
confrontato il DNA totale di otto ceppi di S. agalactiae, rappresentanti
i 5 principali sierotipi che causano infezioni neonatali nell’uomo (Ia,
Ib, II, III, V). Un modello matematico, ottenuto dall’analisi dei dati,
mostra che, per ogni nuovo genoma sequenziato, una media di 33
nuovi geni ceppo-specifici possono essere addizionati al pan-genoma,
il quale viene quindi definito “aperto” (93). Lo studio rivela
un’organizzazione composita del cromosoma caratterizzata da uno
scheletro stabile in cui si inseriscono dalle 11 alle 14 regioni variabili,
molte delle quali sono rappresentate da elementi genetici mobili (17).
L’importante
ruolo
svolto
dall’HGT
nell’evoluzione
del
genoma
batterico di S. agalactiae può essere dimostrato dalla capacità dello
stesso di acquisire in vitro, mediante coniugazione, frammenti molto
ampi di DNA (da 21 kb fino a 334 kb). Inoltre l’analisi della
distribuzione dei polimorfismi nei genomi derivanti da isolati umani
mostra come ogni cromosoma è in realtà un mosaico di frammenti
con origine ancestrale differente (17). Uno studio del 2008 ha
23
Capitolo Primo
Introduzione
identificato in 8 genomi sequenziati di S. agalactiae 35 isole
genomiche corrispondenti a presunti ICE ed elementi correlati. Tra di
essi vi sono 13 ICE, 6 IME, 13 CIME e 4 altri elementi inseriti in 15
loci differenti . Molti di essi sono integrati in un unico sito specifico
che può essere localizzato alla estremità 3’ dei geni per i tRNA, a
livello di geni codificanti per proteine ribosomiali (rpsI, rpsL, o rpm-G)
o del gene guaA. Le isole genomiche identificate in questo studio
rappresentano i 2/3 delle 69 regioni di diversità evidenziate
nell’analisi comparativa dei genomi realizzata da Tettelin et al. Questi
dati non fanno altro che sottolineare l’importanza degli ICE nella
variabilità genetica dei differenti isolati di S. agalactiae, evidenziando
anche
il
coinvolgimento
dell’HGT
nel
trasferimento
intra
e
interspecifico di questi elementi (17).
1.8 ICE e resistenza alla tetraclina negli streptococchi
Tn916 viene considerato il prototipo dei trasposoni coniugativi sia
perché la sua struttura risulta conservata in numerosi elementi
genetici derivati (Tn1545, Tn3872, Tn3701, Tn5397, ecc.), sia perché
il suo meccanismo di trasferimento e di trasposizione sono tra i più
studiati e quindi meglio conosciuti.
Tn916 è un trasposone coniugativo di circa 18 kb all’interno del
quale sono presenti 24 ORF; esso è responsabile della diffusione del
determinante di resistenza alla tetraciclina tet(M), sia nei batteri
Gram-positivi che in quelli Gram-negativi (Figura 3). I geni necessari
24
Capitolo Primo
Introduzione
per la sua integrazione (int) ed escissione (xis) sono stati identificati
ed ampiamente caratterizzati: mentre il gene int è essenziale per
entrambi i processi, il gene xis è coinvolto solo nel processo di
escissione. La sua integrazione sembra avvenire
attraverso la
formazione di un intermedio circolare non replicativo che nell’ospite
può inserirsi in differenti siti cromosomici, generalmente ricchi in
adenine ed in timine (24).
Tn916 è stato identificato in oltre 35 diversi generi batterici, in
numerose specie all’interno di ciascun genere.
Il sequenziamento di diversi genomi, nonché un numero elevato di
studi e di ricerche sull’antibiotico-resistenza hanno messo in luce
l’esistenza di una vasta gamma di elementi genetici strettamente
correlati a Tn916, tanto da utilizzare spesso il termine di “Tn916
family” o “Tn916-like”. Tutti questi elementi condividono uno scaffold
comune a Tn916, comprendente i moduli per la regolazione e la
coniugazione, differenziandosi soprattutto per quanto riguarda il
contenuto di geni accessori (76)(77).
Questi elementi Tn916-like, spesso compositi, sono importanti
serbatoi molecolari dell’antibiotico-resistenza, in particolare della
resistenza all’eritromicina mediata dai determinanti erm(B) e mef(E).
(96).
25
Capitolo Primo
Introduzione
F ig ura 3 . Rapp re se nta z ione sche m a ti ca d i Tn 916 d i E. f ae cal is .
Nella specie Staphylococcus aureus il gene tet(M) è stato associato ad
un
elemento Tn916-like, denominato Tn5801 (25.8 kb). Esso
rappresenta una delle nove isole genomiche presenti nel genoma del
ceppo Mu50 (*Kuroda 2001,
isolato
clinico
giapponese
DDBJ accession no. BA000017), un
meticillino-resistente
e
vancomicino-
intermedio.
Tn5801 e Tn916 condividono diversi open reading frames (ORF) e
presentano un’organizzazione simile. A parte alcune ORF aggiuntive,
con funzioni largamente sconosciute, Tn5801 differisce da Tn916 per
un diverso modulo di ricombinazione (33). Una simile configurazione
è presente in un elemento denominato CW459tet(M) trovato in
Clostridium
perfringens
CW459
(73,
GenBank
accession
no.
AF329848). Trasposoni simili a Tn5801 sono stati dimostrati in altri
isolati umani di S. aureus (33)(59) ed in un solo caso è stata
dimostrata
la
propagazione
orizzontale
mediante
coniugazione
intraspecifica (33). Nell’ambito degli streptococchi, Tn5801-like è
stato successivamente dimostrato nel genoma di Streptococcus mitis
B6 (37), in diversi isolati clinici di S. agalactiae (64) e in un ceppo di
Streptococcus oralis (15).
26
Capitolo Primo
Introduzione
1.9 ICE e resistenza ai macrolidi negli streptococchi
Elementi che veicolano erm(B)
Fino ad un decennio fa, la conoscenza riguardo agli elementi genetici
responsabili
della
resistenza
all’eritromicina
era
limitata
alla
consapevolezza dell’esistenza di pochi plasmidi e trasposoni recanti il
gene erm(B), tra cui Tn917, identificato in E. faecalis (87) e Tn1545,
identificato in S. pneumoniae che contiene in associazione i
determinanti
per
la
resistenza
a
tetraciclina,
eritromicina
e
kanamicina (29). Negli anni successivi sono stati identificati e
caratterizzati vari elementi genetici che conferivano singole o multiple
resistenze agli antibiotici e con capacità di trasferimento a livello
intra- ed interspecifico. Gli studi si sono concentrati in particolare
sugli elementi portanti il gene erm(B) essendo l’allele più diffuso tra
tutte le specie di Streptococcus. Il già citato trasposone non
coniugativo Tn917 (5,614bp) e costituito da 5 open reading frames
(ORF), delle quali orf2 codifica per erm(B) , orf4 e orf5 codificano
rispettivamente per una resolvasi ed una trasposasi. L’esposizione a
basse concentrazioni di eritromicina promuove l’integrazione di
Tn917 in plasmidi coniugativi, rendendo pertanto possibile il
passaggio interspecifico di tale elemento (5). Successivamente è stata
dimostrata la presenza, in ceppi di S. pneumoniae eritromicinoresistenti, la presenza di un elemento composito denominato Tn3872
(23,6kb) derivante dall’inserzione di caratterizzata da Tn916 (Figura
4). Questo tipo di associazione è riscontrabile in altri elementi
27
Capitolo Primo
Introduzione
genetici, tutti derivati dall’inserzione di materiale genetico all’interno
della struttura portante caratterizzata da Tn916 tanto da parlare di
una vera e propria famiglia di elementi derivati, Tn916 family: ne
sono esempi i trasposoni Tn6002, Tn6003, Tn1545, Tn2010 e
Tn2017 (11)(19)(26)(27)(35)(36); Tn2010 e Tn2017 in particolare, sono
considerati dei dual gene system in quanto portano due determinanti
per la resistenza allo stesso antibiotico eritromicina, erm(B) e mef(E)
(36). A differenza di Tn3872 e Tn6002, i trasposoni coniugativi
Tn1545 (94) e Tn6003 (26) sono stati identificati solo in S.
pneumoniae e sono caratterizzati dalla presenza di due geni erm(B) e
da un cluster genico che conferisce resistenza ad aminoglicosidi e
streptotricina (aadE-sat4-aphA-3). I due elementi differiscono per
l’inserzione, in Tn6003, di una copia della sequenza di inserzione
IS1239 (1’245 bp) tra l’orf12 e l’orf13 (27) (Figura 4).
28
Capitolo Primo
Introduzione
Tn3872 (23.6 kb)
24 23 22
21
20
19 18 17
16
15
14
13
12
6 9’
tet(M)
21
20
tnpA
9’ 10 7 8 5 xis int
erm(B)
Tn917
Tn916 (18.0 kb)
24 23 22
3 tnpR
1
19 18 17
16
15
14
13
12
6 9 10 7 8
5 xis int
tet(M)
erm(B) element
Tn6002 (20.9 kb)
24 23 22
21
20F P0P1
P3
P4 19 18 17
16
15
14
13
erm(B)
12
6 9 10 7 8
5 xis int
tet(M)
MAS element
Tn6003 (25.1 kb)
24 23 22
21
sat4
aadE*
20F P0
erm(B)
P1
P3
P4
19 18 17
16
15
14
erm(B)
21
20F P0
12
6 9 10 7 8
5 xis int
tet(M)
1245-bp
insertion
Tn1545 (26.3 kb)
24 23 22
13
sat4 aphA–3 47
aadE*
erm(B)
P1
P3
P4
19 18 17
erm(B)
16
15
14
13
12
IS1239
6 9 10 7 8
5 xis int
tet(M)
Figura 4. Rappresentazione schematica degli elementi “Tn916-family”.
Elementi che veicolano erm(TR)
Gli elementi che veicolano il secondo gene erm più diffuso negli
streptococchi, erm(TR), sono stati estensivamente studiati in S.
pyogenes. Il gene erm(TR) è stato originariamente trovato in un ICE di
49 kb, chiamato ICE10750-RD.2 (7) il quale si integra a livello del
gene cromosomico hsdM. A monte del gene erm(TR) di ICE10750RD.2 sono presenti due sequenze che codificano per una ATP-binding
protein e per una permeasi di membrana, entrambi componenti di
un sistema ABC transporter; i prodotti di questi geni hanno
rispettivamente il 66,7% ed il 44,5% di identità nucleotidica con
TnrB2 e TnrB3 di Streptomyces longisporoflavus, i quali formano un
sistema di efflusso ATP dipendente che conferisce resistenza alla
tetronasina (7). A valle del gene erm(TR) è presente una sequenza
29
Capitolo Primo
Introduzione
codificante per una fosfotransferasi; il prodotto di questo gene ha il
25,6% di identità ed il 39,9% di similarità con gli ultimi 220
amminoacidi del gene aph di Legionella pneumophila conferente
resistenza alla spectinomicina (7). Questi risultati suggeriscono che
ICE10750-RD.2 potrebbe essersi originato a partire da organismi non
strettamente
correlati
con
gli
streptococchi
(7).
Anche
in
S.
pneumoniae, nonostante la rarità del gene erm(TR) in questa specie
(20) è stato identificato e caratterizzato un elemento genetico,
denominato Tn1806, il quale mostra sostanziali omologie con
ICE10750-RD.2, sia per quanto riguarda la sequenza nucleotidica sia
per l’aggancio cromosomico (20) (Figura 5).
1
3
2
5
4
7 9 11
13
6 8 10 12
14
15
17
16
19
18
21
20
23
22
25 27 29
26 28
24
31
30
33
35 37
32 34 36 38
39
41
40
ICE10750-RD.2
erm(TR)
S. pyogenes
MGAS10750 (ca. 49 kb)
ICESp1108
1
3
2
5
4
7 9 11 13
6 8 10 12 14
15
16
17 19
21
18 20
23
22
25
24
S. pyogenes C1
(ca. 45 kb)
Tn1806
27 29 31
28 30
33 35 37 39
32 34 36 38
40
erm(TR)
1
S. pneumoniae
AP200 (ca. 52 kb)
26
3
2
5
4
6
7 9 11 13 15
8 10 12 14
16
17 19 21
23
18
20 22
25
24
27
26
29
28
30
31 3335 37
3941 43 45 47
32 34 36
38 4042 44 46 48
49
50
erm(TR)
Figura 5.Rappresentazione schematica degli elementi genetici che veicolano il gene
erm(TR).
Sempre in S. pyogenes, alcuni anni prima della caratterizzazione di
ICE10750-RD.2 e di Tn1806, era stato osservato che il gene erm(TR)
isolato
da
ceppi
di
S.
pyogenes
con
resistenza
inducibile
all’eritromicina, poteva essere trasferito per coniugazione sia a ceppi
30
Capitolo Primo
Introduzione
di S. pyogenes che ad altre specie di batteri Gram-positivi riceventi
sensibili all’eritromicina, come S.pyogenes, Enterococcus faecalis e
Listeria innocua (47).
I risultati presentati in questo lavoro evidenziavano l’inserzione di
tratti di DNA con diverse dimensioni, a seconda del ceppo di S.
pyogenes utilizzato come donatore, suggerendo che erm(TR) era
veicolato da elementi genetici distinti. Analisi successive hanno
portato alla dimostrazione che nella specie S. pyogenes, esistono altri
due elementi genetici mobili (ICE) distinti da ICE10750-RD2 (7).
L’elemento denominato ICESp1108 è stato dimostrato in ceppi di S.
pyogenes con fenotipo iMLS-C di resistenza all’eritromicina e
tetraciclino-sensibili. ICESp1108 (45’456 bp) è costituito da 40 ORF,
di cui erm(TR) corrisponde all’orf28 (13). Dal punto di vista
dell’organizzazione strutturale, ICESp1108 è strettamente correlato a
ICE10750-RD.2 e Tn1806 (Figura 5), come dimostrato dall’elevata
identità genetica (>90%) a livello della sequenza nucleotidica. Tuttavia
differenze
significative
sono
dimostrabili
all’estremità
destra
dell’elemento: l’orf40 di ICESp1108, codificante per una ricombinasi,
sostituisce le ultime 3 orf di ICE10750-RD.2 e Tn1806, che nei due
elementi presentano un’identità nucleotidica elevata (95%), che
codificano per un sistema di ricombinasi non correlato in alcun modo
con l’enzima prodotto dall’orf40. Dal momento che gli enzimi di
ricombinazione che caratterizzano gli ICE sono generalmente specifici
per quanto riguarda il sito di integrazione, non sorprende che
31
Capitolo Primo
Introduzione
ICESp1108 presenti una diversa inserzione cromosomica, che non si
verifica a livello di hsdM, condiviso da ICE10750-RD2 e Tn1806, ma
la sequenza target è rappresentata dal gene rum di S. pyogenes,
codificante per una RNA uracilmetiltransferasi (13).
L’altro ICE, denominato ICESp2905, completamente distinto da quelli
descritti finora, è stato identificato in ceppi di S. pyogenes
eritromicino-resistenti con fenotipo iMLS-B e tetraciclino-resistenti
per la presenza del gene tet(O). ICESp2905 risulta maggiormente
correlato con un elemento identificato nel genoma di C. difficile 630
(Figura 6) (83).
Secondo le analisi i due geni di resistenza erm(TR) e tet(O) sono
localizzati in frammenti separati che si sono inseriti nel medesimo
scaffold rappresentato da una struttura clostridiale simile a quella di
ICECd630 determinando la formazione di una struttura complessa.
