la manipolazione del corredo cromosomico

Biol. Mar. Mediterr. (2008), 15 (1): 203-206
A. Libertini
Istituto di Scienze Marine, C.N.R. , Riva 7 Martiri, 1364/A – 30122 Venezia, Italia.
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LA MANIPOLAZIONE DEL CORREDO CROMOSOMICO:
APPLICAZIONI IN ACQUACOLTURA
CHROMOSOME SET MANIPULATION IN AQUACULTURE
Abstract – The role of chromosome set manipulation in finfish and shellfish aquaculture is shortly
reviewed. Results on polyploidisation and uniparental inheritance coming from personal experimentation
and literature are summarised.
Key-words: fish and shellfish culture, biotechnology, polyploids, sex determination.
Introduzione - La manipolazione del corredo cromosomico (MCC) è una applicazione biotecnologica che mira ad alterare il “normale” meccanismo con cui i caratteri dei genitori sono trasmessi alla progenie durante la riproduzione sessuata. Con
opportuni interventi manipolativi si possono produrre: a) individui poliploidi, cioè che
hanno un numero di cromosomi superiore al normale diploide (2n), ma pur sempre
multiplo di “n” (triploide = 3n; tetraploide = 4n; ecc.); b) individui diploidi originati
per trasmissione uniparentale del genoma, ossia esclusivamente dalla madre (diploidi
ginogenoti) o dal padre (diploidi androgenoti).
Nell’intento di ottenere rese analoghe a quelle riportate in agronomia, ove molti
cultivar delle piante più performanti sono di origine poliploide (naturale o indotta
tramite MCC), a partire dal secondo dopoguerra la MCC è stata sperimentata anche
in acquacoltura, inizialmente per le specie di acqua dolce e, in seguito, per le marine.
Nelle specie ittiche, la condizione triploide comporta generalmente sterilità e si
riteneva che l’energia non investita nella riproduzione potesse andare a favore di una
maggiore crescita corporea (FAO, 2000). Nella produzione di triploidi costituirebbe
un indubbio vantaggio poter disporre di riproduttori tetraploidi, da incrociare con
normali diploidi, per ottenere il 100% di individui 3n senza ulteriore MCC.
Tra le specie oggetto di acquacoltura, talvolta uno dei due sessi può risultare più
interessante per la produzione, sia perché esibisce un più alto tasso di crescita, sia
per peculiari aspetti organolettici particolarmente graditi dal mercato, come nel caso
delle femmine dei salmonidi e degli storioni o dei maschi nelle tilapie. In questi casi
l’applicazione della MCC, per produrre ceppi ginogenoti o androgenoti, e l’inversione
sessuale, con appropriati trattamenti ormonali, possono garantire la produzione di
lotti monosessuati, nel volgere di una o due generazioni (Purdom, 1993).
Il presente lavoro riassume alcuni dei risultati e dà una valutazione sull’applicazione
della MCC in acquacoltura, in base ad esperienze dirette e derivanti dalla letteratura.
Materiali e metodi - In acquacoltura, la MCC è stata più ampiamente sperimentata su pesci teleostei e molluschi, in virtù di alcuni tratti distintivi della loro biologia
(elevata fertilità, modalità esterna di fecondazione, buona tolleranza alla poliploidia)
che favoriscono l’applicazione delle tecniche di manipolazione. Dirette esperienze sono
state effettuate dall’autore su branzino, orata, ombrina e trota fario.