ICESp2905 (65’575 bp) presenta 61 ORFs, di cui erm(TR) costituisce
l’orf14 e tet(O) l’orf35. La dimostrazione che ICESp2905 può anche
presentarsi in una forma difettiva del frammento contenente l’erm(TR)
ha portato alla conclusione che questo elemento sia in realtà un
elemento
composito,
costituito
da
una
struttura
maggiore,
ICESp2906 (c.a. 53 kb), in cui è localizzato il gene tet(O) e da un ICE
di minori dimensioni che veicola il gene erm(TR) e che è stato
denominato ICESp2907 (c.a. 14,9 kb) (49).
32
Capitolo Primo
Introduzione
ICESp
2905 ( ~ 66 kb)
ICESp2905
kb)
1
3
2
5
4
7 9 11
13
6 8 10 12
16 18
15 17
20
22
19 21
24
23
26 28
25 27
30
29
32
31
34
37 39 41
36 38 40
33
erm(TR) fragment
43 45
42
44
47
46
49
48
51
50
52
53
55
54
56
57
59
58
tet(O) fragment
erm(TR) element
(ICESp2907)
Figura 6. Rappresentazione dell’elemento composito ICESp2905. L’elemento
maggiore, ICESp2906, di natura clostridiale (indicato in giallo) contiene il
frammento tet(O) (in blu) e ICESp2907 (in rosso) che veicola il gene erm(TR).
In base alla numerazione delle ORFs dell’elemento composito
completo ICESp2905, ICESp2907 occupa la posizione che si estende
dall’orf9 all’orf24. L’orf8, che mostra un’identità nucleotidica pari
all’80%
con
il
corrispondente
gene
presente
in
ICECd630,
rappresenta il sito di integrazione di ICESp2907 in ICESp2906. Il
gene erm(TR) (orf14) mostra 99% di identità nucleotidica con il gene
erm(TR) dell’altro elemento di S. pyogenes, ICESp1108; l’orf15 codifica
per
una
spectinomicina
fosfotransferasi
(99,8%
di
identità
nucleotidica con il corrispondente gene di ICESp1108), l’orf16 mostra
un’identità con la porzione iniziale del gene codificante per la citidina
deamminasi presente in ICE10750-RD.2. La porzione genica che va
dall’orf17 all’orf22 è simile ad una regione di ICE6180-RD.1, un
33
61
60
Capitolo Primo
Introduzione
elemento di circa 11 kb presente in S. pyogenes MGAS6180
(accession no. NC_007296). L’orf24, l’ultima orf del frammento
contenente l’erm(TR), codifica per una trasposasi (tndX).
Gran parte delle ORF facenti parte dello scaffold di ICESp2905 sono
simili a quelle di ICECd630. Tuttavia l’orf61 di ICESp2905 che
codifica per una ricombinasi sito-specifica, determina l’integrazione a
livello del gene rum, codificante per una RNA uracil-metiltrasferasi
(13) ; il medesimo sito di inserzione è condiviso anche da ICESp1108.
A conferma della caratterizzazione strutturale è stato dimostrato che
ICESp2907 è capace di escindersi da ICESp2905 e di trasferirsi
orizzontalmente per coniugazione tra ceppi appartenenti alla stessa
specie S. pyogenes. In particolari esperimenti eseguiti incrociando il
ceppo S. pyogenes iB21, che presentava un fenotipo iMLS-B e
contenente ICESp2905 con il ricevente S. pyogenes 402, con fenotipo
iMLS-C e contenente ICESp1108. L’analisi di sequenza di uno dei
transconiuganti ottenuti dimostrava la presenza di due copie di
erm(TR); una corrispondente alla orf28 di ICESp1108 e l’altra identica
all’orf14 di ICESp2905, compreso nell’ICESp2907. Quest’ultimo si era
inserito a livello dell’orf10 di ICESp1108, che contiene lo stesso core
site dell’orf8 di ICESp2905 e che, come già detto, rappresenta il sito
di integrazione di ICESp2907 (49) (Figura 7).
Al contrario di quanto descritto nella specie S. pyogenes, la situazione
in S. agalactiae è poco conosciuta: i dati di letteratura al momento
dimostrano che il gene erm(TR) non è molto diffuso in questa specie e
34
Capitolo Primo
Introduzione
per questo motivo i numerosi studi presenti si sono concentrati solo a
livello
epidemiologico,
considerando
in
particolare
l’eventuale
associazione con il fenotipo e il sierotipo capsulare. (72) (45).
Elementi che veicolano mef
La struttura genetica che tipicamente portante il gene mef(E) è
designata mega (macrolide efflux genetic assembly element), di cui
sono
conosciute
diverse
varianti.
L’elemento
mega,
scoperto
originariamente in S. pneumoniae (44), e successivamente in altri
streptococchi, compreso GBS (61) ha dimensioni variabili (5,4 o 5,5
kb); contiene 5 ORF (di cui mef(E) rappresenta la prima) e
caratteristicamente
presenta
molteplici
siti
di
inserzione
sul
cromosoma ospite, ma ha un’integrazione sito-specifica quando
all’interno del trasposone Tn916 (34). Difatti, è proprio la presenza di
mega in diversi elementi Tn916-like che determina la formazione di
una serie di strutture composite, tutte identificate in S. pneumoniae,
denominate Tn2009, Tn2010 e Tn2017 (77).
La prima struttura genetica portante mef(A), il trasposone difettivo
Tn1207.1 (7’244 bp),
fu identificata in S. pneumoniae (80). Gli
elementi genetici successivamente descritti in S. pyogenes, specie in
cui mef(A) è particolarmente diffuso, sono tutti di natura profagica.
Tn1207.3 (52491 bp) (81) e 10394.4 (58761 bp) (4)(5) presentano la
medesima inserzione cromosomica sito-specifica nel gene comEC; il
terzo profago, m46.1 (55172 bp), sempre identificato in S. pyogenes
(48), integra in un diverso gene cromosomico rum codificante per una
35
Capitolo Primo
Introduzione
23S
rRNA
uracilmetiltrasferasi
(12).
Un
elemento
correlato
a
Tn1207.3 è stato dimostrato anche in S. agalactiae (61).
Un’ulteriore variante allelica, mef(I), identificata inizialmente in S.
pneumoniae
(25)
è
portata
da
una
struttura
a
mosaico,
apparentemente non mobile, denominata 5216IQcomplex (30’505 bp)
(63). Esso è costituito da frammenti di trasposoni noti, Tn5252 e
Tn916 e da un nuovo elemento denominato IQ che contiene, oltre al
gene mef(I), il determinante per la resistenza al cloramfenicolo, catQ
(Figura 8). Elementi IQ derivati sono stati identificati di recente anche
in S. pyogenes (37) e in streptococchi orali (15).
1.10
Scopo della tesi
L’importanza clinica di Streptococcus agalactiae ß-emolitico di
gruppo B (GBS), caratteristicamente associato a gravi infezioni
neonatali, è attualmente in crescita come agente opportunistico
associato ad infezioni del tratto urinario e respiratorio, infezioni della
pelle e dei tessuti molli, batteriemie, endocarditi in soggetti defedati. I
-lattamici rappresentano i farmaci di prima scelta sia per la terapia
delle infezioni invasive, sia nella profilassi intrapartum delle donne in
gravidanza, dal momento che, nonostante alcune segnalazioni di
ridotta sensibilità alla penicillina, GBS è tuttora considerato sensibile
ad essa. Al contrario, la resistenza ai farmaci alternativi, come
macrolidi e lincosamidi, è in costante aumento in tutto il mondo.
36
Capitolo Primo
Introduzione
Gli
studi
epidemiologici
e
le
analisi
filogenetiche
sembrano
evidenziare l’emergenza di pochi cloni di successo, caratterizzati da
un’elevata eterogeneità in termini di acquisizione e scambio di
elementi genetici mobili.
Lo scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di studiare le
caratteristiche di resistenza di ceppi clinici di S. agalactiae isolati
nella Regione Marche. Considerata l’elevata capacità di scambio
operata dai ceppi batterici, sia a livello intra- che interspecifico, ma
prendendo anche atto dell’altrettanto elevata eterogeneità degli
elementi genetici che sono in continua evoluzione, ci siamo
concentrati sullo studio di elementi genetici coniugativi e integrativi
(ICE) recanti al loro interno geni di resistenza agli antibiotici. In
particolare sono stati identificati e caratterizzati diversi ICE che
veicolano i determinanti della resistenza all’eritromicina e alla
tetraciclina.
37
Capitolo Secondo
Materiali e Metodi
MATERIALI E METODI
2.1 Ceppi batterici
Una collezione di 225 ceppi di S. agalactiae, isolati da diversi
materiali clinici nel triennio 2010-2012 presso due ospedali regionali
(Ospedali Riuniti Umberto I di Ancona Torrette e Ospedale provinciale
di Jesi), è stata analizzata per la sensibilità all’eritromicina e alla
tetraciclina.
L’identificazione dei ceppi veniva confermata osservando la presenza
di ß-emolisi, mediante semina su idoneo terreno al sangue [Blood
Agar Base (BAB) addizionato con il 5% di sangue defibrinato di
montone] e saggiando la resistenza alla bacitracina. In tutti i casi
dubbi, ad esempio in presenza di un’emolisi poco visibile o assente, si
utilizzava il kit “SLIDEX Strepto Plus” (BioMerieux 69280 Marcy
l’Etoile – France), un test di agglutinazione al lattice che consente la
rapida identificazione del gruppo di Lancefield dei campioni in esame.
In breve, 3-5 colonie del ceppo erano emulsionate in 0,4 ml della
soluzione enzimatica per l’estrazione del polisaccaride C. Dopo 10
minuti di incubazione a 37°C, la reazione di agglutinazione era
saggiata emulsionando un’aliquota del campione estratto con i
reagenti specifici per i principali gruppi sierologici di Lancefield: A, B,
C, D, F e G. Ciascun reagente è costituito da particelle di lattice con
adesi anticorpi specifici per ogni antigene di gruppo. La reazione di
agglutinazione era visibile in seguito alla formazione di particelle di
colore blu.
38
Capitolo Secondo
Materiali e Metodi
2.2 Test di sensibilità agli antibiotici: antibiogramma e
MIC
Tutti i ceppi in esame sono stati saggiati, in un primo momento, per
la sensibilità a macrolidi, lincosamidi, tetraciclina e cloramfenicolo,
mediante il test di diffusione in agar in accordo con le direttive
proposte dal Clinical and Laboratory Standards Institute (23).
Per questa tecnica è stato utilizzando un terreno agarizzato Mueller
Hinton Agar (MHA), addizionato del 5% di sangue defibrinato di
montone e diversi antibiotici (eritromicina 15 μg, clindamicina 2 μg,
tetraciclina 30 μg, cloramfenicolo 30 μg),
tutti forniti dalla ditta
OXOID (Garbagnate, MI).
In breve, i ceppi in esame, dopo crescita overnight a 37°C su piastre
di agar sangue di montone al 5%, venivano sospesi in Mueller Hinton
brodo (MHB) sino a raggiungere una densità ottica (OD625) di 0,100,
corrispondente a circa 1 x 108 Unità Formanti Colonia per ml
(CFU/ml) e quindi uniformemente distribuiti sulla superficie di
piastre di Mueller Hinton Agar (MHA) contenenti il 5% di sangue di
montone. Per evidenziare il fenotipo di resistenza ai macrolidi (DDtest) dischetti di eritromicina e clindamicina sono stati posizionati al
centro della piastra ad una distanza di circa 15-20 mm, mentre i
dischetti di cloramfenicolo e tetraciclina ai lati opposti in modo da
non interferire con gli aloni di inibizione dovuti agli altri antibiotici. S.
pneumoniae ATCC 49619 era utilizzato come controllo di qualità in
39
Capitolo Secondo
Materiali e Metodi
tutti i saggi di sensibilità. Dopo una notte di incubazione (37°C, CO2
5%), veniva misurato il diametro (in mm) degli aloni di inibizione della
crescita (endpoint). I valori ottenuti erano, quindi, confrontati con
quelli delle tabelle di riferimento (breakpoint) per quella specie
batterica e interpretati secondo i criteri EUCAST e CLSI (23).
Le MIC a tutti gli antibiotici sono state determinate con il metodo
della
microdiluizione
in
brodo,
conformemente
a
quanto
raccomandato dal Clinical Laboratory Standards Institute (23). Come
terreno
di
coltura
è
stato
utilizzato
Muller-Hinton
II
(BBL
Microbiology System, Cocksville, Md) supplementato con il 3% di
sangue lisato di cavallo; l'inoculo era standardizzato in modo da
contenere 5 x 105 CFU/ml. Come ceppo di riferimento è stato usato
S. pneumoniae ATCC 49619.
2.3 Estrazione del DNA
L’estrazione del DNA totale è stata
GenEluteTM
eseguita mediante il kit
Bacterial Genomic DNA (Sigma Aldrich Co, St Louis,
USA) che fornisce reagenti specifici e colonnine in silice, in modo da
ottenere un DNA genomico purificato. L’estrazione è stata eseguita
seguendo
il
protocollo
fornito
dalla
casa
produttrice.
Per
la
preliminare preparazione del lisato i campioni, ottenuti da colture
microbiche cresciute overnight a 37 °C in Brain Heart Infusion (BHI),
previa centrifugazione (13.000 g per 2 minuti) erano sospesi in 200 µl
di Lysozime Solution contenente lisozima alla concentrazione finale di
40
Capitolo Secondo
Materiali e Metodi
45 mg/ml e incubati a 37°C per 3 ore. Al termine, venivano aggiunti
200 µl di Lysis Solution e 20 µl di Proteinasi K, per la procedura di
digestione (55°C per 10 minuti).
2.4
Reazione a catena della polimerasi (PCR)
Le prove di amplificazione del DNA sono state effettuate utilizzando lo
strumento “Gene Amp PCR System 9600 Thermal Cycler – Perkin
Elmer Applied Biosystem” e seguendo specifici protocolli a seconda
del tipo di amplificato cercato e delle coppie di primer utilizzate
(tabella 1). Le reazioni di extended PCR sono state condotte
utilizzando il sistema exTaq (TaKaRa Bio, Shiga, Japan) per
amplificati di dimensioni superiori a 3 kb, mentre in condizioni
standard è stata utilizzata la DreamTaq (Thermo Fisher Scientific,
Massachusetts, USA). Il DNA genomico estratto da ciascun ceppo di
S. agalactiae è stato testato, mediante PCR, per la presenza dei
determinanti di resistenza all’eritromicina erm(TR), erm(B) e erm(T),
mef(A/E) e alla tetraciclina tet(M) e tet(O) e successivamente per la
presenza di altri geni o regione geniche, utili a definirne l’eventuale
contesto genetico.
41
T abell a 1. Copp ie d i p r ime r u ti l i zz a te neg l i e spe rime nti d i PC R.
Gene/amplificato
Primer
Sequenza
Bibliografia
(5’  3’)
tet(M)
TETM3
ATGGAAGCCCAGAAAGGAT
66
TETM2
GAACTCGAACAAGAGGAAAGC
66
O19
GGTAAAGGGCATTTAACGAC
71
O20
CGATATTCTCGATTGACCCA
71
erm(TR)mar-for
AACTTGTGGAAATGAGTCAACGG
61
erm(TR)mar-rev
CAGAATCTACATTAGGCTTAGGG
61
tnpR
O21
CCAAGGAGCTAAAGAGGTCCC
71
tnpA
O22
GTCCCGAGTCCCATGGAAGC
71
int-for
GCGTGATTGTATCTCACT
41
int-rev
GACGCTCCTGTTGCTTCT
41
xis-for
AAGCAGACTGAGATTCCTA
2
xis-rev
GCGTCCAATGTATCTATAA
2
O15
GTACGTCCACCAATGTGG
71
O16
GCACGCTTCCACGAAAGGAG
71
J12
CCCATTGAAGACGCAGAAGT
26
J11
AAAAATCCCTACCGCACT
26
TN6-rev
CCATCAAACATTCATTCAGC
26
erm(B)
erm(TR)
Studio trasposone Tn917
Studio trasposone Tn916
int916
xis916
orf7-orf8
orf20-IR18–19
orf24-orf20
42
42
Gene/amplificato
Primer
Sequenza
Bibliografia
(5’  3’)
PCR mapping Tn5801
int5801
int5801 –tet(M)
int5801 –sav400
sav400-sav408
sav408-sav411
sav413-sav415
sav402-sav406
1812
GTCCATACGTTCCTAAAGTCGTC
33
1811
CCGATATTGAGCCTATTGATGTG
33
1812
GTCCATACGTTCCTAAAGTCGTC
33
TETM2
GAACTCGAACAAGAGGAAAGC
66
1812
GTCCATACGTTCCTAAAGTCGTC
33
400F
TACCGAAGAGTCCATCAAAC
64
400R
TCGTATTTCAAGGCTTCGTC
64
408F
ACTGGCTTATGGCGTTTCTC
64
408R
AATGTAGGGGCGACTTGATG
64
411F
GAGATTAGCAGAAGGTATTGTG
64
413R
AACACCGTTGTCGTCTCCAC
64
415F
TTCTCGTAACGGCTCCTATG
64
402R
GTAGTCGTAGTCATCAAAAGG
Questo studio
406F
TGAAGGAGGTAACGAGATTG
Questo studio
LJ967
CGTGAAGAAATCGCTAAAG
64
Tn5801.Sag inserzioni cromosomiche
SAG967 (guaA)
1811
CCGATATTGAGCCTATTGATGTG
33
sav411
int5801
CF1
TTCAAAGGAACAGAAGCGGG
64
SAG964
RJ964
GAAGTAGAAGAGAGCCATAG
64
1811
CCGATATTGAGCCTATTGATGTG
33
Ricerca forma circolare di Tn5801.Sag
int5801
43
43
Gene/amplificato
Primer
Sequenza
Bibliografia
(5’  3’)
Studio ICE1116.Sag
tndX
linkage erm(B)-tet(M)
linkage tet(M)-DDE-trasposase
linkage pSM19035-orf24
linkage pSM19035-Tn5397
PCR mapping di ICE1116.Sag
tndX1
ATGATGGGTTGGACAAAGA
Questo studio
tndX-inv
CTTTGCTCGATAGGCTCTA
14
ermB-R
CGATATTCTCGATTGACCCA
71
TETM3
ATGGAAGCCCAGAAAGGAT
66
TETM2
GAACTCGAACAAGAGGAAAGC
66
DDE-rev
TAAAGACTCAACGGTATCAAG
Questo studio
beta-rev2
ATCCCTTGGGCTTGTCGTTC
Questo studio
0294f1
GGGGATTATTTTGAACCTG
Questo studio
alpha-DIR
CACTCGCAGATTGGTTATTG
Questo studio
TETM3
ATGGAAGCCCAGAAAGGAT
66
Orf2-for
TTTTCCGAGTGCCGAAGGTGC
14
Orf11-rev
GCGTTACCCCTTTTTCTTTTCG
14
Orf12-for
GACGGTTCCACCATCATTTATC
14
Orf23-rev
CTTTTTCTTCACTCGTAACCGT
14
RepA
CAACTGTTTGGGTTTCCTAATG
Questo studio
Orf14R
GACCATAACTTCCTGATAAA
Questo studio
Orf14F
CTCAATCTTTTCAAGTAATG
Questo studio
O294-rev
ACATAACGACTAATAACACTC
Questo studio
F4
GAAGATTGGATAGTGGTTGAG
Questo studio
rpmH_GBS
TAGTTGACATACGGTGACGG
Questo studio
Rep_Gallo
TTTGCTCATACAGTCGTTCT
Questo studio
Sag1796
CTTGGTCGTGAGGTGTTATC
Questo studio
ICE1116.Sag inserzioni cromosomiche
44
44
Gene/amplificato
Primer
Sequenza
Bibliografia
(5’  3’)
Caratterizzazione genetica ICESp1108
int1108
linkage orf2-orf13
linkage orf15-orf20
linkage orf22/erm(TR)
linkage erm(TR)/orf32
orf40-for
TAAGAACTGGACTTTGGCTGG
Questo studio
thio-rev
GCTGCTTCTTGTATTCCTTT
Questo studio
ETR36
GAGAGCATTTCTATTGAAGCTAAAG
20
ETR57
AGTTCAATGTGGACACTTGGAC
20
ETR94
CTGTTCTTGGATATGTGATTAG
20
ETR99
GGTATTCCAACAGGTATAACAC
20
superfor3-for
AAGAGGGCGATAGTTGATTA
Questo studio
erm(TR)mar-rev
CAGAATCTACATTAGGCTTAGGG
61
erm(TR)mar-for
AACTTGTGGAAATGAGTCAACGG
61
Rum rev3
CCACAAGAAAAATCCTGAAG
Questo studio
ETR38
TGTAATAAACGACTCTCATAAGCC
20
ETR39
ATCCTTGATTGGATCTTCTAGA
20
ETR94
CTGTTCTTGGATATGTGATTAG
20
ETR99
GGTATTCCAACAGGTATAACAC
20
tndXF
AATGATGGAGTAGATACCTTTC
Questo studio
ICE6R
GTGCAATCCCACCAATACTCT
Questo studio
orf12GBS-for
CCCTCCGTATTATCTTTTGC
Questo studio
erm(TR)mar-rev
CAGAATCTACATTAGGCTTAGGG
61
erm(TR)mar-for
AACTTGTGGAAATGAGTCAACGG
61
orf20-rev
CCCTTAGATTTCTCTGGTCA
Questo studio
Caratterizzazione genetica ICE10750RD.2
int10750
linkage orf13-orf18
Caratterizzazione genetica ICESag2907
tndX
linkage orf12-erm(TR)
linkage erm(TR)-orf20
45
45
Gene/amplificato
Primer
Sequenza
Bibliografia
(5’  3’)
linkage orf20/tndX
orf20-for
TATCATACACAATAAAGGCAGC
Questo studio
ICE6R
GTGCAATCCCACCAATACTCT
Questo studio
7F
TGGATACTTTAAGAAGCGTG
Questo studio
10R
TAATCCCTAACTTGGTCTTCTG
Questo studio
tndXF
AATGATGGAGTAGATACCTTTC
Questo studio
25R
ACCTCTGAGTTCCATCCCAT
Questo studio
ICESag2907 inserzioni cromosomiche
46
46
Capitolo Secondo
Materiali e Metodi
2.5 Elettroforesi in gel di agarosio
I prodotti di amplificazione sono stati analizzati e separati mediante
elettroforesi su gel di agarosio all’1% in tampone TAE (Tris acetato
40mM; EDTA 2mM pH8). I campioni erano caricati sul gel previa
colorazione con 1X Track Dye, per il monitoraggio della corsa
elettroforetica. Al termine della procedura i campioni sono stati
visualizzati al transilluminatore UV previa colorazione con appositi
intercalanti del DNA (Green Gel oppure Bromuro di Etidio, 0,5
μg/ml). La stima della dimensione molecolare degli amplificati è stata
estrapolata in base a standard di riferimento, contenenti frammenti
di peso molecolare noto: lo standard 1 kb (range, 250-10000 bp), lo
standard 100 bp plus (range, 100-3000 bp) e infine lo standard 100
bp (range, 80-1031 bp).
2.6 Purificazione e sequenziamento
Per le analisi di sequenziamento tutti i prodotti di PCR erano
purificati mediante il sistema GenElute™ PCR Clean-Up Kit (SIGMA,
Aldrich)
seguendo
scrupolosamente
le
istruzioni
della
ditta
produttrice. La concentrazione del DNA ottenuto (in µg/ml) è stata
misurata mediante un metodo fluorimetrico (Qubit® invitrogen).
Il sequenziamento dei diversi prodotti di amplificazione era eseguito
presso il Servizio BMR Genomics di Padova. Tutti i prodotti di PCR
47
Capitolo Secondo
Materiali e Metodi
sottoposti ad analisi di sequenza erano preparati secondo le
procedure riportate sul sito (http://www.bmr-genomics.it).
Le sequenze ottenute venivano analizzate mediante il programma
freeware Chromas (PC) ottenuto dal sito BMR Genomics. Diversi
programmi disponibili online (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) sono
stati utilizzati per l’analisi delle sequenze ottenute, in particolare per
la ricerca di Open Reading Frames (ORFs) è stato utilizzato il
programma ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)
e per il confronto con le sequenze presente nel database i programmi
BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
2.7 Esperimenti di Coniugazione
Gli esperimenti di coniugazione sono stati condotti in vitro utilizzando
come donatori diversi ceppi di S. agalactiae e come riceventi S.
pyogenes 12RF e S. agalactiae 1357/11, resi mutanti resistenti a
rifampicina ed acido fusidico, e sensibili all’eritromicina (MIC ≤0.015
μg/ml) e alla tetraciclina (MIC 0,25 μg/ml). In qualche incrocio è
stato utilizzato un ulteriore mutante, derivato da S. pyogenes 12RF,
(SN04) resistente a streptomicina e acido nalidissico.
Per la procedura di coniugazione, colture overnight del donatore e del
ricevente in 10 ml di BH (37°C in 5% di CO2) erano opportunamente
diluite fino a raggiungere una OD675 di 0,4 e filtrate attraverso filtro
Millipore da 0,45 μm in un rapporto 1:2. Dopo incubazione di una
notte in agar sangue in atmosfera controllata (5% di CO2), il filtro è
48
Capitolo Secondo
Materiali e Metodi
stato lavato con 10 ml di soluzione fisiologica (SF), centrifugato a
8.000 rpm per circa 10 minuti e il pellet ottenuto è stato risospeso in
1 ml di SF. Sono state effettuate diluizioni seriali a partire dall’intero
fino a 10-7, usando provette contenenti appropriati volumi di
soluzione fisiologica. Per la selezione del donatore e del ricevente sono
stati distribuiti omogeneamente 100 μl delle diluizioni 10-5, 10-6, 10-7
su
piastre
contenenti
specifici
antibiotici
alla
concentrazione
adeguata, tutto il volume residuo è stato seminato per la selezione dei
transconiuganti. I donatori , i riceventi e i transconiuganti sono stati
selezionati con appropriate concentrazioni di antibiotico a seconda
del tipo di incrocio in esame. Dopo incubazione per 24-48 h sono
state contate le colonie cresciute su ciascuno dei terreni seminati, è
stata calcolata la media delle CFU/ml presenti e definita la frequenza
di trasferimento, in funzione del donatore o in funzione del ricevente.
2.8 PFGE
Le colture overnight di S. agalactiae sono state diluite in modo che il
contenuto di DNA fosse approssimativamente 5 μg/ml.
0,5 ml della sospensione batterica venivano mescolati con pari
volume di low-melting-point agarose all’1,6% e introdotti in appositi
stampi chiamati plug-mold per la formazione delle plug. Una volta
solidificate, le stesse venivano incubate per 24 ore a 37°C in 5 ml di
tampone di lisi contenente lisozima (1 mg/ml) e RNasi A (50 g/ml).
Seguiva un’incubazione di 48 ore a 50°C, in 3 ml di digestion buffer
49
Capitolo Secondo
Materiali e Metodi
contenente proteinasi K (0,5 g/ml). Le plug venivano lavate 3 volte
in 10 ml di TE buffer. Il DNA di metà plug era quindi digerito a 30°C
overnight, con 30 U di SmaI. La digestione veniva bloccata
trasferendo le plug in 1 ml di EDTA 0,5 M. Ciascuna plug veniva
posta poi su un “pettine supporto”, con 20 μl di low-melting-point
agarose all’1%.
La PFGE era effettuata in agarosio all’1% per 22 ore a 14°C e 6 V/cm
in una soluzione di TBE allo 0,5%, con initial switch time di 5
secondi, final switch time di 35 secondi e ramping factor lineare. A
corsa ultimata il gel era prima colorato per 30 minuti in Bromuro di
Etidio (0,5 g/ml) ed infine fotografato tramite illuminazione UV. La
dimensione delle bande ottenute e la qualità della corsa veniva
controllata utilizzando un campione standard (Low Range PFGE
Marker) che contiene frammenti di DNA da 0,13 a 194 kb.
Le
corse
elettroforetiche
sono
state
effettuate
utilizzando
l’apparecchiatura CHEF MAPPER XA SYSTEM della ditta BIORAD.
Una volta eseguita la foto, si può procedere all’interpretazione dei
profili genetici valutando il grado di correlazione tra i ceppi in esame.
I criteri interpretativi della PFGE affermano che se tra i profili genetici
non sono presenti differenze, allora i ceppi possono essere considerati
dei cloni. Se invece c’è una differenza di due o tre bande, determinata
da un singolo evento genetico, allora i ceppi sono fortemente correlati.
50
Capitolo Secondo
Materiali e Metodi
2.9
Southern blotting ed ibridazione.
I frammenti di macrorestrizione prodotti da SmaI, dopo essere stati
separati mediante PFGE, venivano trasferiti su una membrana di
nylon (Zeta-Probe; Bio-Rad, Hercules, California, U.S.A.) mediante la
tecnica del trasferimento capillare.
Le pre-ibridazioni sono state condotte per 2 ore a 42°C, in un
tampone Ultra-hyb (Ultrasensitive Hybridization Buffer. Applied
Biosystems).
Le
ibridazioni
sono
state
effettuate
nelle
stesse
condizioni overnight in presenza della sonda marcata con biotina,
specifica per il gene erm(TR), precedentemente denaturata a 100°C
per 10 minuti. Le membrane venivano quindi sottoposte ad una serie
di lavaggi di 15 minuti circa ciascuno e in condizioni stringenti, con
soluzioni di forza ionica decrescente così composte: SDS 0,1%, SSC
2X; SDS 0,1%, SSC 1X; SDS 0,1%, SSC 0,3X; SDS 0,1%, SSC 0,1X.
Le sonde utilizzate negli esperimenti di ibridazione, sono state
ottenute mediante PCR impiegando coppie di primer specifiche e il
DNA di ceppi noti. Gli amplificati venivano purificati direttamente
dalla miscela di reazione mediante il sistema GenElute™ PCR CleanUp Kit (SIGMA, Aldrich) e la marcatura veniva condotta per 45 minuti
sotto UV a temperatura ambiente con un kit Psoralen-Biotin,
BrightStar).
51
Capitolo Terzo
Risultati
RISULTATI
3.1 Caratterizzazione fenotipica e determinanti di
resistenza.
202 isolati su un totale di 225 GBS analizzati presentavano la
resistenza alla tetraciclina (89,8 %, MIC 64- >128 µg/ml), mediata dal
gene tet(M). La percentuale di resistenza ottenuta e la dimostrazione
del gene tet(M) concordano con quanto riportato in letteratura.
La resistenza complessiva all’eritromicina era del 28% (n. 63 isolati),
un valore che risulta più elevato rispetto ai dati segnalati da altri
autori in Italia (55). Utilizzando il test del doppio dischetto (DD test),
come raccomandato dai comitati CLSI ed EUCAST, i 63 ceppi EryR
sono stati ulteriormente distinti in base al fenotipo di resistenza agli
antibiotici MLSB. 54 ceppi mostravano un fenotipo costitutivo (cMLS),
6 un fenotipo inducibile (iMLS) e 3 un fenotipo M (Figura 7). I ceppi
con fenotipo cMLS avevano un range di MIC all’eritromicina di 2 >128; il carattere inducibile dei 6 ceppi mostranti fenotipo iMLS è
stato confermato valutandone le MIC di eritromicina, clindamicina e
josamicina senza e dopo induzione con eritromicina (0,05 g/ml).