La MCC prevede di impedire uno dei processi cariocinetici che seguono la fecondazione provocando: o la mancata espulsione di un globulo polare, con conseguente
inglobamento d’un ulteriore corredo aploide di cromosomi nel nucleo del futuro zigote,
oppure inibire la mitosi nello zigote, provocando il raddoppiamento del numero di
cromosomi. Il blocco di questi eventi è attuato tramite la temporanea esposizione ad
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uno shock fisico (termico caldo, termico freddo, o pressorio) oppure ad un agente
chimico (citocalasina B o D, 6-dimetilaminopurina, caffeina, colchicina). Questi trattamenti inibiscono la formazione del fuso, impedendo la migrazione dei cromosomi
nella cariocinesi. Nel caso s’impieghino nella fecondazione normali gameti maturi, la
mancata espulsione del polocita provoca la generazione di individui triploidi, mentre
bloccando la segmentazione si ottengono dei tetraploidi. Se nel medesimo schema operativo uno dei due gameti è stato geneticamente inattivato, tramite radiazioni ultraviolette o gamma, si potranno ottenere diploidi ginogenoti o androgenoti. I diploidi
ginogenoti possono originare dal blocco della meiosi ovocitaria (meioginogenoti) o
della mitosi (mitoginogenoti), gli androgenoti sono prodotti esclusivamente per blocco
mitotico.
Risultati - Da un punto di vista metodologico, gli shock fisici sono maggiormente
impiegati nella MCC applicata ai pesci, mentre per i molluschi si tende a preferire
l’uso di inibitori chimici del fuso (Purdom, 1993; Nell, 2002). Dalle diverse esperienze
emerge come lo shock termico a caldo sia maggiormente nocivo per le uova rispetto
a quello pressorio, al termico a freddo e al trattamento chimico, influendo spesso
significativamente sulla sopravvivenza degli individui manipolati e provocando malformazioni (Purdom, 1993; personali osservazioni).
Triploidi sono stati ottenuti con elevate percentuali di successo (>90%) in branzino, orata e ombrina tramite shock a freddo (ΔT~15 °C). In trota fario la percentuale
di triploidi ottenuta con shock a caldo è stata molto variabile (20-100%) e strettamente dipendente dal numero e dalla qualità delle uova trattate. Bisogna precisare
che in questa specie, a differenza delle altre tre citate, per avere lotti di produzione
adeguati (superiori alle 50.000 uova) occorre cumulare le ovature di più femmine, le
quali possono rispondere in maniera differenziata ai trattamenti. Nei pesci l’induzione
della triploidia provoca una completa sterilità, generalmente di tipo gonadico nelle
femmine (ovario vestigiale) e gametico nei maschi. Raramente la triploidia ha influito
positivamente sulla crescita e, in ogni caso, riscontri positivi si sono rilevati generalmente dopo la pubertà (Cal et al., 2006). In lotti misti, costituiti da pesci diploidi e
triploidi, si crea competizione tra le due ploidie e la percentuale di individui 3n progressivamente diminuisce.
Nei molluschi triploidi la crescita è maggiormente accelerata che nei diploidi (Guo
et al., 1996; Dunstan et al., 2007). Le ostriche triploidi hanno gonadi di dimensioni
ridotte ma possono essere in grado di produrre gameti, seppure in quantità limitata.
In altri molluschi (pettini e abaloni) i triploidi sono completamente sterili (Guo et al.,
1996; Lohrmann e Von Brand, 2005; Dunstan et al., 2007).
Riproduttori tetraploidi fertili sono stati raramente ottenuti tra i teleostei, prevalentemente per salmonidi e ciprinidi. In molte specie soprattutto marine, come ad
esempio il branzino, la condizione tetraploide comporta un’iniziale bassa sopravvivenza, accompagnata da malformazioni nella morfologia delle larve, che portano ad
una rapida sparizione degli individui 4n nei lotti manipolati (Libertini e Bertotto, 2004;
Sakao et al., 2006). Nell’allevamento dell’ostrica concava (Crassostrea gigas) l’impiego
di riproduttori tetraploidi ha consentito una massiva produzione di triploidi, tale da
raggiungere livelli commerciali in alcuni stati del Nord America. In questo caso, i
riproduttori tetraploidi erano stati ottenuti bloccando l’espulsione del primo polocita
in uova di triploidi fecondate con sperma diploide (Guo et al., 1996), tale procedimento è attualmente protetto da brevetto (US Patent 5824841).