Infine, i 3 ceppi con fenotipo M avevano MIC di 2 g/ml.
52
Capitolo Terzo
Risultati
A
B
C
Figura 7. Test del triplo dischetto, al centro un dischetto di eritromicina (15 µg/ml),
a destra la clindamicina (2 µg/ml) e a sinistra la josamicina (30 µg/ml). A. Fenotipo
costitutivo (cMLS); B. Fenotipo inducibile (iMLS); C. Fenotipo M.
Nell’ambito dei 54 GBS con fenotipo cMLS, 40 presentavano il gene
erm(B) e 13 il gene erm(TR); il ceppo rimanente, che non presentava
nessuno dei geni erm ricercati, è stato studiato in dettaglio per la
ricerca di mutazioni associate al bersaglio. Difatti in GBS 6342 la
resistenza cMLS è mediata da una mutazione puntiforme (A2058G) a
livello del gene che codifica per la subunità RNA ribosomiale 23S.
Tutti i 6 ceppi con fenotipo iMLS, eccetto uno, dimostravano il gene
erm(TR); il ceppo restante conteneva erm(T) come unico determinante
di resistenza all’eritromicina. Infine, i 3 ceppi con fenotipo M erano
positivi per la ricerca del gene mef(A/E). La distinzione tra le due
principali varianti mef(A) e mef(E), o di altre varianti già dimostrate
negli
streptococchi,
come
mef(I),
è
stata
ottenuta
mediante
53
Capitolo Terzo
Risultati
sequenziamento dell’amplificato ottenuto con la coppia di primer
MEF1-MEF2 (90). Tutti i 3 ceppi con fenotipo M presentavano la
variante
mef(E).
La
tabella
2
riassume
i
risultati
della
caratterizzazione fenotipica e della presenza dei geni di resistenza alla
tetraciclina e all’eritromicina ottenuti in questo studio.
Fenotipo
Macrolidi
cMLS (54)
MIC µg/ml
Ery
Cli
2 - > 128 > 128
iCli
Jos
Genotipo
Jos
> 128 16 - 32 32 - 64
erm(B) (40)
erm(TR) (13)
Mutazione (1)
A2058G
iMLS (6)
2- 4
≤0.12
> 128 0,25 - 1 1 - 32
erm(TR) (5)
erm(T) (1)
M (3)
2
mef(E) (3)
Tetraciclina
TET-R (202)
32 - > 128
Tabella 2. Caratteristiche fenotipiche
macrolidi e alla tetraciclina.
tet(M) (202)
e genetiche dei ceppi GBS resistenti ai
54
Capitolo Terzo
Risultati
3.2 Individuazione del contesto genetico che veicola il
gene tet(M).
Dal momento che il gene tet(M) è generalmente portato, anche negli
streptococchi, da elementi della famiglia Tn916 abbiamo esaminato
tutti i 202 ceppi di S. agalactiae TetR per la presenza del gene di
integrasi di questo elemento (int916). Inaspettatamente, non tutti i
ceppi presentanti tet(M) erano positivi per il gene intTn916. Questo
risultato sembrava suggerire la possibile presenza di un elemento
correlato a Tn916 con un diverso modulo di ricombinazione oppure di
un elemento non ancora noto, veicolante tet(M). A questo scopo,
abbiamo analizzato, mediante PCR, la presenza di regioni e/o moduli
genetici
funzionali
dell’elemento
–
ad
esempio
il
modulo
di
coniugazione - oltre al gene di integrasi già studiato. S. agalactiae
ATCC 2603V/R è stato utilizzato come controllo positivo per tutti gli
esperimenti di amplificazione come riferimento genetico per Tn916.
Circa due terzi dei ceppi esaminati presentavano un elemento con
una struttura simile a quella di Tn916. La quota restante (1/3) non
presentava nessuno dei marcatori Tn916.
55
Capitolo Terzo
Risultati
3.3 Identificazione
e
caratterizzazione
di
nuovo
elemento genetico che veicola il gene tet(M) in S.
agalactiae, Tn5801.Sag.
Il risultato ottenuto, vale a dire che 1/3 dei ceppi TetR avevano il gene
tet(M) non inserito in un Tn916, era davvero insolito, dal momento
che questo determinante di resistenza rappresenta, con pochissime
eccezioni,(75) il marcatore di questo trasposone.
Abbiamo ipotizzato che altri elementi genetici, portanti tet(M), diversi
da quelli consueti, potessero essere presenti nei ceppi di GBS.
L’analisi della sequenza del gene tet(M), ottenuta da uno dei ceppi
GBS in esame, evidenziava la maggiore identità nucleotidica con il
corrispondente gene di Staphylococcus aureus. La successiva ricerca
bibliografica ci ha permesso di evidenziare, in questa specie, che
tet(M) è veicolato da due tipi di elementi genetici mobili (33). Gli
autori riportavano che in isolati animali era presente un elemento
Tn916-like mentre negli isolati umani, oltre a Tn916, era presente un
elemento denominato Tn5801, identificato per la prima volta in S.
aureus Mu50 (57); si tratta di un elemento di 25 kb con
un’organizzazione in gran parte sovrapponibile a quella di Tn916,
contenente diverse ORF simili ad esso, ma differente per la presenza
di una ricombinasi sito-specifica distinta dai geni che in Tn916
svolgono le funzioni di integrazione/escissione (int/xis).
56
Capitolo Terzo
Risultati
Nonostante i due elementi abbiano una struttura simile, l’identità
nucleotidica tra le molte ORF in comune riflette la diversità dei due
elementi, andando da un minimo di 38,6% per il gene che codifica la
ricombinasi, ad un massimo di 73,3% per le ORF terminali che in
Tn916 corrispondono ai geni orf22 e orf23. Tn5801 contiene alcuni
geni addizionali con funzione non del tutto nota (sav415, sav414,
sav413, sav410, sav406 e sav404). Lo stesso elemento genetico è
stato identificato nel genoma di Streptococcus mitis B6 (37), un
batterio commensale residente delle alte vie respiratorie.
In base a queste premesse, utilizzando la coppia di primer 1811-1812
(33) (tabella 1)
abbiamo controllato la presenza del gene per la
ricombinasi sito-specifica di Tn5801 nei ceppi di GBS, con esito
positivo. Utilizzando come sequenze di riferimento sia quella originale
di S. aureus Mu50 (accession no. BA000017) sia quella di S. mitis B6
(accession no. FN568063) abbiamo quindi disegnato una serie di
primer
(tabella
1)
per
analizzare
in
maniera
più
estesa
ed
approfondita il nuovo elemento identificato nei nostri ceppi. Come
controllo positivo in tutti gli esperimenti di amplificazione è stato
utilizzato S. aureus Mu50. Dopo la dimostrazione della presenza del
gene di integrasi specifico per Tn5801 (int5801), abbiamo confermato la
sua associazione con il gene tet(M) (primer 1812-tetM2) e abbiamo
sequenziato il prodotto di amplificazione ottenuto. Il confronto delle
sequenze sul database segnalava una maggiore identità nucleotidica
con un elemento omologo individuato in E. faecalis 62 piuttosto che
57
Capitolo Terzo
Risultati
con quello di S. aureus Mu50. Le successive analisi di PCR e
sequenziamento
confermavano
questa
osservazione,
ossia
che
l’elemento posseduto dai nostri ceppi divergeva sia da Tn5801 di S.
aureus sia dall’elemento Tn5801-like individuato in S. mitis B6.
Infatti, primer specifici per rilevare i geni caratteristici di Tn5801 sav413, sav409 e sav408 – non producevano amplificati in nessuno
dei ceppi in esame. Il prodotto del gene sav413 di Tn5801,
corrispondente al locus smi1319 in S. mitis B6, codifica per una
proteina
UvrD
che
non
ha
alcun
omologo
corrispondente
nell’elemento presente in E. faecalis 62; i geni sav409 (smi1323) e
sav408 (smi1324) codificanti rispettivamente per proteine delle
superfamiglie P-loop-NTPasi e Rep-trans, risultano presenti nel
genoma di E. faecalis ma con una minor identità nucleotidica. Alla
luce delle nuove evidenze, abbiamo scelto di allestire un nuovo set di
primer (tabella 1) disegnati direttamente sulla sequenza di E. faecalis
62 (accession no CP002491) o in base alle sequenze ottenute con i
nostri ceppi. Combinando insieme i due set di primer è stata
realizzata la mappa dell’elemento individuato in S. agalactiae, che è
evidenziata in figura 8.
Gli amplificati ottenuti sono stati denominati in figura 8 con le lettere
A, B, C e D. Mentre gli ampliconi A, B e C erano delle dimensioni
attese
(rispettivamente di 7593 bp,
9330 bp, 3814 kb), nessun
amplificato è stato ottenuto con la coppia di primer per il segmento D:
58
Capitolo Terzo
Risultati
questi risultati confermavano l’assenza dei tre ORF terminali di
Tn5801 di S. aureus Mu50 (sav413, sav414, sav415).
I due ampliconi A e C
, ottenuti con le coppie di primer che
amplificano rispettivamente la regione tra l’integrasi int5801 e il gene
tet(M) (1812/400F, 7.593 bp) e i geni sav408-sav411 (408R/411F,
3.814 bp) sono stati sequenziati. Il confronto con le sequenze
depositate
nel
database
evidenziavano
il
96.5%
di
identità
nucleotidica con la porzione corrispondente in Tn5801 di S. aureus
Mu50 100% con il gene tet(M) di S. aureus; simili valori erano
rapportati
anche
per
l’elemento
Tn5801-like
di
S.
mitis
B6.
Sorprendentemente l’identità più alta 99,9%; tet(M) 100% era
ottenuta con un elemento identificato nel genoma di E. faecalis 62
(accession no CP002491), descritto come “Tn916 element” (10) e non
come Tn5801-like.
59
A
1812
408R
400F
B
400R
392 393 394 396
int 5801
int 5801
398
395 397
tet(M)
399 400
401
402
C
411F
409
410 412
D
415F
408F
403
404
405
407 408
406
411
97.1%
96.5%
sequenced region
(7,593 bp)
sequenced region
(3,814 bp)
tet(M)
413R
413
414
415
Tn5801
S. aureus Mu50
(~25.8 kb)
Tn5801.Sag
S. agalactiae 14774
(~20.6 kb)
Figura8. Rappresentazione schematica di Tn5801.Sag di S. agalactiae e strategia di PCR mapping seguita per i ceppi GBS. Le regioni
sequenziate ( 7,593 bp, sinistra, e 3,814 bp, destra) sono indicate dalle barre orizzontali. Tn5801.Sag viene confrontato con Tn5801 from
S. aureus Mu50, dove le ORFs sono numerate da sav392 a sav415 come accordato dalla designazione originale.
60
60
Capitolo Terzo
Risultati
I
risultati
confermano
una
configurazione
genetica
omologa
all’elemento individuato in E. faecalis 62 piuttosto che all’originale
Tn5801 di S. aureus. Il nuovo elemento genetico portante il gene
tet(M) e caratterizzato in S. agalactiae, è stato designato come
Tn5801.Sag.
Inserzioni cromosomiche di Tn5801.Sag
Dai dati di letteratura era noto che gli elementi Tn5801, di S. aureus
Mu50 e di S. mitis B6, sono inseriti a valle di un gene cromosomico
codificante una proteina coinvolta nella biosintesi delle purine, guaA.
Per trovare un gene corrispondente nella specie S. agalactiae abbiamo
utilizzato il ceppo ATCC 2603V/R come genoma di riferimento
(accession no AE009948) e abbiamo disegnato una nuova coppia di
primer
(guaA_GBS-F;
guaA_GBS-R)
sul
corrispondente
locus
SAG0967. Dopo aver confermato la presenza del gene cromosomico
guaA in tutti i ceppi in esame abbiamo controllato l’associazione tra
quest’ultimo e il gene int di Tn5801. Il prodotto di amplificazione
ottenuto mediante la coppia di primer LJ967/1811, indicato in figura
9 con la sigla LJ (left junction, ca 1200 bp) è stato ottenuto per tutti
gli isolati. Sempre utilizzando il genoma di ATCC 2603 V/R come
riferimento, abbiamo disegnato altri primer sui locus SAG0965 e
SAG0966, la cui amplificazione ha dato, però, esito negativo in tutti
gli isolati; i due geni infatti codificano per delle trasposasi IS1381 che
potrebbero non essere presenti in tutti i genomi. Pertanto abbiamo
61
Capitolo Terzo
Risultati
disegnato una nuova coppia di primer sul gene SAG0964, che risulta
essere conservato e presente in tutti i genomi di GBS. Utilizzando la
coppia di primer CF1/RJ964 (giunzione destra) (figura 9), è stato
ottenuto un amplificato di 1,4 kb in tutti i ceppi, tranne uno, in cui
le dimensioni erano di circa 1 kb. Gli amplificati delle due giunzioni
ottenute dal ceppo GBS 14774 sono stati sequenziati ed analizzati ed
è stato possibile, quindi, determinare le regioni di inserzione
cromosomica di Tn5801.Sag.
Left junction
Right junction
Chromosome
(2603 V/R)
Tn5801.Sag
Tn5801.Sag
Chromosome
(2603 V/R)
int 5801
LJ967
1811
1,228 bp
CF1
RJ964
1,414 bp
Figura9. Tn5801.Sag è integrato all’estremità 3’ del gene guaA. Questo gene è
stato individuato in tutti i genomi sequenziati di S. agalactiae e corrisponde alla
ORF967 di S. agalactiae 2603V/R.
I risultati di sequenziamento confermano l’inserzione sito-specifica di
Tn5801.Sag al 3’-end del gene guaA a livello di una sequenza target
di 11 nucleotidi (GAGTGGGAATA) identica a quella ottenibile da
analisi in silico di Tn5801 di S. aureus Mu50.
Contemporaneamente, utilizzando una coppia di primer divergenti
EF62circ1 e 1811, situati alle estremità dell’elemento Tn5801,
abbiamo controllato la formazione di un intermedio circolare,
62
Capitolo Terzo
Risultati
purtroppo con esito negativo in tutti gli isolati. Questo risultato
sembrava evidenziare un deficit funzionale dell’elemento stesso,
essendo questa molecola il primo step indispensabile perché possa
verificarsi un trasferimento genetico orizzontale.
Evidenza di una variabilità strutturale di Tn5801.Sag.
La sequenza parziale di Tn5801.Sag non fornisce indicazioni in grado
di
spiegare
la
non
funzionalità
dell’elemento
stesso.
Difatti,
nonostante ripetuti tentativi, non è stato mai dimostrabile un
intermedio
circolare
né
il
trasferimento
orizzontale
mediante
coniugazione. Sono stati, quindi, presi in esame alcuni dei ceppi che
presentano il Tn5801.Sag e abbiamo focalizzato la nostra attenzione
sulla
regione
centrale,
dal
momento
che,
per
analogia
con
l’organizzazione del trasposone Tn916, contiene gran parte del cluster
genico coinvolto nella coniugazione. La struttura della regione
centrale, parzialmente caratterizzata in precedenza mediante la
coppia di primer 400R/408F è stata ulteriormente analizzata
utilizzando nuovi primer specificatamente disegnati sulla sequenza di
riferimento di S. aureus Mu50 (tabella 1).
Utilizzando la coppia 400R/402F gli amplificati ottenuti da tutti i
GBS contenenti Tn5801.Sag erano comparabili rispetto all’amplificato
ottenuto nel controllo positivo, S. aureus Mu50 (3911 bp). Al
contrario, utilizzando la coppia 402R/406F, si evidenziava una certa
eterogeneità. Con quest’ultima coppia di primer sono stati ottenuti
63
Capitolo Terzo
Risultati
due diversi amplificati di dimensioni molecolari maggiori rispetto a
quelle attese per S. aureus Mu50 (3023 bp): una metà dei ceppi GBS
mostravano amplificati di 3,4 kb e l’altra metà di 4,5 kb (Figura10).
Alcuni prodotti sono stati purificati e sottoposti a sequenziamento.
L’analisi delle sequenze evidenzia che in tutti i ceppi la sav404 di
Tn5801 di S. aureus Mu50 è sostituita da un altro gene di dimensioni
maggiori (1026 bp) il cui prodotto (341 aa) non presenta nessun
dominio conservato e pertanto la sua funzione è al momento
sconosciuta. L’ORF ha comunque 99% identità ed una positività del
100% con il corrispondente gene EF62_0526 di E. faecalis 62.
402
403
404
405
406
S. aureus
Mu50
~ 3 kb
402R
406F
45,6%
S. agalactiae
~ 3,4 kb
22068
EF62_0526
S. agalactiae
~ 4,5 kb
15387
EF62_0526
IS256
Figura 10. Rappresentazione schematica della variabilità genetica dei Tn5801.Sag:
(1) S. aureus Mu50 (amplificato 3023-bp). Il gene sav404 è indicato dalla freccia
bianca e rappresenta il controllo positivo per Tn5801; (2) S. agalactiae 22068
(amplificato di ~ 3,4 kb) in cui sav404 è sostituito da una ORF di dimensioni
maggiori identica a EF62_0526 di E. faecalis 62 (freccia gialla); (3) GBS 15387
(amplificato di ~ 4,5 kb). Una copia di IS256 (freccia arancione) è inserita tra i geni
ORF EF_0526 (freccia gialla) e sav403.
64
Capitolo Terzo
Risultati
Il materiale supplementare presente negli amplificati di 4,5 kb
corrisponde ad una sequenza d’inserzione IS256 (1167 bp, 388 aa)
che dal confronto con altre sequenze disponibili nel database è
diffusa in diversi generi low GC% Gram-positive, in particolare in
diverse specie di Staphylococcus ed Enterococcus, sia a livello
cromosomico che plasmidico.
Tipizzazione molecolare dei ceppi contenenti Tn5801.Sag.
La relazione genetica tra i ceppi , in cui è stata studiata la variabilità
della regione centrale del Tn5801.Sag, è stata analizzata mediante
digestione con SmaI e PFGE. I profili di macrorestrizione dimostrano
che, a parte 3 campioni che risultano geneticamente identici
all’interno del cluster A, la presenza del trasposone Tn5801.Sag non è
dovuta alla diffusione di uno o pochi cloni. L’analisi molecolare ha
evidenziato 14 pulsotipi, raggruppati in 7 cluster (A-G) sulla base del
cut-off di 70% di similarità (Figura 11). Un solo isolato è risultato non
tipizzabile.
65
Capitolo Terzo
Risultati
22068
19450
A
523896
1109
14701
16076
B
15004
19230
15098
C
14819
15387
14606
14613
D
14774
14796
19369
E
22283
F
14813
G
24214
NT
Figura 11. Il dendrogramma mostra la relazione genica di 19 isolati di S. agalactiae
che veicolano il trasposone Tn5801.Sag.
Esperimenti di trasferibilità.
Nonostante l’assenza di un intermedio circolare, evidenziato dai
precedenti esperimenti di amplificazione con primer divergenti
specifici, abbiamo eseguito alcuni esperimenti di coniugazione con lo
scopo di verificare la mobilità di Tn5801.Sag. Diverse evidenze in
letteratura infatti suggerivano la possibilità che un ICE possa
sfruttare altri sistemi di secrezione presenti nell’ospite per la propria
mobilità orizzontale. Tre ceppi di S. agalactiae recanti Tn5801-like,
geneticamente distinti in base al profilo SmaI-PFGE, sono stati scelti
come donatori per incroci intraspecifici e interspecifici, utilizzando
come riceventi i ceppi di S. agalactiae 1357-11RF e di S. pyogenes
12RF. Tutti gli incroci hanno dato esito negativo, confermando un
66
Capitolo Terzo
Risultati
difetto funzionale dell’elemento, già evidenziato dalla mancata
formazione della struttura circolare.
3.4 Individuazione del contesto genetico che veicola il
gene erm(B).
E’ noto in letteratura che diversi elementi genetici sono responsabili
della diffusione di erm(B) negli streptococchi, che rappresenta di gran
lunga il determinante di resistenza all’eritromicina più frequente. Un
primo screening è stato eseguito sui 40 ceppi GBS erm(B)-positivi per
la ricerca del trasposone Tn917 (5,2 kb), utilizzando primer di
letteratura (O21/O22, tabella 1 , 70) che marcano i due specifici geni
di trasposizione, tnpA e tnpR. 30 ceppi GBS sui 40 totali hanno dato
risultato positivo, con un amplificato atteso di circa 1,5 kb. Tuttavia,
negli streptococchi, Tn917 è generalmente inserito all’interno di
elementi derivati dalla famiglia Tn916, formando elementi compositi
come il ben noto Tn3872, dimostrato dapprima in S. pneumoniae (62)
e successivamente in S. pyogenes (11) e S. agalactiae (70). Mediante
esperimenti di amplificazione usando specifiche coppie di primer di
letteratura (62) abbiamo potuto individuare un elemento Tn3872-like
in tutti i ceppi GBS nei quali era già stata evidenziata la presenza di
Tn917.
I restanti 10 isolati GBS erm(B) positivi sono stati saggiati per la
presenza di un secondo gruppo di elementi compositi derivati da
Tn916, diversi da Tn3872, nei quali è comunque dimostrabile
67
Capitolo Terzo
Risultati
l’associazione tra erm(B) e tet(M). Si tratta di due elementi descritti in
S. pneumoniae (26) denominati Tn6002 e Tn6003, che differiscono
essenzialmente per la regione genica portante erm(B) che, in entrambi
gli elementi, si inserisce, tra i geni orf19 e orf20 della struttura
comune Tn916. La ricerca, utilizzando, anche in questo caso, primer
di letteratura (26) ha dato esito negativo: in altre parole, nessuno tra i
10 isolati conteneva un elemento correlato a Tn6002 (o Tn6003).
Questo risultato era abbastanza singolare, dal momento che Tn6002
rappresenta il trasposone coniugativo erm(B)-carrying maggiormente
diffuso in S. pneumoniae, (26), ma è rappresentato anche in S.
pyogenes (11) e in diversi altri streptococchi (15). Un terzo tipo di
elemento genetico in cui è presente la classica associazione
erm(B)/tet(M) è stato descritto in S. pyogenes (11), inizialmente
denominato Tn1116 e, in seguito al completo sequenziamento,
ridefinito come ICESp1116 (14). Si tratta di un elemento composito,
in cui erm(B) è incluso in un frammento (ca. 7 kb) del plasmide
pSM19035 di S. pyogenes, adiacente ad un frammento del trasposone
Tn5397 di Clostridium difficile che porta tet(M); la ricombinazione
sito-specifica di Tn5397 è mediata da un gene distinto (tndX) diverso
da int/xis di Tn916. In ICESp1116 è inoltre presente una copia di
IS1216V che causa la delezione del gene tet(M), che pertanto risulta
non espresso. La ricerca di questi marcatori (tndX e IS1216V)
nell’ambito dei 10 ceppi ancora da caratterizzare, sempre utilizzando
68
Capitolo Terzo
Risultati
primer specifici di letteratura (14), ha dato esito positivo in 1 solo
isolato (GBS 16685).
3.5 Identificazione
e
caratterizzazione
di
nuovo
elemento genetico che veicola il gene erm(B) in S.
agalactiae, ICE1116.Sag.
Le analisi preliminari suggerivano la presenza, in GBS 16685, di un
elemento correlabile a ICESp1116, nonostante importanti differenze a
livello dell’antibiotico-resistenza dimostrata nelle due specie. Difatti,
mentre nell’ICESp1116 il gene strutturale tet(M) è silente ed il gene
erm(B) determina un fenotipo inducibile, nell’elemento contenuto in
GBS, riferito in questo studio ICE1116.Sag, il gene tet(M) è
pienamente espresso ed il gene erm(B) è responsabile di un fenotipo
costitutivo. Utilizzando come riferimento la sequenza disponibile di
ICESp1116 (accession no. HE802677) abbiamo seguito inizialmente
la strategia utilizzata dagli autori (14) per eseguire una mappatura
dell’intero
elemento
ICE1116.Sag,
mediante
reazioni
di
amplificazione. Il ceppo S. pyogenes A-3 è stato utilizzato come
controllo
in
tutti
gli
esperimenti
molecolari.
I
risultati
sono
rappresentati in figura 12.
Amplificati sono stati ottenuti solo con le quattro coppie di primer
(0294F1/ß-rev2; α-dir/M3; M2/DDErev; ermBr/M3) che rilevano i
geni da orf24 fino a orf45 (secondo la numerazione delle ORF in
ICESp1116). Nessun risultato è stato ottenuto con le due coppie di
69
Capitolo Terzo
Risultati
primer restanti (ORF2-for/ORF11-rev; ORF12-for/ORf23-rev).
La regione compresa tra le ORF24 e ORF45 (che codifica per una
DDE trasposasi) di ICESp1116 è stata ulteriormente analizzata.
Utilizzando primer che marcano i geni di resistenza erm(B) e tet(M)
(ermBr/M3; tabella 1) è stato ottenuto un amplificato con dimensioni
maggiori (ca. 3,5 kb) rispetto a quelle attese per il ceppo S. pyogenes
A-3 (2,7 kb); la parziale sequenza di questo amplificato ha confermato
la presenza di una copia di IS1216V inserita a monte del promotore e
della sequenza leader di tet(M), precisamente all’interno del gene
corrispondente alla orf13 di Tn916, al nucleotide 11341 (in base alla
numerazione di Tn916, accession no. U09422). La diversa inserzione
giustifica non solo le maggiori dimensioni dell’amplificato ottenuto,
ma anche la piena funzionalità del gene tet(M) nel ceppo S. agalactiae
che, come anticipato, è tetraciclino-resistente.
70
2644 bp
ermBr M3
8326 bp
-dir
11230 bp
ORF2-for
2
1
4
3
9
5
6
8316 bp
11490 bp
ORF11-rev ORF12-for
7
8
101112 13
14
M3
ORF23-rev
16 18
15 17 19 20
0294F1
22
21 23
24
6808 bp
ß-rev2
26
25
27
29
28 30
M2
31
32 34
37
40 42
33 35 36 38 39 41 43
45
E
DD
Rep
ORF14F
dX
16236 bp
44
tn
tM
te 16V
12
IS B
m
er
9987 bp
DDE_rev
0294-rev
ORF14R
Figura 12. Struttura di ICESp1116 del ceppo di riferimento S. pyogenes A-3 (accession no. HE802677) e strategia di PCR mapping seguita
per S. agalactiae 16685. La numerazione e il colore delle ORF sono quelli riportati in letteratura (14): le ORF di colore rosso rappresentano il
frammento di Tn5397, quelle blu il frammento di pSM19035. Al di sopra dell’elemento sono indicati i primer utilizzati e le dimensione dei
relativi prodotti di amplificazione attesi per ICESp1116. Sono evidenziati i principali geni di resistenza, la sequenza di inserzione IS1216V, i
geni che codificano le due ricombinasi tipiche dell’elemento ICESp1116 (tndX e DDE trasposasi). Infine, le due coppie di primer indicate in
rosso (al di sotto dell’elemento) rappresentano un’ulteriore analisi dell’elemento presente in S. agalactiae 16685.
71
71
Capitolo Terzo
Risultati
La
presenza
dei
due
frammenti
adiacenti
che
caratterizzano
ICESp1116, vale a dire il frammento di pSM19035 e il frammento di
Tn5397, è stata analizzata utilizzando appropriate combinazioni di
primer (tabella 1). Per l’analisi della regione compresa tra i geni tet(M)
e DDE trasposasi è stata utilizzata la coppia di primer M2/DDE-rev:
le dimensioni dell’amplificato ottenuto (ca. 6,8 kb) sono comparabili
al ceppo di controllo S. pyogenes A-3 (6808 bp), suggerendo una
medesima
configurazione
delle
ORF
(figura
12).
Combinando
opportunamente primer sul gene erm(B) e sul frammento pSM19035
sono stati ottenuti amplificati con le stesse dimensioni ottenute per il
ceppo di controllo. I risultati ottenuti dalle analisi di PCR-mapping
evidenziavano che l’elemento individuato in GBS 16685 aveva una
configurazione identica al modello di ICESp1116 descritto in S.
pyogenes (14).
Gli amplificati
ottenuti con le coppie
alpha-DIR/M3 e beta-
rev2/0294gallo-f2 (entrambi di ca. 8,5 kb) sono stati parzialmente
sequenziati. Le sequenze ottenute con la prima coppia confermano i
risultati già ottenuti, per quanto riguarda la posizione della IS1216V
e la presenza dell’orfα (corrispondente al gene ORF29 dell’elemento di
S. pyogenes). Molto interessante è la sequenza ottenuta con il primer
0294gallo-f2
che
marca
un
gene
funzionale
dell’ICE
stesso
(codificante l’enzima DNA primasi) che presenta la maggiore identità
nucleotidica (99%) con i corrispondenti geni individuati in elementi
genetici di due ceppi di GBS (S. agalactiae ni1122, accession no.
72
Capitolo Terzo
Risultati
KC460338 e S. agalactiae 2584, accession no. KC492042). In
entrambi i casi si tratta di una nuova famiglia di elementi descritti
solo di recente in S. agalactiae che utilizzano un diverso sistema di
ricombinazione, mediata da un enzima DDE trasposasi (50). La
sequenza ottenuta con il primer beta-rev2 evidenzia la presenza di
entrambe le orf30 e 29 di ICESp1116 (corrispondenti alle proteine α e
ß codificate da pSM19035), ma non della orf28 (codificante per una
proteina ipotetica), sostituita, in ICE1116.Sag, da un altro gene che
dimostra l’88% di identità nucleotidica con un ORF presente nel
database dei genomi di GBS. Interessante è che tale gene è stato
individuato in 5 genomi diversi dai due indicati in precedenza e tutti,
nuovamente, contenenti un elemento con una DDE trasposasi. Presi
insieme, i nostri risultati evidenziano che, nell’elemento individuato
in GBS 16685, i frammenti di pSM19035 e Tn5397 sono inseriti in
tandem all’interno di un elemento genetico maggiore che possiede la
stessa configurazione di ICESp1116, ma che presenta una sequenza
nucleotidica differente, vale a dire uno scaffold tipico della specie S.
agalactiae.