La produzione di diploidi ginogenoti per via meiotica è stata sperimentata per
molte specie di teleostei, più limitata, generalmente a ciprinidi e salmonidi, è stata
l’attenzione rivolta ai mitoginogenoti (Komen e Thorgaard, 2007).
Nel branzino la meioginogenesi produce lotti costituiti sia da femmine sia da
La manipolazione del corredo cromosomico: applicazioni in acquacoltura
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maschi, con le prime in netta maggioranza, testimoniando che in questa specie il sesso
non è determinato da un sistema genetico monofattoriale. Nei meioginogenoti di D.
labrax, svezzati a temperature inferiori ai 20 °C, gonadogenesi e fertilità sono comparabili a quelle dei diploidi biparentali. Femmine meioginogenoti sono state impiegate
con successo per ulteriori esperimenti di ginogenesi (Francescon et al., 2005). Il branzino è, inoltre, una delle tre specie di teleostei marini per cui è stata prodotta progenie
ginogenote doppio aploide, tramite blocco mitotico (Bertotto et al., 2005). Un lotto
di doppi aploidi è stato allevato fino al quinto anno di età senza aver dato segni di
maturazione delle gonadi. Infine, il lotto è stato sacrificato durante la stagione riproduttiva, e le gonadi, apparentemente tutti ovari, presentavano un aspetto vestigiale
molto simile a quello delle femmine triploidi. Delle circa due dozzine di specie di teleostei per cui sono stati prodotti ceppi ginogenetici doppio aploidi, solo per una decina
si sono potuti produrre cloni omozigoti (Komen e Thorgaard, 2007).
Ceppi androgenoti sono stati prodotti con successo per una decina di specie di
teleostei, di cui circa metà sono di reale interesse per l’acquacoltura (salmonidi e ciprinidi), e dai quali sono originati cloni omozigoti (Komen e Thorgaard, 2007).
Nei salmonidi, nelle tilapie e nella carpa, la cui determinazione del sesso è prevalentemente cromosomica ad eterogametia maschile, la MCC ad eredità uniparentale è
stata impiegata, in alternativa all’esclusivo impiego di ormoni, per originare riproduttori che hanno generato, tramite accoppiamento con genitori “normali”, ceppi monosessuati (Ezaz et al., 2004; Komen e Thorgaard, 2007). Progenie ginogenetica (pertanto
geneticamente costituita di sole femmine XX) può essere sottoposta ad inversione sessuale, tramite trattamento con ormoni mascolinizzanti, al fine di produrre neomaschi
(XX) da accoppiare con normali femmine (XX) per generare ceppi costituiti da sole
femmine (Purdom, 1993). Un esperimento simile è attualmente in corso, per la trota
fario, in un impianto sperimentale di Veneto Agricoltura. Con l’androgenesi (o con
la ginogenesi applicata a neofemmine XY) è possibile produrre maschi YY da incrociare con femmine XX per produrre ceppi monosessuati di maschi (XY), come messo
in pratica per la tilapia (Ezaz et al., 2004). La MCC ad eredità uniparentale non ha
ancora superato il livello sperimentale nei molluschi.
Conclusioni - Nonostante un’ampia sperimentazione, l’impiego della MCC a livello
commerciale ha, di fatto, al suo attivo pochi riscontri positivi. Pertanto, l’applicazione
della MCC richiede sempre un’accurata sperimentazione al fine di valutarne efficacemente gli effettivi benefici quando applicata ad un dato sistema biologico. Il maggior successo della MCC si riscontra nei triploidi di ostrica concava: crescono più dei
diploidi e, avendo gonadi ridotte, sono commerciabili per tutto l’anno a differenza
dei 2n. In ogni caso la triploidia nei molluschi si accompagna molto spesso ad un
incremento della resa in taglia. Lotti di sole femmine nei salmonidi e di soli maschi in
tilapia garantiscono incrementi significativi della produzione, rispetto a omologhi lotti
costituiti dai due sessi, e sono ormai largamente diffusi negli impianti intensivi. Per
i salmonidi gli allevatori hanno mostrato interessamento verso ceppi di sole femmine
triploidi, per rispondere alla richiesta di pezzature decisamente più grandi dell’usuale
taglia commerciale. Le associazioni e gli enti preposti al ripopolamento ittico possono
essere interessati all’immissione in natura di pesci triploidi perché la loro sterilità, ed
altri caratteri associati alla sindrome 3n, garantiscono un minore impatto sui popolamenti naturali. Ceppi doppio aploidi e cloni omozigoti sono attivamente impiegati
nello studio dei caratteri quantitativi (QTL) e per la costruzione di mappe genetiche.