Integrazione cromosomica dell’elemento ICE1116.Sag
In S. pyogenes, ICESp1116 si integra a livello del gene cromosomico
rpmH, che codifica per la proteina ribosomiale L34. Per studiare se
tale
inserzione
cromosomica
fosse
confermata
anche
per
ICE1116.Sag, abbiamo prima di tutto individuato un gene omologo
nel genoma di S. agalactiae, mediante analisi in silico del database. Il
73
Capitolo Terzo
Risultati
genoma del ceppo ATCC 2603V/R (accession no. AE009948) è stato
utilizzato come riferimento molecolare sia per analizzare la putativa
regione di integrazione di ICE1116.Sag nel cromosoma di S.
agalactiae, sia per costruire primer specifici per le successive analisi
di amplificazione e sequenziamento. Le regioni fiancheggianti il gene
rpmH (corrispondente al locus SAG1793) comprendono, a monte,
l’operone DltDCBA, costituito da 6 ORF (SAG1787-SAG1792),
coinvolto nell’incorporazione del residuo di D-alanina nell’acido
lipoteicoico e, a valle, tre ORF (SAG1794, SAG1795, SAG1796) che
codificano rispettivamente per una proteina di membrana, una
trasposasi appartenente alla famiglia IS30 e una proteina ABC (ATPbinding cassette) (figura 13). Le coppie di primer Rep_Gallo/SAG1796
e F4/rpmH-GBS (tabella 1) sono state utilizzate per amplificare
rispettivamente la regione di integrazione cromosomica sinistra ( 5,0
kb) e destra ( 3,1 kb). Il parziale sequenziamento degli amplificati
ottenuti conferma l’integrazione dell’elemento ICE1116.Sag nella
regione intergenica compresa tra i geni rpmH e SAG1794 (figura 13).
74
Capitolo Terzo
Risultati
Giunzione sinistra
Giunzione destra
Cromosoma ICE1116.Sag
ICE1116.Sag Cromosoma
(2603 V/R)
(2603 V/R)
17
90
91
17
92
17 3
9
17
94
17
95
17
96
17
tA
dl
H
m
rp
E
dX
DD
tn
N
A_
p
re
SAG1796
 5,0 kb
Rep_Gallo
F4
 3,1 kb
rpmH
Figura 13. Integrazione di ICE1116.Sag. L’elemento si integra a monte del
terminale 5’ del gene rpmH (che codifica per la proteina ribosomiale L34). Tale gene
è conservato in tutti i genomi di S. agalactiae e corrisponde alla ORF SAG1793 di S.
agalactiae 2603V/R (accession no. AE009948), da cui deriva la numerazione delle
ORF cromosomiche, indicate in figura con delle frecce bianche. I geni appartenenti
all’ICE1116.Sag sono indicati in azzurro.
Nel
complesso,
l’organizzazione
strutturale
dell’elemento
ICE1116.Sag, ottenuta mediante procedure di PCR mapping e
sequenziamento e l’analisi della regione cromosomica di inserzione
evidenziano una similarità con un elemento denominato TnGBS2.5,
identificato in S. agalactiae ni1122, (accession no. KC460338) (50).
Tale elemento è caratterizzato dalla presenza di un gene codificante
una DDE trasposasi e risulta inserito a monte del gene rpmH, in
maniera analoga a quanto dimostrato sia per ICESp1116 di S.
pyogenes A3 che per ICE1116.Sag di S. agalactiae 16685. La figura
14 illustra il confronto tra le sequenze dei due elementi di riferimento,
per i quali è disponibile la sequenza completa: ICESp1116 di S.
pyogenes (14) e TnGBS2.5 di S. agalactiae (50).
75
Capitolo Terzo
Risultati
E’ evidente in figura che, nonostante i due elementi abbiano in gran
parte una medesima organizzazione delle ORF, le regioni in cui
l’identità nucleotidica è superiore al 90% sono poche e tutte
localizzate nella metà destra, che comprende anche il gene codificante
la DDE trasposasi. Questa osservazione suggeriva che i risultati
negativi ottenuti nei precedenti esperimenti di PCR mapping potevano
essere considerati dei falsi negativi, essendo stati condotti con primer
disegnati sullo scaffold di S. pyogenes. Pertanto, la regione che è
spiccatamente divergente (ORF2-ORF24 di ICESp1116) è stata
analizzata de novo, utilizzando come riferimento la sequenza di
TnGBS2.5 per disegnare una nuova coppia di primer sul gene orf14
di
ICESp1116.
Come
atteso,
utilizzando
le
coppie
di
primer
Rep/ORF14R e ORF14F/0294 (tabella 1 e figura 12), sono stati
ottenuti amplificati il cui sequenziamento è tuttora in corso, per
definire la regione corrispondente ai geni orf5, orf6 e orf7 in
ICESp1116. La dimensione molecolare di ICE1116.Sag è stata
stimata in ca. 50 kb.
76
Capitolo Terzo
Risultati
2
1
4
3
9
5
6
7
8
10
11
12 13
14
16 18
15 17 19 20
22
21 23
24
26
25
27
29
28 30
31
32 34
37
40 42
33 35 36 38 39 41 43
ermB tetM
rpmH
44
45
tndX DDE
IS1216V
78%
90%
90%
95%
rpmH
LPXTG motif
IS256 DDE
Figura 14. Confronto tra ICESp1116 di S. pyogenes A-3 (in alto) (accession no
HE802677) (14) e TnGBS2.5 di S. agalactiae ni1122 (in basso) (accession no.
KC460338) (50). Le aree in grigio evidenziano la similarità tra i due elementi;
l’identità nucleotidica è riportata (in percentuale) al centro della regione di
similarità.
Esperimenti di coniugazione
La mobilità orizzontale di ICE1116.Sag è stata studiata utilizzando le
due specie riceventi S. agalactiae 1357RF e S. pyogenes 12RF. In tutti
gli esperimenti coniugativi la selezione per il donatore è stata eseguita
con eritromicina (10 µg/ml), mentre per il ricevente con acido fusidico
e rifampicina (10 µg/ml) e tutti e tre gli antibiotici alla medesima
concentrazione (10 µg/ml) per la selezione dei transconiuganti. Tali
esperimenti hanno dimostrato la possibilità di un trasferimento
orizzontale dell’elemento sia a livello intraspecifico che interspecifico.
Le
frequenze
di
trasferimento
[espresse
come
numero
di
transconiuganti (CFU) per ricevente] erano di 5,27 x 10-7 nell’incrocio
intraspecifico e di 1,03 x 10-6 nell’incrocio interspecifico.
I transconiuganti selezionati da ciascun incrocio sono stati studiati
77
Capitolo Terzo
Risultati
dal punto di vista fenotipico e molecolare seguendo le strategie
descritte per il ceppo donatore GBS 16685.
Tutti i transconiuganti sono resistenti alla tetraciclina e ai macrolidi,
presentano una copia dell’ICE1116.Sag, inserita invariabilmente nella
regione intergenica a monte del gene rpmH. Ma è interessante notare
che nell’incrocio interspecifico i transconiuganti di S. pyogenes
ottenuti avevano tutti indistintamente un fenotipo cMLS, a differenza
della situazione evidenziata in ceppi naturali di S. pyogenes (11) dove
ICESp1116 è associato ad un fenotipo inducibile (iMLS-A).
3.6 Individuazione del contesto genetico che veicola il
gene erm(TR).
In S. agalactiae, nonostante diversi lavori abbiano evidenziato la
presenza del gene erm(TR), sottoclasse erm(A), non è mai stata
riportata la descrizione degli elementi associati ad esso. Pertanto, i 18
ceppi eritromicino-resistenti, erm(TR) positivi, sono stati saggiati per
la presenza dei geni di ricombinazione dei diversi elementi (tabella 1)
circolanti in S. pyogenes: 10750RD.2 (7), ICESp1108 e ICESp2905
(13) (49) e dell’unico elemento individuato in S. pneumoniae, Tn1806
(20), specie in cui il gene erm(TR) è isolato assai di rado. Dal
momento che Tn1806 e 10750RD.2 sono correlati e condividono il
medesimo modulo di ricombinazione e l’integrazione cromosomica
sito-specifica, in questo lavoro verrà riportato solo 10750RD.2 come
elemento di riferimento.
78
Capitolo Terzo
Risultati
5 ceppi sono risultati positivi alla ricerca dei tre geni di integrasi che
caratterizzano due elementi correlati, ICE10750-RD.2 di S. pyogenes
e Tn1806 di S. pneumoniae (int10750); 5 avevano il gene int di
ICESp1108 (int1108); 3 ceppi dimostravano la presenza del gene tndX
di
ICESp2907
(tndX2907)
ma
erano
negativi
per
int
di
ICESp2905/ICESp2906, un risultato che sembrava suggerire la
presenza di un singolo elemento ICESp2907-like, vale a dire non
inserito nello scaffold di ICESp2905. Nei restanti 5 ceppi non è stato
dimostrato nessun gene di integrasi noto.
Successivamente ogni gruppo di ceppi, distinto in base al rispettivo
gene int, è stato analizzato mediante mappatura genetica utilizzando
appropriate coppie di primer che marcano regioni specifiche di
ciascun ICE (tabella 1).
3.7 Analisi della correlazione genetica dei ceppi
erm(TR) positivi
La relazione genetica tra i 18 ceppi portanti erm(TR) è stata studiata
mediante tipizzazione SmaI-PFGE. I risultati sono illustrati in figura
15.
Profili
identici
16076/331/3921,
sono
stati
2106/16891,
ottenuti
per
24715/10185,
i
ceppi
di
GBS
12253/2009.
7
campioni presentavano un fenotipo unico (5236 – 15781 – 10415 24075 – 3585 –21912 - 24814). Il campione 2106 aveva un profilo
strettamente correlato con quello del principale gruppo clonale
costituito dai 3 ceppi 16076, 331, 3921; 18709 e 21861 erano
79
Capitolo Terzo
Risultati
strettamente correlati tra loro, ma distinti da tutti gli altri profili. Nel
complesso pertanto è stato possibile identificare 14 genotipi distinti.
L’analisi molecolare, dopo digestione con SmaI e PFGE, ci ha
permesso di costruire un dendrogramma, in cui si evidenzia la
presenza di 14 pulsotipi. I pulsotipi sono raggruppati in 6 cluster
sulla base del cut-off di 70% di similarità (Figura 15).
A
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12 13
14 15 16 17 18
Figura 15.(A) Tipizzazione molecolare mediante SmaI-PFGE condotta sui 18 ceppi
di S.agalactiae erm(TR) positivi. M, low range PFGE marker; 1, 331; 2, 2009; 3,
2106; 4,3585; 5, 3921; 6, 5236; 7, 10185; 8, 10415; 9, 12253; 10, 16076; 11,
16891; 12,18709; 13, 21861; 14, 21912; 15, 24075; 16, 24715; 17, 24814 e 18,
15781.
80
Capitolo Terzo
Risultati
B
A
B
C
D
E
F
Figura 15. (B) Il dendrogramma mostra la relazione genica di 18 isolati di S.
agalactiae che veicolano il erm(TR).
3.8 Elementi correlati a ICE10750-RD.2/Tn1806 e
ICESp1108.
ICE10750-RD.2 e ICESp1108 sono sostanzialmente simili, essendo
la principale differenza legata alla diversa integrazione sito-specifica,
determinata da tre geni di ricombinasi in ICE10750-RD.2 e da un
unico gene per ICESp1108. Per questo motivo gli esperimenti di PCR
mapping sono stati condotti con tutti i ceppi positivi per entrambe le
integrasi ed utilizzando le stesse coppie di primer.
Il primo passo per la caratterizzazione consisteva nel dimostrare
l’associazione tra erm(TR) e il gene int dell’elemento di riferimento.
Tuttavia, i prodotti attesi per gli elementi di riferimento erano di
81
Capitolo Terzo
Risultati
dimensioni troppo grandi (16 kb e 12 kb per ICE10750-RD.2 e
ICESp1108 rispettivamente) per essere amplificati anche con il
sistema Extaq. Perciò abbiamo utilizzato altre due coppie di primer
per valutare l’inserzione di erm(TR) nell’elemento, controllandone
l’associazione con geni funzionali dello scaffold come i geni codificanti
per un’elicasi e una relaxasi (primer: superfor3/ermTRMar-rev;
ermTR-Marfor/rum-rev3,
risultavano
delle
tabella
dimensioni
1).
attese
Gli
amplificati
rispetto
agli
ottenuti
elementi
di
riferimento (6 kb con la coppia superfor3/ermTRMar-rev; 4 kb per la
coppia
ermTR-Marfor/rum-rev3) e confermavano la presenza di
erm(TR) all’interno dello scaffold dei rispettivi elementi (Figura 16).
La regione prossimale dei due elementi, vale a dire la porzione che si
estende dal gene codificante per una replication protein fino al gene
che produce una DNA topoisomerasi di tipo III è stata analizzata
utilizzando le seguenti coppie di primer: (i) ETR36/ETR57, per
evidenziare rispettivamente il gene rep (corrispondente all’orf2 in
entrambi gli elementi di riferimento) e un gene codificante per una
hypothetical protein (orf12 in ICESp1108 e orf10 in ICE10750-RD.2) e
(ii) ETR99/ETR94 che identifica la regione dal gene codificante una
hypothetical protein (orf14 in ICESp1108 e orf13 in ICE10750-RD.2)
fino al gene per la DNA topoisomerasi (orf20 in ICESp1108 e orf18 in
ICE10750-RD.2). Mentre con la seconda coppia ETR99/ETR94 si
otteneva un amplificato di ca. 8 kb, più o meno corrispondente ai
prodotti attesi per ICE10750-RD.2 (7,3 kb) e ICESp1108 (8 kb), con la
82
Capitolo Terzo
Risultati
coppia ETR36/ETR57 gli amplificati ottenuti erano di ca. 10 kb
(Figura 16), un valore pari a quello ottenibile in Tn1806, che
nonostante la stretta correlazione con ICE10750-RD.2, come già
riportato, presenta comunque delle regioni variabili (20). In ogni caso,
abbiamo voluto escludere la presenza, in questa regione, di
un’eventuale copia supplementare di erm(TR), dal momento che in S.
pyogenes
questa
eventualità
è
stata
già
riportata
per
ceppi
transconiuganti ottenuti in laboratorio (49)
A
2
ETR36
12 14
20
6,7 kb
ETR57
22
28
32
40
6,3 kb
8 kb
superfor3
ETR94
ETR99
erm(TR)mar rev
4 kb
erm(TR)mar for
Rum rev3
B
2
10
13
7,3 kb
ETR36
ETR57
18
20
26
30
39
40 41
6,3 kb
superfor3
7,3 kb
ETR99
erm(TR)mar rev
ETR94
erm(TR)mar for
4 kb
Rum rev3
Figura 16. PCR-mapping di ICESp1108 (A) e ICE10750-RD.2 (B).
83
Capitolo Terzo
Risultati
Inserzione
cromosomica
degli
elementi
ICE10750-RD.2
e
ICESp1108
In S. pyogenes ICE10750-RD.2 e ICESp1108, si integrano in maniera
sito-specifica in due geni cromosomici diversi, rispettivamente, hsdM
che codifica per un sistema di modificazione-restrizione di tipo I e rum
che codifica per una metiltransferasi 23S rRNA. La ricerca in silico di
un gene omologo a hsdM nel genoma di S. agalactiae non ha prodotto
risultati, mentre è presente un omologo del gene rum, che risulta
essere conservato in tutti i genomi di GBS presenti nel database (sia
completi o ancora da assemblare). Specifici primer sono stati
disegnati sul gene rum di GBS, usando come riferimento la sequenza
genomica di ATCC 2603V/R (accession no. AE009948.1), al fine di
analizzare l’inserzione cromosomica in tutti i ceppi in esame che
dimostravano un elemento correlato a ICESp1108. La sequenza
dell’amplificato ottenuto (2,7 kb) ha confermato, anche per gli
elementi di S. agalactiae correlati a ICESp1108, l’inserzione sitospecifica nel gene rum.
Esperimenti di coniugazione.
Gli esperimenti di coniugazione sono stati eseguiti utilizzando come
donatori alcuni ceppi rappresentativi di S. agalactiae, che in base alla
caratterizzazione
precedente
dimostravano
elementi
correlati
a
ICESp1108 e ICE10750-RD.2. S. pyogenes 12RF e S. agalactiae
1357-11RF sono stati nuovamente utilizzati come riceventi.
84
Capitolo Terzo
Risultati
Nonostante i diversi tentativi, non sono stati ottenuti transconiuganti
in nessuno degli incroci eseguiti. Il difetto di trasferimento è stato
confermato dal mancato ottenimento di un intermedio circolare dei
rispettivi elementi ICESp1108-like e ICE10750-RD.2-like.
I nostri risultati sembrano in contrasto con quanto riportato in
letteratura, almeno per quanto riguarda ICESp1108 (13).
3.9 Individuazione e caratterizzazione di un elemento
correlato a ICESp2907.
Nei tre ceppi in cui è stata riscontrata la presenza del gene tndX, che
codifica una serina ricombinasi, coinvolta nella ricombinazione sito
specifica
di
ICESp2907,
abbiamo
inizialmente
controllato
se
quest’ultimo fosse normalmente inserito nell’elemento composito
ICESp2905, come riportato in precedenza in S. pyogenes (13).
Sorprendentemente, nessuno dei campioni in esame era positivo alla
ricerca di int2905/2906 o per altri geni caratteristici di ICESp2905
(Figura 17). Già di per se questo era un dato rilevante, in quanto
sembrava suggerire una sorta di
“indipendenza” dell’elemento
portante erm(TR), ICESp2907, o quanto meno che esso poteva essere
inserito in uno scaffold diverso da ICESp2905.
85
Capitolo Terzo
Risultati
1
3
2
5
4
79 11
6810 12
13
16 18
1517
20
22 24
19 21
23
26 28
25 27
30
29
32
31
34
33
erm(TR) fragment
37 39 41
36 3840
43 45
42
44 46
47
49
48
51
53
50 52
tet(O) fragment
55
54
57
56
59 61
58
60
ICESp2905
(~ 66 kb)
Figura 17. Rappresentazione schematica di ICESp2905.
A questo punto abbiamo analizzato, mediante PCR mapping ed
utilizzando la sequenza di riferimento (accession no. FR691055.1),
(13), la presenza dell’intero elemento correlato a ICESp2907 (figura
18).
Le
varie
combinazioni
di
primer
utilizzate
dimostravano
l’associazione genica tra il gene MATE (orf12) ed erm(TR), e tra
erm(TR) e orf20 e infine tra orf20 e tndX. In tutti e tre gli isolati
(10185, 5236 e 24715) era pertanto dimostrabile un elemento
correlato a ICESp2907. L’elemento ottenuto da GBS 24715 è stato
completamente sequenziato e designato ICESag2907. Esso ha
dimensioni 12’617 bp, comprende 16 ORF e presenta 99% di identità
nucleotidica con il corrispondente elemento di S. pyogenes.
Una volta sequenziato l’elemento, abbiamo voluto verificare se fosse
in grado di formare un intermedio circolare, necessario per il
trasferimento coniugativo. Sono stati utilizzati la coppia di primer
divergenti tndXF/orf10rev (tabella 1) ottenendo un amplificato di
circa 500 bp. Il sequenziamento dell’amplificato ha consentito di
determinare
il
putativo
core
site,
di
21
nt
(attI,
AGGCATAAAGCAATTTATGGC) identico a quello già descritto per S.
pyogenes (49). La dimostrazione dell’intermedio circolare ci ha
86
Capitolo Terzo
Risultati
suggerito di verificare il possibile trasferimento genico di ICESag2907
mediante coniugazione.
12
20
orf12GBSfor
erm(TR)mar-rev
erm(TR)mar-for
orf20-for
ICE6R
orf20-rev
Figura 18. Rappresentazione schematica e PCR-mapping di ICESag2907.
Integrazione di ICESag2907
Nella
sua
considerato
prima
descrizione,
inizialmente
come
integrato in uno specifico gene
ICESp2907
un
era
erm(TR)
stato
f ragment
target (orf8) all’interno
dell’elemento composito ICE Sp2905 che conteneva anche
un
tet(O)
f ragment
(13).
La
successiva
definizione
ICESp2907 derivava da uno studio successivo
di
in cui veniva
dimostrata la sua escissione spontanea da ICESp2905 e il suo
trasferimento coniugativo (49). Sempre in questo lavoro, in alcuni
transconiuganti ICESp2907 poteva integrarsi nell’orf10 di un altro
elemento erm(TR), ICESp1108, omologo all’orf8
di ICESp2905 e
contenente la stessa sequenza di 21-bp.
Dalle indagini preliminari, anche ICESag2907 (in S. agalactiae)
contiene il medesimo core site di ICESp2907 (in S. pyogenes) e
87
Capitolo Terzo
Risultati
presenta pertanto le stesse proprietà di trasferimento e sito-specificità
di integrazione. Utilizzando come query la sequenza dell’intermedio
circolare di ICESag2907 per interrogare il database di GBS, abbiamo
potuto identificare un identico core site di 21 bp in soli due genomi di
S. agalactiae,
CCUG37742 (ctg7180000003096, Sequence ID:
ALQR01000041) e CCUG37741 (ctg120001198220, Sequence ID
ALQQ01000033).
Utilizzando
quest’ultimo
(CCUG37741)
come
riferimento molecolare, sono stati disegnati nuovi primer nelle regioni
che fiancheggiano il gene SAG0064_01250 omologo al gene target
orf8 di ICESp2905 e orf10 di ICESp1108. Le giunzioni sinistra e
destra di ICESag2907 sono state studiate in GBS 24715 e negli altri
due ceppi in esame (5236 e 10185) mediante le coppie di primer
7F/10R
e
tndXF/25R . La sequenza di entrambe le regioni
conferma l’integrazione sito-specifica di ICESag2907 all’interno di un
elemento mosaico correlato con quello di grandi dimensioni (ca. 115
kb) evidenziato in S. agalactiae CCUG37741 e distinto dagli elementi
di S. pyogenes (ICESp2905 o ICESp1108).
Esperimenti di coniugazione
La mobilità di ICESag2907 è stata studiata utilizzando i donatori
GBS 24715 e GBS 5236 sia a livello intra- che inter-specifico,
utilizzando rispettivamente i riceventi S. agalactiae 1357RF e S.
pyogenes 12RF (o il suo mutante derivato SN04).
88
Capitolo Terzo
Risultati
I transconiuganti sono stati selezionati con una concentrazione
minore di eritromicina (1 g/ml), rispetto ad altri esperimenti di
coniugazione sopra riportati, per i bassi livelli di resistenza osservati
con entrambi i ceppi donatori (tabella 2). Tutti i transconiuganti
ottenuti nei vari esperimento sono stati studiati dal punto di vista
fenotipico e molecolare seguendo le strategie descritte per i rispettivi
donatori.
Per quanto riguarda l’incrocio con il donatore GBS 24715 le
frequenze di trasferimento (espresse come numero di transconiuganti
(CFU) per ricevente) erano di 2,79 X 10-9 nell’incrocio intraspecifico e
di 4,4 X 10-8 nell’incrocio interspecifico. Tutti i transconiuganti sono
resistenti ai macrolidi, hanno fenotipo iMLS e contengono una copia
di ICESag2907 inserita in un elemento più grande.
Negli incroci in cui il donatore era GBS 5236 è stato necessario
preparare nuovi mutanti riceventi, resistenti alla streptomicina e
all’acido nalidissico, dal momento che il ceppo donatore si è
dimostrato resistente all’acido fusidico, uno dei due marcatori
normalmente utilizzati per la selezione dei transconiuganti. Pertanto,
per la selezione dei prodotti di coniugazione è stata utilizzata una
combinazione di eritromicina (1 µg/ml), rifampicina (10 µg/ml) e
streptomicina (500 µg/ml). A differenza dei risultati ottenuti con
l’altro donatore, in questo caso sono stati ottenuti transconiuganti,
solo con il ricevente S. pyogenes SN04 e con bassa frequenza (5,5 X
10-9). L’analisi dei transconiuganti ottenuti dimostrava, anche in
89
Capitolo Terzo
Risultati
questa serie di esperimenti, il trasferimento di ICESag2907 all’interno
di un elemento più grande.
Analisi mediante SmaI-PFGE ed esperimenti di ibridizzazione.
I transconiuganti ottenuti nei diversi tipi di incrocio precedentemente
riportati sono stati analizzati mediante PFGE.
Nell’incrocio intra-specifico GBS 24715 X GBS 1357RF il profilo di
macrorestrizione
con
SmaI
dei
transconiuganti
mostrava
la
scomparsa di una banda di circa 390 kb e la comparsa di una banda
più grande di 450 kb, che ibridizzava con la sonda erm(TR) (figura
19).
Marker
A
B
C
436.5 K
388 K
339.5 K
291 K
242.5 K
194 K
144.5 K
97 K
48.5 K
23.1 K
Figura19. PFGE dei frammenti di restrizione prodotti da SmaI. (A) Ceppo ricevente
S. agalactiae 1357 (B) Transconiugante ottenuto nell’incrocio GBS 24715 x GBS
1357 (C) ibridazione con la sonda specifica per erm(TR).
: pesi molecolari standard (in kilobases), Bacteriophage lambda DNA concatemers
(Bio-Rad).
90
Capitolo Terzo
Risultati
Questo
risultato
confermava
il
trasferimento
di
un
elemento
coniugativo più grande, contenente ICESag2907 (13 kb), le cui
dimensioni sono state stimate in circa 60 kb.
Il
profilo
di
SmaI-PFGE
dell’unico
transconiugante
ottenuto
dall’incrocio interspecifico GBS 24715 X GAS 12RF presentava la
comparsa di un nuovo frammento di DNA di ca. 100 kb, che ibridizza
con la sonda erm(TR) (figura 20).
Marker
A
B
C
436.5 K
388 K
339.5 K
291 K
242.5 K
194 K
144.5 K
97 K
48.5 K
23.1 K
Figura 20. PFGE dei frammenti di restrizione prodotti da SmaI. (A) Ceppo ricevente
S. pyogenes 12RF (B) Transconiugante ottenuto nell’incrocio GBS 24715 x GAS
12RF (C) ibridazione con la sonda specifica per erm(TR).
: pesi molecolari standard (in kilobases), Bacteriophage lambda DNA concatemers
(Bio-Rad).
Per quanto riguarda l’incrocio di GBS 5236 con S. pyogenes SN04, il
profilo di macrorestrizione del transconiugante ha mostrato la
scomparsa di una banda di ca. 145 kb e la successiva comparsa di
91
Capitolo Terzo
Risultati
una banda di ca. 230 kb, che ibridizzava con la sonda erm(TR) (figura
21).
Marker
A
B
C
436.5 K
388 K
339.5 K
291 K
242.5 K
194 K
144.5 K
97 K
48.5 K
23.1 K
Figura 21. PFGE dei frammenti di restrizione prodotti da SmaI. (A) Ceppo ricevente
S. pyogenes SN04 (B) Transconiugante ottenuto nell’incrocio GBS 5236 x GAS
SN04 (C) ibridazione con la sonda specifica per erm(TR).
: pesi molecolari standard (in kilobases), Bacteriophage lambda DNA concatemers
(Bio-Rad).
92
Capitolo Terzo
Risultati
3.10 Elementi genetici sconosciuti che veicolano il gene
erm(TR)
Per i restanti 5 ceppi, positivi per il gene erm(TR) ma negativi per
tutte le integrasi finora note, non è stato identificato nessun contesto
genetico del determinante di resistenza. Tuttavia, dal momento che
gli ICE dimostrano grande flessibilità e sono possibili eventi genetici
che spesso producono una ricombinazione a livello dei moduli
funzionali (100) abbiamo analizzato ugualmente questi ceppi per la
presenza di strutture già note. Inoltre, è proprio in S. pyogenes che
era stato dimostrato un elemento veicolante erm(TR), ICESp1108, che
si distingueva da ICE10750-RD.2 esclusivamente per il modulo di
ricombinazione (13). Queste considerazioni, unitamente alla grande
variabilità genetica documentata per S. agalactiae (17) sembrava
suggerire la possibilità che in questi ceppi il gene erm(TR) poteva
essere associato ad elementi del tutto simili a quelli già circolanti in
S. pyogenes, ma con un diverso gene di integrazione cromosomica.
Purtroppo, nonostante un’accurata indagine non abbiamo ottenuto
nessun risultato positivo, portando alla conclusione che il supporto
genetico del gene erm(TR) nei 4 ceppi in esame rimane al momento
sconosciuto.
93
Capitolo Terzo
Risultati
3.11
Identificazione del plasmide che veicola il gene
erm(T) per la resistenza all’eritromicina in S.
agalactiae
In
un
solo
isolato
(GBS
11788)
la
resistenza
inducibile
all’eritromicina era mediata dal gene erm(T). Contrariamente a
erm(TR) ed erm(B), che sono prevalentemente associati ad ICE,
erm(T) è legato a piccolo plasmidi, mobilizzabili e con ampio
spettro di ospite, dimostrati in S. pyogenes (98), S. agalactiae (39)
e in un ceppo di S. dysgalactiae subsp. equisimilis isolate (67).
L’analisi di PCR mapping del plasmide ottenuto dall’isolato, è
stata condotta combinando tra loro primer che marcano il gene
erm(T) e due geni funzionali specifici, mob e rep. I risultati
confermano la presenza di un plasmide, portante erm(T), con
organizzazione genica e dimensioni uguali ai plasmidi pGB2001
(S. agalactiae) e pGA2000 (S. pyogenes) (39).
94
Capitolo quarto
Discussione
DISCUSSIONE
Diversi studi comparativi dei genomi di S. agalactiae hanno messo in
luce la grande flessibilità genomica di questa specie e come il
cromosoma possa essere considerato una struttura composita, con
uno scheletro stabile e diverse regioni di materiale variabile (da 11 a
14 per genoma), costituito per lo più da elementi genetici mobili (17),
(93). Gran parte delle conoscenze su questi elementi scaturiscono
dalle analisi in silico delle sequenze genomiche disponibili nel
database di S. agalactiae (309 sequenze attualmente presenti), dal
momento che, nella maggioranza dei casi, sono assenti tipici geni
cargo. Nello stesso tempo in GBS sono già stati descritti diversi
elementi di resistenza come la ben nota famiglia Tn916/Tn1545, che
negli streptococchi è responsabile della diffusione non solo della
tetraciclino-resistenza ma anche della resistenza agli antibiotici MLSB
(96) (77) o ICE correlabili a ICE_2603_rplL (17) che determina la
resistenza ai metalli pesanti. E’ pertanto evidente come la ricchezza e
la diversità degli elementi genetici (plasmidi, plasmidi coniugativi,
ICE, IME, CIME, IS, trasposoni, ecc.) dimostrabili nella specie S.
agalactiae contribuisce non solo alla loro diffusione orizzontale, ma
anche alla loro stessa evoluzione verso forme sempre più composite,
essendosi dimostrati in grado di acquisire una varietà di determinanti
di resistenza.
L’acquisizione della resistenza alla tetraciclina, ad esempio, sembra
aver contribuito all’espansione di pochi cloni GBS adattati all’uomo
95
Capitolo quarto
Discussione
(31). In contrasto con quanto osservato per altre specie batteriсhe,
dove in genere si osserva una riduzione della resistenza in assenza di
pressione selettiva, la tetraciclino-resistenza tra i ceppi di S.
agalactiae umani rimane stabile e ad alto livello (> 90%).