Ringraziamenti - Per la diretta collaborazione nelle ricerche si è grati ai colleghi: A. Barbaro, D. Bertotto,
F. Bilò, F. Borghesan, A. Francescon, e S. Salviati. Si ringrazia Veneto Agricoltura per l’ospitalità presso i
suoi impianti ittici sperimentali di Pellestrina (VE) e Valdastico (VI).
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Bibliografia
BERTOTTO D., CEPOLLARO F., LIBERTINI A., BARBARO A., FRANCESCON A., BELVEDERE P., BARBARO J., COLOMBO L. (2005) - Production of clonal founders in the European
sea bass, Dicentrarchus labrax L., by mitotic gynogenesis. Aquaculture, 246: 115-124.
CAL R.M., VIDAL S., GOMEZ C., ALVAREZ-BLAZQUEZ B., MARTINEZ P., PIFERRER F.
(2006) - Growth and gonadal development in diploid and triploid turbot (Scophthalmus maximus).
Aquaculture, 251: 99-108.
DUNSTAN G.A., ELLIOTT N.G., APPLEYARD S.A., HOLMES B.H., CONOD N., GRUBERT
M.A., COZENS M.A. (2007) - Culture of triploid greenlip abalone (Haliotis laevigata Donovan)
to market size: Commercial implications. Aquaculture, 271: 130-141.
EZAZ M.T., MYERS J.M., POWELL S.F., McANDREW B.J., PENMAN D.J. (2004) - Sex ratios
in the progeny of androgenetic and gynogenetic YY male Nile tilapia, Oreochromis niloticus L.
Aquaculture, 232: 205-214.
FAO (2000) - How appropriate are currently available biotechnologies for the fishery sector in developing countries? URL: http://www.fao.org/biotech/c4doc.htm
FRANCESCON A., BARBARO A., BERTOTTO D., LIBERTINI A., CEPOLLARO F., RICHARD
J., BELVEDERE P., COLOMBO L. (2005) - Assessment of homozygosity and fertility in meiotic
gynogens of the European sea bass (Dicentrarchus labrax L.). Aquaculture, 243: 93-102.
GUO X.M., DEBROSSE G.A., ALLEN S.K. (1996) - All-triploid Pacific oysters (Crassostrea gigas
Thunberg) produced by mating tetraploids and diploids. Aquaculture, 142: 149-161.
KOMEN H., THORGAARD G.H. (2007) - Androgenesis, gynogenesis and the production of clones
in fishes: A review. Aquaculture, 269: 150-173.
LIBERTINI A., BERTOTTO D. (2004) - Una microtecnica per allestire campioni da singole larve di
pesci teleostei per la diagnosi della ploidia tramite citometria a flusso. Lettere GIC, 13: 9-12.
LOHRMANN K.B., VON BRAND E. (2005) - Histological study of gonads in triploid scallops,
Argopecten purpuratus. Journal of Shellfish Research, 24: 369-375.
NELL J.A. (2002) - Farming triploid oysters. Aquaculture, 210: 69-88.
PURDOM C.E. (1993) - Genetics and Fish Breeding. Chapman and Hall, London: 228 pp.
SAKAO S., FUJIMOTO T., KIMURA S., YAMAHA E., ARAI K. (2006) - Drastic mortality in
tetraploid induction results from the elevation of ploidy in masu salmon Oncorhynchus masou.
Aquaculture, 252: 147-160.