La percentuale di resistenza ottenuta in questo studio (89,8%)
conferma queste osservazioni ed è in linea con altri dati recenti di
letteratura (54) (86). Tale resistenza è mediata dal gene tet(M) che
nella maggior parte dei ceppi è associato ad elementi della famiglia
Tn916, sia come unico fattore di resistenza che in associazione con il
determinante erm(B), formando il trasposone composito Tn3872. In
un terzo dei ceppi, tet(M) è portato da un elemento genetico, Tn5801,
che era stato sporadicamente descritto in poche altre specie
batteriche, ma mai riportato finora in S. agalactiae. Tn5801 era stato
individuato
per
la
prima
volta
in
S.
aureus
Mu50
(57),
successivamente caratterizzato in ceppi umani di S. aureus (33) e
descritto in S. mitis B6, grazie al sequenziamento del primo genoma
di una specie commensale di streptococco (37). Tn5801 è considerato
un membro della famiglia Tn916 (77) nonostante esso differisca per la
presenza di una distinta integrasi che conferisce un’integrazione sitospecifica nel cromosoma dell’ospite (33).
Focalizzando il nostro studio su questo gruppo di ceppi, abbiamo
caratterizzato il nuovo elemento, utilizzando sia primer di letteratura
che nuovi set di primer disegnati specificatamente in base ai risultati
che man mano si ottenevano con gli esperimenti di amplificazione e
96
Capitolo quarto
Discussione
sequenziamento. L’elemento Tn5801-like riscontrato nei isolati di S.
agalactiae
è
stato
ridenominato
Tn5801.Sag
poiché
differiva
dall’elemento originariamente identificato in S. aureus; inoltre, era
molto più affine a quello evidenziato nel genoma di E. faecalis 62.
Tn5801.Sag non sembrava produrre un intermedio circolare e non
sembrava essere trasferibile mediante coniugazione sia in incroci
intraspecifici che
interspecifici,
risultato che era in contrasto con
quanto riportato da altri autori (33) per isolati di S. aureus. Tuttavia,
la configurazione genica di Tn5801.Sag, quasi identica all’elemento
corrispondente in E. faecalis 62, sembrava suggerire la possibile
provenienza ambientale da questa specie batterica. Non si poteva
altresì escludere un possibile interscambio e/o ricombinazione
genetica a partire da specie come S. aureus o E. faecalis, che spesso
condividono l’habitat di S. agalactiae (ad esempio il tratto intestinale
di uomini e animali). La presenza di questo elemento in circa un terzo
degli isolati resistenti alla tetraciclina poteva riflettere la circolazione
di uno stesso clone epidemico, ma le analisi di correlazione genetica
hanno escluso questa ipotesi, essendo stati evidenziati ben 14 profili
distinti, suggerendo, al contrario, un’acquisizione non clonale.
Per quanto riguarda la resistenza ai macrolidi, negli streptococchi
questa rappresenta un problema di primaria importanza poiché
questa classe di antibiotici è largamente utilizzata in clinica,
soprattutto quando i β-lattamici non possono essere utilizzati
(pazienti allergici) o non hanno effetto (fallimento terapeutico). La
97
Capitolo quarto
Discussione
resistenza ai macrolidi sta assumendo livelli allarmanti anche per S.
agalactiae, dal momento che, pur essendo farmaci di seconda scelta,
sono di fatto largamente utilizzati.
In questo lavoro di tesi, oltre ad elementi già noti in S. agalactiae,
abbiamo
identificato
e
caratterizzato
nuovi
ICE
descritti
in
precedenza solo in S. pyogenes come: ICESp1116 responsabile della
diffusione di erm(B), e ICE10750RD.2, ICESp1108, e ICESp2907 che
veicolano erm(TR).
L’elemento
identificato
nell’
isolato
clinico,
GBS
16685,
è
strettamente correlato con l’ICESp1116, che è ampiamente diffuso in
S. pyogenes (14). ICESp1116 consiste in una struttura composita
mobile, la cui ricombinazione cromosomica è assicurata da un
enzima della classe delle DDE trasposasi; la regione cargo è invece un
mosaico di elementi, essendo costituita da un frammento del
plasmide pSM19035, dal gene erm(B), dalla sequenza di inserzione
IS1216V e da un frammento del trasposone Tn5397 che porta il gene
tet(M). Tuttavia, l’elemento riscontrato in GBS 16685 e denominato in
questo
studio
ICE1116.Sag
mostra
importanti
differenze
con
l’elemento di riferimento descritto in S. pyogenes. Infatti, mentre in
ICESp1116 l’erm(B) è espresso inducibilmente e il tet(M) è silente, in
ICE1116.Sag l’erm(B) determina un fenotipo costitutivo e il gene
tet(M) è pienamente espresso. Anche in ICE1116.Sag è presente una
copia della sequenza d’inserzione IS1216V che è inserita a monte del
promotore del gene tet(M), a differenza di quanto si verifica
98
Capitolo quarto
Discussione
nell’elemento di S. pyogenes, dove invece determina la delezione della
porzione
iniziale
ICE1116.Sag
è
del
stata
gene
strutturale.
dapprima
La
analizzata
configurazione
utilizzando
di
come
riferimento la sequenza disponibile di ICESp1116 (14). I risultati di
PCR e di sequenziamento evidenziano che i due elementi sono
perfettamente confrontabili a livello della regione cargo, ma non dello
scaffold
come
dimostrato
dall’assenza
di
alcuni
prodotti
di
amplificazione attesi in base al riferimento di S. pyogenes. Il parziale
sequenziamento
della
regione
immediatamente
a
monte
del
frammento di pSM19035 ha confermato la presenza delle orf29 e
orf30 di ICESp1116 ma l’assenza dell’orf28, sostituita in ICE1116.Sag
da un’altra ORF che presenta un’identità nucleotidica dell’88% con 5
genomi di GBS, tutti contenenti un elemento caratterizzato dalla
presenza di una DDE trasposasi. Allo stesso modo, la sequenza di
una parte del gene funzionale corrispondente all’orf24 di ICESp1116,
evidenzia un’alta identità nucleotidica con i geni presenti negli
elementi di altri due ceppi GBS (S. agalactiae ni1122, accession no.
KC460338 e S. agalactiae 2584, accession no. KC492042). Anche
questi due elementi sono caratterizzati da una DDE trasposasi. Tali
elementi, denominati TnGBS di gruppo 1 e gruppo 2, rappresentano
una nuova famiglia caratterizzata solo di recente e che sembra essere
largamente diffusa nel genere Streptococcus (17),(50). Nel complesso,
gli elementi TnGBSs sono correlabili agli ICE, ma presentano un
diverso meccanismo di ricombinazione, in quanto l’enzima DDE
99
Capitolo quarto
Discussione
trasposasi che li caratterizza ha un meccanismo di trasposizione
simile a quello delle sequenze d’inserzione, inoltre il modulo di
coniugazione è più correlato a quello di molti plasmidi coniugativi
(50). I dati a disposizione supportano l’ipotesi per cui i nuovi elementi
TnGBS sono il frutto di una conversione da plasmidi coniugativi a
ICE in seguito al reclutamento del modulo di trasposizione di origine
IS (50).
Utilizzando come modello di riferimento il TnGBS2.5 del ceppo GBS
ni1122 (accession no. KC460338) sono stati disegnati nuovi primer
per analizzare meglio lo scaffold di ICE1116.Sag.
La ricerca delle giunzioni cromosomiche è stata effettuata sulla base
delle informazioni presenti in letteratura (14), secondo le quali
l’ICESp1116 si integra in modo sito specifico a livello del gene rpmH.
Considerando
la
diversa
configurazione
del
cromosoma
di
S.
agalactiae e facendo riferimento al genoma del GBS 2603 V/R e
all’elemento TnGBS2.5, sono stati costruiti appositi primer per la
ricerca putativa del sito di inserimento cromosomico dell’elemento in
esame, individuato nella regione a monte del 5’ end del gene rpmH,
una modalità di integrazione che è peculiare degli elementi TnGBS2
(50).
La
caratterizzazione
di
ICESp1116.Sag
è
stata
completata
analizzando la sua mobilità mediante coniugazione, risultando
trasferibile sia a cellule della stessa specie che a cellule appartenenti
a specie differenti. Tuttavia, in letteratura è descritto che gli elementi
100
Capitolo quarto
Discussione
correlati a TnGBS non si dimostrano trasferibili efficacemente ad
altre specie, al di fuori di S. agalactiae (50). Probabilmente la
maggiore efficienza di trasferimento dimostrata in questo studio con il
ricevente di S. pyogenes
la cui frequenza di coniugazione è un
logaritmo più alto (10-6) di quella ottenuta con il ricevente S.
agalactiae (10-7) potrebbe essere dovuta alla presenza dei geni di
resistenza erm(B) e tet(M). Da sottolineare è che il trasferimento di
ICE1116.Sag determina, anche nei transconiuganti di S. pyogenes,
una resistenza costitutiva all’eritromicina, come il donatore GBS
16685, a differenza dei dati riportati in letteratura, in cui ICESp1116
genera nella propria specie (e nei transconiuganti derivati) un
fenotipo inducibile (iMLS).
La scoperta e la caratterizzazione in questo lavoro di ICE1116.Sag,
strettamente correlato all’originale ICESp1116 di S. pyogenes è
interessante per alcuni aspetti: prima di tutto è il primo esempio della
presenza di un elemento di questo tipo al di fuori della specie S.
pyogenes in contrasto con quanto riportato in letteratura (16); inoltre
è anche il primo esempio di un elemento appartenente alla famiglia di
ICE TnGBS2 che veicola due determinanti di resistenza, di nuovo in
contrasto con quanto riportato (50). Anche queste due nuove famiglie
di ICE, al pari di altri ICE ampiamente descritti negli streptococchi,
sono serbatoi molecolari, nei quali l’inserzione di elementi genetici o
frammenti di essi, possono contribuire all’evoluzione degli ICE stessi
101
Capitolo quarto
Discussione
e alla diffusione dei geni cargo in essi contenuti, siano geni di
resistenza e/o di virulenza.
In S. agalactiae la resistenza all’eritromicina è mediata anche dal
gene erm(TR), già nota da tempo (61) ma, diversamente da quanto
noto per la specie S. pyogenes (13), gli elementi genetici associati ad
esso non sono mai stati studiati. Nella maggior parte dei casi, il gene
erm(TR) è responsabile di un fenotipo inducibile, al contrario del gene
erm(B) che invece mostra un fenotipo costitutivo.
I valori di MIC per eritromicina, clindamicina e josamicina sono
sostanzialmente in accordo per quanto riguarda il fenotipo iMLS,
dove si riscontra un basso livello di resistenza all’eritromicina e
sensibilità a lincosamidi e macrolidi a 16 atomi, in accordo con la
presenza del solo determinante erm(TR). Nei ceppi con fenotipo cMLS
i valori elevati di resistenza alla clindamicina (tutti >128 mg/ml)
sembrano suggerire la presenza di qualche altro fattore direttamente
o indirettamente responsabile dell’alta resistenza nei confronti della
clindamicina. Questa situazione era già stata osservata proprio in S.
agalactiae (30).
Il contesto genetico che veicola il gene erm(TR) in GBS è stato
studiato utilizzando come riferimento molecolare i tre elementi
individuati in S. pyogenes, ICE10750RD.2, ICESp1108 e ICESp2905.
I
risultati,
ottenuti
sequenziamento
dalle
parziale
di
procedure
quegli
di
PCR
amplificati
mapping
con
e
dal
dimensioni
discordanti rispetto ai riferimenti molecolari, ci hanno consentito di
102
Capitolo quarto
Discussione
ottenere un quadro della distribuzione degli elementi genetici che
sono presenti in S. agalactiae. Nell’ambito dei 18 ceppi analizzati, 13
dimostravano un elemento genetico correlato con almeno uno dei tre
noti per S. pyogenes; nello specifico, 5 avevano un ICE10750RD.2like, 5 avevano un ICESp1108-like e infine 3 presentavano un
ICESp2907-like (denominato ICESag2907). Per i restanti 5 ceppi non
è stato possibile dimostrare nessuno degli elementi noti.
Lo studio della correlazione genetica dimostra una sostanziale
eterogeneità; 13 genotipi diversi sono stati individuati tra i 18 ceppi
eritromicino-resistenti
erm(TR) positivi. E’ comunque presente un
clone maggiore che comprende 3 isolati identici (331, 3921, 16076)
che sono stati isolati in tre distinti anni e tutti contenenti ICESp1108.
La maggiore diversità si può riscontrare sicuramente tra i 5 ceppi con
ICE10750-RD.2 (18709, 15781, 16891, 21861,24814) ma essa è
ancora più evidente considerando i 5 ceppi con elemento sconosciuto,
essendo tutti diversi eccetto due (2009-12253) che sono invece
strettamente correlati tra loro, ma comunque non identici. Mentre il
sito di integrazione di ICESag1108 in S. agalactiae è stato
determinato a livello del gene rum, identico a quello descritto in S.
pyogenes, non è stato possibile al momento ottenere lo stesso
risultato con i ceppi che contenevano ICE10750-RD.2. Difatti, un
gene omologo a hsdM, che rappresenta il sito specifico di integrazione
cromosomica in S. pyogenes (7) non è stato rilevato da analisi in silico
eseguite sul genoma di S. agalactiae. Ancora più discordanti sono i
103
Capitolo quarto
Discussione
risultati ottenuti dagli esperimenti di trasferimento orizzontale.
Mentre ICE10750-RD.2 e ICESp1108 non sono trasferibili per
coniugazione, transconiuganti sono stati ottenuti dai ceppi che
presentavano ICESag2907, sia a livello intra- che interspecifico.
Inoltre, diversamente da quanto noto per ICESp2907 di S. pyogenes
(13), ICESag2907 non è associato ad elementi coniugativi di maggiori
dimensioni, come ICESp2905 o altri elementi portanti erm(TR), come
ICESp1108 (49). Benché i due elementi ICESag2907 e ICESp2907
abbiano lo stesso core site, in base alle analisi di sequenza, in realtà
ICESag2907 sembra presentare un diverso sito di integrazione
cromosomica. Questo risultato potrebbe riflettere la sostanziale
flessibilità genomica che da tempo è stata dimostrata per questa
specie (93). Molti tipi di elementi genetici possono essere infatti
dimostrati in GBS (17) ed è quindi molto probabile che ICESag2907
possa rappresentare un nuovo tipo di elemento genetico, che può
contribuire alla diffusione di erm(TR) in questa specie. Benché i
risultati ottenuti dagli esperimenti di trasferimento genico orizzontale
sembrano evidenziare che ICESag2907 sia un elemento coniugativo,
in base alla sequenza nucleotidica non sono presenti geni che
codificano per il sistema di secrezione di tipo IV, che rappresenta il
supporto molecolare attraverso cui avviene il trasferimento del
materiale genetico tra due cellule in stretto contatto (9). Queste
osservazioni sembrano suggerire che la natura di questo elemento sia
più riconducibile a quella di un IME (Integrative and mobilizable
104
Capitolo quarto
Discussione
element) piuttosto che di un ICE a tutti gli effetti, tuttavia non ci sono
ancora informazioni su quale sia l’elemento in grado di mobilizzare
ICESag2907.
In conclusione, i risultati ottenuti sui ceppi di GBS tetraciclino- e/o
eritromicino-resistenti confermano che i trasposoni appartenenti alla
famiglia
Tn916
rappresentano
gli
elementi
genetici
mobili
maggiormente diffusi anche nella specie S. agalactiae, così come in
altri importanti streptococchi patogeni, tuttavia cominciano ad essere
dimostrabili altri elementi genetici che sembrano avere origine da
batteri che, analogamente a S. agalactiae, hanno un serbatoio non
esclusivamente
umano, come S. aureus o E. faecalis; oppure
potrebbero riflettere l’interscambio nell’ambito di specie strettamente
adattate all’uomo, come S. pyogenes. Nel complesso la varietà degli
elementi genetici dimostrata in questo lavoro conferma la flessibilità e
la dinamicità del “pan-genoma” di S. agalactiae.
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